CN115776985A - 用于治疗真菌感染的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明已经开发了θ‑防御素的肽类似物,其在治疗播散性真菌疾病和/或相关的脓毒性休克中提供双相效应。这些类似物在浓度低于提供杀真菌效应和功能所需的浓度时具有活性,这是通过最初动员免疫系统的效应细胞来对付感染性生物体,然后调节免疫系统来下调炎性应答而实现的。这些θ‑防御素类似物在天然产生的θ‑防御素没有明显作用的浓度下具有保护作用,并且包括在天然θ‑防御素中没有发现的一组核心结构和序列特征。
Description
本发明是在美国国立卫生研究院(NIH)授予的编号为AI142959和AI125141号的政府的支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年6月26日提交的序列号为63/044,943的美国临时专利申请的权益。这些和所有其他参考的外部材料在此全部引入作为参考。如果通过引用并入本文的参考文献中某术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反,则本文提供的该术语的定义应被视为具有约束力。
技术领域
本发明属于生物医学领域,尤其是肽药物。
背景技术
背景描述包括可能有助于理解本发明的信息。这并不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关,或者任何具体或隐含引用的出版物是现有技术。
浅表性真菌感染,如口腔和生殖器粘膜的真菌感染相对常见,很少危及生命。然而,系统性或播散性真菌感染的死亡率在30%至50%之间。真菌病原体是医院获得性感染的主要原因,尤其是在手术患者和留置导管患者中。系统性真菌感染风险增加还与免疫功能下降、中性粒细胞减少和糖尿病有关。系统性或播散性真菌感染的风险增加也与使用生物疗法治疗炎性或自身免疫性疾病有关,这些疾病选择性地抑制免疫应答的组分。
系统性真菌感染通常由念珠菌属(Candida spp.)(如白色念珠菌,C.albicans)引起,它们基本上无处不在,因此不容易避免。尽管抗真菌药物的抗性或多重药物菌株变得越来越普遍。不幸的是,由多种耐药真菌引起的系统性感染仍是一个日益严重的全球健康问题。每年约有150万例播散性真菌病发生,且与高死亡率相关。
多重耐药念珠菌感染的发病率不断上升,导致系统性念珠菌病的死亡率增加。系统性念珠菌病的一个主要风险因素是生物膜的存在,生物膜通常在静脉导管等植入式医疗器械上形成。众所周知,此类生物膜对抗真菌治疗具有耐药性,并且是真菌病原体经血液传播的常见来源。
开发有效且相对无毒的抗真菌药物已被证明具有挑战性。目前用于治疗侵袭性真菌感染的抗真菌药物只有三类:多烯类、唑类和棘白菌素类。其中棘白菌素类是最近批准的一类抗真菌药物,于近30年前首次引入。与使用目前可用的抗真菌药物相关的局限性包括分子靶标范围有限、严重的副作用以及缺乏抗生物膜活性。多重耐药真菌病原体的出现深刻表明了开发治疗真菌感染的新方法的迫切需求。
防御素是一个多样的小抗微生物蛋白家族,是机体抗感染非特异性防御的一部分。防御素蛋白有三种不同且结构独特的类别:α、β和θ防御素。α和β防御素是含有3个二硫键的线性肽,分子量分别约为2.6kDa或4.5kDa。相反,θ-防御素是由18个氨基酸组成的环状肽(即环肽,其中主链由没有游离的氨基或羧基末端的连续肽键形成)。
θ-防御素在恒河猴、狒狒和其他旧世界猴的组织中表达。它们不存在于人类和其他原始人身上。天然存在的θ-防御素由18种通过三个二硫键稳定的主链环化(即通过α-胺基而不是侧链部分)肽组成。这三个二硫键在所有已知的θ-防御素中是保守的。θ-防御素最初被发现并根据肽的抗微生物特性归类为防御素。最近发现θ-防御素具有强效免疫调节作用。
公开号为WO 2007/044998(Lehrer等人)的国际专利申请描述了逆转录环素肽和这种肽的类似物的结构和生物活性之间的关系,其包括不同程度的对映异构体成分以试图推导出结构/活性关系。然而,这些类似物保留了天然逆转录环素的长度和结构。此外,该参考文献仅对抗菌活性具有指导意义。
已研究了各种防御素的肽类似物。例如,欧洲专利申请EP2990415(Colavita等人)描述了β-防御素的环状类似物,其相对于亲本蛋白显示出改进的抗生素效力。然而,此类β-防御素已显示可刺激促炎细胞因子的释放,这引起了安全性问题并限制了其用途。
公开号为US 2003/0022829的美国专利申请(Maury等人)描述了嵌合θ-防御素的合成和生物活性,并推测了进行保守氨基酸取代的可能性,然而这些似乎保留了天然θ-防御素的长度和结构。美国专利10,512,669(Selsted等人)描述了几种衍生自RTD-1的十四肽θ-防御素类似物及其生物学特性。
因此,仍然需要用于管控和/或治疗真菌感染,特别是播散性真菌感染的安全和有效的化合物。
发明内容
本发明主题提供了θ-防御素的合成类似物,其相对于天然θ-防御素在治疗真菌感染(特别是播散性或系统性真菌感染)中具有增强的活性。这些肽通过宿主定向机制发挥作用,并且在低于类似物体外对相同病原体具有直接杀真菌和/或抑真菌作用的浓度下有效。
