CN115786311A - 一种选择性降解粘蛋白的丝氨酸蛋白酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种选择性降解粘蛋白的丝氨酸蛋白酶及其应用。所述丝氨酸蛋白酶为丝氨酸蛋白酶EatA，其蛋白质包括具有丝氨酸蛋白酶EatA活性的乘客域，所述乘客域的氨基酸序列为与SEQ ID NO.2具有至少90%的同一性的氨基酸序列；优选为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。所述丝氨酸蛋白酶EatA能够选择性降解疾病相关粘液中的粘蛋白，且具有较高且持久的稳定性，因此所述丝氨酸蛋白酶和包括所述丝氨酸蛋白酶的药物组合物能够作为药物或药物有效成分，用于治疗分泌粘蛋白的癌症如腹膜假粘液瘤（PMP）和涉及粘蛋白的其他疾病中。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种选择性降解粘蛋白的丝氨酸蛋白酶及其在粘蛋白降解中的应用。
背景技术
粘蛋白是人体内表达的一类由分泌细胞表达的高分子量和高度糖基化的蛋白质，其分泌细胞一般分布于胃肠道、呼吸道、肺、肾、卵巢、乳房和胰腺的上皮组织腺组织。粘蛋白在正常的生理环境中在人体组织表面起到润滑和保护的作用。粘蛋白的表达和组成受到严格调控。但在一些病理条件下，如癌症、炎症下，粘蛋白的表达和组成不受控制而发生改变，这些粘蛋白的大量累积对患者产生了较大的负面影响。在癌症和非癌性疾病中均会因粘蛋白的表达异常而表现出严重的临床病理特征。上述疾病包括腹膜假粘液瘤、慢性阻塞性肺疾病、粘液性结直肠癌和粘液性卵巢癌等。
腹膜假粘液瘤是一类病因尚不清楚，但临床诊断多起源于卵巢、阑尾和肠粘液腺等器官和组织的癌症类型，癌细胞最终定植于腹膜和腹腔器官的腹膜侧表面，肿瘤持续生长并分泌产生大量粘蛋白，特别是粘蛋白MUC2，MUC2是小肠和大肠中主要的凝胶形成粘蛋白。凝胶形成粘蛋白在特定的pH值、盐浓度和同家族粘蛋白浓度组成下会形成凝胶样果冻状聚合物。MUC2分子的核心区域是高度糖基化的，对常规蛋白酶，如蛋白酶K、胃胰蛋白酶的降解具有极高的抵抗力，而蛋白链的C末端和N末端的共价相互作用分别有助于MUC2二聚体和多聚体的形成。形成凝胶状的粘蛋白包裹癌细胞团等病灶，并逐渐发展为弥漫的转移灶，形成腹膜假粘液瘤，粘液遍及腹膜内。由于此类型癌细胞被大量凝胶状的粘蛋白包裹，常规的药物递送方式使得药物难以抵达靶点，药物治疗效果差。并且在病人体内大量分布的腹腔粘蛋白使病人受到累害，在严重情形下，大量粘蛋白压迫脏器，导致肠梗阻并发症，危及病人生命。
慢性阻塞性肺病是一种慢性肺部疾病，是世界上第三大死因(2019，WTO)，肺部小气道的异常导致气流进出肺部受到限制。慢性阻塞性肺病成因包括长期暴露于有害气体和微粒，以及一些个人因素，如儿童时期影响肺部发育的事件及遗传因素。慢性阻塞性肺病会引起持续和渐进的呼吸道症状，包括呼吸困难、咳嗽和生成痰液。一些过程导致气道变窄。部分肺部可能会受到破坏，该疾病患者呼吸道粘液分泌异常，粘液阻塞气道，气道内壁出现炎症和肿胀。慢性阻塞性肺病有时也被称为“肺气肿”或“慢性支气管炎”。肺气肿通常指肺部气道末端的小肺泡受损。慢性支气管炎则指气道炎症引起的慢性咳嗽，同时伴有痰液产生。
粘液性卵巢癌是一种病因尚不明确，其起源多源于黏液上皮细胞，其导致患者双侧卵巢受累，卵巢表面受累，黏蛋白存在于细胞外、破坏性的间质浸润、结节性生长、卵巢门受累、血管受侵、印戒细胞以及广泛坏死等，90％以上的卵巢粘液性瘤的细胞内含有大量粘蛋白。
此外，包括粘液性结直肠癌和其他粘性性疾病等，均具有伴随粘液大量表达的病理性质。因此在治疗涉及粘蛋白的疾病中需要清除粘蛋白以为患者提供更好的结果。例如在腹膜假粘液瘤的治疗中，可通外科开腹手术去除粘液，但往往难以清除干净，且长期、多次的开创手术，对患者来说是一种负担，因此发展和使用了粘液溶解试剂治疗粘蛋白相关的疾病。上述试剂可通过物理、化学的方式分解破坏粘蛋白的结构，清除凝胶状结构，使得粘蛋白可以被轻易的吸取出体外，或被人体清除，或促进癌细胞靶向的药物更易于抵达靶细胞行使抗癌作用。临床上准备进行手术的积极患者腹腔内肿瘤广泛，且粘液较硬，导致脏器粘连严重，增加了手术难度和不良事件的发生率。因此，在手术前软化甚至溶解粘液，可以在一定程度上降低器官粘连程度，降低手术风险。
由此可见，粘液溶解试剂对治疗粘蛋白相关的疾病具有重要作用，因此需要提供一种新的能够更好地降解疾病相关粘蛋白的蛋白酶及其制剂。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本申请基于所发现的丝氨酸蛋白酶EatA的降解活性，提供了一种选择性降解粘蛋白的丝氨酸蛋白酶EatA，所述丝氨酸蛋白酶EatA能够有效降解粘液相关的疾病中的粘蛋白，将其施用到患者体内后能发挥丝氨酸蛋白酶EatA的粘液降解功能，因此能够较好地应用于粘液相关疾病的治疗中。
为此，本申请第一方面提供了一种选择性降解粘蛋白的丝氨酸蛋白酶，所述丝氨酸蛋白酶为丝氨酸蛋白酶EatA，其蛋白质包括具有丝氨酸蛋白酶EatA活性的乘客域(passenger domain)，所述乘客域的氨基酸序列为与SEQ ID NO.2具有至少90％的同一性的氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，所述乘客域的氨基酸序列为与SEQ ID NO.2具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
在一些优选的实施方式中，所述乘客域的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。SEQ ID NO.2的具体序列如下所示：
