CN115753727B - 一种Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针、层析试条及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS‑CoV‑2检测探针、层析试条及制备方法与应用。所述检测探针的制备方法包括：(1)将黑磷晶体研磨成粉末，加入到除氧去离子水中；氩气环境下进行超声剥离，离心去沉淀，得磷烯(Pp)纳米片悬浮液；(2)向悬浮液中加入硝酸银溶液，日光灯下光还原，向Pp纳米片引入Ag纳米颗粒，得Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片；(3)将Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片吸附罗丹明B(RhB)探针分子，得修饰RhB探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片；(4)将RhB探针分子活化并修饰SARS‑CoV‑2病毒N蛋白抗体，经二次尺寸筛选，得Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS‑CoV‑2检测探针。
Description
技术领域
本发明涉及二维复合纳米材料设计和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测技术，具体涉及一种Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针、层析试条及制备方法与应用，属于病毒检测领域。
背景技术
传染病持续威胁着人类健康，2019年由SARS-CoV-2引起的COVID-19全球大流行继续对人类健康和全球经济造成破坏性影响。快速诊断检测对于疾病的预防和治疗以及大流行的遏制至关重要。侧流免疫分析(LFA)是使用最为广泛的即时(POC)诊断测试技术之一，无需经过专门培训的人员即可实现快速的实时检测。
目前，常用的新冠病毒检测手段为荧光定量qPCR核酸检测方法，其灵敏度较高，但是检测耗时较长(≥2h)，且需要专门的设备、熟练的操作人员以及昂贵的化学试剂。传统的LFA新冠抗原检测作为一种辅助手段，尽管速度快(15～30分钟)，但灵敏度低，容易造成漏检。近年来，使用由微米级和纳米级材料制成的横向流动生物传感器已经实现了改进的特异性。基于颜色、电化学信号、磁性、发光和表面增强拉曼光谱的信号读数已与LFA集成以进行量化分析。
表面增强拉曼光谱(SurfaceEnhancedRamanSpectroscopy，SERS)是一种快速无损的检测技术，被称为检测物的“指纹光谱”。基于SERS技术的生物传感器已经广泛地应用于蛋白、病毒以及癌症的检测中，具有简单的操作过程以及高的检测灵敏度。目前已有技术将SERS与LFA技术连用，可以将LFA的灵敏度提高两个数量级或以上。但是，目前无论基于胶体金还是乳胶法的LFA试条都存在灵敏度的瓶颈。相对于PCR检测，抗原检测没有扩增的步骤，因此每次取样得到的病毒数量是有限的，既每次检测的抗原数量有极限值，那么通过双抗夹心法被固定在T线上的纳米探针数量便存在极限值。不论是视觉辨认还是结合SERS等技术手段，LFA试条的灵敏度都很难继续提升。
因此，若要继续提高LFA试条的灵敏度，不能仅从抗原-抗体结合效率抑或信号识别手段出发，开发新的技术手段以提高层析试条T线上被固定的探针数量，才能进一步提高抗原检测的灵敏度。目前的抗原检测乳胶法灵敏度略高于胶体金法，其中一个原因就是乳胶法的颗粒尺寸(200-400nm)比胶体金颗粒(20-40nm)更大，同样数量的抗原存在的情况下，乳胶法的试条能够在T线上固定更大尺寸的颗粒，从而提高显色灵敏度。但是，颗粒尺寸不能无限制提高，因为过大尺寸的颗粒会造成卡膜，影响试条的正常使用。
发明内容
针对上述问题，本发明目的在于提供一种Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针及其制备方法，并用于免疫层析试条，通过显色法结合SERS技术，提高SARS-CoV-2病毒检测的灵敏度。
第一方面，本发明提供了一种Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将黑磷晶体破碎研磨预处理得到横向、纵向尺寸均≤500μm、厚度≤100μm的黑磷粉末，然后加入到除氧去离子水中；氩气环境下进行黑磷的液相超声剥离，然后离心去除沉淀，得到厚度3～10nm、横向尺寸0.1～1.0μm的磷烯(Pp)纳米片悬浮液；
(2)向所述Pp纳米片悬浮液中加入硝酸银溶液，日光灯条件下进行光还原，在Pp纳米片表面和插层之间原位引入Ag纳米颗粒，得到Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片；
(3)将所述Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片吸附罗丹明B(RhB)探针分子，得到修饰RhB探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片；
(4)将所述RhB探针分子活化并修饰SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体，经过二次尺寸筛选，得到所述Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针。
较佳地，所述黑磷粉末与除氧去离子水的用量比为40～80mg:50～150mL，优选为50mg:100mL。
较佳地，所述黑磷液相超声剥离的工艺参数为：超声功率800～1000W，超声频率20～25KHz，液相环境温度10～35℃，超声时间50～80h。
较佳地，所述Pp纳米片悬浮液的浓度为20～30mg/mL，硝酸银溶液的浓度为0.2～1.0g/100mL，优选为0.5g/100mL；所述Pp纳米片悬浮液与所述硝酸银溶液的用量比为10mL:1～3mL。
较佳地，所述日光灯为氙灯模拟日光灯；所述日光灯的光斑尺寸为20×20～50×50mm2，功率密度为3000～10000mW/cm2，光还原反应的时间为20～40min。
较佳地，所述原位引入的Ag纳米颗粒包括Ag纳米大颗粒与Ag纳米小颗粒；所述Ag纳米大颗粒的粒径尺寸为50～100nm，所述Ag纳米小颗粒的粒径尺寸为3～5nm；
优选地，所述原位引入的Ag纳米颗粒在Pp纳米片表面的负载面积大于60％。
较佳地，所述RhB探针分子通过P-N单键在Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片上进行饱和吸附。
较佳地，所述Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片吸附RhB探针分子的方式为液相超声吸附；所述液相超声吸附的功率为500～1000W，温度为4～50℃，时间为15～45min。
较佳地，所述RhB探针分子活化的工艺为：向修饰RhB探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的悬浮液中，同时加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，超声混匀即可。