本发明构思的一个实施方案是由14个氨基酸组成并具有如图7A所示结构的环肽,包括两对半胱氨酸之间的两个二硫键,其中AA3和AA12是通过二硫键连接的半胱氨酸,AA5和AA10是通过二硫键连接的半胱氨酸,AA4是丝氨酸或第一疏水性氨基酸,AA11是丝氨酸或第二疏水性氨基酸,AA6是精氨酸,AA7是精氨酸,AA8为精氨酸,且其中所述环肽包含五个精氨酸残基,所述精氨酸残基在生理pH下提供至少约36%的正电荷含量。在一些实施方案中,所述第一疏水性氨基酸和所述第二疏水性氨基酸为亮氨酸或异亮氨酸。在一些实施方案中,AA1是甘氨酸。在一些实施方案中,AA2是第三疏水性氨基酸,例如缬氨酸或亮氨酸。在一些实施方案中,AA9是第四疏水性氨基酸,例如缬氨酸或苯丙氨酸。在一些实施方案中,AA13和AA14是精氨酸。在一些实施方案中,AA4不能是丙氨酸或丝氨酸。在一些实施方案中,AA11不能是丙氨酸。
另一个实施方案是由14个氨基酸组成并具有如图7A所示结构的环肽,包括两对半胱氨酸之间的两个二硫键,其中AA3和AA12是通过二硫键连接的半胱氨酸,AA5和AA10是通过二硫键连接的半胱氨酸,AA4是精氨酸,AA11是精氨酸,AA6、AA7和AA8中的两个是精氨酸,并且其中环肽包括五个或更多个精氨酸残基,所述精氨酸残基在生理pH下提供至少约36%的正电荷含量。
这种环肽可以是θ-防御素的类似物,当在播散性真菌感染的小鼠模型中系统应用时,相对于θ-防御素本身提高存活率。在一些实施方案中,所述环肽在应用于脓毒症的小鼠模型时提供双相应答。这种双相应答包括具有抗真菌活性的宿主效应细胞动员的第一阶段和调节宿主炎性应答的第二阶段。在一些实施方案中,环肽具有TACE抑制活性,和/或抑制TNF的表达、加工和释放中的至少一种。
这种环肽在暴露于极端温度、低pH值、冷冻和/或解冻、以及溶解于生物基质(如血液、血浆或血清)中的环境中后仍能保持活性。在一些实施方案中,这种环肽在有效治疗或预防播散性真菌疾病和相关脓毒性休克的剂量下是非免疫原性的。这种环肽可激活宿主免疫系统,以增强宿主对病原体的清除。并且在有效治疗或预防脓毒性休克的剂量下还可以具有调节炎症以助于疾病消退和改善疾病存活率的活性。
本发明构思的另一个实施方案是通过将如上所述的环肽施用于有播散性真菌疾病风险的动物来治疗或预防脓毒性休克和/或重症脓毒症的方法。
本发明构思的另一个实施方案是如上所述的环肽在治疗或预防播散性真菌疾病和/或相关的脓毒性休克和/或重症脓毒症中的用途,或这种环肽在制备有效治疗或预防播散性真菌疾病和/或脓毒性休克的药物中的用途。
通过下面对优选实施方案的详细描述以及附图,本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加显而易见,在附图中,相同的数字表示相同的组件。
附图说明
图1:图1示出了天然存在的θ-防御素RTD-1(SEQ ID NO.1)的示意图。
图2:图2示出了合成的θ-防御素类似物环肽1(SEQ ID NO.2)的示意图。
图3:图3示出了合成的θ-防御素类似物环肽2(SEQ ID NO.3)的示意图。
图4:图4示出了合成的θ-防御素类似物环肽3(SEQ ID NO.4)的示意图。
图5:图5示出了合成的θ-防御素类似物环肽4(SEQ ID NO.5)的示意图。
图6:图6示出了合成的θ-防御素类似物环肽5(SEQ ID NO.6)的示意图。
图7A和7B:图7A描绘了在常规线性肽中不存在离散的氨基末端和羧基末端的情况下,用于命名本文所述的环状十四肽中的特定氨基酸的编号系统。图7B描绘了应用于环肽5(SEQ ID NO.6)的该编号系统。
图8:图8示出了合成的θ-防御素类似物环肽6(SEQ ID NO.7)的示意图。
图9:图9示出了,通过研究RTD-1、合成的环状十四肽环肽5和两种抗真菌药物在播散性念珠菌病的体内模型中的作用的典型结果。小鼠在T=0时静脉注射3×105白色念珠菌遗传定义的参考菌株SC5314的芽孢子以感染。在T=24h时,小鼠每日一次腹腔注射生理盐水、5mg/kg卡泊芬净(Caspo)、5mg/kg氟康唑(Fluco)、5mg/kg RTD-1或0.25mg/kg环肽5,持续7天。每天观察小鼠,共26天,并通过log-rank分析将治疗小鼠的存活率与生理盐水对照组进行比较:对于RTD-1、Caspo和Fluco,P=3.4×10-6;0.25mg/kg环肽5,P=2.3×10-7。
图10:图10示出了,通过研究0.25mg/kg和0.1mg/kg的合成环状十四肽环肽5和5mg/kg的氟康唑(Fluco)在播散性念珠菌病的体内模型中的作用的典型结果。小鼠在T=0时静脉注射3×105白色念珠菌SC5314的芽孢子以感染。在T=24h时,每天对小鼠每日进行腹腔注射,治疗7天。每天观察小鼠,共30天,并通过log-rank分析对存活率的提高进行分析。
图11:图11示出了,通过研究0.25mg/kg的合成环状十四肽环肽5和0.1mg/kg的环肽3以及5mg/kg的氟康唑(Fluco)在播散性念珠菌病的体内模型中的作用的典型结果,所述播散性念珠菌病的体内模型如图10所示研究。
图12:图12示出了,通过研究0.25mg/kg的合成环状十四肽环肽5和0.1mg/kg的环肽4以及5mg/kg的氟康唑(Fluco)在播散性念珠菌病的体内模型中的作用的典型结果,所述播散性念珠菌病的体内模型如图10所示研究。
图13:图13示出了,通过研究0.25mg/kg的合成环状十四肽环肽5和0.1mg/kg的环肽1以及5mg/kg的氟康唑(Fluco)在播散性念珠菌病的体内模型中的作用的典型结果,所述播散性念珠菌病的体内模型如图10所示研究。
