CN115778967B - 人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D联合五味子乙素在治疗心肌损伤中的应用 - Google Patents
人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D联合五味子乙素在治疗心肌损伤中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D联合五味子乙素在治疗心肌损伤中的应用。实验证明，人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素与抗肿瘤药物DOX联用，在治疗由抗肿瘤药物DOX引起的心肌损伤的同时不影响DOX对肿瘤细胞的杀伤。因此，人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D联合五味子乙素可以预防和/或治疗抗肿瘤药物引起的心肌损伤。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D联合五味子乙素在治疗心肌损伤中的应用。
背景技术
蒽环类药物被认为是最有效的抗肿瘤药物之一，其抗瘤作用强、疗效显著。然而，已有大量研究表明，患者在接受长时间蒽环类药物化疗后会发生慢性心力衰竭和扩张性心肌病。蒽环类药物会引起心肌细胞线粒体损伤以及心肌细胞凋亡，最终导致心肌损害。
蒽环类药物中的阿霉素(Doxorubicin，DOX)是从一种链霉菌的发酵液中提取的糖苷类抗生素，也是目前临床上使用的一种广谱抗肿瘤药物，对多种肿瘤均有治疗作用。阿霉素通过插入DNA链抑制DNA拓扑异构酶II，从而抑制RNA和DNA的合成，进而杀死肿瘤细胞，属于周期非特异性药物。同其它蒽环类抗肿瘤药物类似，阿霉素表现出的心脏毒性副作用很大程度上限制了它在临床上的使用。因此，在抗肿瘤药物的化疗过程中，联用特异保护心肌细胞免受损伤的药物是非常重要的。
发明内容
本发明的目的为提供抗肿瘤药物化疗过程中联用的、保护心肌细胞免受损伤的药物。
本发明首先保护组合物在制备用于治疗心肌损伤的产品中的应用；所述组合物可包括人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素。
本发明还保护组合物在制备用于预防心肌损伤的产品中的应用；所述组合物可包括人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素。
上述任一所述的应用中，所述心肌损伤可由抗肿瘤药物引起。
上述应用中，所述抗肿瘤药物可为阿霉素。
上述任一所述的应用中，所述心肌损伤可表现为心肌细胞凋亡。
上述应用中，所述心肌细胞凋亡可表现为线粒体损伤。
上述任一所述的应用中，所述组合物可由人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素组成。
上述任一所述组合物中，人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素的摩尔比具体可为1：1：1。
本发明还保护一种组合物，可由人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素组成。
所述组合物中，人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素的摩尔比具体可为1：1：1。
本发明的发明人经过大量实验发现，Rh2和OpD不仅可以激活线粒体活性，提高心肌细胞的能量代谢水平，还可以激活抗过氧化物酶的表达(如SOD、GPX和TXN等)，从而降低细胞活性氧水平，保护心肌细胞免受活性氧损伤；SchB可以激活心肌细胞重构，以调整线粒体的动态排布来维持线粒体的活性。进一步通过实验证明，人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素与抗肿瘤药物DOX联用，心肌细胞的恢复程度远远优于单体(如人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D或五味子乙素)，而且不影响DOX对肿瘤细胞的杀伤。因此，人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D联合五味子乙素可以治疗抗肿瘤药物引起的心肌损伤。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为人参皂苷Rh2和麦冬皂苷D(OpD)上调表达基因的功能分析。A为DOX+Rh2处理组、DOX+OpD处理组和DOX+SchB处理组与DOX处理组相比上调表达的基因；B为Rh2与OpD共同上调表达基因的GO富集分析；C和D分别为GSEA富集分析中人参皂苷Rh2(C)和麦冬皂苷D(D)处理显著激活线粒体电子传递链(Electron transport chain)和脂肪酸代谢通路(Fattyacid metabolism)；E为Rh2与OpD作用模式图；F为Rh2依赖于SIRT1激活抗氧化物酶的表达。其中，DOX+Rh2为DOX+Rh2处理组，DOX+OpD为DOX+OpD处理组，DOX+SchB为DOX+SchB处理组，DOX为DOX处理组，DOX+Rh2+EX527为DOX+Rh2处理组同时加入SIRT1抑制剂EX527。