较佳地，所述RhB探针分子修饰SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体的工艺为：向修饰活化后的RhB探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片悬浮液中，加入SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体，4～30℃下混合反应；然后，加入牛血清蛋白BSA溶液，继续混合反应即可。
较佳地，控制修饰的SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体的质量占所述Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针的质量的比例为5～15wt‰。
较佳地，所述二次尺寸筛选的工艺为：将修饰RhB探针分子与SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片悬浮液静置1～2h或在3000～5000rpm转速下离心3～5min即可。
第二方面，本发明提供了一种根据上述制备方法得到的Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针。
第三方面，本发明提供了一种SARS-CoV-2检测层析试条，所述层析试条包含上述Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针。
第四方面，本发明提供了一种上述SARS-CoV-2检测层析试条在非疾病诊断与治疗目的SARS-CoV-2病毒检测中的应用。
较佳地，所述应用包括以下步骤：取干燥的层析试条，将每根带有金标垫的层析试条分别放入20～60μL待检样本与20～60μL裂解液的混合溶液中，层析15～25min后进行试条检测线T线色带的结果读取或结合拉曼检测进行结果判定。
有益效果
(1)本发明预先将大块黑磷晶体破碎，并全程在氩气环境中剥离，得到的磷烯(Pp)纳米片厚度更薄，避免了过度氧化，较好地保持了Pp纳米片本身的物理化学性质；
(2)本发明创造性地使用光还原方案在磷烯纳米片表面原位引入银(Ag)纳米颗粒，与现有方案相比带来了更高的还原效率：光照下Pp纳米片产生了大量光生载流子，一方面还原效率更高，能够获得更多的热点；另一方面，由于银颗粒成核效率的加快，部分颗粒在银离子耗尽之前无法继续长大，从而在纳米片表面和插层之间保留了大量的超细银纳米颗粒，这对化学增强提高拉曼检测的信号至关重要；
(3)本发明创造性地使用磷烯纳米片材料作为免疫层析试条的纳米探针，一方面，利用Pp纳米片的大尺寸，超大比表面积，高润滑性和强大的机械柔韧性等特点，极大提高了层析试条T线上纳米探针的尺寸和拉曼报告分子的负载量，进而提高显色和拉曼信号，而同样尺寸的金溶胶探针会出现卡膜情况；另一方面，磷烯纳米片具有单分子检测灵敏度，拉曼检测的灵敏度大大提高；
(4)本发明突破了目前抗原试条显色法的灵敏度阈值，检测灵敏度能够达到Ct36或以上。
附图说明
图1为基于Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片探针免疫层析试条用于检测SARS-CoV-2病毒的示意图；
图2为实施例1制备的Pp纳米片形貌和厚度表征图，图2a为Pp纳米片的TEM图，图2b为Pp纳米片的AFM图，图2c为Pp纳米片对应于图2b的厚度；
图3为实施例1制备的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片形貌图，图3a为Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的SEM图，图3b为Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片片层之间的TEM图；
图4a为实施例1制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的显色结果示意图，左右两部分为重复实验；图4b为实施例1制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的拉曼测试结果示意图；
图5a为实施例2制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的显色结果示意图，左右两部分为重复实验；图5b为实施例2制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的拉曼测试结果示意图；
图6a为实施例3制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的显色结果示意图，左右两部分为重复实验；图6b为实施例3制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的拉曼测试结果示意图；
图7a为实施例4制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的显色结果示意图，左右两部分为重复实验；图7b为实施例2制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的拉曼测试结果示意图；
图8a为实施例5制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的显色结果示意图，左右两部分为重复实验；图8b为实施例5制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的拉曼测试结果示意图；
图9a为对比例1制备的免疫层析试条显色结果示意图；图9b为对比例2制备的层析试条显色结果示意图(左)与使用经破碎的黑磷晶体为原料制备的层析试条显色结果(右)对比结果图；图9c为对比例3制备的层析试条显色结果示意图(左)与使用经过二次筛选纳米片尺寸的探针制备的层析试条显色结果(右)对比结果图；
图10a为对比例2制备的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的SEM图，图10b为AFM图，图10c对应于图10b的厚度；
图11a为对比例4制备的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的SEM图；图11b为对比例4制备的免疫层析试条对不同浓度病毒(原型株：A)检测的显色结果图，左右两部分为重复实验；图11c为对比例4制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的拉曼测试结果图；
图12a为对比例5制备得到的免疫层析试条对不同浓度病毒(原型株：A)检测的显色结果图；图12b为对比例6制备得到的免疫层析试条对不同浓度病毒(原型株：A)检测的显色结果图，左右两部分为重复实验；图12c为对比例6制备得到的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的拉曼测试结果图。
具体实施方式
以下通过实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
本发明创造性地采用磷烯(Pp)纳米片材料作为免疫层析试条的纳米探针基体材料。一方面，利用Pp纳米片的大尺寸、超大比表面积、高润滑性和强大的机械柔韧性等特点，提高层析试条T线上纳米探针的尺寸和拉曼报告分子的负载量，进而提高显色和拉曼信号强度，而同样尺寸的金溶胶探针则会出现卡膜情况；另一方面，Pp纳米片具有单分子检测灵敏度，可以使得试条拉曼检测的灵敏度大大提高。
