CN115772499A - 293t多靶点靶细胞及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞免疫工程技术领域，具体涉及一种293T多靶点靶细胞及其制备方法和应用。该靶细胞包括表达抗原CEA的核苷酸片段a、表达抗原CD19的核苷酸片段b、表达抗原BCMA的核苷酸片段c、表达抗原CD70的核苷酸片段d。其制备方法是选择一款基础细胞(293T细胞)，通过外源构建的方式构建，再通过流式检测其抗原表达，分选出同时高表达抗原CEA、CD19、BCMA和CD70的靶细胞作为目标细胞。该靶细胞外源表达多个抗原可用于多个靶点的检测，将需要重复4次的操作浓缩为一次的操作，减少了细胞培养工作量，大大节省了时间以及成本，而且检测时本底因子分泌量正常，因子检测结果稳定、信噪比更高，更有利于后续产品的质量检测。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫工程技术领域，具体涉及一种293T多靶点靶细胞及其制备方法和应用。
背景技术
现有细胞体外药效评价方法中，靶细胞通常是对应适应症的单个靶点细胞，例如B系急性淋巴细胞白血病的CAR-T细胞评价，对应靶细胞为内源表达CD19的NALM6细胞，多发性骨髓瘤的CAR-T细胞评价，对应靶细胞为内源表达BCMA的MM.1S细胞，若要评价多种适应症的CAR-T细胞药效，则需培养多个肿瘤细胞，这样不仅工作量较大，而且一次性培养多种细胞，出错率也会大大增加；另外，细胞体外药效评价实验方法中，不同适应症会有一个不同的阴性对照靶细胞，目前，大多数阴性单个靶点的对照靶细胞存在本底因子分泌量较高的问题，影响了体外药效整体评价，影响药物的质量控制。
293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。许多真核表达载体如pcDNA3.1中含有SV40病毒的复制起始位点，可以在表达SV40病毒T抗原的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平。因此293T细胞广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白，且该细胞易培养、生长快，为了达到实验的方便以及体外药效整体评价的好的效果，本发明采用293T细胞作为靶细胞，但是在293T细胞上表达多种抗原，可能会存在多种抗原之间互相影响表达、表达多个抗原也可能会对293T细胞本身造成一定的影响，本发明基于以上的目的以及克服了实验过程中的重重不确定因素，最后构建成了针对多个靶点的293T标准化细胞。
发明内容
有鉴于此，本发明在于提供一种靶细胞，所述靶细胞可以同时表达抗原CEA、抗原CD19、抗原BCMA和抗原CD70，细胞上表达多种抗原的靶细胞，可能会存在多种抗原之间互相影响表达、表达多个抗原也可能会对靶细胞本身造成一定的影响，本发明技术方案克服了重重不确定因素，最后构建成了针对多个靶点的靶细胞。
所述靶细胞包括表达抗原CEA的核苷酸片段a和表达抗原CD19的核苷酸片段b和表达抗原BCMA的核苷酸片段c和表达抗原CD70的核苷酸片段d。
进一步，所述靶细胞还包括表达标记蛋白的核苷酸片段。
进一步，所述核苷酸片段a和/或所述核苷酸片段b和/或所述核苷酸片段c和/或所述核苷酸片段d分别连在非/同一个表达载体上；连接于非同一个表达载体时，所述表达载体的类型相同或者不同。
优选地，所述表达载体可以是病毒载体，也可以是其他适用的真核或原核表达载体。
进一步，所述靶细胞是293T作为基础细胞，通过外源构建的方式进行改造的，改造得到“293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP靶细胞”或“293T-CEA-CD19-BCMA-CD70靶细胞”。
本发明进一步提供前述的靶细胞的制备方法，该制备方法是选择一款基础细胞，通过外源构建的方式构建，再通过流式检测其抗原表达，分选出同时高表达四种抗原(抗原CEA、抗原CD19、抗原BCMA和抗原CD70)的靶细胞作为目标细胞。
所述高表达四种抗原的靶细胞的制备方法包括：将所述核苷酸片段a、所述核苷酸片段b、所述核苷酸片段c、所述核苷酸片段d分别选择合适的感染系数转染到靶细胞a上；所述核苷酸片段a、核苷酸片段b、核苷酸片段c、核苷酸片段d的感染系数均为8-12MOI，优选为10MOI。
进一步，所述核苷酸片段的转染是分次进行，转染顺序可以是任意顺序组合中的一种。优选地，将所述核苷酸片段a、所述核苷酸片段b、所述核苷酸片段c、所述核苷酸片段d依次转染到所述靶细胞a。
