CN115777629A - 一种心肌缺血再灌注模型的建立和评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种心肌缺血再灌注模型的建立和评价方法，包括：术前称重和麻醉固定、气管插管、冠状动脉左前降支双针结扎、术后缝合以及待动物恢复自主呼吸拔出气管插管等步骤。本发明提供的心肌缺血再灌注模型的建模成功率和模型稳定性提升，所需样本量显著减少，模型评价指标更加全面准确。
Description
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，涉及一种心肌缺血再灌注模型的建立和评价方法。
背景技术
缺血再灌注损伤(Ischemia-Reperfusion Injury，IRI)是指组织器官缺血后血液再灌注，不仅不能使组织器官功能恢复，反而加重组织器官的功能障碍和结构损伤。
急性冠状动脉梗阻性疾病是目前心血管疾病的主要致死原因之一。急性心肌缺血后，恢复冠状动脉血流(再灌)本身又会导致心肌细胞损伤及死亡，这一现象称为心肌缺血再灌注损伤，占总心肌损伤的40％-50％，是导致心肌梗死不良预后的重要因素。
目前心肌缺血再灌注损伤建模方法和缺点：
1、心脏原位结扎：建模成功率较低，梗死稳定性较差；
2、挤心脏法：心脏挤出，一定程度上破坏了原始生理结构，因操作迅速一般不连接呼吸机，导致后续再灌注不易操作(二次挤出心脏或者体外留线，再灌注效果不确切)。
现有的建模方法都是在冠状动脉左前降支进行单次结扎，结扎一段时间后再打开结扎部位完成缺血再灌。结扎有完全结扎和部分结扎两种方式，单次完全结扎被认为是完全阻断了结扎处的血流，部分结扎的方式被认为是部分阻断结扎处血流。单次完全结扎后引起供血部位心肌细胞的完全缺血，模拟临床心肌梗死，缺血一定时间后打开结扎位点，模拟临床再灌。该模型梗死比例变化大，模型稳定性较差，增加了统计学误差，每组动物样本量要求大。
现有的模型评价指标单一、不够准确：a.肉眼观察结扎前后心肌颜色变化；b.心电指标上目前采用的II导联监测不能准确、合理地监测缺血损伤部位；c.再灌注损伤启动于再灌早期数分钟，并继续以包含大量交互式机制的级联方式进展数分钟或数小时，但目前在术中超急性期使用超声监测大鼠心功能的几乎无，大/小鼠心梗/衰模型一般会在一周、一个月、两个月采用超声监测心功能。
因此，亟需一种梗死相对稳定、评价指标相对全面准确的心肌缺血再灌注模型的建立方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种梗死相对稳定、评价指标相对准确全面的动物心肌缺血模型和心肌缺血再灌注模型的建立和评价方法，以克服现有的模型稳定性较差，评价指标单一、不准确等技术难题。
在第一个方面，本发明提供一种动物心肌缺血模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)术前称重和麻醉固定：
根据动物(例如，大鼠)体重，腹腔注射适量的麻醉剂，对动物进行麻醉；将麻醉后动物胸腔部位备皮，消毒；仰卧位固定于手术台；
所述麻醉剂可以为本领域常用的麻醉剂(例如，气体麻醉和注射用麻醉剂)，例如10％水合氯醛，注射剂量可以采用常规剂量以达到麻醉效果即可，例如，针对大鼠，10％水合氯醛的注射剂量为0.3-0.35ml/100g，如0.35ml/100g；
(2)气管插管：
打开呼吸机，调节呼吸机参数，经口进行气管插管；
呼吸机参数可以根据动物进行调整，针对大鼠，可以为：潮气量：100g/1mL；呼吸比：1:1；呼吸频率：80-85次/min；
(3)冠状动脉左前降支双针结扎：
1)动物胸廓纵向剪开皮肤，暴露肌肉层，沿肌肉走向剪开，使用弯镊将胸肌逐层钝性分离暴露肋骨，于第4、5肋间用弯头剪打开胸腔，暴露心脏，撕开心包膜，暴露主动脉圆锥及左心耳；
2)使用缝针(例如，5-0铲型缝针)在左心耳最下缘2-3mm进针，主动脉圆锥附近出针，结扎冠状动脉左前降支；第二针位于第一针下缘2-3mm处再次结扎；