基于上述原理，本发明首先通过液相剥离的方法获得超薄Pp纳米片，并通过光还原技术在Pp纳米片表面和插层之间原位引入Ag纳米颗粒，得到Ag纳米颗粒增强磷烯的纳米片；随后，在Ag纳米颗粒增强磷烯的纳米片上修饰拉曼探针分子和抗体，最终得到基于Ag纳米颗粒增强磷烯的复合纳米片，所述复合纳米片能够用作SARS-CoV-2病毒N蛋白检测免疫层析试条的探针。负载所述探针的层析试纸条灵敏度高、特异性强、使用方便快捷，能够达到当前PCR的检测灵敏度要求，在临床快速诊断中具有极大的推广和应用价值。
以下示例性说明本发明提供的Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针的制备方法，所述制备方法主要包括以下步骤。
(1)液相超声剥离制备Pp纳米片。取黑磷晶体进行破碎研磨预处理，得到黑磷粉末；将去离子水置于真空度为-1.0～-0.5bar的环境中5分钟，随后充入氩气，循环重复抽真空与充氩气的过程3次或以上，得到除氧去离子水；然后，将所述黑磷粉末加入所述除氧去离子水中，氩气环境下进行黑磷的液相超声剥离，得到浓度为20～30mg/mL的剥离后的Pp纳米片悬浮液；将所述悬浮液离心去除沉淀，于上层得到厚度3～10nm、横向尺寸0.1～1.0μm的Pp纳米片悬浮液，将其置于氩气环境中备用。
本发明通过在氩气环境中进行液相超声剥离得到的Pp纳米片厚度更薄，而且得到的Pp纳米片得到较好地保护，未被过度氧化。所述特定尺寸的Pp纳米片可以保证溶液较好的分散性，尺寸过大容易造成卡膜和团聚沉降的现象。
在一些实施方式中，可以控制黑磷晶体预处理后得到的所述黑磷粉末横向、纵向尺寸均≤500μm，厚度≤100μm。通过先将大块黑磷晶体进行预处理可以保证Pp纳米片的合适尺寸，从而进一步保障Pp纳米片分散液较好的流动性。
在一些实施方式中，所述黑磷粉末与除氧去离子水的用量比可以为40～80mg:50～150mL，优选为50mg:100mL。
在可选的实施方式中，所述黑磷液相超声剥离的工艺参数可以为：超声功率800～1000W，超声频率20～25KHz，液相环境温度10～35℃，超声时间50～80h。所述超声的功率和时间不足会导致难以得到相应尺寸的纳米片；继续增加功率和时间对材料尺寸减小的收益较小且会增加氧化时间；超声的温度过高会造成材料失效。
所述离心去除沉淀的转速可以为4000～6000rpm，离心时间可以为8～10min。
(2)光还原法制备Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片。向步骤(1)中制备得到的Pp纳米片悬浮液中迅速加入硝酸银溶液，置于日光灯并在搅拌条件下进行光还原，在所述Pp纳米片表面和插层之间原位引入Ag纳米颗粒；经固液分离，得到所述Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片(磷烯和银杂化的纳米片)。将所述Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片使用去离子水清洗3次或以上，分散在1mL去离子水中，储存于氩气中备用。
在一些实施方式中，所述硝酸银溶液的浓度可以为0.2～1.0g/100mL，优选为0.5g/100mL；所述Pp纳米片悬浮液与所述硝酸银溶液的用量比可以为10mL:1～3mL。所述硝酸银过少会导致Pp纳米片表面和插层间引入的Ag纳米颗粒过少；过多则会导致引入的Ag纳米颗粒过多，掩盖磷烯的性能。
所述日光灯可以为氙灯模拟日光灯；所述日光灯的光斑尺寸可以控制为20×20～50×50mm2，功率密度可以控制为3000～10000mW/cm2；所述光还原反应的时间可以控制为20～40min。合适的光斑尺寸能够保证光斑照射液体的均匀性；同时，日光灯光功率密度过小会导致还原效率不足，过大则容易烧坏样品。
光照条件下Pp纳米片能够产生大量光生载流子。本发明通过采用光还原技术在二维磷烯纳米片表面原位引入银纳米颗粒，包括在磷烯纳米片的表面和插层之间引入的超小银纳米颗粒。与现有方案相比：一方面，还原效率更高，能够获得更多的热点；另一方面，由于银颗粒成核效率的加快，部分颗粒在银离子耗尽之前无法继续长大，从而在纳米片表面和插层之间保留了大量的超细银纳米颗粒，可以提供高效的电荷转移以促进化学增强。
所述原位引入的Ag纳米颗粒包括Ag纳米大颗粒与Ag纳米小颗粒(超细银纳米颗粒)。在可选的实施方式中，可以控制所述Ag纳米大颗粒的粒径尺寸为50～100nm，所述Ag纳米小颗粒的粒径尺寸为3～5nm。优选地，所述原位引入的Ag纳米颗粒在Pp纳米片表面的负载面积大于60％。大量的超细银纳米颗粒(Ag纳米小颗粒)能够起到较好的耦合增强效果，从而通过化学增强提高拉曼检测的信号强度。
(3)Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片修饰罗丹明B(RhB)探针分子。向步骤(2)中制备得到的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片悬浮液中加入RhB溶液，超声吸附后进行离心分离，得到修饰RhB探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片。
在一些实施方式中，所述RhB溶液的浓度可以为10-4～10-6M；所述Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的悬浮液与RhB溶液的用量比可以为1mL:1～4mL。所述RhB探针分子通过P-N单键在Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片上进行饱和吸附。
所述超声吸附的功率可以为500～1000W，温度可以为4～50℃，时间可以为15～45min。
所述离心分离的转速可以为10000～13000rpm，时间可以为8～20min。在可选的实施方式中，所述离心分离的具体工艺可以为：首先，将超声吸附后得到的修饰RhB探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片悬浮液离心并弃去上清，之后加入5mL去离子水清洗；然后，将悬浮液重新离心，弃上清，将沉淀分散在500uL的MEST缓冲液中备用。
所述罗丹明B(RhB)探针分子能够在532nm激光下与磷烯体系产生共振以增强拉曼信号，同时还能够为抗体连接提供活性位点。本发明中，采用罗丹明B得到的探针性能明显优于R6G(罗丹明6G)、4MBA(4-巯基苯甲酸)、DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸))等拉曼探针分子，R6G探针分子虽然能够满足共振条件但无法连接后述SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗体，4MBA、DTNB则无法满足共振条件，从而导致无拉曼信号产生。
(4)RhB拉曼探针分子末端修饰SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体。首先，利用EDC与NHS将步骤(3)制备得到的修饰RhB探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的RhB分子末端的羧基活化；然后，在RhB探针分子的羧基末端修饰SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体，得到所述Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针。