图14:图14示出了,通过研究0.25mg/kg的合成环状十四肽环肽5和0.1mg/kg的环肽2以及5mg/kg的氟康唑(Fluco)在播散性念珠菌病的体内模型中的作用的典型结果,所述播散性念珠菌病的体内模型如图10所示研究。
图15:图15示出了,通过研究0.25mg/kg的合成环状十四肽环肽5和0.1mg/kg的环肽6以及5mg/kg的氟康唑(Fluco)在播散性念珠菌病的体内模型中的作用的典型结果,所述播散性念珠菌病的体内模型如图10所示研究。
图16:图16示出了用氟康唑(Fluco)和本发明构思的合成环状十四肽治疗的播散性念珠菌病的小鼠模型中真菌清除的研究结果。
具体实施方式
本发明的主题提供了使用宿主介导的过程在治疗真菌感染(例如播散性真菌感染)中诱导双相效应的新型肽。这种肽可以通过最初募集免疫系统的效应细胞来解决感染性真菌生物体,然后调节免疫系统来调节炎性应答来发挥作用。所述新型肽是天然存在的θ-防御素的类似物,其序列经过修饰,通过募集宿主免疫系统的效应细胞提供间接抗真菌作用,并预防和/或治疗脓毒症/脓毒性休克。在宿主先天免疫效应物不存在的情况下,这些新型θ-防御素类似物在不提供直接抗真菌作用的亚抗真菌血浆浓度下是有效的(即,当在体外以此浓度施用时,不产生杀真菌或抑真菌作用)。这种θ-防御素类似物在天然θ-防御素无明显作用的浓度下具有保护作用,包括一组在天然θ-防御素中未发现的核心结构和序列特征。
在本申请的上下文中,关于真菌病原体的“亚抗真菌浓度”应理解为,当如此描述的化合物在体外(例如在液体培养基中)施用于真菌病原体时,例如在不存在宿主免疫效应物的情况下,所述化合物没有抗真菌作用的浓度。例如,关于白色念珠菌的化合物的亚抗真菌浓度将是指,低于在体外环境中(例如在不存在宿主免疫效应物的情况下)对生物体表现出抗真菌作用的浓度。
Basso等人(Basso等人,“Rhesus theta defensin 1promotes long termsurvival in systemic candidiasis by host directed mechanisms”NatureScientific Reports(2019)9:16905)提供了一个针对不同白色念珠菌菌株测定天然θ-防御素RTD-1亚抗真菌药物浓度的示例。在RPMI培养基或含有50%血清的RPMI培养基中建立不同白色念珠菌菌株的培养物。使用不同剂量的氟康唑(Fluco)、卡泊芬净(Caspo)或RTD-1,并监测真菌生长。确定MFC为相对于输入接种物提供99%杀灭的最低浓度。MIC被确定为抑制生长的最低浓度。结果见表1。
表1
基于此类数据,对于白色念珠菌,血清存在时RTD-1的亚抗真菌药物浓度将小于100μg/mL。此类亚抗真菌药物浓度可通过实验(例如,通过患者样本培养)或优选通过历史数据确定。
以下描述包括可能有助于理解本发明的信息。这并不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关,或者任何具体或隐含引用的出版物是现有技术。
在一些实施方案中,用于描述和要求保护本发明某些实施方案的表示成分的量、性质(如浓度、反应条件等)的数字应理解为在某些情况下被术语“约”修饰。因此,在一些实施方案中,书面描述和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值,其可以根据特定实施方案寻求获得的期望特性而变化。在一些实施方案中,应该根据所报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入方法来解释数字参数。尽管阐述本发明的一些实施方案的宽范围的数值范围和参数是近似值,但是在具体实例中阐述的数值被尽可能精确地报告。在本发明的一些实施方案中呈现的数值可能包含一定的误差,这些误差必然由在它们各自的测试测量中发现的标准偏差引起。
如本文的描述和在随后的整个权利要求中所使用的,除非上下文另有明确规定,否则“一”、“一个”和“所述”的含义包括复数引用。此外,如在本文的描述中所使用的,除非上下文另有明确说明,否则“在...中(in)”的含义包括“在...中(in)”和“在...上(on)”。
本文公开的本发明的替代元件或实施方案的分组不应被解释为限制。每组成员可以单独提及并要求保护,也可以与该组的其他成员或本文中的其他元素组合提及并要求保护。出于方便和/或可专利性的原因,组中的一个或多个成员可以被包括在一个组中或从一个组中删除。当发生任何这种包含或删除时,本说明书在此被认为包含所修改的基团,从而满足所附权利要求中使用的所有马库什基团的书面描述。
本文中数值范围的叙述仅旨在作为单独提及落入该范围内的每个单独数值的简写方法。除非本文中另有说明,否则每一个单独的值都包含在本说明书中,如同其在本文中被单独陈述一样。本文描述的所有方法都可以以任何合适的顺序执行,除非本文另有说明或者上下文明显矛盾。关于本文的某些实施方案提供的任何和所有示例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明,而不是对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应该被解释为表示对本发明的实践至关重要的任何未要求保护的元素。
以下讨论提供了本发明主题的许多示例性实施方案。尽管每个实施方案代表发明元素的单个组合,但是发明主题被认为包括所公开元素的所有可能组合。因此,如果一个实施方案包括元素A、B和C,而第二个实施方案包括元素B和D,那么本发明的主题也被认为包括A、B、C或D的其他剩余组合,即使没有明确公开。