双针结扎操作控制在3-5min内完成，双针结扎保证了对冠状动脉左前降支的完全阻断，提高结扎(心肌缺血)的成功率，降低模型偏差，减少每组动物用量；
(4)术后缝合，待动物恢复自主呼吸，拔出气管插管：
肋间缝合后用注射器(外接留置针前端软管)插入肋间，弯头镊关闭表皮，将胸腔气体排出，负压状态下单结缝合外皮；待动物恢复自主呼吸，拔出气管插管，关闭呼吸机。
在一些实施方案中，上述动物心肌缺血模型的建立方法中，在步骤(1)和(2)之间，还包括术前心脏超声监测和/或心电监测，以入组正常动物；
所述心电监测采用全导联心电，优选观察V1导联和II导联；所述全导联心电是指：肢体导联：四肢插入电极；胸导联V1：心尖处附近插入电极；
心电正常的动物入组；空白心电异常(心动过缓：心率＜200bpm/min；与正常心电图相比有较大差异：J点很低；S波很宽，R波高耸，病理性Q波等)的动物排除入组；
通过心脏超声监测动物(例如，大鼠)心功能，心功能正常的动物左心室的超声图显示前、后壁均收缩正常，并且左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)在正常范围内，比如左心室射血分数(LVEF)为93.2±4.52％，左心室缩短分数(LVFS)为63.13±8.55％；而前、后壁收缩功能异常或矛盾运动、心脏位置明显异常(明显偏左或偏右)等心功能异常的动物排除入组。
在一些实施方案中，上述任一所述的动物心肌缺血模型的建立方法中，步骤(3)中，还包括：
3)缺血期间心电指标判断和肉眼观察，以评价是否缺血成功：
双针结扎30min内(例如5min)，进行缺血期间心电监测和肉眼观察：
若结扎后Ⅱ导联和V1导联ST段均抬高≥0.2mv，且肉眼可见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断为缺血成功；
若结扎后V1导联ST段明显抬高≥0.2mv但Ⅱ导联ST段抬高＜0.2mv，且肉眼可见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断为缺血成功；
若结扎后Ⅱ导联和V1导联ST段抬高均＜0.2mv，且肉眼未见结扎处以下心肌变苍白暗黄，判断缺血失败；
若动物术中出现恶性心律失常(室颤、室速等)，可通过股静脉快速推注胺碘酮(例如，3mg/kg)，能有效降低术中死亡率，间接提高建模成功率。
在第二个方面，本发明提供一种动物心肌缺血再灌注模型的建立方法，其包括上述心肌缺血模型的建立方法的所有步骤，并且在步骤(3)和(4)之间还包括如下步骤：
再灌注：双针结扎后进行缝合关胸(只缝合肋间)，结扎(心肌缺血)15-60min(例如30min)后打开胸腔，打开两个结进行再灌注。
在一些实施方案中，上述动物心肌缺血再灌注模型的建立方法中，在步骤(1)和(2)之间，还包括术前心脏超声监测和/或心电监测，以入组正常动物；
所述心电监测采用全导联心电，优选观察V1导联和II导联；所述全导联心电是指：肢体导联：四肢插入电极；胸导联V1：心尖处附近插入电极；
心电正常的动物入组；空白心电异常(心动过缓：心率＜200bpm/min；与正常心电图相比有较大差异：J点很低；S波很宽，R波高耸，病理性Q波等)的动物排除入组；
通过心脏超声监测动物(例如，大鼠)心功能，心功能正常的动物左心室的超声图显示前、后壁均收缩正常，并且左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)在正常范围内，比如左心室射血分数(LVEF)为93.2±4.52％，左心室缩短分数(LVFS)为63.13±8.55％；而前、后壁收缩功能异常或矛盾运动、心脏位置明显异常(明显偏左或偏右)等心功能异常的动物排除入组。
在一些实施方案中，上述任一所述的动物心肌缺血再灌注模型的建立方法中，步骤(3)中，还包括：
3)缺血期间心电指标判断和肉眼观察，以评价是否缺血成功：
