CN115754292A - 一种定量检测非小细胞肺癌患者血清sp70的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测非小细胞肺癌患者血清SP70的方法，包括配制工作浓度洗涤液、洗板、加单克隆抗体、加酶标二抗、温育、加显色液、加终止液、OD值测定等步骤。本发明与现有技术相比的优点在于：可用于肿瘤的早期诊断工作中，肿瘤标志物具有较高的灵敏度和特异点，可基于血清检测，操作要求简便。
Description
技术领域
本发明涉及血清检测方法，具体是指一种定量检测非小细胞肺癌患者血清SP70的方法。
背景技术
SP70是指一株抗人非小细胞肺癌单克隆抗体的细胞株，由于其特异性结合的抗原相对分子质量为70000左右，故而命名为SP70。SP70主要存在于癌细胞的胞膜及胞浆当中，其功能研究发现SP70具有抗凋亡、促进增殖、侵袭转移的作用,被认为是肺癌临床诊断及检测当中的分子靶标，同时也被认为是抗癌治疗的靶点，而现有的检测SP70的方法仍然以影像学、组织细胞学以及病理学等方法为主，其中影像学检查方法在早期肺癌中的诊断率较低，而组织细胞学检查方法尽管具有一定诊断准确率，但同样可存在多种原因导致误诊及漏诊的出现。
发明内容
本发明要解决的技术问题是上述技术问题，提供一种具有较高检测水平可用于早期诊断的定量检测非小细胞肺癌患者血清SP70的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种定量检测非小细胞肺癌患者血清SP70的方法，包括以下步骤：
步骤1：将试剂盒从冰箱取出置于室温平衡30分钟后进行实验；
步骤2：配制工作浓度洗涤液：将一瓶30mL的浓缩洗液，室温环境下加入到装有570mL纯水的1L试剂瓶中，充分混匀，置于2℃～8℃条件下保存；
步骤3：取出抗SP70酶标反应板，将剩余微孔板条放入密封袋内，置冰箱2℃～8℃条件下保存；
步骤4：溶解标准品：分别用移液器吸取120μL的纯水加入装有冻干粉的标准管中，溶解SP70冻干标准品并充分混匀得SP70标准品；
步骤5：用移液器分别吸取100μL的SP70标准品、样本加到相应的检测孔内，在10分钟内完成加样过程，将反应板置于37℃水浴锅搁板上，37℃温育60分钟，弃去温育液体；
步骤6：洗板：机器洗：每孔加250μL工作浓度洗涤缓冲液，洗涤共4次；手工洗：弃掉孔内液体，每孔加250μL工作浓度洗涤缓冲液，弃液，甩干，在吸水纸上拍干，重复4次；
步骤7：加单克隆抗体：取所需单克隆抗体用抗体稀释液100倍稀释后制得单克隆抗体工作液，每孔内加入100μL抗体工作液后将反应板置于37℃水浴锅搁板上，37℃温育30分钟，弃去温育液体；
步骤8：洗板：机器洗：每孔加250μL工作浓度洗涤缓冲液，洗涤共4次；手工洗：弃掉孔内液体，每孔加250μL工作浓度洗涤缓冲液，弃液，甩干，在吸水纸上拍干，重复4次；
步骤9：加酶标二抗：抗体稀释液100倍稀释所需酶标二抗后得酶标二抗工作液，每孔内加入100μL酶标二抗工作液；
步骤10：温育：将反应板置于37℃水浴锅搁板上，37℃温育30分钟，弃去温育液体；
步骤11：洗板：操作同前，清洗5次；
步骤12：加显色液：每孔内加入100μL的TMB后将反应板置于室温避光处反应15分钟；
步骤13：加终止液：每孔内加入50μL的终止液，轻晃板的边缘，混匀30秒钟，检查并去除每孔内的气泡；
步骤14：OD值测定：用酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值，终止后15分钟内完成酶标仪的读数。
本发明与现有技术相比的优点在于：可用于肿瘤的早期诊断工作中，肿瘤标志物具有较高的灵敏度和特异点，可基于血清检测，操作要求简便。
附图说明
图1是本发明一种定量检测非小细胞肺癌患者血清SP70的方法的精密度验证结果。
图2是本发明一种定量检测非小细胞肺癌患者血清SP70的方法的正确度验证结果。
图3是本发明一种定量检测非小细胞肺癌患者血清SP70的方法的参考区间验证结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。
结合附图1、附图2和附图3，一种定量检测非小细胞肺癌患者血清SP70的方法，包括以下步骤：
步骤1：将试剂盒从冰箱取出置于室温平衡30分钟后进行实验；
步骤2：配制工作浓度洗涤液：将一瓶30mL的浓缩洗液，室温环境下加入到装有570mL纯水的1L试剂瓶中，充分混匀，置于2℃～8℃条件下保存；
步骤3：取出抗SP70酶标反应板，将剩余微孔板条放入密封袋内，置冰箱2℃～8℃条件下保存；
步骤4：溶解标准品：分别用移液器吸取120μL的纯水加入装有冻干粉的标准管中，溶解SP70冻干标准品并充分混匀得SP70标准品；
步骤5：用移液器分别吸取100μL的SP70标准品、样本加到相应的检测孔内，在10分钟内完成加样过程，将反应板置于37℃水浴锅搁板上，37℃温育60分钟，弃去温育液体；