图2为五味子乙素(SchB)上调表达基因的功能分析。A为五味子乙素上调表达基因的GO富集分析；B为胞外基质(ECM)和细胞骨架相关基因的表达聚类分析。其中，DOX+Rh2为DOX+Rh2处理组，DOX+OpD为DOX+OpD处理组，DOX+SchB为DOX+SchB处理组，DOX为DOX处理组。
图3为人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素下调表达基因的功能分析。A为DOX+Rh2处理组、DOX+OpD处理组和DOX+SchB处理组与DOX处理组相比下调表达的基因；B为Rh2与SchB共同下调表达基因的GO富集分析；C为SchB特异下调表达基因的GO富集分析；D、E和F分别为GSEA分析Rh2(D)、SchB(E)和OpD(F)处理中的p53通路富集情况。其中，DOX+Rh2为DOX+Rh2处理组，DOX+OpD为DOX+OpD处理组，DOX+SchB为DOX+SchB处理组，DOX为DOX处理组。
图4为人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D联合五味子乙素可以缓解抗肿瘤药物引起的心肌损伤且不影响DOX对细胞的增殖。A为对照组、DOX+Rh2处理组、DOX+OpD处理组、DOX+SchB处理组、DOX处理组和DOX+3CP处理组的JC-1染料荧光成像结果；B为JC-1染料荧光成像结果中，红色与绿色荧光强度的比值统计结果；C为定量PCR检测不同通路相关基因的表达变化(ETC，线粒体电子电子传递链相关基因；Fatty acid metabolism，脂肪酸代谢相关基因；ECM/Cytoskeleton，胞外基质和细胞骨架相关基因；Cell death，细胞死亡相关基因；Cellcycle，细胞周期相关基因)。其中，DOX+Rh2为DOX+Rh2处理组，DOX+OpD为DOX+OpD处理组，DOX+SchB为DOX+SchB处理组，DOX为DOX处理组，DOX+3CP为DOX+3CP处理组，Ctrl为对照组。
图5为人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D联合五味子乙素不阻碍DOX对A549肺癌细胞的杀伤。A为对照组、DOX+Rh2处理组、DOX+OpD处理组、DOX+SchB处理组、DOX处理组和DOX+3CP处理组的JC-1染料荧光成像结果；B为JC-1染料荧光成像结果中，红色与绿色荧光强度的比值统计结果。其中，DOX+Rh2为DOX+Rh2处理组，DOX+OpD为DOX+OpD处理组，DOX+SchB为DOX+SchB处理组，DOX为DOX处理组，DOX+3CP为DOX+3CP处理组，Ctrl为对照组。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
H9c2心肌细胞和A549肺癌细胞均为协和细胞库的产品。人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素均为上海源叶生物科技有限公司的产品，产品目录号依次为B21062、B20831和B21327。
人参皂苷Rh2的结构式如式(I)所示：
麦冬皂苷D的结构式如式(II)所示：
五味子乙素的结构式如式(III)所示：
实施例、
一、实验方法
1、细胞培养
H9c2心肌细胞和A549肺癌细胞均用含10％(v/v)FBS的DMEM培养液在37℃、5％CO2的培养箱中培养。
2、通过转录组测序分析人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素降低DOX引起心肌损伤的机制
(1)处理
DOX+Rh2处理组：向H9c2心肌细胞中加入人参皂苷Rh2(Rh2)，得到处理体系；处理体系中，人参皂苷Rh2的浓度为1μM。取所述处理体系，静置培养24h，之后加入DOX(APExBIO公司)，得到药物处理体系；药物处理体系中，DOX的浓度为1μM。取所述药物处理体系，静置培养24h，之后离心，收集细胞。
DOX+OpD处理组：向H9c2心肌细胞中加入麦冬皂苷D(OpD)，得到处理体系；处理体系中，OpD的浓度为1μM。取所述处理体系，静置培养24h，之后加入DOX，得到药物处理体系；药物处理体系中，DOX的浓度为1μM。取所述药物处理体系，静置培养24h，之后离心，收集细胞。
DOX+SchB处理组：向H9c2心肌细胞中加入五味子乙素(SchB)，得到处理体系；处理体系中，SchB的浓度为1μM。取所述处理体系，静置培养24h，之后加入DOX，得到药物处理体系；药物处理体系中，DOX的浓度为1μM。取所述药物处理体系，静置培养24h，之后离心，收集细胞。
DOX+3CP处理组：向H9c2心肌细胞中加入人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素，得到处理体系；处理体系中，人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素的浓度均为1μM。取所述处理体系，静置培养24h，之后加入DOX，得到药物处理体系；药物处理体系中，DOX的浓度为1μM。取所述药物处理体系，静置培养24h，之后离心，收集细胞。
DOX处理组：向H9c2心肌细胞中加入DMSO溶液，得到处理体系。取所述处理体系，静置培养24h，之后加入含DOX的DMSO溶液，得到药物处理体系；药物处理体系中，DOX的浓度为1μM。取所述药物处理体系，静置培养24h，之后离心，收集细胞。
(2)转录组测序和分析