双针结扎30min内后(例如5min)，进行缺血期间心电监测和肉眼观察：
若结扎后Ⅱ导联和V1导联ST段均抬高≥0.2mv，且肉眼可见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断为缺血成功；
若结扎后V1导联ST段明显抬高≥0.2mv但Ⅱ导联ST段抬高＜0.2mv，且肉眼可见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断为缺血成功；
若结扎后Ⅱ导联和V1导联ST段抬高均＜0.2mv，且肉眼未见结扎处以下心肌变苍白暗黄，判断缺血失败；
若动物术中出现恶性心律失常(室颤、室速等)，可通过股静脉快速推注胺碘酮(例如，3mg/kg)，能有效降低术中死亡率，间接提高建模成功率。
在一些实施方案中，上述任一所述的动物心肌缺血再灌注模型的建立方法中，还包括在再灌注后超急性期(再灌后30-60min，例如再灌后30min)进行心电监测和/或心脏超声监测，以评价是否再灌成功和/或对心功能的影响；
所述心电监测采用全导联心电，优选观察V1导联和II导联；
再灌注后超急性期，与缺血期间心电相比，Ⅱ导联和/或V1导联ST段回落＞50％，且肉眼可见结扎处以下心肌由苍白恢复红色视作再灌注成功；和/或
再灌注后超急性期，与术前相比，动物左心室前壁收缩减弱，左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)下降，表明缺血再灌注损伤对心功能造成不良影响。
在一些实施方案中，上述任一所述的动物心肌缺血模型的建立方法中或上述任一所述的动物心肌缺血再灌注模型的建立方法中，还包括在再灌后24h进行心电监测和/或心脏超声监测，以进一步评估心肌损伤和/或心功能；
所述心电监测采用全导联心电，优选观察V1导联和II导联；
再灌后24h，V1导联和/或II导联心电图出现病理性Q波或QS波，表明心肌出现病理性损伤，即心肌梗死；和/或
再灌后24h，与术前相比，动物左心室前壁收缩减弱，左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)下降，表明缺血再灌注损伤对心功能造成不良影响。
实验证实，再灌后30min、再灌后24h分别与术前进行比较：再灌后30min心功能(左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS))降低更显著，表明再灌后超急性期的超声监测更能反映出瞬时的缺血再灌注损伤。
在一些实施方案中，上述任一所述的动物心肌缺血模型的建立方法中或上述任一所述的动物心肌缺血再灌注模型的建立方法中，还包括在再灌后24h进行动物心脏双染确定是否梗死和梗死比例的步骤，以最终评价模型是否成功建立。
在一些实施方案中，上述任一所述的动物心肌缺血模型的建立方法中或上述任一所述的动物心肌缺血再灌注模型的建立方法中，所述动物为哺乳动物，例如大鼠、小鼠。
优选地，本发明提供的动物心肌缺血再灌注模型的建立方法包括以下步骤：
(1)术前称重和麻醉固定；
(2)术前心脏超声监测和/或心电监测；
(3)气管插管；
(4)冠状动脉左前降支双针结扎：
1)在动物胸廓纵向剪开皮肤，暴露肌肉层，沿肌肉走向剪开，将胸肌逐层钝性分离暴露肋骨，于第4、5肋间打开胸腔，暴露心脏，撕开心包膜，暴露主动脉圆锥及左心耳；
2)使用缝针在左心耳最下缘2-3mm进针，肺动脉圆锥处出针，使用活结结扎冠状动脉左前降支；第二针位于第一针下缘2-3mm处再次活结结扎；
3)缺血期间心电指标判断和肉眼观察，以评价是否缺血成功：
双针结扎30min内，进行缺血期间心电监测和肉眼观察：
若结扎后Ⅱ导联和V1导联ST段均抬高≥0.2mv，且肉眼可见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断为缺血成功；
若结扎后V1导联ST段抬高≥0.2mv但Ⅱ导联ST段抬高＜0.2mv，且肉眼可见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断为缺血成功；