ATVNADISYQTFRDFAENKGAFIVGASNINIYDKNGVLVGVLDKAPMPDFSSATMNTGTLPPGDHTLYSPQYVVTAKHVNGSDIMSFGHIQNNYTVVGENNHNSLDIKIRRLNKIVTEVAPAEISSVGAVNGAYQEGGRFKAFYRLGGGLQYIKDKNGNLTPVYTNGGFLTGGTISALSSYNNGQMITAPTGDIFNPANGPLANYLNKGDSGSPLFAYDSLDKKWVLVGVLSSGSEHGNNWVVTTQDFLHQQPKHDFDKTISYDSEKGSLQWRYNKNSGVGTLSQESVVWDMHGKKGGDLNAGKNLQFTGNNGEIILHDSIDQGAGYLQFFDNYTVTSLTDQTWTGGGIITEKGVNVLWQVNGVNDDNLHKVGEGTLTVNGKGVNNGGLKVGDGTVILNQRPDDNGHKQAFSSINISSGRATVILSDANQVNPDKISWGYRGGTLDLNGNNVNFTRLQAADYGAIVSNNNKNKSELTLKLQTLNENDISVDVKTYEVFGGHGSPGDLYYVPASNTYFILKSKAYGPFFSDLDNTNVWQNVGHDRDKAIQIVKQQKIGESSQPYMFHGQLNGYMDVNIHPLSGKDVLTLDGSVNLPEGVITKKSGTLIFQGHPVIHAGMTTSAGQSDWENRQFTMDKLRLDAATFHLSRNAHMQGDISAANGSTVILGSSRVFTDKNDGTGNAVSSVEGSSIATTAGDQSYYSGNVLLENHSSLEVRENFTGGIEAYDSSVSVTSQNAIFDHVGSFVNSSLLLEKGAKLTAQSGIFTNNTMKIKENASLTLTGIPSVGKPGYYSPVTSTTEGIHLGERASLSVKNMGYLSSNITAENSAAIINLGDSNATIGKTDSPLFSTLMRGYNAVLQGNIMGPQSSVNMNNALWHSDRNSELKELKANDSQIELGVRGHFAKLRVKELIASNSVFLVHANNSQADQLNVTDKLQGSNNTILVDFFNKAANGTNVTLITAPKGSDENTFKAGTQQIGFSNITPEIRTENTDTATQWVLTGYQSVADARASKIATDFMDSGYKSFLTEVNNLNKRMGDLRD。
本申请中，由于所述丝氨酸蛋白酶EatA蛋白质中的乘客域正确折叠时就会具有丝氨酸蛋白酶EatA的活性(即选择性降解粘蛋白的活性)，所述活性由组氨酸-天冬氨酸-丝氨酸催化三联体形成。因此在一些具体实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶EatA即为仅具有乘客域的丝氨酸蛋白酶EatA-EatAp。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶EatA的蛋白质还包括N段的信号肽和C端的β桶状结构中的至少一种。
在一些实施方式中，具有所述乘客域和C端的β桶状结构的丝氨酸蛋白酶EatA的蛋白质氨基酸序列为与SEQ ID NO.3具有至少90％的同一性的氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，具有所述乘客域和C端的β桶状结构的丝氨酸蛋白酶EatA的蛋白质氨基酸序列为与SEQ ID NO.3具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
在一些优选的实施方式中，具有所述乘客域和C端的β桶状结构的丝氨酸蛋白酶EatA的蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。SEQ ID NO.3的具体序列如下所示：
ATVNADISYQTFRDFAENKGAFIVGASNINIYDKNGVLVGVLDKAPMPDFSSATMNTGTLPPGDHTLYSPQYVVTAKHVNGSDIMSFGHIQNNYTVVGENNHNSLDIKIRRLNKIVTEVAPAEISSVGAVNGAYQEGGRFKAFYRLGGGLQYIKDKNGNLTPVYTNGGFLTGGTISALSSYNNGQMITAPTGDIFNPANGPLANYLNKGDSGSPLFAYDSLDKKWVLVGVLSSGSEHGNNWVVTTQDFLHQQPKHDFDKTISYDSEKGSLQWRYNKNSGVGTLSQESVVWDMHGKKGGDLNAGKNLQFTGNNGEIILHDSIDQGAGYLQFFDNYTVTSLTDQTWTGGGIITEKGVNVLWQVNGVNDDNLHKVGEGTLTVNGKGVNNGGLKVGDGTVILNQRPDDNGHKQAFSSINISSGRATVILSDANQVNPDKISWGYRGGTLDLNGNNVNFTRLQAADYGAIVSNNNKNKSELTLKLQTLNENDISVDVKTYEVFGGHGSPGDLYYVPASNTYFILKSKAYGPFFSDLDNTNVWQNVGHDRDKAIQIVKQQKIGESSQPYMFHGQLNGYMDVNIHPLSGKDVLTLDGSVNLPEGVITKKSGTLIFQGHPVIHAGMTTSAGQSDWENRQFTMDKLRLDAATFHLSRNAHMQGDISAANGSTVILGSSRVFTDKNDGTGNAVSSVEGSSIATTAGDQSYYSGNVLLENHSSLEVRENFTGGIEAYDSSVSVTSQNAIFDHVGSFVNSSLLLEKGAKLTAQSGIFTNNTMKIKENASLTLTGIPSVGKPGYYSPVTSTTEGIHLGERASLSVKNMGYLSSNITAENSAAIINLGDSNATIGKTDSPLFSTLMRGYNAVLQGNIMGPQSSVNMNNALWHSDRNSELKELKANDSQIELGVRGHFAKLRVKELIASNSVFLVHANNSQADQLNVTDKLQGSNNTILVDFFNKAANGTNVTLITAPKGSDENTFKAGTQQIGFSNITPEIRTENTDTATQWVLTGYQSVADARASKIATDFMDSGYKSFLTEVNNLNKRMGDLRDSQGDAGGWARIMNGTGSGESGYRDNYTHVQIGADRKHELNGIDLFTGALLTYTDNNASSQAFSGKTKSLGGGVYASGLFESGAYFDLIGKYLHHDNRYTLNFASLGERSYTSHSLYAGAEIGYRYHMSENTWVEPQMELVYGSVSGKSFNWKDQGMQLSMKDKDYHPLIGRTGVDVGRAFSGDTWKVTVRAGLGYQFDLLANGETVLQDASGKKHFKGEKDSRMLMNVGTNVEVKDNMRFGLELEKSAFGRYNIDNSINANFRYYF*(终止密码子)。
在一些实施方式中，具有所述乘客域、N段的信号肽和C端的β桶状结构的丝氨酸蛋白酶EatA的蛋白质全长氨基酸序列为与SEQ ID NO.1具有至少80％的同一性的氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，具有所述乘客域、N段的信号肽和C端的β桶状结构的丝氨酸蛋白酶EatA的蛋白质全长氨基酸序列为与SEQ ID NO.1具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
在一些优选的实施方式中，具有所述乘客域、N段的信号肽和C端的β桶状结构的丝氨酸蛋白酶EatA的蛋白质全长氨基酸序列为与SEQ ID NO.1具有至少90％的同一性的氨基酸序列。
在一些更优选的实施方式中，具有所述乘客域、N段的信号肽和C端的β桶状结构的丝氨酸蛋白酶EatA的蛋白质全长氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。SEQ IDNO.1的具体序列如下所示：
MNKVFSLKYSFLAKGFIAVSELARRVSVKGKLKSASSIIISPITIAIVSYAPPSLAATVNADISYQTFRDFAENKGAFIVGASNINIYDKNGVLVGVLDKAPMPDFSSATMNTGTLPPGDHTLYSPQYVVTAKHVNGSDIMSFGHIQNNYTVVGENNHNSLDIKIRRLNKIVTEVAPAEISSVGAVNGAYQEGGRFKAFYRLGGGLQYIKDKNGNLTPVYTNGGFLTGGTISALSSYNNGQMITAPTGDIFNPANGPLANYLNKGDSGSPLFAYDSLDKKWVLVGVLSSGSEHGNNWVVTTQDFLHQQPKHDFDKTISYDSEKGSLQWRYNKNSGVGTLSQESVVWDMHGKKGGDLNAGKNLQFTGNNGEIILHDSIDQGAGYLQFFDNYTVTSLTDQTWTGGGIITEKGVNVLWQVNGVNDDNLHKVGEGTLTVNGKGVNNGGLKVGDGTVILNQRPDDNGHKQAFSSINISSGRATVILSDANQVNPDKISWGYRGGTLDLNGNNVNFTRLQAADYGAIVSNNNKNKSELTLKLQTLNENDISVDVKTYEVFGGHGSPGDLYYVPASNTYFILKSKAYGPFFSDLDNTNVWQNVGHDRDKAIQIVKQQKIGESSQPYMFHGQLNGYMDVNIHPLSGKDVLTLDGSVNLPEGVITKKSGTLIFQGHPVIHAGMTTSAGQSDWENRQFTMDKLRLDAATFHLSRNAHMQGDISAANGSTVILGSSRVFTDKNDGTGNAVSSVEGSSIATTAGDQSYYSGNVLLENHSSLEVRENFTGGIEAYDSSVSVTSQNAIFDHVGSFVNSSLLLEKGAKLTAQSGIFTNNTMKIKENASLTLTGIPSVGKPGYYSPVTSTTEGIHLGERASLSVKNMGYLSSNITAENSAAIINLGDSNATIGKTDSPLFSTLMRGYNAVLQGNIMGPQSSVNMNNALWHSDRNSELKELKANDSQIELGVRGHFAKLRVKELIASNSVFLVHANNSQADQLNVTDKLQGSNNTILVDFFNKAANGTNVTLITAPKGSDENTFKAGTQQIGFSNITPEIRTENTDTATQWVLTGYQSVADARASKIATDFMDSGYKSFLTEVNNLNKRMGDLRDSQGDAGGWARIMNGTGSGESGYRDNYTHVQIGADRKHELNGIDLFTGALLTYTDNNASSQAFSGKTKSLGGGVYASGLFESGAYFDLIGKYLHHDNRYTLNFASLGERSYTSHSLYAGAEIGYRYHMSENTWVEPQMELVYGSVSGKSFNWKDQGMQLSMKDKDYHPLIGRTGVDVGRAFSGDTWKVTVRAGLGYQFDLLANGETVLQDASGKKHFKGEKDSRMLMNVGTNVEVKDNMRFGLELEKSAFGRYNIDNSINANFRYYF*(终止密码子)。
本申请中，所述丝氨酸蛋白酶EatA为来源于肠杆菌科的产肠毒素大肠杆菌的自转运蛋白，其全长蛋白质包括N段的信号肽，C端的β桶状结构以及蛋白链中间的乘客域，所述乘客域具有丝氨酸蛋白酶活性，所述活性由组氨酸-天冬氨酸-丝氨酸催化三联体形成；所述肠杆菌科的血清型为O78:H11，所述产肠毒素大肠杆菌的菌株为H10407菌株。本申请中，所述丝氨酸蛋白酶EatA定义为：包含具有丝氨酸蛋白酶活性的乘客域片段EatA-EatAp如SEQ ID NO.2所示蛋白，全长的丝氨酸蛋白酶EatA如SEQ ID NO.1序列所示的蛋白，以及无信号肽的蛋白酶片段如SEQ ID NO.3序列所述蛋白。