应当理解,所公开的肽提供了许多有利的技术效果,包括当以低的亚抗真菌药物量施用时,提供有效降低由播散性或系统性真菌感染和相关脓毒症或休克引起的死亡率的双相应答。
最近,Basso等人(Basso等人,“Rhesus theta defensin 1promotes long termsurvival in systemic candidiasis by host directed mechanisms”NatureScientific Reports(2019)9:16905)已表明,天然存在的θ-防御素RTD-1(SEQ ID NO.1)在系统性念珠菌病动物模型中对易感和多重耐药白色念珠菌菌株均有效。这一文章通过引用并入本文。虽然RTD-1在体外研究中是有效的,但由于血清的存在,抗真菌活性被消除,并且需要比在小鼠动物模型研究中发现的体内有效浓度高50倍或更高的浓度。此类体内研究显示,在使用RTD-1治疗时,抗真菌活性和促炎细胞因子的长期生成均减少,这两者均有助于从播散性真菌感染中恢复,并减少此类感染的潜在的有害后遗症。如下所示,新型θ-防御素合成类似物可提供类似或改善的活性。
发明人已经开发了θ-防御素RTD-1的合成环状十四肽类似物,其证明了亲本肽的至少部分抗真菌活性,尽管它们的尺寸较小并且二硫键的数量减少。RTD-1的结构如图1所示。如图所示,RTD-1(在恒河猴中自然表达)是一种环状十八肽,包括3对通过二硫键偶联的半胱氨酸,二硫键穿过肽的环状一级结构。
图2至6和图8中示出了RTD-1的合成的(即,非天然存在的)类似物的多个示例。图2示出了θ-防御素类似物环肽1(SEQ ID NO.2)的环状结构。图3示出了θ-防御素类似物环肽2(SEQ ID NO.3)的环状结构。图4示出了θ-防御素类似物环肽3(SEQ ID NO.4)的环状结构。图5示出了θ-防御素类似物环肽4(SEQ ID NO.5)的环状结构。图6示出了θ-防御素类似物环肽5(SEQ IDNO.6)的环状结构,在这些研究中用作模型化合物。图8示出了θ-防御素类似物环肽6(SEQ ID NO.7)的环状结构。每一个示例性的合成类似物是包括通过二硫键偶联的2对半胱氨酸的十四肽。这些二硫键穿过合成肽的环状一级结构,形成一个“盒”状亚结构,内含额外的氨基酸。应当理解,这些示例性类似物显示出与RTD-1不同程度的序列同一性,并且在一些情况下显示出在由合成肽类似物的半胱氨酸所定义的“盒”附近和之间的保守氨基酸取代。
发明人已经制备并筛选了一系列θ-防御素类似物,其具有显著的体内抗真菌活性,并在播散性念珠菌病模型中使得小鼠长期存活。这些效应在令人惊讶的低浓度下发生,远低于体外发现的模型病原体中具有直接抗真菌活性的浓度。不希望受理论的束缚,发明人相信观察到的抗真菌作用是由于宿主免疫效应物的调节。应当理解的是,播散性真菌感染的长期生存需要对感染的生物体和由宿主对感染的应答所诱导的休克进行管控,这两者中的任一个都可以导致死亡。
虽然提供了抗播散性真菌感染活性的示例,但发明人相信本文所述的θ-防御素类似物可有效治疗其它真菌感染,例如局部真菌感染(例如鹅口疮)。此外,发明人相信本文所述的θ-防御素类似物可用于治疗由免疫或炎性应答失调引起的多种病症,包括慢性病症。此类慢性疾病的示例包括类风湿性关节炎和炎性肠病。
本发明人注意到,已经发现θ-防御素具有抗病毒活性,并且相信本发明构思的θ-防御素类似物可以类似地提供抗病毒活性,并且可以证明可用于治疗病毒性疾病和病毒感染的炎性后遗症。此类治疗包括预防和/或活动性疾病。在一些实施方案中,如此治疗的活动性疾病是有症状的。在其它实施方案中,如此治疗的活动性疾病是无症状的。
令人惊讶的是,鉴定出θ-防御素类似物在调节免疫系统以应答系统性真菌感染中提供双相应答。最初的作用是动员中性粒细胞,从而清除真菌病原体。这有助于对抗感染,令人惊讶的发现,这是在θ-防御素类似物在体外未能证明对模型病原体具有抗真菌作用的浓度下发生的。在这种初始动员效应之后,这些合成θ-防御素类似物表现出较长期的免疫调节效应(例如,降低TNF、IF-6和其他炎性细胞因子),有助于长期生存并预防由播散性真菌感染引起的脓毒性休克。
如上所述,天然存在的θ-防御素和示例性θ-防御素类似物的示例在图1至6和图8中示出。应当理解,这些环肽通过肽主链环化,因此缺乏常规的氨基末端和羧基末端。因此,随附氨基酸序列表中提供的氨基酸序列信息不应被解释为描述了这些θ-防御素类似物的离散N-末端或C-末端。在本申请的上下文中,使用基于θ-防御素类似物的共同结构特征的数字标记来识别氨基酸位置,如图7A所示。如图所示,沿着环状十四肽链的每个位置都有一个数字标记。图7B描述了将该编号方案应用于模型合成的环状十四肽环肽5(如图6所示)的情况。对于这样的14-氨基酸类似物,应当理解它们的三维结构包括由氨基酸6至9形成的第一β转角(β-turn)和由氨基酸13、14、1和2形成的第二β转角(β-turn),如使用适于与环状θ-防御素及其类似物一起使用的编号系统命名的,如图7A和7B所示。
可通过针对播散性念珠菌病的小鼠模型进行筛选来确定合适的环状十四肽。从美国典型培养物保藏中心获得的白色念珠菌SC5314可用作合适的参考菌株。在优选的实施方案中,可以使用一种或多种表现出对两种或多种抗真菌药物的抗性的白色念珠菌和/或白色念珠菌菌株。典型的抗真菌药物包括卡泊芬净和氟康唑。待测环十四肽和抗真菌药物可悬浮或溶于水或等渗盐水中,通过皮下、肌内、静脉内和/或腹膜内注射给药。