若结扎后Ⅱ导联和V1导联ST段抬高均＜0.2mv，且肉眼未见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断缺血失败；
(5)再灌注：双针结扎后进行缝合关胸，只缝合肋间，结扎15-60min后打开胸腔，打开两个结进行再灌注；
(6)术后缝合，待动物恢复自主呼吸，拔出气管插管；
(7)再灌后30-60min进行心电监测和/或心脏超声监测，以评价是否再灌成功和/或对心功能的影响；
所述心电监测采用全导联心电，优选观察V1导联和II导联；
再灌后30-60min，与缺血期间心电相比，Ⅱ导联和/或V1导联ST段回落＞50％，且肉眼可见结扎处以下心肌由苍白恢复红色，视作再灌注成功；和/或
再灌后30-60min，与术前相比，动物左心室前壁收缩减弱，左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)下降，表明缺血再灌注损伤对心功能产生不良影响；
(8)术后恢复，再灌后24h进行心电监测和/或心脏超声监测，以进一步评估心肌损伤和/或心功能；
所述心电监测采用全导联心电，优选观察V1导联和II导联；
再灌后24h，V1导联和/或II导联心电图出现病理性Q波或QS波，说明心肌出现病理性损伤，即心肌梗死；和/或
再灌后24h，与术前相比，动物左心室前壁收缩减弱，左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)下降，表明缺血再灌注损伤对心功能产生不良影响；
(9)再灌后24h进行动物心脏双染确定是否梗死和梗死比例的步骤，以最终评价模型是否成功建立。
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述结扎方式可以是死结或者活结，优选活结，方便后续步骤的打开需要。
在第三个方面，本发明还提供上述任一所述的动物心肌缺血模型和/或动物心肌缺血再灌注模型在评价预防和/或治疗心肌缺血和/或心肌缺血再灌注损伤的药物的效用中的应用。
本发明的有益效果如下：
1、根据几十年来的文献报道，现有技术不进行第二针再次结扎，其原因有三：一、一般认为单次结扎已经完全阻断血流；二、双针结扎的第二针对心脏造成更多的损伤；三、双针结扎的操作更复杂，耗时更久，增加实验工作量。然而，本发明的心肌缺血再灌注模型的制备方法采用双针结扎，相较于单针结扎模型的制备方法，建模成功率和模型稳定性提升，所需样本量显著减少。
2、本发明提供的心肌缺血再灌注模型的制备方法，在术前、缺血再灌注手术过程、再灌后24h均监测全导联心电指标，结果显示：a.缺血期间可观测到：ST段抬高敏感性(先后性)：胸导联V1＞I、AVL导联＞Ⅱ导联；b.V1导联ST段抬高≥0.2mv但Ⅱ导联ST段抬高＜0.2mv，心脏双染显示存在明显的前壁梗死(图3中C和D)，这与现有的评价标准(即Ⅱ导联ST段抬高＜0.2mv一般判断为缺血不成功,心肌无明显梗死)不一致，说明Ⅱ导联监测存在一定漏检率，降低了建模成功率，原因可能为结扎冠状动脉左前降支主要造成左心室前壁缺血性损伤，但II导联监测的实则是后壁的缺血损伤；c.V1导联和II导联综合评价缺血和再灌注的效果，更加全面和准确。
3、本发明提供的动物心肌缺血再灌注模型的制备方法，在术前、再灌后30min、再灌后24h分别监测超声心功能指标，再灌后30min(超急性期)和再灌后24h的超声数据(LVEF、LVFS)分别与术前对比：再灌后30min(超急性期)心功能降低更显著(图4)，说明再灌后超急性期的超声监测更能反映出短时的缺血再灌注损伤。而现有技术没有把再灌后30min(超急性期)超声作为评价标准，不能评价再灌后数分钟即引发的再灌注损伤。
附图说明
图1为心脏双针结扎位置示意图。