在一些实施方式中，利用EDC/NHS将RhB分子末端的羧基活化的工艺可以采取以下步骤：向步骤(3)中制备的修饰RhB探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的悬浮液中，同时加入5uL浓度为50～150mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和10uL浓度为50～150mM的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)；随后，超声10～30min混匀即可。可选地，将超声混匀后的悬浮液于10000～13000rpm转速下离心5～15min，弃上清，将沉淀重新悬浮在200uL的0.05％PBST中备用。
在一些实施方式中，所述RhB探针分子末端修饰SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体的工艺可以包括以下步骤：向上述修饰末端羧基活化的RhB探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的悬浮液中，加入5～15ug的SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗体，1000～3000rpm的转速下震荡2h，温度控制为4～30℃；然后，加入100～300uL、浓度为10wt％的牛血清蛋白BSA溶液封闭(阻止Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片与T线上抗体发生非特异性结合)，继续在1000～3000rpm的转速下震荡1h；接着，将震荡后的悬浮液在10000～13000rpm的转速条件下离心5～15min，弃上清，向沉淀中加入500uL 0.05wt％PBST清洗；再次离心，弃上清，将沉淀重新分散在200uL的0.05wt％PBST中；随后，静置1～2h或在3000～5000rpm转速下离心3～5min，去除上述沉淀中的大尺寸纳米片(厚度≥20nm，横向尺寸≥1.5μm)，将静置或离心后得到的上层悬浮液储存于4℃的氩气环境中备用，得到所述RhB拉曼探针分子末端修饰SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗体的Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2病毒检测探针。
在一些实施方式中，可以控制修饰的SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体的质量占所述Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针的质量的比例为5～15wt‰。所述N蛋白抗体的修饰量过高会造成抗体浪费，过低则会导致探针分子与抗原的结合能力不足。
通过本发明提供的上述Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针，经过最终的静置或离心二次尺寸筛选后得到的厚度为3～10nm、横向尺寸0.1～1.0μm的探针，可以作为进一步制备SARS-CoV-2检测层析试条的目标探针。
其中，在可选的实施方式中，所述SARS-CoV-2检测层析试条金标垫的制备工艺可以采取以下步骤：将2～15uL标记有RhB拉曼报告分子和SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体的Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针悬浮液，均匀喷洒在层析试条的结合垫上，30～40℃下干燥，即可得到层析试条的金标垫。
在一些实施方式中，所述层析试条的检测线T线可以为SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体稀释至1～5mg/mL后进行划线得到，划液量可以为0.5～5μL/cm，划膜速度可以为50～100mm/s；所述层析试条的质控线C线可以为羊抗鼠IgG稀释至5～10mg/mL后进行划线得到，划液量可以为0.5～5μL/cm，划膜速度可以为50～100mm/s。
优选地，所述层析试条检测线T线和质控线C线的间距可以为1～2cm，所述C线宽度可以为200～500μm，所述T线宽度可以为200～500μm。
将组装好的SARS-CoV-2检测层析试条干燥后于真空环境下保存。
通过上述SARS-CoV-2检测层析试条可以进行SARS-CoV-2病毒的检测。利用所述层析试条进行非疾病诊断与治疗目的检测的方法可以采用如下步骤：取干燥的层析试条，将每根带有金标垫的层析试条分别放入20～60μL待检样本与20～60μL裂解液的混合溶液中，层析15～25min后进行试条检测线T线色带的结果读取或进一步结合拉曼检测进行结果判定。
若通过层析试条显色法无法判断阴/阳性，可以进一步结合SERS技术通过拉曼光谱识别T线信号以检测SARS-CoV-2病毒，进行阴/阳性的判断。
图1为基于Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片探针免疫层析试条用于检测SARS-CoV-2病毒的示意图。
本发明与现有免疫层析试条产品相比，突破了目前抗原检测灵敏度的阈值，显色灵敏度可以达到与PCR相当的水平，拉曼检测灵敏度可以达到Ct37-38水平，能够满足目前新冠病毒检测灵敏度的要求。
下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围，下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
(1)液相超声剥离制备Pp纳米片。取黑磷晶体进行破碎研磨预处理，得到黑磷粉末；将去离子水置于真空度为-1.0bar真空环境中5分钟，随后充入氩气，循环重复抽真空与充氩气的过程3次，得到除氧去离子水；然后，将50mg黑磷粉末加入100mL除氧去离子水中，氩气环境中进行黑磷的液相超声剥离，超声功率900W，频率22KHz，液相环境温度25℃，超声时间62h。将剥离后的纳米片悬浮液置于离心管中，5000rpm转速下，离心10min，去除沉淀取上层Pp纳米片悬浮液，置于氩气环境中备用。图2为实施例1制备的Pp纳米片形貌和厚度表征图，图2a为Pp纳米片的TEM图，图2b为Pp纳米片的AFM图，图2c为Pp纳米片对应于图2b的厚度。从图中可以看出，实施例1制备的Pp纳米片横向尺寸在250nm(0.25um)左右，厚度在4nm左右。
(2)光还原法制备Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片。取步骤(1)中制备的Pp纳米片悬浮液10mL，置于三颈烧瓶中，随后迅速加入2mL浓度为0.5g/100mL的硝酸银溶液，置于日光灯并在搅拌条件下进行光还原反应30min。所使用的光源为氙灯模拟日光灯，光斑尺寸30×30mm2，功率密度5000mW/cm2。反应结束后进行固液分离，得到所述Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片。将所述Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片使用去离子水清洗3次或以上，并分散在1mL去离子水中，储存于氩气中备用。图3为实施例1制备的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片形貌图，图3a为Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的SEM图，图3b为Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片片层之间的TEM图。从图3a中可以看出，通过光还原法成功在Pp纳米片表面引入了粒径为50～100nm的银纳米颗粒；从图3b中可以看出，将纳米片清洗并剥离后观察内层纳米片，纳米片表面存在粒径尺寸为3～5nm的超细银纳米颗粒。