步骤6：洗板：机器洗：每孔加250μL工作浓度洗涤缓冲液，洗涤共4次；手工洗：弃掉孔内液体，每孔加250μL工作浓度洗涤缓冲液，弃液，甩干，在吸水纸上拍干，重复4次；
步骤7：加单克隆抗体：取所需单克隆抗体用抗体稀释液100倍稀释后制得单克隆抗体工作液，每孔内加入100μL抗体工作液后将反应板置于37℃水浴锅搁板上，37℃温育30分钟，弃去温育液体；
步骤8：洗板：机器洗：每孔加250μL工作浓度洗涤缓冲液，洗涤共4次；手工洗：弃掉孔内液体，每孔加250μL工作浓度洗涤缓冲液，弃液，甩干，在吸水纸上拍干，重复4次；
步骤9：加酶标二抗：抗体稀释液100倍稀释所需酶标二抗后得酶标二抗工作液，每孔内加入100μL酶标二抗工作液；
步骤10：温育：将反应板置于37℃水浴锅搁板上，37℃温育30分钟，弃去温育液体；
步骤11：洗板：操作同前，清洗5次；
步骤12：加显色液：每孔内加入100μL的TMB后将反应板置于室温避光处反应15分钟；
步骤13：加终止液：每孔内加入50μL的终止液，轻晃板的边缘，混匀30秒钟，检查并去除每孔内的气泡；
步骤14：OD值测定：用酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值，终止后15分钟内完成酶标仪的读数。
本发明在具体实施时，根据CLSIEP15-A文件，选取SP70高值、低值两个浓度水平血清样本，浓度分别为29.63mg/dL和9.89mg/dL进行精密度验证，依据CLSIEP15-A2文件，选择厂家的高、低浓度水平的标准品各2份用于正确度验证，选用浓度为0ng/mL标准品20份用于检测限验证，选取20例健康体检者的血清样本，其中男性和女性个体各10例用于参考区间验证，根据CLSIEP6-A,取低值血清样本(L)和高值血清样本(H)各一份，按照1L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、1H比例混合稀释，形成6管不同浓度水平的系列评价样本用于线性范围验证。
本发明的工作原理：试剂盒中反应板微孔内已包被抗SP70多克隆抗体，加入血清后，血清中的SP70抗原与包被在反应孔内的抗体结合，形成抗原抗体复合物后，加入鼠抗人SP70单克隆抗体NJ001与复合物结合，通过加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鼠IgG抗体，过氧化物酶HRP的催化其底物四甲基联苯胺(TMB)转为蓝色，终止反应后，通过波长450nm酶标读数仪测定光密度(OD值)，根据血清样本中SP70的浓度水平与OD值呈正比关系，从标准曲线中求得样品浓度。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种定量检测非小细胞肺癌患者血清SP70的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1：将试剂盒从冰箱取出置于室温平衡30分钟后进行实验；
步骤2：配制工作浓度洗涤液：将一瓶30mL的浓缩洗液，室温环境下加入到装有570mL纯水的1L试剂瓶中，充分混匀，置于2℃～8℃条件下保存；
步骤3：取出抗SP70酶标反应板，将剩余微孔板条放入密封袋内，置冰箱2℃～8℃条件下保存；
步骤4：溶解标准品：分别用移液器吸取120μL的纯水加入装有冻干粉的标准管中，溶解SP70冻干标准品并充分混匀得SP70标准品；
步骤5：用移液器分别吸取100μL的SP70标准品、样本加到相应的检测孔内，在10分钟内完成加样过程，将反应板置于37℃水浴锅搁板上，37℃温育60分钟，弃去温育液体；
步骤6：洗板：机器洗：每孔加250μL工作浓度洗涤缓冲液，洗涤共4次；手工洗：弃掉孔内液体，每孔加250μL工作浓度洗涤缓冲液，弃液，甩干，在吸水纸上拍干，重复4次；
步骤7：加单克隆抗体：取所需单克隆抗体用抗体稀释液100倍稀释后制得单克隆抗体工作液，每孔内加入100μL抗体工作液后将反应板置于37℃水浴锅搁板上，37℃温育30分钟，弃去温育液体；
步骤8：洗板：机器洗：每孔加250μL工作浓度洗涤缓冲液，洗涤共4次；手工洗：弃掉孔内液体，每孔加250μL工作浓度洗涤缓冲液，弃液，甩干，在吸水纸上拍干，重复4次；
步骤9：加酶标二抗：抗体稀释液100倍稀释所需酶标二抗后得酶标二抗工作液，每孔内加入100μL酶标二抗工作液；
步骤10：温育：将反应板置于37℃水浴锅搁板上，37℃温育30分钟，弃去温育液体；
步骤11：洗板：操作同前，清洗5次；
步骤12：加显色液：每孔内加入100μL的TMB后将反应板置于室温避光处反应15分钟；
步骤13：加终止液：每孔内加入50μL的终止液，轻晃板的边缘，混匀30秒钟，检查并去除每孔内的气泡；
步骤14：OD值测定：用酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值，终止后15分钟内完成酶标仪的读数。
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