图2为全导联心电监测中的V1导联和II导联心电图；其中，A为术前V1导联和II导联心电图：正常；B为缺血期间V1导联和II导联心电图：ST段弓背上抬明显；C为再灌后30minV1导联和II导联心电图：ST段回落明显；D为再灌后24h V1导联和II导联心电图：出现病理性Q波。
图3为心肌缺血期间全导联心电监测中的V1导联和II导联心电图；其中，A为大鼠1缺血5min后V1导联和II导联心电图：ST段均明显抬高；B为大鼠1再灌24h后心脏双染图：前、后壁均梗死明显，梗死区和危险区均较大；C为大鼠2缺血5min后V1导联和II导联心电图：V1导联ST段明显抬高，但II导联ST段未明显抬高；D为大鼠2再灌24h后心脏双染图：前壁梗死明显，危险区较小。
图4为超声监测心功能；其中，A为术前、再灌后30min、再灌后24h胸骨旁左心室长轴切面典型超声心动图；B为术前、再灌后30min、再灌后24h左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)的统计图(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，三组用单因素方差分析；两组之间用T检验)。
图5为实验所需动物样本量预估图；其中，A为双针结扎和全导联心电监测(实施例)所需的样本量预估图；B为单针结扎和全导联心电监测(对比例1)所需的样本量预估图；C为双针结扎和II导联心电监测(对比例2)所需的样本量预估图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。如非特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域常规操作，或按照试剂盒及仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
统计分析：利用软件Graphpad prism 7进行统计学分析：两组以上用单因素方差分析；两组之间用T检验，若组间样本配对，可进行配对T检验；*表示p<0.05有统计学差异,**表示p<0.01有显著统计学差异,***表示p<0.001有极其显著的统计学差异。
实施例：心肌缺血再灌注模型的建立
实验动物：选用6-8周龄，体重在200g左右，背景为雄性的SPF级SD大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)52只为实验对象。
动物饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。手术前12h大鼠禁食，可自由饮水。
(1)术前称重和麻醉固定：大鼠称重，异氟烷预麻醉后，根据大鼠体重腹腔注射适量的10％水合氯醛麻醉(0.35ml/100g)，大鼠指压无反应，角膜反射消失视为麻醉成功；大鼠胸腔部位备皮，碘伏消毒；仰卧位用压敏胶带绑定四肢于手术台上。
(2)术前心脏超声监测和心电监测：
术前心脏超声监测：使用百胜Sigma-VET便携式超声仪，探头SL3116，频率10-22Hz，在大鼠备皮区涂上适量超声耦合剂，调整探头方向以平行于腹中线逆时针45°找到胸骨旁长轴切面，待图像清晰稳定后，进入M型超声心动图界面，测量线置于左心室中部乳头肌水平位置(测量线尽量避开肋骨、勿靠近心尖)，使用FREEZE键冻结实时图像，IMAGE键保存超声图像3张，测量左心室平均收缩功能(左心室射血分数LVEF、左心室缩短分数LVFS)；选取心功能正常的大鼠入组。如图4中A所示，正常大鼠术前左心室的超声图，显示前后壁均收缩正常。如图4中B显示正常大鼠术前左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)。
术前心电监测：使用成都泰盟BL-420N生物信号采集与分析系统，监测大鼠全导联心电(肢体导联：四肢插入电极；胸导联V1：心尖处附近插入电极)；选取心电正常的大鼠入组。如图2中A所示，正常大鼠术前V1导联和II导联心电图显示正常。其余心电图(未显示)也显示正常。