进一步，所述转染的方式包括：将所述核苷酸片段a、所述核苷酸片段b、所述核苷酸片段c、所述核苷酸片段d分别连接在不同的表达载体上进行转染，表达载体可以是病毒载体，也可以是其他适用的真核或原核表达载体，优选为病毒载体。即表达载体是选自市场上能购买的或者本申请人其他专利中的表达载体。转染方法为本领域技术人员的常规转染，与申请人其他相关专利中的转染方式一致。
进一步，所述制备方法还包括：使用标记蛋白的核苷酸序列转染到所述靶细胞a，优选地，所述标记蛋白为Luc-GFP。
进一步，所述制备方法还包括：转染结束并进行培养后，使用对应的抗体标记所述靶细胞，然后分选出抗原CEA、抗原CD19、抗原BCMA和抗原CD70均表达阳性的细胞群。
优选地，分选的方式为流式检测其抗原表达进行分选，一般使用流式检测仪器进行分选。分选后扩大培养并建库。
进一步，转染后的培养为常规的靶细胞培养，使用常规的培养基，培养常规的时间。
优选地，所述靶细胞a为293T细胞。293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。许多真核表达载体如pcDNA3.1中含有SV40病毒的复制起始位点，可以在表达SV40病毒T抗原的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平。因此293T细胞广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白，且该细胞易培养、生长快。
本发明目的在于还提供一种前任一所述的同时高表达四种抗原的靶细胞的应用，所述靶细胞可以作为细胞体外药效评价试剂进行应用，所述靶细胞也可以在制备细胞体外药效评价试剂或装置中进行应用。
进一步，所述细胞体外药效评价试剂或装置为检验CAR-T细胞杀伤效果试剂或装置或者检验CAR-T细胞因子分泌量试剂或装置，所述CAR-T细胞靶向CEA、CD19、BCMA、CD70中至少一种。
优选地，所述靶细胞可以作为B系急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、CEA阳性恶性肿瘤、肾细胞癌四种适应症其中一种或多种的体外药效评价的阳性对照靶细胞。
本发明有益效果在于
本发明提供的同时表达CEA、CD19、BCMA、CD70四种抗原的靶细胞外源表达多个靶点，将需要重复4次的操作浓缩为一次的操作，减少了细胞培养工作量，大大节省了时间以及成本。
本发明提供的同时表达CEA、CD19、BCMA、CD70四种抗原的293T靶细胞，检测时本底因子分泌量正常，因子检测结果稳定、信噪比更高，更有利于后续产品的质量检测。
本发明提供的同时表达CEA、CD19、BCMA、CD70四种抗原的靶细胞，在293T细胞上表达的这4个抗原互相不影响，都能正常表达，并且也都能达到相应靶点的质控效果。
附图说明
图1为多靶点靶细胞的CEA抗原表达流式图。
图2为多靶点靶细胞的CD19抗原表达流式图。
图3为多靶点靶细胞的BCMA抗原表达流式图。
图4为多靶点靶细胞的CD70抗原表达流式图。
图5为多靶点靶细胞的GFP表达流式图。
图6为多靶点靶细胞的CEA靶点与常规靶细胞的细胞杀伤结果对比。
图7为多靶点靶细胞的CEA靶点与常规靶细胞的细胞因子分泌实验结果对比。
图8为多靶点靶细胞的CEA靶点与单靶点细胞的细胞杀伤结果对比。
图9为多靶点靶细胞的CEA靶点与单靶点细胞的细胞因子分泌实验结果比对比。
图10为多靶点靶细胞的CD19靶点的细胞杀伤结果。
图11为多靶点靶细胞的CD19靶点的细胞因子分泌结果。
图12为多靶点靶细胞的BCMA靶点的细胞杀伤结果。
图13为多靶点靶细胞的BCMA靶点的细胞因子分泌结果。
图14为多靶点靶细胞的CD70靶点的细胞杀伤结果。
图15为多靶点靶细胞的BCMA靶点的细胞因子分泌结果。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，靶细胞上表达的抗原序列(包含表达抗原CEA、CD19、BCMA、CD70的核苷酸片段)来源如下表1所示：
表1实施例中使用的抗原及来源
| 抗原 | Genebank序列 |
| CEA | NM_004363.6 |
| CD19 | NM_001770.6 |
| BCMA | NM_001192.3 |
| CD70 | NM_001252.5 |
本发明实施例中，表达载体及转染方法选自申请人的另一篇专利201710301492.1，靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体。
本发明实施例中，用Luciferase法检测细胞杀伤和ELISA法检测细胞因子(IFN-γ)分泌验证标准化细胞作为各靶点体外药效评价的阳性靶细胞的可行性，且与各靶点常规用靶细胞以及单靶点外源构建细胞的药效评价结果做对比，评价其一致性。Luciferase法检测细胞杀伤是通过基因转染技术将真核生物的报告酶luciferase(Luc)基因转染靶细胞，建立稳定转染靶细胞系，以此测定CAR-T细胞介导的生物细胞毒性。选择合适的效靶比将靶细胞和CAR-T细胞共同铺入合适体系中，共培养一段时间后，通过试剂盒测定释放入培养液中报告酶活性(代表靶细胞存活数目)，可以计算出效应细胞对靶细胞的杀伤率。