(3)Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片修饰RhB探针分子。向1mL步骤(2)中制备的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片悬浮液中，加入4mL浓度为10-5M的RhB溶液，超声吸附20min，超声功率900W，温度30℃。随后，在12000rpm转速下，离心10min，弃去上清再加入5mL去离子水清洗；取1mL悬浮液重新离心，弃上清；将沉淀分散在500μL的MEST缓冲液中备用。
(4)RhB拉曼探针分子末端修饰SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗体。向步骤(3)制备得到的修饰RhB探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的悬浮液中，同时加入5μL浓度为100mM的EDC和10μL浓度为100mM的NHS；随后，超声15min混匀；将超声混匀后的悬浮液于12000rpm转速下离心10min，弃上清，将沉淀重新悬浮在200μL的0.05％PBST中备用。
向上述修饰末端羧基活化的RhB探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的悬浮液中，加入10ug的SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗体，2000rpm的转速下震荡2h，温度控制为25℃；然后，加入200μL 10wt％的BSA溶液封闭，继续在2000rpm的转速下震荡1h；接着，将震荡后的悬浮液在12000rpm的转速条件下离心10min，弃上清，向沉淀中加入500μL的0.05wt％PBST清洗；再次离心，弃上清，将沉淀重新分散在200μL的0.05wt％PBST中；随后，静置2h，去除上述沉淀中的大尺寸纳米片，将静置后得到的上层悬浮液储存于4℃的氩气环境中备用。
通过上述制备方法得到的Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针，经过静置二次尺寸筛选后得到的探针进一步制备SARS-CoV-2检测层析试条。其中，所述SARS-CoV-2检测层析试条金标垫的制备工艺采取以下步骤：将4uL标记有RhB拉曼报告分子和SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体的Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针悬浮液，均匀喷洒在层析试条的结合垫上，35℃下干燥，得到金标垫。然后，将金标垫组装到划膜后的试条上，进行病毒检测。
本实施例的样本中毒株为新冠原型株(A)，阴性样本为病毒裂解液。取干燥的层析试条，将每根带有金标垫的层析试条分别放入50μL待检样本与50μL裂解液的混合溶液中，层析15min后进行试条检测线T线色带的结果读取并进一步结合拉曼检测进行结果判定。
图4a为实施例1制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的显色结果示意图，左右两部分为重复实验；图4b为实施例1制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的拉曼测试结果示意图。从图4a中可以看出，显色法灵敏度可以达到Ct36；进一步等试条干燥之后，对更低病毒浓度的试条进行拉曼检测，如图4b所示，灵敏度可以达到Ct38。
实施例2
(1)液相超声剥离制备Pp纳米片。取黑磷晶体进行破碎研磨预处理，得到黑磷粉末；将去离子水置于真空度为-0.8bar真空环境中5分钟，随后充入氩气，循环重复抽真空与充氩气的过程3次，得到除氧去离子水；然后，将50mg黑磷粉末加入100mL除氧去离子水中，氩气环境中进行黑磷的液相超声剥离，超声功率为1000W，超声频率22KHz，液相环境温度25℃，超声时间55h。将剥离后的纳米片悬浮液置于离心管中，6000rpm转速下，离心8min，去除沉淀取上层Pp纳米片悬浮液，置于氩气环境中备用。得到的纳米片尺寸与实施例1类似。
(2)光还原法制备Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片。取步骤(1)中制备的Pp纳米片悬浮液10mL，置于三颈烧瓶中，随后迅速加入2.5mL浓度为0.5g/100mL的硝酸银溶液，置于日光灯并在搅拌条件下进行光还原反应25min。所使用的光源为氙灯模拟日光灯，光斑尺寸40×40mm2，功率密度3125mW/cm2。反应结束后进行固液分离，得到所述Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片。将所述Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片使用去离子水清洗3次或以上，并分散在1mL去离子水中，储存于氩气中备用。纳米片表面Ag颗粒的负载情况与实施例1类似。
(3)Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片修饰RhB探针分子。向1mL步骤(2)中制备的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片悬浮液中，加入2mL浓度为10-4M的RhB溶液，超声吸附15min，超声功率800W，温度35℃。随后，在10000rpm转速下，离心20min，弃上清再加入5mL去离子水清洗；取1mL悬浮液重新离心，弃上清；将沉淀分散在500μL的MEST缓冲液中备用。
(4)RhB拉曼探针分子末端修饰SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗体。向步骤(3)制备得到的修饰RhB探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的悬浮液中，同时加入5μL浓度为60mM的EDC和10μL浓度为60mM的NHS；随后，超声15min混匀；将超声混匀后的悬浮液于10000rpm转速下离心15min，弃上清，将沉淀重新悬浮在200μL的0.05％PBST中备用。
向上述修饰末端羧基活化的RhB探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的悬浮液中，加入5ug SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗体，2000rpm的转速下震荡2h，温度控制为20℃；然后，加入100μL 10wt％的BSA溶液封闭，继续在1500rpm的转速下震荡1h；接着，将震荡后的悬浮液在10000rpm转速条件下离心15min，弃上清，向沉淀中加入500μL的0.05wt％PBST清洗；再次离心，弃上清，将沉淀重新分散在200μL的0.05wt％PBST中；随后，在5000rpm转速下离心3min，去除上述沉淀中的大尺寸纳米片，将离心后得到的上层悬浮液储存于4℃的氩气环境中备用。