合成的环状十四肽和抗真菌化合物的体外活性可以使用如上关于RTD-1所述的本领域已知的常规培养技术来测定,并且可以用于测定亚抗真菌浓度。系统性或播散性念珠菌病可通过例如以约2×105至约2×107CFU/mL的生物量用0.15至2mL的白色念珠菌(参考株或抗性株)攻击近交系BALB/c或远缘CD-I雌性小鼠来体内建模。在用病原体攻击之前、在病原体攻击时或在用病原体攻击之后,可以用候选合成环状十四肽治疗动物。在这种系统性或播散性念珠菌病的体内模型中,抗真菌药物和/或候选合成环状十四肽可以皮下、肌内、静脉内和/或腹膜内给药。
发明人已经鉴定了许多新的θ-防御素类似物,其在体内显示出显著的抗真菌活性。示例性环肽的氨基酸序列如表2所示。应当理解,氨基酸身份是使用如图7A中建立的环状结构内的相应位置的数字名称来指示的。
根据图7A所示的约定指定氨基酸位置。
表2
肽环肽1、环肽2、环肽3和环肽4示出了与环肽5的共同结构特征,本发明人相信其将与在播散性真菌疾病的体内模型中显示抗真菌和抗炎活性的其它合成环肽十四肽相同。
环肽6与模型肽环肽5的显著不同之处在于,在参与肽二硫键的半胱氨酸之间插入精氨酸(即在“C-X-C盒”内),并且在表2中氨基酸6、7、8和9所定义的第一β转角处不包括连续(即相邻)精氨酸的三联体。发明人认为,环肽6代表与环肽1、环肽2、环肽3和环肽4所代表的家族不同的合成环状十四肽θ-防御素类似物家族。本发明人还认为,在播散性真菌感染的体内模型中,合成的环状十四肽(包括由两对二硫键连接的半胱氨酸限定的C-X-C盒结构内的多个精氨酸和/或在6、7和8位缺乏连续/相邻精氨酸的特征性三联体)可具有显著的抗真菌活性。
在活性研究中,将最初被鉴定为具有显著抗真菌活性的合成环状十四肽环肽5(SEQ ID NO.6)用作模型肽。简而言之,在T=0时,用3×105CFU白色念珠菌SC5314对7-8周龄的免疫活性雌性BALB/c小鼠进行的静脉注射(i.v.)以感染。感染后24小时,小鼠腹腔注射(i.p.)生理盐水、氟康唑(Fluco)、卡泊芬净(Caspo)或合成环十四肽进行治疗,每天一次,持续7天。发明人先前已经确定,在该体内模型中,模型肽环肽5比天然θ-防御素RTD-1有效得多,因为0.25mg/kg的环肽5比5mg/kg的RTD-1效果更好。两种肽均比5mg/kg氟康唑效果更好(见图9)。然而,将环肽5肽剂量降低至0.1mg/kg对存活率没产生有益效果(见图10)。
当以>5mg/kg的剂量给药时,通过测定无毒性,对候选合成环状十四肽进行了耐受性预筛选。在上述念珠菌病模型中筛选候选合成环状十四肽的有效性,从感染后24小时开始每天给予每种肽(0.1和0.5mg/kg)7天,将每种候选肽与环肽5参考肽和氟康唑进行比较。
根据这些试验方案,用盐水处理的白色念珠菌感染小鼠出现了皱缩的皮毛和显著的体重减轻,并在5-10天内变得奄奄一息,此时体重减轻>30%。相比之下,长期存活的环肽5治疗的念珠菌病小鼠的体重出现短暂的15%平均下降,在第10天稳定下来,该组中90%的小鼠在第3天恢复了初始体重。
利用念珠菌病模型,并以存活率作为疗效指标,鉴定出多个与环肽5相当或优于环肽5的合成环肽。其中包括环肽3、环肽4、环肽1、环肽2和环肽6。来自这些的体内播散性念珠菌病模型的结果如图10至15所示。
图10示出了使用0.25mg/kg或0.1mg/kg环肽5的试验的典型结果。发现环肽5相对无效,结果与盐水治疗相似。图11示出了用0.25mg/kg的环肽5和0.1mg/kg的环肽3治疗的典型结果的比较。发现环肽3在此相对低的剂量下有效。图12示出了来自环肽5和环肽4的比较研究的典型结果,其中两种肽以0.25mg/kg施用。环肽4在此剂量下有效。图13示出了用环肽5和环肽1治疗的典型结果的比较,其中两种肽以0.25mg/kg施用。环肽1在此剂量下有效。图14示出了0.25mg/kg的环肽5和0.1mg/kg的环肽l的比较研究的典型结果。环肽1在此相对低的剂量下有效。
如上所述,环肽6与本文引用的其他肽的不同之处在于,在肽的特征性β转角部分(由AA6、AA7、AA8和AA9限定)内缺少连续(即相邻)精氨酸残基的三联体,并且在该环肽家族的特征性C-X-C盒内具有强碱性精氨酸残基而非疏水性氨基酸。图15示出了来自环肽5和环肽6之间的比较研究的典型数据,其中肽以0.25mg/kg施用。发现环肽6的存活率超过了现有技术抗真菌药物(氟康唑)和环肽5。
在每一个病例中,指定的合成环状十四肽提高了存活率,并且效果非常显著(P<1×105,log-rank分析)。通过终点分析(第30天χ2分析,p.i.),环肽3、环肽4、环肽1和环肽6在提高生存率方面比氟康唑更有效。在该体内模型中,所有鉴定出的合成环状十四肽均可防止体重显著减轻。
在濒死盐水处理对照组(第5-10天p.i.)和长期存活者(30天p.i.)的肾匀浆中测定了肾真菌负荷。用合成的环状十四肽或氟康唑治疗。如图16所示,合成的环状十四肽(0.1或0.25mg/kg)和5mg/kg氟康唑降低了真菌负荷。环肽5、环肽3、环肽4和环肽1降低真菌负荷的程度大于氟康唑(图16中的星号;通过FisherLSD检验分析:环肽5(P=3×10-3)、环肽3(P=7.4×10-3)、环肽4(P=0.02)和环肽1(P=3.5×10-5)。
鉴定了许多序列特征,与这些参考肽相比,这些特征赋予RTD-1和环肽5衍生的类似物优越的活性。如上所述,环肽3、环肽4、环肽1和环肽2代表一组合成的环状十四肽θ-防御素类似物,其显示出明显的结构相似性。本发明人相信,该家族中具有显著抗真菌和/或抗炎活性的θ-防御素类似物可至少具有:
·两个二硫键,分别位于Cys3和Cysl2之间以及Cys5和Cys10之间。
·丝氨酸或位于θ-防御素类似物一级结构中Cys3和Cys5之间以及Cys10和Cysl2之间的疏水性氨基酸(即4和11位),其中疏水性氨基酸优选亮氨酸或异亮氨酸。结合上面提到的二硫键,这定义了肽的环状一级结构中的“C-X-C盒”特征,其中“C”是半胱氨酸,“X”是丝氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
·总共五个精氨酸残基,使肽在生理pH下的电荷为+5。
·位置6、7和8处(即第一β转角内)的一组相邻精氨酸三联体。
在一些实施方案中,活性θ-防御素类似物还可以包括一个或多个以下特征:
·1位的甘氨酸。
·2位和9位疏水性氨基酸,优选缬氨酸或亮氨酸。
·第二β转角中的精氨酸对(如13和14位)。
候选肽的毒性表明,活性θ-防御素类似物不应包括以下一种或多种:
·4位丙氨酸。
·11位丙氨酸。
因此,本发明人相信合成的环状十四肽θ-防御素类似物将有效地降低播散性真菌感染中的死亡率和/或改善播散性真菌感染中的长期存活,并且可有效地治疗以调节炎症或免疫应答失调为特征的其它病症,所述环状十四肽θ-防御素类似物包括如上所述的“C-X-C盒”结构、在6、7和8位的相邻精氨酸残基的三联体、在9位的疏水性氨基酸(例如缬氨酸或苯丙氨酸,并且由于精氨酸含量而具有+5的净正电荷(约占总氨基酸含量的36%)。
本发明人认为环肽6是θ-防御素的不同合成环状十四肽类似物家族的代表,其具有全部或部分上述特征,但以下情况除外:
·C-X-C盒中存在多个两个或多个带正电荷的氨基酸(如精氨酸、赖氨酸)
·在AA6、AA7、AA8和AA9定义的第二β转角内缺乏连续(即相邻)的精氨酸三联体。
本文所述的θ-防御素的合成环状十四肽类似物可使用任何合适的方法应用。例如,此类类似物可通过注射或输注提供。观察到的一些θ-防御素类似物的高度有效性表明,可通过简单的皮下、皮内、真皮下和/或肌内注射向需要治疗的个体提供有效量的这些类似物。
或者,环状结构和二硫键的存在所赋予的低分子量和高度稳定性可允许口服施用本发明构思的θ-防御素类似物。这种口服给药可以包括在适于口服给药的液体药物载体中施用θ-防御素类似物的溶液或悬浮液。在一些实施方案中,θ-防御素类似物可以以干燥或冻干形式提供,其在口服给药之前在液体介质中重构。此类干燥或冻干制剂可包括稳定剂。合适的稳定剂包括碳水化合物(例如甘露醇、蔗糖、海藻糖)和/或蛋白质(例如白蛋白)。
或者,θ-防御素类似物可以以片剂、胶囊、丸剂或其它适合口服给药的固体和紧密形式提供。此类制剂可包括包衣、壳或提供θ-防御素类似物延迟释放(例如,延迟释放直至到达小肠)的类似组分。此类制剂可在外壳或包衣内包含液体形式的θ-防御素。或者,此类制剂可包括干燥或冻干形式的θ-防御素类似物。合适的干燥或冻干形式包括粉末、颗粒和压缩固体。此类干燥或冻干制剂可包括稳定剂。合适的稳定剂包括碳水化合物(例如甘露醇、蔗糖、海藻糖)和/或蛋白质(例如白蛋白)。
如上所述,本发明构思的θ-防御素类似物可有效治疗播散性真菌感染和相关脓毒症和/或脓毒性休克。在一些实施方案中,这种治疗是对正在进行的急性病症的应答。在其它实施方案中,这种治疗是预防性的,例如当个体被怀疑患有或很有可能患上这种疾病时,用于预防播散性真菌感染的发展。可以通过以任何合适的时间表施用本发明构思的θ-防御素类似物来提供治疗。例如,θ-防御素类似物可以以单剂量、周期性剂量或连续输注的形式提供。周期性剂量给药可以在任何合适的时间间隔进行。合适的间隔可以是每小时、每2小时、每4小时、每天4次、每天3次、每天2次、每天1次、每2天、每3天、每周2次、每周1次、每2周、每4周、每2个月、每3个月、每4个月、每年3次、每年2次或每年1次。
在一些实施方案中,θ-防御素类似物的给药模式可以在治疗过程中改变。例如,本发明构思的θ-防御素类似物最初可以通过静脉内注射或输注给药(例如,在急性播散性真菌感染中快速提供有效浓度),随后进行皮内注射、肌内注射和/或口服给药,以在剩余的治疗期间维持有效浓度。
为了预防性使用,可以在可观察到的症状出现之前给予θ-防御素类似物。为了治疗活动性疾病或病症,可给予θ-防御素类似物一段时间,以有效治疗该疾病或病症。这一期限可以超过受控的时间,也可以是长期的(例如,用于治疗慢性疾病)。
在本发明构思的一些实施方案中,θ-防御素类似物可与其它药物活性化合物组合使用。合适的化合物包括θ-防御素、不同的θ-防御素类似物、抗真菌抗生素、抗细菌抗生素、抗病毒剂、抗炎药物(例如类固醇、非类固醇抗炎药物)、血管加压药和/或生物制剂(例如抗体或抗体片段)。此类额外的药物化合物可按θ-防御素类似物的相同时间表或独立时间表提供。在一些实施方案中,可以提供包含θ-防御素类似物的制剂,其包含一种或多种这样的额外的药物活性化合物。本发明人相信,这种联合治疗可以提供协同效应,其中θ-防御素类似物与额外的药物活性化合物联合给药的累积效应超过使用θ-防御素类似物和额外的药物活性化合物的治疗所观察到的个体效应的总和,其量与用于联合治疗的量相当。