本申请中，所述丝氨酸蛋白酶EatA的蛋白在以大肠杆菌为表达载体时，EatA全长是膜蛋白，会通过自转运的方式将中间的部分(乘客域)转移到膜外，并通过自我剪切从而实现乘客域释放，释放在培养基中的蛋白即是具有丝氨酸蛋白酶活性EatA的目标蛋白(仅具有乘客域的丝氨酸蛋白酶EatA-EatAp)。
粘液溶解试剂是可影响和作用于粘蛋白的含有蛋白酶的试剂，其通过引起对糖蛋白、粘蛋白的蛋白水解实现凝胶粘液的降解。丝氨酸蛋白酶EatA是肠杆菌科丝氨酸自转运蛋白家族的一员，已经作为预防腹泻性肠杆菌引起的严重腹泻的抗原，通过注射引发免疫反应产生抗体。本申请的发明人通过研究发现，丝氨酸蛋白酶EatA在体外情况下具有相当长的稳定期，并可破坏粘蛋白的凝胶状物理状态形成液态。因此本申请的丝氨酸蛋白酶EatA可用于制备粘液溶解试剂。
应当说明的是，通过本领域常规和已知的搜索办法，可以在其他物种和菌种中寻找丝氨酸蛋白酶EatA的同源物，同源物的序列相似性可以通过常规算法确定，例如，在对比两个蛋白的相似性时，可以通过使用被广泛使用的blastN和blastX程序进行计算，以上程序的算法来源于Karlin和Altschul，被允许引入少量空位以实现两个核酸或蛋白分子间序列同一性百分比的最佳拟合。因此基于以上，本申请所述的丝氨酸蛋白酶EatA还可以被与其氨基酸序列具有高度同一性(至少80％的同一性)的同源物替代。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶EatA降解粘蛋白时最佳的反应条件为：反应温度为34～37℃，pH值为7～8，反应系数为1～100万。例如在一些具体实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶EatA降解粘蛋白时的反应温度为37℃，pH值为7.2～7.4(pH在7.2到7.4更符合人体环境，特别是组织和腹腔pH)，反应系数为100～10000。
本申请中，当将反应条件控制在上述范围内时，体外实验中所述丝氨酸蛋白酶EatA对粘蛋白的降解效果最佳。
由于本申请所降解的粘蛋白是凝胶样的半固体，初始不溶于水，但存在缓慢水化作用，本申请实施例中所使用的粘蛋白与水的相对平均密度接近1.0，因此我们在进行浓度计量时做以下定义，反应系数：即在固定的1000uL(1，y)反应体系中具有1000uL(1，x)粘蛋白情况下，粘蛋白密度为1(1g/mL，ρ)，在体系中含有质量浓度总计1ug/mL(1ug，z)的丝氨酸蛋白酶EatA，反应在37℃下孵育10小时后，粘蛋白溶解值w＝100％表示降解完全，(w，表示被溶解的粘液质量的百分比)，此时反应系数为1，即反应系数计算公式为：公式1：------------------反应系数
y>x，y～δ：即在酶和底物粘蛋白质量比已知的情形下，反应体系的体积不能超过其对应的反应系数，且反应体系体积数值应当始终大于粘蛋白的体积数值。
因此可以预见的所使用的反应系数范围为1～100万，例如1～100、100～1000、1000～10000、10000～10万、10万～100万等。
以上反应系数的构建基于逻辑，由于粘蛋白在大体积的水溶液中时会自发的发生水合作用，并缓慢溶解，因此为了降低水合的作用在酶降解中的影响，因此反应系数指的是在添加丝氨酸蛋白酶EatA后10小时，可使得全部粘液降解为可溶性液体时，反应体系对底物粘蛋白的非线性作用强度，不能直接代表酶活力。其数值与反应体积、底物粘蛋白的量以及酶本身的质量浓度和活力、反应时间有关。由于粘蛋白在不同病理下具有不同密度，因此为计算统一使用了其体积作为标识刻度。
应当注意，实施例中给予的反应系数作为优选方案，并不在于指明和限定EatA降解粘液/粘蛋白时的计量和浓度。
在一些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶EatA具有特异性的丝氨酸蛋白酶活性，用于选择性的降解粘蛋白。
本申请中，所述丝氨酸蛋白酶EatA能够特异性的对粘蛋白进行降解，对非目标蛋白(例如粘液中的杂蛋白)不具有降解功能。在先前研究中，EatA不降解明胶、乳铁蛋白和CD43等常见人体糖蛋白以及BSA和BSM等非人源蛋白；本申请的发明人的实验结果进一步表明，EatA不降解临床来源的粘蛋白中含有的杂蛋白，仅仅对凝胶样粘蛋白进行选择性降解，使其从半固态凝胶样转化为溶液，易于被吸取转移或可能被机体吸收。因此本申请中的丝氨酸蛋白酶EatA能较好地用于降解粘液相关疾病中的粘蛋白，且不对机体中的其他蛋白带来损害。
在一些实施方式中，被降解的所述粘蛋白为存在于腹膜假粘液瘤粘液、慢性阻塞性肺病粘液、粘液型卵巢癌粘液、粘液型结直肠癌粘液和阑尾癌粘液中的至少一种；优选存在于腹膜假粘液瘤粘液中。
本申请中，所述丝氨酸蛋白酶EatA所降解的粘蛋白并不是经过变性纯化的粘蛋白(如MUC2)，而是存在于疾病相关粘液中的粘蛋白。与经过变性纯化的粘蛋白(如MUC2)不同的是，存在于疾病相关粘液中的粘蛋白参与和组织形成了粘液，特别是在PMP中形成了凝胶样粘液，MUC2与本身和其他粘蛋白家族分子形成大的聚合体，并且在疾病中粘蛋白家族有不同的修饰模式。因此，与经过变性纯化的粘蛋白相比，存在于疾病相关粘液中的粘蛋白结构更为复杂，降解也更为困难。例如，弹性蛋白酶和胰酶，均可降解纯化至SDS-PAGE级别的粘蛋白分子，但对形成粘液后的粘蛋白降解效率低下。而本申请所述的丝氨酸蛋白酶EatA能够高效降解粘液相关疾病中的粘蛋白，进而能够在表达上述粘蛋白特别是表达MUC2型粘蛋白的粘液相关疾病如腹膜假粘液瘤中进行应用，以降解粘蛋白，消除凝胶性质，实现特定的治疗作用。