(3)气管插管：打开呼吸机，调节呼吸机参数(潮气量：100g/1mL；呼吸比：1:1；呼吸频率：85次/min)，必要时用棉线清理口腔分泌物，经口进行气管插管：左手提拉大鼠舌头，用止血钳将其向上抵，右手持呼吸机插管(斜面朝下)，紧贴上颚进入口腔，在冷光源直射下，可见声门随呼吸一张一合，待声门张开时迅速插进气管，插入时可感到竹节样阻碍；当观察到大鼠胸腔起伏与呼吸机频率一致，视为插管成功。
(4)心肌缺血—冠状动脉左前降支(LAD)双针结扎：
1)观察大鼠胸廓心跳最为明显处(仰卧位剑突靠左处)，纵向剪开皮肤约2cm长度，暴露肌肉层，沿肌肉走向剪开，使用弯镊将胸肌逐层钝性分离暴露肋骨，于第4、5肋间用弯头剪打开胸腔，暴露心脏，小心撕开心包膜，暴露主动脉圆锥及左心耳，开胸过程中注意避免伤及肺部造成气胸意外死亡。
2)5-0铲型缝针于左心耳最下缘2-3mm进针，主动脉圆锥附近出针，使用活结结扎冠状动脉左前降支；第二针位于第一针下缘2-3mm处再次活结结扎；结扎动作尽可能轻柔迅速，双针结扎操作控制在3-5min内完成。心脏双针结扎位置示意图如图1所示。
3)缺血期间心电指标判断和肉眼观察：
双针结扎30min内，进行缺血期间心电监测和肉眼观察。
如图2中B显示，缺血期间ST段弓背上抬明显。
若结扎后Ⅱ导联和V1导联ST段均抬高≥0.2mv(如图3中A所示，来自大鼠1)，且肉眼可见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断为缺血成功；
若结扎后V1导联ST段抬高≥0.2mv但Ⅱ导联ST段抬高＜0.2mv(如图3中C所示，来自大鼠2)，且肉眼可见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断为缺血成功；
若结扎后Ⅱ导联和V1导联ST段抬高均＜0.2mv，且肉眼未见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断缺血失败；
大鼠术前暴露右下肢股静脉，若大鼠术中出现恶性心律失常(室颤、室速等)，可通过股静脉快速推注胺碘酮(3mg/kg)，能有效降低术中死亡率，间接提高建模成功率。
(5)再灌注：对于缺血成功的大鼠，心肌双针结扎后进行缝合关胸(只缝合肋间)，双针结扎(心肌缺血)30min后打开胸腔，轻柔打开两个活结进行再灌注。
(6)术后处理：肋间缝合后用注射器(外接留置针前端软管)插入肋间，弯头镊关闭表皮，将胸腔气体抽出约2ml，负压状态下单结缝合外皮；伤口缝合处碘伏擦拭，待大鼠恢复自主呼吸，拔出气管插管，关闭呼吸机。
(7)再灌后30min(超急性期)心脏超声监测和心电监测：
再灌后30min，进行心脏超声监测和心电监测。
如图4中A所示，再灌后30min，大鼠的前壁微弱收缩。如图4中B所示，再灌后30min，与术前相比，大鼠的左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)下降明显。
如图2中C所示，再灌后30min，Ⅱ导联和/或V1导联ST段回落＞50％，且肉眼可见结扎处以下心肌由苍白恢复红色视作再灌注成功。
结束后将大鼠放入恒温箱(29℃)保温，利于术后恢复。
(8)再灌后24h心脏超声监测和心电监测：
再灌后24h后麻醉大鼠，进行心脏超声监测和心电监测。
如图4中A所示，再灌后24h，大鼠的前壁基本无收缩。如图4中B所示，再灌后30min、再灌后24h分别与术前进行比较：再灌后30min心功能(左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS))降低更显著。
再灌后30min(超急性期)与再灌后24h心脏超声监测心功能结果比较也可参见表1。
表1
与术前进行比较，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
如图2中D所示，再灌后24h V1导联和II导联心电图出现病理性Q波，表明心肌出现病理性损伤，即心肌梗死。
(9)心脏双染确定梗死比例