对本领域技术人员来说显而易见的是,在不脱离本文的发明构思的情况下,除了已经描述的那些之外,许多更多的修改是可能的。因此,除了所附权利要求的精神之外,本发明的主题不受限制。此外,在解释说明书和权利要求时,所有术语都应该以与上下文一致的尽可能广泛的方式来解释。特别地,术语“包括”和“包含”应当被解释为以非排他性的方式指代元件、组件或步骤,表示所引用的元件、组件或步骤可以存在,或被利用,或与未明确引用的其他元件、组件或步骤相结合。其中说明书权利要求书涉及选自A、B、C....和N,文本应被解释为只需要该可选范围中的一个元素,而不是A+N,或B+N等。
序列表
<110> 迈克尔·塞尔斯特德
<120> 用于治疗真菌感染的组合物和方法
<130> 103388.0010PCT
<150> US 63/044943
<151> 2020-06-26
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> Macaca mulatta
<400> 1
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1 5 10 15
Thr Arg
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环肽1
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环肽3
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<211> 14
<212> PRT
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<220>
<223> 环肽4
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1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 环肽6
<400> 7
Gly Val Cys Arg Cys Arg Arg Gly Val Cys Arg Cys Arg Arg
1 5 10
Claims (67)
2.根据权利要求1所述的环肽,其中AA1是甘氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的环肽,其中,AA2是第一疏水性氨基酸。
4.根据权利要求3所述的环肽,其中所述第一疏水性氨基酸是缬氨酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的环肽,其中,AA9是第二疏水性氨基酸。
6.根据权利要求5所述的环肽,其中所述第二疏水性氨基酸是缬氨酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的环肽,其中AA13是精氨酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的环肽,其中AA14是精氨酸。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的环肽,其中所述环肽是θ-防御素的类似物,并且其中当所述环肽在鼠播散性念珠菌病模型中系统应用时,相对于所述θ-防御素提供改善的存活率。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的环肽,其中所述环肽在应用于播散性念珠菌病的小鼠模型时提供双相应答,其中所述双相应答包括动员具有抗真菌活性的宿主效应细胞的第一阶段和调节宿主炎性应答的第二阶段。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的环肽,其中所述环肽具有TACE抑制活性。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的环肽,其中所述环肽抑制促炎细胞因子的表达、加工和释放中的至少一种。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的环肽,其中所述环肽在暴露于极端温度、低pH值、冷冻和/或解冻以及溶解于生物基质中的环境之后保持活性。
14.根据权利要求13所述的环肽,其中所述生物基质选自血液、血浆和血清。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的环肽,其中所述环肽在有效治疗播散性真菌感染病的剂量下是非免疫原性的。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的环肽,其中所述环肽激活宿主免疫系统以增强宿主对病原体的清除。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的环肽,其中所述环肽的特征在于,在有效治疗播散性真菌感染病的剂量下调节炎症以助于疾病消退和改善疾病存活率的活性。
19.根据权利要求18所述的方法,其中AA1是甘氨酸。
20.根据权利要求18或19所述的方法,其中AA2是第一疏水性氨基酸。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述第一疏水性氨基酸是缬氨酸。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法,其中AA9是第二疏水性氨基酸。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述第二疏水性氨基酸是缬氨酸。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的方法,其中AA13是精氨酸。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的方法,其中AA14是精氨酸。
