CN115753310A - 深海保压保温微生物采集过滤固定培养的系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种深海保压保温微生物采集过滤固定培养的系统及方法，本发明的系统包括采水器，其具有外框架，外框架内设有进样结构和采样结构，其中，进样结构包括采样泵、注液泵、旋转执行器、采样阀和过滤结构，带有采样泵的管道和带有注液泵的管道均连接至过滤结构，所述旋转执行器用于启闭所述采样阀，以控制带有所述采样泵的管道和带有所述注液泵的管道连接至所述过滤结构的任一管道通断；所述采样结构包括样品釜，所述样品釜也连接至所述过滤结构，以承接经过所述过滤结构的海水；带有所述采样泵的管道用于通入海水，所述过滤结构用于初步从海水筛滤出微生物，带有所述注液泵的管道用于往所述过滤结构注入RNAlater固定液，以在原位固定微生物。

Description

深海保压保温微生物采集过滤固定培养的系统及方法

技术领域

本发明涉及深海保压保温多序列海水采集、过滤固定与长周期培养技术领域，具体涉及一种深海保压保温微生物采集过滤固定培养的系统及方法。

背景技术

海洋在地球的总面积约为3.6亿平方公里，占据了地球表面积的71％,包涵全球97％的水体,其广阔的水体为生命的起源和各种生命形态的蓬勃发展提供了可能。深海生态系统由生产者和各级消费者构成。海洋生物中90％为海洋微生物，它们参与碳、氮、硫等关键元素循环，连接地球深部和海洋表面的物质循环，是生物地球化学循环过程中重要的组成部分，为各级消费者提供营养物质，维持着深海生态系统的正常运转。

不同微生物在海洋中的生物地球化学循环中扮演不同的角色，例如光能自养的微生物在水体顶部200米的真光层内可以利用光能作为能量来源，其他微生物则通过化能自养和异养的方式利用无机和有机的化学物质作为能量来源。受益于海水中环境参数的变化，微生物的能量利用形式也不同，直接影响了微生物的种类，例如随着海水深度增加，环境中的叶绿素、溶解氧等都会出现跃层。上层海水中主要为蓝细菌和藻类的生成者，在利用光能的同时吸收营养盐和二氧化碳生成有机物，而下层海水因为没有光的照射，一般情况变形菌门占据主导地位，例如在南海“海马”冷泉区，下层海水中变形菌门通过化能合成作用维持生长。此外，在某些区域海水中还存在大量参与甲烷氧化或者生成的微生物。因此，探究原位多序列深海微生物特性对进一步理解深海物质循环有重要意义。

在现有技术中，人们对于深海海水中微生物群落结构研究，主要是进行微生物的原位固定或者保压采集相应的海水，一般过滤或采集的海水量较少，不满足后续的培养、分析等要求；相关的环境参数一般在上岸释压后开始测试，非保压会造成溶解组分的析出，给数据质量带来一定的误差。因此，目前的技术均未探究在深海保压保温多序列海水采集、环境参数感知、过滤固定微生物与长周期培养等方面的研究，这限制了我们对海洋不同水层微生物的认识以及微生物资源的开发与利用。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供一种深海保压保温微生物采集过滤固定培养的系统及方法，其可以保温、保压采集海水，过滤并固定深海中的微生物，为原位海水的研究提供足够的样品。

为实现上述目的，本发明可以采用以下技术方案进行：

第一方面，本发明提供一种微生物采集过滤固定培养的系统，其包括：

采水器，其具有外框架，所述外框架内设有进样结构和采样结构，其中，所述进样结构包括采样泵、注液泵、旋转执行器、采样阀和过滤结构，带有所述采样泵的管道和带有所述注液泵的管道均连接至所述过滤结构，所述旋转执行器用于启闭所述采样阀，以控制带有所述采样泵的管道和带有所述注液泵的管道连接至所述过滤结构的任一管道通断；所述采样结构包括样品釜，所述样品釜也连接至所述过滤结构，以承接经过所述过滤结构的海水；