通过上述制备方法得到的Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针，经过离心二次尺寸筛选后得到的探针进一步制备SARS-CoV-2检测层析试条。其中，所述SARS-CoV-2检测层析试条金标垫的制备工艺采取以下步骤：将5uL上述标记有RhB拉曼报告分子和SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体的Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针悬浮液，均匀喷洒在层析试条的结合垫上，35℃下干燥，得到金标垫。然后，将金标垫组装到划膜后的试条上，进行病毒检测。
本实施例的样本中毒株为新冠α变异株(B.1.1.7)，阴性样本为人体咽拭子混检采样液。取彻底干燥的层析试条，将每根带有金标垫的层析试条分别放入50μL待检样本与50μL裂解液的混合溶液中，层析15min后进行试条检测线T线色带的结果读取并进一步结合拉曼检测进行结果判定。
图5a为实施例2制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的显色结果示意图，左右两部分为重复实验；图5b为实施例2制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的拉曼测试结果示意图。从图5a中可以看出，显色法灵敏度可以达到Ct35；进一步等试条干燥之后，对更低病毒浓度的试条进行拉曼检测，如图5b所示，灵敏度可以达到Ct37。
实施例3
本实施例中，各步骤参照实施例1。主要区别在于：本实施例的样本中毒株为β变异株(B.1.351)。
图6a为实施例3制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的显色结果示意图，左右两部分为重复实验；图6b为实施例3制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的拉曼测试结果示意图。从图6a中可以看出，显色法灵敏度可以达到Ct36；进一步等试条干燥之后，对更低病毒浓度的试条进行拉曼检测，如图6b所示，灵敏度可以达到Ct38。
实施例4
本实施例中，各步骤参照实施例2。主要区别在于：本实施例的样本中毒株为Δ变异株(B.1.617.2)。
图7a为实施例4制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的显色结果示意图，左右两部分为重复实验；图7b为实施例2制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的拉曼测试结果示意图。从图7a中可以看出，显色法灵敏度可以达到Ct35；进一步等试条干燥之后，对更低病毒浓度的试条进行拉曼检测，如图7b所示，灵敏度可以达到Ct37。
实施例5
(1)液相超声剥离制备Pp纳米片。取黑磷晶体进行破碎研磨预处理，得到黑磷粉末；将去离子水置于真空度为-0.5bar真空环境中5分钟，随后充入氩气，循环重复抽真空与充氩气的过程3次，得到除氧去离子水；然后，将50mg黑磷粉末加入100mL除氧去离子水中，氩气环境中进行黑磷的液相超声剥离，超声功率为800W，频率22KHz，液相环境温度25℃，超声时间50h。将剥离后的纳米片悬浮液置于离心管中，6000rpm转速下，离心8min，去除沉淀取上层Pp纳米片悬浮液，置于氩气环境中备用。得到的纳米片尺寸与实施例1类似。
(2)光还原法制备Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片。取步骤(1)中制备的Pp纳米片悬浮液10mL，置于三颈烧瓶中，随后迅速加入1.5mL浓度为0.5g/100mL的硝酸银溶液，置于日光灯并在搅拌条件下进行光还原反应40min。所使用的光源为氙灯模拟日光灯，光斑尺寸20×20mm2，功率密度10000mW/cm2。反应结束后进行固液分离，得到所述Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片。将所述Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片使用去离子水清洗3次或以上，并分散在1mL去离子水中，储存于氩气中备用。纳米片表面Ag颗粒的负载情况与实施例1类似。
(3)Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片修饰RhB探针分子。向1mL步骤(2)中制备的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片悬浮液中，加入1mL浓度为10-4M的RhB溶液，超声吸附25min，超声功率600W，温度45℃。随后，在10000rpm转速下，离心15min，弃上清再加入5mL去离子水清洗；取1mL悬浮液重新离心，弃上清；将沉淀分散在500μL的MEST缓冲液中备用。
(4)RhB拉曼探针分子末端修饰SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗体。向步骤(3)制备的修饰RhB探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的悬浮液中，同时加入5μL浓度为80mM的EDC和10μL浓度为80mM的NHS；随后，超声15min混匀；将超声混匀后的悬浮液于10000rpm转速下离心15min，弃上清，将沉淀重新悬浮在200μL的0.05％PBST中备用。
向上述修饰末端羧基活化的RhB探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的悬浮液中，加入5ug SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗体，3000rpm的转速下震荡2h，温度控制为10℃；然后，加入100μL 10wt％的BSA溶液封闭，继续在1000rpm的转速下震荡1h；接着，将震荡后的悬浮液在10000rpm转速条件下离心15min，弃上清，向沉淀中加入500μL的0.05wt％PBST清洗；再次离心，弃上清，将沉淀重新分散在200μL的0.05wt％PBST中；随后，在4000rpm转速下离心4min，去除上述沉淀中的大尺寸纳米片，将离心后的上层悬浮液储存于4℃的氩气环境中备用。
通过上述制备方法得到的Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针，经过离心二次尺寸筛选后得到的探针进一步制备SARS-CoV-2检测层析试条。其中，所述SARS-CoV-2检测层析试条金标垫的制备工艺采取以下步骤：将15uL标记有RhB拉曼报告分子和SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体的Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针悬浮液，均匀喷洒在层析试条的结合垫上，35℃下干燥，得到金标垫。然后，将金标垫组装到划膜后的试条上，进行病毒检测。
本实施例的样本中毒株为新冠奥秘克戎变异株(BA.1.15.1)。取彻底干燥的层析试条，将每根带有金标垫的层析试条分别放入50μL待检样本与50μL裂解液的混合溶液中，层析15min后进行试条检测线T线色带的结果读取并进一步结合拉曼检测进行结果判定。