(2-1)用TRIgent(聚合美，MF034)提取步骤(1)收集的细胞的总RNA，之后由华大基因公司进行转录组测序，得到测序数据。
(2-2)将测序数据通过DESeq2进行差异表达基因鉴定。差异表达的基因(差异倍数不小于1.5，FDR不大于0.05)通过ShinyGO 0.76进行功能聚类分析。
(2-3)对测序数据进行GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)的富集分析。
3、反转录和定量PCR
(1)处理
同步骤2中(1)。
(2)反转录和定量PCR
(2-1)用TRIgent(聚合美，MF034)提取步骤(1)收集的细胞的总RNA，之后用反转录试剂盒(聚合美，MF166-plus)进行反转录，得到细胞的cDNA。
(2-2)以步骤(2-1)得到细胞的cDNA为模板，之后采用定量PCR试剂盒(聚合美，MF788)进行基因检测(使用大鼠的Actb基因作为内参)，用2-△△Ct的方法进行基因表达分析。
定量PCR所用的基因特异性引物和用于扩增的基因详见表1。
表1
4、采用JC-1染料检测线粒体活性
线粒体膜电位异常是线粒体损伤的早期特征，线粒体膜电位变化常用于衡量线粒体的健康状态，也是用来检测细胞早期凋亡的常用方法。线粒体膜电位通常使用JC-1染料进行检测，JC-1染料呈现出线粒体膜电位依赖性聚集。线粒体正常时，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光；线粒体受损伤时，由于膜电位的下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光。因此，颜色的变化可以直接反映出线粒体膜电位的变化，而且通过红/绿色荧光强度的比值可以衡量线粒体状态，比值越小线粒体损伤越严重，预示细胞更倾向于凋亡。
(1)处理
DOX+Rh2处理组：向细胞(H9c2心肌细胞或A549肺癌细胞)中加入人参皂苷Rh2(Rh2)，得到处理体系；处理体系中，人参皂苷Rh2的浓度为1μM。取所述处理体系，静置培养24h，之后加入DOX，得到药物处理体系；药物处理体系中，DOX的浓度为1μM。取所述药物处理体系，静置培养24h。
DOX+OpD处理组：向细胞中加入麦冬皂苷D(OpD)，得到处理体系；处理体系中，OpD的浓度为1μM。取所述处理体系，静置培养24h，之后加入DOX，得到药物处理体系；药物处理体系中，DOX的浓度为1μM。取所述药物处理体系，静置培养24h。
DOX+SchB处理组：向细胞中加入五味子乙素(SchB)，得到处理体系；处理体系中，SchB的浓度为1μM。取所述处理体系，静置培养24h，之后加入DOX，得到药物处理体系；药物处理体系中，DOX的浓度为1μM。取所述药物处理体系，静置培养24h。
DOX+3CP处理组：向细胞中加入人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素，得到处理体系；处理体系中，人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素的浓度均为1μM。取所述处理体系，静置培养24h，之后加入DOX，得到药物处理体系；药物处理体系中，DOX的浓度为1μM。取所述药物处理体系，静置培养24h。
DOX处理组：向细胞中加入DMSO溶液，得到处理体系。取所述处理体系，静置培养24h，之后加入含DOX的DMSO溶液，得到药物处理体系；药物处理体系中，DOX的浓度为1μM。取所述药物处理体系，静置培养24h。
对照组：向细胞中加入DMSO溶液，静置培养48h。
(2)取步骤(1)收集的细胞，先用1×PBS缓冲液洗涤1次；然后加入100μl JC-1工作液，37℃孵育20min；之后再用1×PBS缓冲液洗涤1次；最后用高内涵成像系统(PE公司)进行荧光检测，并计算红/绿荧光强度的比值。
1×PBS缓冲液和JC-1工作液均为线粒体膜电位检测试剂盒(碧云天，C2006)中的组件。
二、实验结果
1、人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素从不同角度激活线粒体活性
结果表明，与DOX处理组相比，DOX+Rh2处理组、DOX+OpD处理组和DOX+SchB处理组分别有1011个、533个和286个基因上调表达，其中OpD上调表达的基因大部分被Rh2上调表达的基因覆盖(见图1中A)，其中包括313个仅被Rh2和OpD共同上调表达的基因，这部分基因主要富集于线粒体上(图1中B)。
进一步GSEA分析结果表明，人参皂苷Rh2和麦冬皂苷D可以激活线粒体电子传递链(Electron transport chain)通路(图1中C)和脂肪酸代谢通路(Fatty acid metabolism)(图1中D)。脂肪酸代谢在线粒体产生ATP时会形成活性氧，过多的活性氧会导致线粒体损伤以及细胞死亡。细胞内有多个抗过氧化物酶可以去除活性氧，如SOD(如Sod1)、GPX(Gpx1)和TXN(Txn2)等。已有报道指出，SIRT1可以激活NRF2，NRF2可以正向调控这些抗过氧化物酶基因的表达(图1中E)。人参皂苷Rh2处理后，这些抗过氧化物酶的表达显著上调，而同时加入SIRT1抑制剂EX527(APExBIO)后，它们的上调表达受到抑制(图1中F)。由此可见，人参皂苷Rh2激活抗过氧化物酶的表达依赖于SIRT1。
不同于DOX+Rh2处理组和DOX+OpD处理组，DOX+SchB处理组特异上调的119个基因显著富集在胞外基质和细胞骨架相关的通路(见图2)。预测SchB可以保护心肌细胞结构，维持线粒体在胞质的正常分布，有利于线粒体正常发挥功能。