本申请中，特定的治疗作用包括但不限于使粘蛋白易于清除，暴露癌细胞或者病灶，促进其他化疗药物等实现作用，减轻患者受累的形式。
在将本申请中的丝氨酸蛋白酶EatA用于治疗腹膜假粘液瘤等粘液性疾病时，由于本申请所述丝氨酸蛋白酶EatA具有长且稳定的活性，因此输入人体腹腔后，具有长效持久的粘液降解活性，在微创甚至无创的条件下消解减少大量粘蛋白形成的凝胶样固体的质量和体积，相对于开腹手术，更易于执行，侵入性更低，避免了开腹手术可能带来的感染和对病人的损伤。丝氨酸蛋白酶EatA对粘液的降解作用可以通过输入到患者体内特定病理区域实现，输入方式可根据不同的疾病类型和不同的目标区域实现。具体的实例为，在覆膜假粘液瘤类型的疾病中，可通过使用注射的方式实现，直接通过注射特定浓度的EatA蛋白酶到腹腔内、或者肿瘤或癌性囊肿内，从而实现腹腔内或靶区域粘蛋白的降解，最终实现一定的治疗效果。这种治疗效果可以是粘蛋白所处的环境中的粘蛋白质量的下降，以及同时使患者受累情形的改善。
值得注意的是，本申请中所述丝氨酸蛋白酶EatA对粘液相关疾病的粘液进行降解时，降解后的粘液为与水类似的液体，消除了粘液的凝胶性质，进而使得患者病灶区的粘液易于被清除，可通过针头或特定的吸取器械从体内吸出，并可促进其他治疗药物如抗癌药物直达病灶和癌细胞，从而提高治疗疗效，减少病人的受累和负担，提高生存质量。与本领域现有的降解粘蛋白的制剂相比(例如包括菠萝蛋白酶的制剂)，本申请中所述丝氨酸蛋白酶EatA具有更优的性状，表现为更优的选择性，不降解非目标蛋白，具有更高效的降解效率和更符合降解预期的降解产物，如更易于被移液器械吸取。
本申请第二方面提供了一种药物组合物，其包括如本申请第一方面所述的丝氨酸蛋白酶。
在一些实施方式中，所述药物组合物还包括其他试剂，所述其他试剂选自化疗和放疗试剂、酶和化学盐试剂中的至少一种。
本申请中，丝氨酸蛋白酶EatA可以同其他治疗效果的试剂中的一种或多种组合使用，例如顺铂和吉西他滨等常见的细胞毒性化疗药物，使得药物可以更直接有效的靶向癌细胞，提高化疗有效性。另外，丝氨酸蛋白酶EatA发挥其粘液降解功能是其受到PMSF抑制的蛋白酶活性，因此在具体实施中，可以配合一些具有其他粘蛋白糖链降解活性的酶和一些化学盐试剂共同使用。
在一些具体实施方式中，所述化疗和放疗试剂选自吉西他滨、顺铂、亚得里亚霉素、氟尿嘧啶、紫杉酮、紫杉醇和奥沙利柏中的至少一种；所述酶选自N-乙酰半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、唾液酸酶和特异性的内切粘蛋白酶中的至少一种；所述化学盐试剂选自碳酸氢钠、羧甲半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸和氨溴索中的至少一种。
本申请第三方面提供了一种如本申请第一方面所述的丝氨酸蛋白酶或者第二方面所述的药物组合物在制备用于治疗粘液相关疾病的药物，和/或用于提升粘液相关疾病治疗效果和病患生存质量的药物中的应用。
由于丝氨酸蛋白酶EatA具有的蛋白酶活性使其可作为治疗粘液相关的疾病的药物或药物成分，因此本申请提供了一种丝氨酸蛋白酶EatA在粘液相关疾病如腹膜假粘液瘤、慢性阻塞性肺疾病方向的新用途。通过向上述粘液相关疾病的病灶区，如腹腔和呼吸道施用有效剂量的丝氨酸蛋白酶EatA，能够导致病灶区粘蛋白的降解，或者凝胶样蛋白量减少或消减使得大量粘蛋白可易于被移除，进而达到治疗粘液相关疾病的目的。进一步地，通过施用有效剂量的丝氨酸蛋白酶EatA降解粘蛋白后，消除了粘液对癌细胞和病灶的包裹和隔离，使得细胞毒性的药物增强效用，促进其他药物如化疗药物顺铂、吉西他滨等对病灶和对癌细胞的可及性，提升粘液相关疾病治疗效果和病患生存质量。因此本申请第一方面所述的丝氨酸蛋白酶或者第二方面所述的药物组合物能够应用在制备用于治疗粘液相关疾病的药物，和/或用于提升粘液相关疾病治疗效果和病患生存质量的药物中，包括第一方面所述的丝氨酸蛋白酶或者第二方面所述的药物组合物的药物，通过降解粘蛋白及破坏粘蛋白形成的凝胶样蛋白，使其易于被清除，并可促进其他治疗药物如抗癌药物直达病灶和癌细胞，从而提高治疗疗效，减少病人的受累和负担，提高生存质量。
本申请中，上述粘蛋白相关疾病，除了包括世界卫生组织所定义的粘液癌：由含有胞浆内粘蛋白的胃肠型细胞组成的恶性肿瘤外，还可被认为是与正常健康条件下的细胞、组织和器官由于机能或者环境改变，导致其粘液表达相关的调控不正常，导致粘液大量产生形成病理组织或者粘蛋白分泌后包裹了细胞、组织和器官外部，阻挡了正常功能的生理功能的实现，如免疫识别，或者治疗药物的浸润和触及。
在一些实施方式中，所述粘液相关疾病选自慢性阻塞性肺病、粘液型结直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、阑尾癌、腹膜癌、前列腺癌、结直肠癌、小肠癌、淋巴癌、卵巢癌、腺癌和哮喘中的至少一种；所述卵巢癌包括粘液型卵巢癌，所述腹膜癌包括腹膜假粘液瘤。所述阑尾癌例如可以为粘液型阑尾腺癌等。
本申请中的丝氨酸蛋白酶EatA在研究中被揭露其对覆膜假粘液瘤来源的粘液具高效而高专一性的降解活性，同时腹膜假粘液瘤相关的粘蛋白在其他一些粘液性疾病中也有与疾病类型相关联的大量或少量的表达。可用以治疗的腹膜假粘液瘤多是因为来自结直肠、阑尾和卵巢的癌细胞发生转移到腹腔，肿瘤细胞大量分泌粘液而形成的假粘液瘤。这些癌细胞来源是多样的，可起源于结直肠、直肠、胰腺、乳腺、肺、胆囊和卵巢，但大量的临床报告显示其来源于阑尾。这些肿瘤细胞向腹腔内大量分泌粘液，难以降解，最终引起大量累积，累害其他脏器，增加发病严重程度和死亡率。常规的开腹手术移除粘蛋白方法，常由于治疗的不彻底和疾病的渐进性，导致这种手术需要多次进行，导致发病率增加和死亡。