图8a为实施例5制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的显色结果示意图，左右两部分为重复实验；图8b为实施例5制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的拉曼测试结果示意图。从图8a中可以看出，显色法灵敏度可以达到Ct35；进一步等试条干燥之后，对更低病毒浓度的试条进行拉曼检测，如图8b所示，灵敏度可以达到Ct37。
对比例1
向直径为200nm左右的金纳米球(AuNPs)表面依次连接4-MBA与SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体得到的复合金纳米颗粒AuNPs@4-MBA@抗体，并将其作为检测探针进行免疫层析试条制备与病毒检测。
所述检测探针的制备工艺为：(1)在AuNPs表面连接4-MBA。向1mLAuNPs溶胶(1011particles/mL)中加入100μL浓度为10-3M的4-MBA，超声吸附1.5h，得到AuNPs@4-MBA溶液；(2)AuNPs@4-MBA表面连接SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体。向1mL所述AuNPs@4-MBA溶液中加入0.1M K2CO3溶液15μL，同时加入5μL浓度为100mM的EDC和10μL浓度为100mM的NHS，随后超声混匀15min，得到拉曼分子活化的AuNPs@4-MBA溶液(胶体金溶液)。每1mL胶体金溶液中加入10μg抗体，震荡1h(2000rpm)，得到AuNPs@4-MBA@抗体检测探针。
利用所述AuNPs@4-MBA@抗体检测探针制备SARS-CoV-2病毒拉曼免疫层析试纸条。向1mL的AuNPs@4-MBA@抗体探针溶液中加入10wt％的BSA 40μL，震荡1h(2000rpm)；放入离心机中6000rmp离心10分钟，浓缩后的胶体金溶液使用胶体金稀释液进行稀释，稀释比例为50：1；取2μL稀释后的胶体金溶液，加在层析试条金标垫位置，得到含SERS标记的新冠病毒抗体的结合垫。将干燥后的硝酸纤维素膜与结合垫、吸水纸、样品垫一同叠压并安装在PVC底板，得到SARS-CoV-2病毒拉曼免疫层析试纸条。通过裁切得到成品试纸条，将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于干燥环境密封备用。
本对比例的样本中毒株为新冠原型株(A)。取彻底干燥的层析试条，将每根带有金标垫的层析试条分别放入50μL待检样本与50μL裂解液的混合溶液中，层析15min后进行试条检测线T线色带的结果读取并进一步结合拉曼检测进行结果判定。
图9a为对比例1制备的免疫层析试条显色结果示意图。从图9a中Ct27的样本显色结果可以看出，该尺寸的胶体金虽然T线信号清晰，但是存在卡膜现象。
对比例2
(1)液相超声剥离制备Pp纳米片。将去离子水置于真空度为-1.0bar真空环境中5分钟，随后充入氩气，循环重复抽真空与充氩气的过程3次，得到除氧去离子水；然后，将50mg黑磷晶体(横向/纵向尺寸＞500μm，厚度＞100μm)加入100mL除氧去离子水中，氩气环境中进行黑磷晶体的液相超声剥离，所述超声功率为900W，频率22KHz，液相环境温度25℃，超声时间62h。将剥离后的纳米片悬浮液置于离心管中，5000rpm转速下，离心10min，去除沉淀取上层Pp纳米片悬浮液，置于氩气环境中备用。
(2)光还原法制备Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片。参照实施例1。图10a为对比例2制备的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的SEM图，图10b为AFM图，图10c对应于图10b的厚度。从图10a-c中可以看出，制备的纳米片横向尺寸大于1μm，厚度在100nm左右。
(3)Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片修饰RhB探针分子。参照实施例1。
(4)RhB拉曼探针分子末端修饰SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗体。参照实施例1。本对比例制备的悬浮液在静置或离心二次筛选后团聚严重，使用前需超声分散。
通过上述制备方法得到的Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2病毒检测探针进一步制备SARS-CoV-2检测层析试条。其中，所述SARS-CoV-2检测层析试条金标垫的制备工艺参照实施例1。然后，将金标垫组装到划膜后的试条上，进行病毒检测。
本对比例2中样本中毒株为新冠原型株(A)，阴性样本为病毒裂解液。取彻底干燥的层析试条，将每根带有金标垫的层析试条分别放入50μL待检样本与50μL裂解液的混合溶液中，层析15min后进行试条检测线T线色带的结果读取并进一步结合拉曼检测进行结果判定。
图9b为对比例2制备的层析试条显色结果示意图(左)与使用经破碎的黑磷晶体为原料制备的层析试条显色结果(右)对比结果图。从图9b中Ct29的样本显色结果可以看出，该尺寸Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片探针的层析试条虽然T线信号清晰，但是也存在卡膜现象。
对比例3
本对比例中，各步骤参照实施例1。主要区别在于：步骤(4)中，最后一次在0.05wt％PBST磷酸缓冲盐溶液中分散后，不进行静置或离心二次筛选去除沉淀中的大尺寸纳米片的过程，而是直接进行喷金制备金标垫与试条，并进行病毒检测。
图9c为对比例3制备的层析试条显色结果示意图(左)与使用经过二次筛选纳米片尺寸的探针制备的层析试条显色结果(右)对比结果图。从图9c中Ct29的样本显色结果可以看出，该对比例中的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片探针层析试条虽然T线信号清晰，但是也存在卡膜现象。
对比例4
本对比例中，各步骤参照实施例1。主要区别在于：步骤(2)中，不进行光照辅助还原。
图11a为对比例4制备的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的SEM图；图11b为对比例4制备的免疫层析试条对不同浓度病毒(原型株：A)检测的显色结果图，左右两部分为重复实验；图11c为对比例4制备的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的拉曼测试结果图。从图11a中可以看出，对比例4制备的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片探针表面银颗粒负载量少且没有超细银纳米颗粒(3～5nm)；从图11b中可以看出，显色法灵敏度可以达到Ct35；进一步等试条干燥之后，对更低病毒浓度的试条进行拉曼检测，由于纳米片表面银纳米颗粒的负载量少且无超细银纳米颗粒促进化学增强，如图11c所示，检测灵敏度仅为Ct36。
对比例5
本对比例中，各步骤参照实施例1。主要区别在于：步骤(3)中，将RhB探针分子替换为R6G。
图12a为对比例5制备得到的免疫层析试条对不同浓度病毒(原型株：A)检测的显色结果图。从图12a中可以看出，由于R6G分子没有抗体连接位点，抗体只能通过非特异性吸附于纳米片，显色灵敏度为Ct29。
对比例6
本对比例中，各步骤参照实施例1。主要区别在于：步骤(3)中，将RhB探针分子替换为常用的探针分子4MBA。