再灌后24h进行心脏双染：大鼠麻醉后仰卧位固定在手术台上(手术台铺护理垫防污染)，打开腹腔暴露后腔静脉，先后分别注入3mg/ml肝素钠抗凝液1ml，1.5％TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色液1.5ml；随后打开胸腔暴露心脏，轻柔打开心脏上的双活结，再次进行原位结扎，止血钳阻断主动脉血流，主动脉逆行灌注1％ EVB(伊文思蓝)染色液0.5-1ml，待心脏蓝染完全后剪下心脏，用生理盐水清洗腔室内多余血液和染料，滤纸吸干，心脏放入10％ KCl浸泡，目的使心脏统一停跳在舒张期。染色完毕的心脏立刻放入-80℃冰箱冻存约7-8min后切片6片(厚度2mm左右)，拍照，生理盐水漂洗后，置于10％多聚甲醛溶液中固定30min，扫描拍照。
典型双染图(从心尖处开始切六片心肌片，到第一个结扎线处停止)如图3中B和D所示，白色梗死区明显，红染区(代表危险区)、蓝染区(代表正常心肌)分辨度高，其中B为大鼠1再灌24h后心脏双染图，前、后壁均梗死明显，梗死区和危险区均较大；D为大鼠2再灌24h后心脏双染图：前壁梗死明显，危险区较小。
最后利用ImageJ软件进行梗死比例(梗死区/危险区，IS/AAR(％))的统计，如表2所示。
对比例1
所有实验材料和操作同实施例，区别仅在于具体结扎步骤如下：5-0铲型缝针于左心耳最下缘2-3mm进针，肺动脉圆锥附近出针，使用活结单结扎冠状动脉左前降支；结扎动作尽可能轻柔迅速，结扎操作控制在3-5min内完成。
所得到的单针结扎模型大鼠的梗死比例(梗死区/危险区，IS/AAR(％))统计如表2所示。
对比例2
所有实验材料和结扎操作同实施例，区别仅在于用II导联监测心电指标，其中缺血期间心电指标判断标准：若结扎后30min内，Ⅱ导联ST段抬高≥0.2mv，且肉眼可见结扎处以下心肌变苍白暗黄，判断为缺血成功；再灌注成功判断标准：再灌后30min，Ⅱ导联ST段回落＞50％，且肉眼可见结扎处以下心肌由苍白恢复红色视作再灌注成功。
测试例
借助网站上计算样本量的软件(Power and Sample Size.com Calculators)，输入对应结扎方法下梗死比例(梗死区/危险区*100，IS/AAR*100)的平均值(Mean)和标准差(SD)，给药组默认均减少9.95％梗死比例，测算得出双针和全导联心电监测组所需样本量为14只，单针和全导联心电监测组所需样本量为28只，双针和II导联心电监测组所需样本量为20只，结果如图5和表2所示。
表2L30R24(结扎缺血30分钟，再灌24小时)后取材
建模成功率＝建模成功的动物数/入组实验的总动物数*100％。
表2和图5的结果表明，实施例的大鼠心肌缺血再灌注模型制备方法(即，双针结扎和全导联心电监测)，相较于对比例1(单针结扎和全导联心电监测)、对比例2(双针结扎和II导联心电监测)的模型制备方法，建模成功率和模型稳定性得到提升，所需样本量显著减少。
Claims (10)
1.一种动物心肌缺血模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)术前称重和麻醉固定；
(2)气管插管；
(3)冠状动脉左前降支双针结扎：
1)打开胸腔，暴露心脏，暴露主动脉圆锥及左心耳；
2)使用缝针在左心耳最下缘2-3mm进针，主动脉圆锥处出针，结扎冠状动脉左前降支；第二针位于第一针下缘2-3mm处再次结扎；
(4)术后缝合，待动物恢复自主呼吸，拔出气管插管。
2.根据权利要求1所述的动物心肌缺血模型的建立方法，其特征在于：在步骤(1)和(2)之间，还包括术前心脏超声监测和/或心电监测，以入组正常动物；
所述心电监测采用全导联心电，优选观察V1导联和II导联。
3.根据权利要求1或2所述的动物心肌缺血模型的建立方法，其特征在于：步骤(3)中，还包括：
3)缺血期间心电指标判断和肉眼观察，以评价是否缺血成功：
双针结扎30min内，进行缺血期间心电监测和肉眼观察：