本发明实施中，通过ELISA法检测细胞因子(IFN-γ)分泌，具体为：将收集的共培养后的细胞上清，用Human IFN-γELISA Set试剂盒通过抗原抗体结合的原理，定量检测样本中IFN-γ的含量。
实施例1质控标准化细胞构建
将携带有表达四个抗原(CEA、CD19、BCMA、CD70)和表达Luc-GFP的核苷酸片段的病毒载体，感染系数为10MOI，分次转染到293T细胞上，培养后选择对应的抗体标记该细胞后用流式分选仪器分选出共阳且稳定强表达细胞群，最终得293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP细胞，扩大培养并建库，流式分选后，各抗原表达阳性率检测结果如图1-5所示，CEA抗原表达为98.33％，强表达(图1所示)；CD19抗原表达为99.61％，强表达(图2所示)；BCMA抗原表达为97.65％，强表达(图3所示)；CD70抗原表达为99.94％，强表达(图4所示)；GFP表达为99.32％，强表达(图5所示)。
实施例2靶点验证
(1)CEA靶点验证
1)与常规靶细胞对比验证
用CEA-CAR-T作为效应细胞进行体外药效评价，293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP、293T-Luc-GFP作为靶细胞，对照实验以DLD1-CEA-Luc-GFP、DLD1-Luc-GFP为靶细胞，将两者实验结果进行比较。
细胞杀伤实验结果显示(如表2和图6所示)在E/T＝8:1 24h时，CEA-CAR-T对293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP的杀伤率与对DLD1-CEA-Luc-GFP的杀伤率一致。
表2多靶点靶细胞的CEA靶点与常规靶细胞的细胞杀伤结果对比
细胞因子分泌实验结果显示(如表3和图7所示)，在与对照实验同效靶比条件下，293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP能分泌更高的IFN-γ；另外，两个实验结果均显示用293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP、293T-Luc-GFP作为靶细胞比常规靶细胞的信噪比好。
表3多靶点靶细胞的CEA靶点与常规靶细胞的细胞因子分泌实验结果及信噪比对比
2)与单靶点细胞对比验证
用CEA-CAR-T作为效应细胞进行体外药效评价，293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP、293T-Luc-GFP作为靶细胞，对照实验以293T-CEA-Luc-GFP、293T-Luc-GFP为靶细胞，将两者实验结果进行比较。
细胞杀伤实验结果显示(如表4和图8所示)，在E/T＝8:1 24h时，CEA-CAR-T对293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP的杀伤率与对293T-CEA-Luc-GFP的杀伤率一致。
表4多靶点靶细胞的CEA靶点与单靶点细胞的细胞杀伤结果对比
细胞因子分泌实验结果显示(如表5和图9所示)在与对照实验同效靶比条件下，293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP能分泌更高的IFN-γ。
表5多靶点靶细胞的CEA靶点与单靶点细胞的细胞因子分泌实验结果及信噪比对比
(2)CD19靶点验证
用CD19-CAR-T作为效应细胞进行体外药效评价，以293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP、293T-Luc-GFP作为靶细胞，对照实验以NALM6-Luc-GFP、K562-Luc-GFP为靶细胞，将两者实验结果进行比较。
细胞杀伤实验结果显示(如表6和图10所示)，在E/T＝8:1 24h时，CD19-CAR-T对293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP的杀伤率与对NALM6-Luc-GFP的杀伤率一致。
表6多靶点靶细胞的CD19靶点的细胞杀伤结果
细胞因子分泌实验结果显示(如表7和图11所示)在与对照实验同效靶比条件下，293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP能分泌更高的IFN-γ。