26.根据权利要求18至25中任一项所述的方法,其中所述环肽是θ-防御素的类似物,并且其中当所述环肽在播散性念珠菌病的小鼠模型中系统应用时,相对于θ-防御素提供改善的存活率。
27.根据权利要求18至26中任一项所述的方法,其中所述方法在应用于播散性念珠菌病的小鼠模型时提供双相应答,其中所述双相应答包括动员具有抗真菌活性的宿主效应细胞的第一阶段和调节宿主炎性应答的第二阶段。
28.根据权利要求18至27中任一项所述的方法,其中所述方法抑制TACE活性。
29.根据权利要求18至28中任一项所述的方法,其中所述方法抑制促炎细胞因子的表达、加工和释放中的至少一种。
30.根据权利要求18至29中任一项所述的方法,其中所述环肽在暴露于极端温度、低pH值、冷冻和/或解冻以及溶解于生物基质中的环境之后保持活性。
31.根据权利要求30所述的方法,其中所述生物基质选自血液、血浆和血清。
32.根据权利要求18至31中任一项所述的方法,其中所述环肽在有效治疗或预防播散性真菌感染病的剂量下是非免疫原性的。
33.根据权利要求18至32中任一项所述的方法,其中所述环肽激活宿主免疫系统以增强宿主对病原体的清除。
35.根据权利要求34所述的用途,其中AA1是甘氨酸。
36.根据权利要求34或35所述的用途,其中AA2是第一疏水性氨基酸。
37.根据权利要求36所述的用途,其中所述第一疏水性氨基酸是缬氨酸。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的用途,其中AA9是第二疏水性氨基酸。
39.根据权利要求38所述的用途,其中所述第二疏水性氨基酸是缬氨酸。
40.根据权利要求34至39中任一项所述的用途,其中AA13是精氨酸。
41.根据权利要求34至40中任一项所述的用途,其中AA14是精氨酸。
42.根据权利要求34至41中任一项所述的用途,其中所述环肽是θ-防御素的类似物,并且其中当所述环肽在鼠脓毒症模型中系统应用时,相对于所述θ-防御素提供改善的存活率。
43.权利要求34至42中任一项所述的用途,其中所述环肽在应用于脓毒症的小鼠模型时提供双相应答,其中所述双相应答包括募集具有抗微生物活性的宿主效应细胞的第一阶段和调节宿主炎性应答的第二阶段。
44.根据权利要求34至43中任一项所述的用途,其中所述环肽具有TACE抑制活性。
45.权利要求34至44中任一项所述的用途,其中所述环肽抑制促炎细胞因子的表达、加工和释放中的至少一种。
46.根据权利要求34至45中任一项所述的用途,其中所述环肽在暴露于极端温度、低pH值、冷冻和/或解冻以及溶解于生物基质中的环境之后保持活性。
47.根据权利要求46所述的用途,其中所述生物基质选自血液、血浆和血清。
48.根据权利要求34至47中任一项所述的用途,其中所述环肽在有效治疗或预防播散性真菌疾病的剂量下是非免疫原性的。
49.根据权利要求34至48中任一项所述的用途,其中所述环肽激活宿主免疫系统以增强宿主对病原体的清除。
50.根据权利要求34至49中任一项所述的用途,其中所述环肽的特征在于,在有效治疗或预防播散性真菌疾病的剂量下调节炎症以助于疾病消退和改善疾病存活率的活性。
52.根据权利要求51所述的用途,其中AA1是甘氨酸。
53.根据权利要求51或52所述的用途,其中AA2是第一疏水性氨基酸。
54.根据权利要求53所述的用途,其中所述第一疏水性氨基酸是缬氨酸。
55.根据权利要求51至54中任一项所述的用途,其中AA9是第二疏水性氨基酸。
56.根据权利要求55所述的用途,其中所述第二疏水性氨基酸是缬氨酸。
57.根据权利要求51至56中任一项所述的用途,其中AA13是精氨酸。
58.根据权利要求51至57中任一项所述的用途,其中AA14是精氨酸。
59.根据权利要求51至58中任一项所述的用途,其中所述环肽是θ-防御素的类似物,并且其中当所述环肽在播散性念珠菌病的小鼠模型中系统应用时,相对于θ-防御素提供改善的存活率。
60.根据权利要求51至59中任一项所述的用途,其中所述环肽在应用于播散性念珠菌病的小鼠模型时提供双相应答,其中所述双相应答包括募集具有抗微生物活性的宿主效应细胞的第一阶段和调节宿主炎性应答的第二阶段。
61.根据权利要求51至60中任一项所述的用途,其中所述环肽具有TACE抑制活性。
62.根据权利要求51至61中任一项所述的用途,其中所述环肽抑制促炎细胞因子的表达、加工和释放中的至少一种。
63.根据权利要求51至62中任一项所述的用途,其中所述环肽在暴露于极端温度、低pH值、冷冻和/或解冻以及溶解于生物基质中的环境之后保持活性。
64.根据权利要求63所述的用途,其中所述生物基质选自血液、血浆和血清。
65.根据权利要求51至64中任一项所述的用途,其中所述环肽在有效治疗或预防播散性真菌疾病的剂量下是非免疫原性的。
66.根据权利要求51至65中任一项所述的用途,其中所述环肽激活宿主免疫系统以增强宿主对病原体的清除。
67.根据权利要求51至66中任一项所述的用途,其中所述环肽的特征在于,在有效治疗或预防播散性真菌疾病的剂量下调节炎症以助于疾病消退和改善疾病存活率的活性。
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