图12b为对比例6制备得到的免疫层析试条对不同浓度病毒(原型株：A)检测的显色结果图，左右两部分为重复实验；图12c为对比例6制备得到的免疫层析试条对不同浓度病毒检测的拉曼测试结果图。从图12b中可以看出，显色法灵敏度可以达到Ct36；进一步等试条干燥之后，对试条进行拉曼检测，由于4MBA分子无法与Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片体系产生共振，如图12c所示，4MBA无拉曼信号。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (19)
1.一种Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将黑磷晶体破碎研磨预处理得到横向、纵向尺寸均≤500μm、厚度≤100μm的黑磷粉末，然后加入到除氧去离子水中；氩气环境下进行黑磷的液相超声剥离，然后离心去除沉淀，得到厚度3～10 nm、横向尺寸0.1～1.0μm的磷烯纳米片悬浮液；
（2）向所述磷烯纳米片悬浮液中加入硝酸银溶液，日光灯条件下进行光还原，在磷烯纳米片表面和插层之间原位引入Ag纳米颗粒，得到Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片；
（3）将所述Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片吸附罗丹明B探针分子，得到修饰罗丹明B探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片；
（4）将所述修饰罗丹明B探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片活化并修饰SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体，经过二次尺寸筛选，得到所述Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述黑磷粉末与除氧去离子水的用量比为40～80mg:50～150mL。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述黑磷粉末与除氧去离子水的用量比为50mg:100mL。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述黑磷液相超声剥离的工艺参数为：超声功率800～1000 W，超声频率20～25 KHz，液相环境温度10～35℃，超声时间50～80h。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磷烯纳米片悬浮液的浓度为20～30 mg/mL，硝酸银溶液的浓度为0.2～1.0 g/100mL；所述磷烯纳米片悬浮液与所述硝酸银溶液的用量比为10mL:1～3 mL。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述硝酸银溶液的浓度为0.5 g/100mL。
7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述日光灯为氙灯模拟日光灯；所述日光灯的光斑尺寸为20×20～50×50 mm2，功率密度为3000～10000 mW/cm2，光还原反应的时间为20～40 min。
8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述原位引入的Ag纳米颗粒包括Ag纳米大颗粒与Ag纳米小颗粒；所述Ag纳米大颗粒的粒径尺寸为50～100 nm，所述Ag纳米小颗粒的粒径尺寸为3～5 nm。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述原位引入的Ag纳米颗粒在磷烯纳米片表面的负载面积大于60%。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述罗丹明B探针分子通过P-N单键在Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片上进行饱和吸附。
11. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片吸附罗丹明B探针分子的方式为液相超声吸附；所述液相超声吸附的功率为500～1000 W，温度为4～50℃，时间为15～45 min。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述修饰罗丹明B探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片活化的工艺为：向修饰罗丹明B探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片的悬浮液中，同时加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，超声混匀即可。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述修饰罗丹明B探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片修饰SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体的工艺为：向活化后的修饰罗丹明B探针分子的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片悬浮液中，加入SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体，4～30℃下混合反应；然后，加入牛血清蛋白BSA溶液，继续混合反应即可。
14. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，控制修饰的SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体的质量占所述Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针的质量的比例为5～15wt‰。
15. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述二次尺寸筛选的工艺为：将修饰罗丹明B探针分子与SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体的Ag纳米颗粒增强磷烯纳米片制成悬浮液静置1～2 h或在3000～5000 rpm转速下离心3～5 min即可。
16.一种根据权利要求1所述的制备方法得到的Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针。
17.一种SARS-CoV-2检测层析试条，其特征在于，所述层析试条包含权利要求16所述的Ag纳米颗粒增强磷烯的SARS-CoV-2检测探针。
18.一种权利要求17所述的SARS-CoV-2检测层析试条在非疾病诊断与治疗目的SARS-CoV-2病毒检测中的应用。
19. 根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：取干燥的层析试条，将每根带有金标垫的层析试条分别放入20～60μL待检样本与20～60μL裂解液的混合溶液中，层析15～25 min后进行试条检测线T线色带的结果读取或结合拉曼检测进行结果判定。
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