上述粘液相关性疾病粘液的定义中，有关腹膜假粘液瘤中的粘液是指在腹膜表面形成肿瘤或癌后，以MUC2、MUC5AC和MUC5B为主要成分而形成的具有软、中硬和硬质三种表型形式的具有无色透明至琥珀色的果冻样半固体凝胶物质，其特征是腹腔内肿瘤性粘蛋白分泌细胞在腹膜表面增殖产生粘液性腹水；粘液性卵巢癌的粘液是指发生于卵巢的肿瘤或癌在病理区分泌后形成的白色至琥珀色，部分粘液呈巧克力样棕色的半透明至透明具有极高粘稠度，其粘液粘度在数千至万mPa·s的糖浆样半固体或流体，特征是附着在卵巢粘液癌细胞或腺体囊表明的大量包裹性的粘蛋白为主的粘性混合物；慢性阻塞性肺炎的粘液，也称为痰液，是在肺部或呼吸道上皮/腺细胞分泌的粘液物质，其特征为粘蛋白为主的粘液附着在呼吸道和肺气管表面，形成粘液，而慢性阻塞性肺炎与正常生理条件的痰液不同在于具有更高的含量和粘性，常常导致肺阻塞和气管阻塞。
通常，所述药物的给药途径应当按照接受体的身体特征，包括疾病类型和健康状况共同考量的方式实施，这对于临床工作者和相关的技术人员来说是易于得出结论的。在一些实施方式中，所述药物的给药途径选自注射给药、口服给药和喷雾给药中的任意一种。
本申请中上述的给药途径中，注射给药例如可以为腹膜内注射给药，口服给药例如为速溶片剂，喷雾给药例如以气溶胶的方式鼻腔或口腔吸入。特别的，作为注射给药方式，药物的承载方式可以是生理盐水、磷酸盐缓冲液、Tris-HCI缓冲液、林格式试剂、葡萄糖注射缓冲液和水-丙二醇溶液等在药学上可接受的载体或者赋形剂。用于制备肠胃外给药和腹腔给药的组合物和药物的方法对本领域技术人员来说是轻松可变的。
本申请中，上述药物的有效剂量应当是取决于多种因素的，比如被应用的粘蛋白相关的疾病类型和粘液的量、预计应当治疗的时间共同决定。例如，适当的剂量可取决于多种因素，包括但不限于个体的物理性质，例如年龄、体重和性别；该药物是否被作为单一试剂使用或作为佐剂疗法使用；被治疗的疾病或病症的进展，即病理状态；以及对本领域普通技术人员显而易见的其他因素。
本申请的药物可适用于任何患者和个体，在一些实施方式中，该患者为哺乳类，最为典型的个体当是人类患者。但显然其他哺乳类个体在适用性允许的情况下也将从本发明中收益，因此，这些患者和个体可以是小鼠、大鼠、猫、狗、熊、牛、马和其他的具有治疗价值的哺乳动物。
本申请的有益技术效果：本申请所述丝氨酸蛋白酶为丝氨酸蛋白酶EatA，所述丝氨酸蛋白酶EatA能够选择性降解疾病相关粘蛋白，且具有长期稳定性，因此所述丝氨酸蛋白酶和包括所述丝氨酸蛋白酶的药物组合物能够作为药物或药物有效成分，用于治疗分泌粘蛋白的癌症如腹膜假粘液瘤(PMP)和涉及粘蛋白的其他疾病中。
附图说明
图1为实施例1对照组中在凝胶样粘蛋白中未添加EatA后的粘蛋白降解结果图。
图2为实施例1实验组中在凝胶样粘蛋白中添加EatA后的粘蛋白降解结果图。
图3为实施例2中菠萝蛋白酶(BroM)与丝氨酸蛋白酶EatA对粘蛋白进行降解的结果图。
图4为实施例3中丝氨酸蛋白酶EatA对粘蛋白进行降解的温度曲线图。
图5为实施例3中丝氨酸蛋白酶EatA对粘蛋白进行降解的pH曲线图。
图6为实施例3中丝氨酸蛋白酶EatA对粘蛋白进行降解的时间曲线图。
图7为实施例4中菠萝蛋白酶(BroM)与丝氨酸蛋白酶EatA对粘蛋白内部混杂的杂蛋白的降解结果图。
图8为实施例5中实验组(mucus粘液+EatA)、不添加酶对照组(mucus+PBS)和菠萝蛋白酶实验组(mucus粘液+菠萝蛋白酶)中最终剩余的粘蛋白量的结果图。
图9为实施例5中实验组(mucus粘液+EatA)、不添加酶对照组(mucus+PBS)和菠萝蛋白酶实验组(mucus粘液+菠萝蛋白酶)中小鼠的腹腔检查结果图。
图10为实施例6中丝氨酸蛋白酶EatA对来自卵巢粘液癌粘液以及粘液型阑尾腺癌粘液进行降解的箱线图。
图11为实施例6中丝氨酸蛋白酶EatA对来自粘液型阑尾腺癌(MAA)粘液降解的结果示意图。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
由于不同来源的粘蛋白甚至是粘液疾病相关的粘蛋白具有不同的表达模式和翻译后的修饰，因此本申请中使用了临床病理来源的不同粘蛋白及其混合物。优选的，使用了临床腹膜假粘液瘤来源的粘蛋白。本申请首先收集了来自于临床腹膜假粘液瘤患者腹腔内的凝胶状粘蛋白，通过30～100％硫酸铵沉淀，蛋白沉淀后挑选去除粘蛋白收集过程中可能掺杂的细胞和组织碎片、脂肪组织等，并通过100KDa透析袋透析过滤，通过使用硫酸根检测试纸，确认透析液和透析袋内侧硫酸根浓度低于200mg/L，结束透析，可见凝胶状粘蛋白，收集该样品，作体外实验的底物，检查丝氨酸蛋白酶EatA对粘蛋白的降解能力。部分实例直接使用了从临床病人腹腔内取出的未进行纯化处理的粘蛋白进行实验。
实施例1
在500ul反应体系中，准确称量0.30g凝胶状粘蛋白，在实验组中加入约80ug的丝氨酸蛋白酶EatA(反应系数是133)，对照组中不添加丝氨酸蛋白酶EatA，然后实验组和对照组均在37℃孵育3h，孵育结束后，对粘蛋白的降解情况进行观察；其中对照组和实验组中的粘蛋白降解结果分别如图1和图2所示。
从图1和图2可知，未加丝氨酸蛋白酶EatA的对照组在3h后仍具有块状的凝胶状蛋白分子，不能使用移液枪头吸取；与对照组相比，加入丝氨酸蛋白酶EatA的实验组出现了明显的凝胶状粘蛋白的降解，实验组的凝胶状粘蛋白降解为可被枪头吸取的类似于水状的溶液，且体视显微镜下块状凝胶消失。
实施例2
菠萝蛋白酶作为广谱的蛋白酶，具有广泛的降解活性，能够降解MUC2粘蛋白，在消炎甚至粘液降解方面有一定应用。基于此，本实施例对比了相同底物/酶比的菠萝蛋白酶(BroM)与丝氨酸蛋白酶EatA对凝胶状粘蛋白的降解活性。