带有所述采样泵的管道用于通入海水，所述过滤结构用于初步从海水筛滤出微生物，带有所述注液泵的管道用于往所述过滤结构注入RNAlater固定液，以在原位固定微生物。

如上所述的微生物采集过滤固定培养的系统，进一步地，所述采样结构还包括保护结构和电子元件仓，其中，所述电子元件仓包括控制单元、通讯单元和电池仓，其中，所述控制单元用于控制所述旋转执行器动作，所述通讯单元通过电信号连接有中央控制系统，带有所述采样泵的管道和带有所述注液泵的管道分别设有单向阀，所述电池仓用于给所述采样泵和所述注液泵供电。

如上所述的微生物采集过滤固定培养的系统，进一步地，所述外框架包括上框架和下框架，所述上框架通过固定板连接有所述旋转执行器和所述采样阀，所述采样阀具有顶杆，所述旋转执行器控制所述采样阀的顶杆动作；所述上框架的边缘固定有与所述带有注液泵的管道连通的盛液仓，所述盛液仓存放有RNAlater固定液。

如上所述的微生物采集过滤固定培养的系统，进一步地，所述过滤结构包括过滤网和膜架，所述膜架中内至少设有一个设定孔径的滤盘，所述滤盘上安装有不同孔径的双层滤膜，所述过滤网设置于所述采样泵的吸水端。

如上所述的微生物采集过滤固定培养的系统，进一步地，所述样品釜内部通过一可上下活动的第一活塞划分为采样腔和蓄能腔，所述采样腔的上端设有第一截止阀；所述蓄能腔的下端设有第二截止阀以及用于监测所述蓄能腔的压力的压力传感器。

如上所述的微生物采集过滤固定培养的系统，进一步地，还包括保护结构，所述保护结构设置在所述过滤结构和所述样品釜之间，所述保护结构包括节流器和溢流阀，所述节流器用于控制所述过滤结构的过滤和采样速度；所述溢流阀用于保证所述样品釜被充满后所述过滤结构能继续进行过滤。

如上所述的微生物采集过滤固定培养的系统，进一步地，还包括用于监测所述系统各物理参数的环境参数检测单元，所述环境参数检测单元通过电信号连接所述中央控制系统。

如上所述的微生物采集过滤固定培养的系统，进一步地，还包括增压系统，所述增压系统用于向所述蓄能腔注入设定量的气体，其中，所述增压系统包括连接有增压泵的空压机，以及连接在所述空压机的出口的储气罐，所述储气罐通过带有调压阀的进气通道连接至所述样品釜。

如上所述的微生物采集过滤固定培养的系统，进一步地，还包括保温箱，所述保温箱包括由保温材料构成的箱体，所述箱体内通过固定架固定有所述样品釜，且所述箱体上设有制冷单元和压缩机，所述制冷单元和压缩机配合使用以控制所述箱体内的温度；所述箱体包括箱盒和转动连接在所述箱盒上的箱盖。

第二方面，本发明提供一种微生物采集过滤固定培养的方法，其利用上述的微生物采集过滤固定培养的系统进行，其包括以下步骤：

S1：对样品釜内的采样腔进行清洗灭菌，同一个膜架上，在滤盘上依次按孔径大小安装滤膜，每个滤盘上放至少一张滤膜，每个膜架间隔安装滤膜；

S2：通过增压系统往保压采样需要用到的样品釜内的蓄能腔注入一定压力的气体；非保压采样的样品釜不采取任何措施；

S3：将光缆与微生物采集过滤固定培养的系统的中央控制系统连接；

S4：在微生物采集过滤固定培养的系统下潜过程中，实时记录海洋环境的环境参数，为下一步序列过滤海水或保压采集海水做准备；

S5：到达关注第一海水层位后，通过旋转执行器打开顶杆，无需开启采样泵，第一海水层的海水直接进入提前注气过的样品釜内的采样腔；

S6：保压海水采集完后，通过旋转执行器打开顶杆，开启采样泵，第一海水层的海水直接通过过滤结构过滤微生物，其中一部分海水流至未注气的样品釜，剩余排放至海里；过滤结束后，开启注液泵，往过滤结构的滤膜上注入RNAlater固定液；