若结扎后Ⅱ导联和V1导联ST段均抬高≥0.2mv，且肉眼可见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断为缺血成功；
若结扎后V1导联ST段抬高≥0.2mv但Ⅱ导联ST段抬高＜0.2mv，且肉眼可见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断为缺血成功；
若结扎后Ⅱ导联和V1导联ST段抬高均＜0.2mv，且肉眼未见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断缺血失败。
4.一种动物心肌缺血再灌注模型的建立方法，其包括权利要求1的步骤，并在步骤(3)和(4)之间还包括如下步骤：
再灌注：双针结扎后进行缝合关胸，结扎15-60min后打开胸腔，打开两个结进行再灌注。
5.根据权利要求4所述的动物心肌缺血再灌注模型的建立方法，其特征在于：在步骤(1)和(2)之间，还包括术前心脏超声监测和/或心电监测，以入组正常动物；
所述心电监测采用全导联心电，优选观察V1导联和II导联。
6.根据权利要求4或5所述的动物心肌缺血再灌注模型的建立方法，其特征在于：步骤(3)中，还包括：
3)缺血期间心电指标判断和肉眼观察，以评价是否缺血成功：
双针结扎30min内，进行缺血期间心电监测和肉眼观察：
若结扎后Ⅱ导联和V1导联ST段均抬高≥0.2mv，且肉眼可见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断为缺血成功；
若结扎后V1导联ST段抬高≥0.2mv但Ⅱ导联ST段抬高＜0.2mv，且肉眼可见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断为缺血成功；
若结扎后Ⅱ导联和V1导联ST段抬高均＜0.2mv，且肉眼未见结扎处以下心肌变苍白暗黄，则判断缺血失败。
7.根据权利要求4-6任一项所述的动物心肌缺血再灌注模型的建立方法，其特征在于：还包括在再灌注后30-60min进行心电监测和/或心脏超声监测，以评价再灌注是否成功和/或对心功能的影响；
所述心电监测采用全导联心电，优选观察V1导联和II导联；
再灌注后30-60min，与缺血期间心电相比，Ⅱ导联和/或V1导联ST段回落＞50％，且肉眼可见结扎处以下心肌由苍白恢复红色，视作再灌注成功；和/或
再灌注后30-60min，与术前相比，动物左心室前壁收缩减弱，左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)下降，表明缺血再灌注损伤对心功能造成不良影响。
8.根据权利要求1-3任一项所述的动物心肌缺血模型的建立方法或根据权利要求4-7任一项所述的动物心肌缺血再灌注模型的建立方法，其特征在于：还包括在再灌后24h进行心电监测和/或心脏超声监测，以进一步评估心肌损伤和/或心功能；
所述心电监测采用全导联心电，优选观察V1导联和II导联；
再灌后24h，V1导联和/或II导联心电图出现病理性Q波或QS波，表明心肌出现病理性损伤，即心肌梗死；和/或
再灌后24h，与术前相比，动物左心室前壁收缩减弱，左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)下降，表明缺血再灌注损伤对心功能造成不良影响。
9.根据权利要求1-3任一项所述的动物心肌缺血模型的建立方法或根据权利要求4-8任一项所述的动物心肌缺血再灌注模型的建立方法，其特征在于：还包括进行动物心脏双染确定是否梗死和梗死比例的步骤，以评价模型是否成功建立。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法构建的动物模型在评价预防和/或治疗心肌缺血和/或心肌缺血再灌注损伤的药物的效用中的应用。
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