准确称量0.10g粘蛋白置于500uL磷酸盐缓冲液(PBS)反应体系中，分别加入两种酶(菠萝蛋白酶(BroM)与丝氨酸蛋白酶EatA)于37℃进行反应，反应6h后结束。将所有产物倒置于40um细胞过滤网，从滤网另一侧使用吸水纸吸去液体，小心反转凝胶状产物三到四次，尽可能吸取流动的液体，称量剩余的凝胶状粘蛋白的质量，上述实验每个取样点使用三个样本重复，结果如图3所示。从图3可知，6小时内随着EatA酶的质量浓度增加，凝胶状粘蛋白的质量损失增加，剩余量快速减少，即凝胶状粘蛋白的降解；在添加40ug EatA时，凝胶状粘蛋白质量的损失平均为90.33％(以初始的0.1g计算)，几乎全部降解；另外由于凝胶状粘蛋白的吸水作用，导致在初始时刻其质量增加。而菠萝蛋白酶在该底物/酶比条件下，凝胶状粘蛋白吸水后质量增加，随着BroM酶浓度增加，其质量损失为负值，表明降解效率低下，凝胶状粘蛋白降解极少。
实施例3
本实施例通过获取丝氨酸蛋白酶EatA降解粘蛋白时在pH依赖、温度依赖和不同作用时间下的降解曲线，进而表征了丝氨酸蛋白酶EatA降解粘蛋白时的工作环境。
实验过程中，每个单一反应均准确称量了0.10g凝胶样粘蛋白，氨酸蛋白酶EatA添加20ug，反应均在500uL溶液体系中进行，剩余凝胶状粘蛋白的称量方法与实施例2一致。对照组除不添加丝氨酸蛋白酶EatA外，在同样工况下进行，每个组均设置三个反应作为统计学重复。由于凝胶状粘蛋白的水合性质，因此在溶液中时会吸水膨胀，导致最终称量时，即使对照组也出现了一定的重量增加。
其中，对温度梯度进行的实验在pH＝7.1的生理盐水中进行，结果如图4；在对pH进行实验时，采用的反应体系为以0.9％生理盐水为基础配置成的具有不同pH值的溶液体系，反应温度为37℃，结果如图5；上述两实验反应时间为6h。
在有关降解时间的实验中，基于温度曲线和pH曲线选择了在pH＝7.2～7.4的PBS缓冲液中于37℃进行，结果见图6。
从图4可知，未添加酶的对照组，随着温度的改变，孵育结束后，对照组中凝胶状粘蛋白质量变化不大，而添加酶的实验组，凝胶状粘蛋白均降解，且在34～37℃时具有最大酶活。由于对照组在41℃以上也表现一定的(质量损失)降解趋势，可能表明该温度对蛋白的作用，尚不能表明该阶段的降解效率增加仅与酶有关。
从图5可知，不同的pH条件下丝氨酸蛋白酶EatA对凝胶状粘蛋白的降解表明，丝氨酸蛋白酶EatA对凝胶状粘蛋白的降解在pH＝8附近具有最大的降解效率。而对照组在不同pH下其质量损失几乎不变。
从图6可知，加入丝氨酸蛋白酶EatA后，凝胶状粘蛋白的质量损失先减小到负值，表明其吸水，使得其质量增加，随着时间的增长，质量损失增加，并在10.5小时时质量损失达到80％，表明丝氨酸蛋白酶EatA对底物凝胶状粘蛋白的降解随着孵育时间增加持续作用。
综上，丝氨酸蛋白酶EatA降解凝胶状粘蛋白时较优的工作环境为：反应温度为34～37℃，pH值7～8。
实施例4：丝氨酸蛋白酶EatA降解的特异性
将临床患者来源的未经处理的粘蛋白，经过简单清理去除细胞组织。准确称取上述粘蛋白0.20g置于1mL的PBS溶液中，加入3-4颗直径1mm的磁珠，于-30℃冷冻震荡均质，破坏粘蛋白的凝胶样形态，并释放凝胶样粘蛋白内部混杂的患者来源的杂蛋白。取均质后的粘蛋白溶液100uL，分别加入2～10ug蛋白酶(菠萝蛋白酶或者丝氨酸蛋白酶EatA)在200uL反应体系中进行反应，反应6小时后分别取样进行SDS-PAGE检测，分析破碎后的总蛋白，该总蛋白为患者腹腔/腹腔粘蛋白中的患者来源的杂蛋白，结果如图7所示。
从图7可知，添加BroM(菠萝蛋白酶)的组中，在数微克的BroM酶添加量下，病人腹腔来源的杂蛋白出现随酶添加量的增加而变化的降解趋势，也即在菠萝蛋白酶(BroM)的添加组中，杂蛋白出现降解。而对照组(中间三条孔标记为“0”的条带)与添加丝氨酸蛋白酶EatA的蛋白条带一致，说明添加丝氨酸蛋白酶EatA在降解粘蛋白过程中并不降解这些腹腔来源的蛋白质，表明其在降解粘蛋过程中具有专一性。
实施例5：丝氨酸蛋白酶EatA体内降解粘蛋白的能力
基于体外实验的良好效果，本实施例开展了动物体内实验，以证明丝氨酸蛋白酶EatA对粘蛋白的体内降解能力。
实验中包括20只6-8周龄的C57雄性小鼠，小鼠实验共计设置5个组别，分别为实验组(mucus粘液+EatA，5只)，不添加酶对照组(mucus粘液+PBS，5只)，菠萝蛋白酶实验组(mucus粘液+菠萝蛋白酶，5只)，阴性假手术组(仅做开创手术，不添加粘蛋白和酶，3只)，参考组(开创手术，添加EatA蛋白酶，2只)。参考前人研究的大鼠实验和腹膜假粘液瘤患者腹腔内粘蛋白的参考平均质量以及体外实验的反应系数，小鼠实验中的腹腔允许最大注射量2mL，在小鼠实验中埋入了0.30g经过PBS缓冲液简单清洗的人类患者来源的凝胶状粘蛋白，观察和确认小鼠生活状态。24h后分别注射等质量的溶解于PBS的菠萝蛋白酶和丝氨酸蛋白酶EatA，80ug。经过48小时后，对小鼠进行牺牲，剖腹(剖腹后的腹腔检查结果如图9所示)并取出小鼠体内全部凝胶状粘蛋白，使用实施例2所述方法进行称量，统计并比较添加凝胶状粘蛋白作为底物的三个组别(实验组(mucus粘液+EatA)、不添加酶对照组(mucus+PBS)和菠萝蛋白酶实验组(mucus粘液+菠萝蛋白酶))中最终剩余的凝胶状粘蛋白量，结果见图8。
从图8可知，添加丝氨酸蛋白酶EatA的小鼠组中凝胶状粘蛋白具有最小的剩余质量，表明凝胶状粘蛋白降解最多，降解效率为78％(按照初始接种量0.30g计算，在腹腔内，凝胶状粘蛋白仍会吸水导致其质量增加)。与此对比，BroM组和对照组中的凝胶状粘蛋白质量剩余仍大于0.30g，因此未能计算其降解效率。说明丝氨酸蛋白酶EatA在小鼠内对凝胶状粘蛋白的降解远远优于BroM。
图9中的红框表明了凝胶状粘蛋白在移植入小鼠腹腔后，随着小鼠运动转移到不同的腹腔位置，并显示其最终降解后的体积，与图8可相对应。
实验过程中记录了所有组别在实验前后的体重变化，结果对比无差异，牺牲小鼠后的腹腔检查也未见异常。注射丝氨酸蛋白酶EatA的小鼠从实验开始，已存活100天以上，未见不良反应，与未注射组对比，小鼠行为和体重均无异常。