表7多靶点靶细胞的CD19靶点的细胞因子分泌结果和信噪比
(3)BCMA靶点验证
用BCMA-CAR-T作为效应细胞进行体外药效评价，以293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP、293T-Luc-GFP作为靶细胞，对照实验以MM.1S-Luc-GFP、K562-Luc-GFP为靶细胞，将两者实验结果进行比较。
细胞杀伤实验结果显示(如表8和图12所示)，在E/T＝8:1 24h时，BCMA-CAR-T对293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP的杀伤率与对MM.1S-Luc-GFP的杀伤率一致。
表8多靶点靶细胞的BCMA靶点的细胞杀伤结果
细胞因子分泌实验结果显示(如表9和图13所示)，在与对照实验同效靶比条件下，293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP分泌的IFN-γ也与MM.1S-Luc-GFP的分泌量一致。
表9多靶点靶细胞的BCMA靶点的细胞因子分泌结果和信噪比
(4)CD70靶点验证
用CD70-CAR-T作为效应细胞进行体外药效评价，以293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP、293T-Luc-GFP作为靶细胞，对照实验以786-O-Luc-GFP、A549-Luc-GFP为靶细胞，将两者实验结果进行比较。
细胞杀伤实验结果显示(如表10和图14所示)，在E/T＝8:1 24h时，CD70-CAR-T对293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP的杀伤率与对786-O-Luc-GFP的杀伤率一致。
表10多靶点靶细胞的CD70靶点的细胞杀伤结果
细胞因子分泌实验结果显示(如表11和图15所示)，在与对照实验同效靶比条件下，293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP能分泌更高的IFN-γ；另外，两个实验结果均显示用293T-CEA-CD19-BCMA-CD70-Luc-GFP、293T-Luc-GFP作为靶细胞比常规靶细胞的信噪比好。
表11多靶点靶细胞的BCMA靶点的细胞因子分泌结果和信噪比
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种靶细胞，其特征在于，所述靶细胞包括表达抗原CEA的核苷酸片段a、表达抗原CD19的核苷酸片段b、表达抗原BCMA的核苷酸片段c、表达抗原CD70的核苷酸片段d。
2.根据权利要求1所述的靶细胞，其特征在于，所述靶细胞还包括表达标记蛋白的核苷酸片段。
3.根据权利要求1所述的靶细胞，所述核苷酸片段a和/或所述核苷酸片段b和/或所述核苷酸片段c和/或所述核苷酸片段d分别连在非/同一个表达载体上；连接于非同一个表达载体时，所述表达载体的类型相同或者不同。
4.权利要求1所述的靶细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将所述核苷酸片段a、所述核苷酸片段b、所述核苷酸片段c、所述核苷酸片段d分别选择合适的感染系数转染到靶细胞a上；所述核苷酸片段a、核苷酸片段b、核苷酸片段c、核苷酸片段d的感染系数均为8-12MOI。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将所述核苷酸片段a、所述核苷酸片段b、所述核苷酸片段c、所述核苷酸片段d依次转染到所述靶细胞a。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：使用标记蛋白的核苷酸序列转染到所述靶细胞a。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：转染结束并进行培养后，使用对应的抗体标记所述靶细胞，然后分选出抗原CEA、抗原CD19、抗原BCMA和抗原CD70均表达阳性的细胞群。
8.根据权利要求4-7任一所述的制备方法，其特征在于，所述靶细胞a为293T细胞。
9.权利要求1-3任意一项所述的靶细胞在作为或制备细胞体外药效评价试剂或装置中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细胞体外药效评价试剂或装置为检验CAR-T细胞杀伤效果试剂或装置和/或检验CAR-T细胞因子分泌量试剂或装置，所述CAR-T细胞靶向CEA、CD19、BCMA、CD70中至少一种。
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