综上所述，DOX+Rh2处理组和DOX+OpD处理组可以激活线粒体活性，提高心肌细胞的能量代谢水平，Rh2还可以激活抗过氧化物酶的表达(如SOD、GPX和TXN等)，从而降低细胞活性氧水平，保护心肌细胞免受活性氧损伤。而DOX+SchB处理组可以激活心肌细胞重构，以调整线粒体的动态排布来维持线粒体的活性。
2、人参皂苷Rh2和五味子乙素抑制心肌细胞凋亡
与DOX处理组相比，DOX+Rh2处理组、DOX+OpD处理组和DOX+SchB处理组分别有812、326和696个基因下调表达(图3中A)，其中OpD下调表达的基因在GO通路上没有富集，而Rh2(图3中B)和SchB(图3中C)下调表达的基因富集在细胞死亡相关通路。
进一步的GSEA分析显示该结果表明，Rh2(图3中D)和SchB(图3中E)可以抑制p53通路相关基因表达，SchB所调控的基因具有更小的FDR值，预示着SchB在细胞死亡抑制方面具有更重要的作用。而OpD在抑制p53通路方面不显著(FDR为0.14)(图3中F)。
3、人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D联合五味子乙素缓解抗肿瘤药物引起的心肌损伤且不影响DOX对细胞的增殖
当细胞为H9c2心肌细胞时，采用JC-1染料检测线粒体活性的结果表明，与DOX+Rh2处理组、DOX+OpD处理组和DOX+SchB处理组相比，DOX+3CP处理组的细胞的线粒体绿色荧光信号明显降低，其红/绿荧光强度的比值也显著增加(见图4中A和B)。由此可见，人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D联合五味子乙素可以缓解抗肿瘤药物引起的心肌损伤。
在基因表达层面，线粒体电子传递链(ETC)、脂肪酸代谢(Fatty acidmetabolism)和细胞骨架(ECM/Cytoskeleton)通路的相关基因在DOX+3CP处理组中的表达水平高于DOX+Rh2处理组、DOX+OpD处理组和DOX+SchB处理组，而细胞死亡的相关基因在DOX+3CP处理组中的表达水平显著低于DOX+Rh2处理组和DOX+OpD处理组(图4中C)。另外，细胞周期相关基因表达变化不显著(图4中C)。由此可见，人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D联合五味子乙素不影响DOX对细胞的增殖。
4、人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D联合五味子乙素不阻碍DOX对A549肺癌细胞的杀伤
当细胞为A549肺癌细胞时，采用JC-1染料检测线粒体活性的结果表明(见图5)，与DOX处理组相比，DOX+Rh2处理组、DOX+OpD处理组、DOX+SchB处理组、DOX+3CP处理组的细胞的线粒体绿色荧光无显著差异，红/绿荧光强度的比值也无显著差异。由此可见，人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D联合五味子乙素不阻碍DOX对A549肺癌细胞的杀伤。
上述结果表明，人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素的组合与抗肿瘤药物DOX联用，心肌细胞的恢复程度优于单体(如人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D或五味子乙素)，而且不影响DOX对肿瘤细胞的杀伤。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (7)
1.组合物在制备用于治疗心肌损伤的产品中的应用；
所述组合物由人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素组成；
所述组合物中，人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素的摩尔比为1：1：1。
2.组合物在制备用于预防心肌损伤的产品中的应用；
所述组合物由人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素组成；
所述组合物中，人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素的摩尔比为1：1：1。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述心肌损伤由抗肿瘤药物引起。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述抗肿瘤药物为阿霉素。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述心肌损伤表现为心肌细胞凋亡。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述心肌细胞凋亡表现为线粒体损伤。
7.一种组合物，由人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素组成；
所述组合物中，人参皂苷Rh2、麦冬皂苷D和五味子乙素的摩尔比为1：1：1。
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