实施例6：丝氨酸蛋白酶EatA对粘液型卵巢癌(MOC)粘液、粘液型阑尾腺癌(MAA)粘液的降解
本实施例采用丝氨酸蛋白酶EatA对来自粘液型卵巢癌的粘液和粘液型阑尾腺癌的粘液进行了降解实验。分别在试管中直接称取来自临床来源的的上述两类新粘液癌粘液0.50mL，加入50ug溶解在0.25mL的PBS缓冲液中的EatA丝氨酸蛋白酶，然后在总的750uL反应体系中37℃，600rpm孵育20h。每种类型的粘液癌粘液样本设置了仅添加等体积PBS的对照组，共计四组实验，每组实验均设置三个重复。孵育后的实验样品在安东帕流变仪下进行粘度测量，探头型号为pp25，样本间隔0.45mm。每个样品在经历20s，剪切频率为5rad/s的预剪切后，在10rad/s的剪切频率下，通过在60s内以每隔5s的周期读取了共计12个数据，每组样品共计获得36个样本点数据。实验结果以箱线图展示了每组样本所有数据的统计结果，如图10所示。
从图10可知，实验中临床来源的粘液型卵巢癌粘液的粘度平均约为2000mPa·s，添加丝氨酸蛋白酶EatA孵育后其粘度降低为约670mPa·s；而粘液型阑尾腺癌MAA临床来源的粘液粘度约为1200mPa·s，加入粘蛋白后其粘度降低为约7mPa·s左右。由此可见，以上两种不同癌症来源的粘液在反应后粘度大幅度降低，丝氨酸蛋白酶EatA降粘效果极其明显。
图11进一步展示了来自粘液型阑尾腺癌(MAA)粘液降解的结果示意图。由于该样本的阑尾癌粘液透明，可通过检验溶液均一性质检测其粘度降低的性状。由孵育结束后的结果可知，加入丝氨酸蛋白酶孵育后的粘液样本溶液变得均一，样品中不受EatA降解的杂质经过静置后沉积到底部。而对照组还保持高度的凝胶状粘液，内部的杂质等不能沉积到底部。
同时，本申请中的丝氨酸蛋白酶EatA在申请人的相关研究结果中被证明，对慢性肺阻塞肺炎病人粘液(痰液)，粘液性结肠癌等粘液等也具有一定降解效果。根据以上实例，本申请的丝氨酸蛋白酶具有良好的医学利用前景，与市场目前其他药物和待成药制剂相比具有极大优势。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种选择性降解粘蛋白的丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶为丝氨酸蛋白酶EatA，其蛋白质包括具有丝氨酸蛋白酶EatA活性的乘客域，所述乘客域的氨基酸序列为与SEQ ID NO.2具有至少90%的同一性的氨基酸序列；优选为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶EatA的蛋白质还包括N段的信号肽和C端的β桶状结构中的至少一种。
3. 根据权利要求2所述的丝氨酸蛋白酶，其特征在于，具有所述乘客域和C端的β桶状结构的丝氨酸蛋白酶EatA的蛋白质氨基酸序列为与SEQ ID NO.3具有至少90%的同一性的氨基酸序列；优选为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
4. 根据权利要求2所述的丝氨酸蛋白酶，其特征在于，具有所述乘客域、N段的信号肽和C端的β桶状结构的丝氨酸蛋白酶EatA的蛋白质全长氨基酸序列为与SEQ ID NO.1具有至少80%的同一性的氨基酸序列；优选为与SEQ ID NO.1具有至少90%的同一性的氨基酸序列；更优选为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的丝氨酸蛋白酶，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶EatA具有特异性的丝氨酸蛋白酶活性，用于选择性的降解粘蛋白。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的丝氨酸蛋白酶，其特征在于，被降解的所述粘蛋白为存在于腹膜假粘液瘤粘液、慢性阻塞性肺病粘液、粘液型卵巢癌粘液、粘液型结直肠癌粘液和阑尾癌粘液中的至少一种；优选存在于腹膜假粘液瘤粘液中。
7.一种药物组合物，其包括如权利要求1-6中任意一项所述的丝氨酸蛋白酶；优选地，所述药物组合物还包括其他试剂，所述其他试剂选自化疗和放疗试剂、酶和化学盐试剂中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述化疗和放疗试剂选自吉西他滨、顺铂、亚得里亚霉素、氟尿嘧啶、紫杉酮、紫杉醇和奥沙利柏中的至少一种；所述酶选自N-乙酰半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、唾液酸酶和特异性的内切粘蛋白酶中的至少一种；所述化学盐试剂选自碳酸氢钠、羧甲半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸和氨溴索中的至少一种。
9.一种如权利要求1-6中任意一项所述的丝氨酸蛋白酶或者权利要求7或8所述的药物组合物在制备用于治疗粘液相关疾病的药物，和/或用于提升粘液相关疾病治疗效果和病患生存质量的药物中的应用；
优选地，所述粘液相关疾病选自慢性阻塞性肺病、粘液型结直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、阑尾癌、腹膜癌、前列腺癌、结直肠癌、小肠癌、淋巴癌、卵巢癌、腺癌和哮喘中的至少一种；所述卵巢癌包括粘液型卵巢癌，所述腹膜癌包括腹膜假粘液瘤。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物的给药途径选自注射给药、口服给药和喷雾给药中的任意一种；优选地，所述注射给药为腹膜内注射给药。
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