S7：到达关注第二海水层位后，通过旋转执行器打开顶杆，开启采样泵吸取海水，第二海水层的海水直接进入提前注气过的样品釜内的采样腔；

S8：重复S5和S6的步骤，进行非保压和保压海水采集，实现原位过滤并固定海水微生物；

S9：上岸后收集相应的滤膜，将样品釜放置在保温箱内，按照原有层位温度培养保压海水；

S10：培养过程中，因实验需要取出海水后，导致样品釜内的压力下降，采用增压系统进行补充，多次实验取出海水后，样品釜内微生物所需营养下降，加入一定量的非保压过滤海水继续培养研究。

本发明与现有技术相比，其有益效果在于：

1、相对于现有的原位过滤海水技术，本发明提出了大体积和多级膜过滤并固定海水微生物的技术，且过滤完的膜具有完整性，可以在原位环境固定不同直径大小的微生物，实现对微生物按直径大小的分类研究。

2、在原位置环境的同一个深度，获得大体积保温、保压采集的海水和过滤并固定后的微生物，以及过滤后海水的收集，可以为原位海水的研究提供足够的样品。

3、与现有技术相比较，通过保温、保压采集海水，突破对原位海水的保温、保压培养研究，可以更加清晰的认识海水中原有微生物，同时采用培养技术，可以明确原位海水微生物的功能特性等。

4、采用环境参数感知系统，可以实时了解深海环境的具体情况，并根据环境信息做出在实验过程中做出相应调整，避免盲采。

5、本发明可以实现在陆地上进行原位海水的保温、保压培养研究，且因保温、保压培养研究损失的海水溶液或者压力，可以人为控制补回，例如样品釜内的海水溶液减少可以加入非保压过滤的海水补充。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图进行简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例的深海保压保温微生物采集过滤固定培养的系统的结构示意图；

图2为图1所示的深海保压保温微生物采集过滤固定培养的系统的俯视图；

图3(a)为本发明实施例的样品釜的结构示意图；

图3(b)为本发明实施例的注气罐的结构示意图；

图4为本发明实施例的单向阀与采样泵和注液泵连接的结构示意图；

图5为本发明实施例的中央控制系统的电路模块连接示意图；

图6为本发明实施例的增压系统的结构示意图；

图7为本发明实施例的保温箱的结构示意图；

图8为本发明实施例的深海保压保温微生物采集过滤固定培养的方法的流程示意图；

图9为本发明实施例的探究海水中微生物氧化甲烷特性实验的流程示意图。

其中：11、上框架；12、下框架；13、U形双头螺丝；14、卡箍；15、固定板；21、采样泵；22、注液泵；23、旋转执行器；24、采样阀；241、顶杆；25、过滤结构；251、滤网；26、单向阀；261、第一单向阀；262、第二单向阀；31、样品釜；311、采样腔；312、蓄能腔；313、第一截止阀；314、第二截止阀；315、压力传感器；316(a)、第一活塞；316(b)、第二活塞；32、保护结构；321、节流器；322、溢流阀；33、电子元件仓；4、环境参数检测单元；41、海水深度测量仪；42、叶绿素含量测量仪；43、温度传感器；44、溶解氧含量测量仪；45、甲烷浓度传感器；46、盐度测量仪；5、盛液仓；6、增压系统；61、空压机；62、增压泵；63、储气罐；64、调压阀；71、箱体；711、箱盒；712、箱盖；713、合页；72、固定架；73、制冷单元；74、压缩机；75、电源插头；8、中央控制系统；9、注气罐；91、第三截止阀；92、第四截止阀。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例：

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，本发明实施例的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个、三个等，除非另有明确具体的限定。此外，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

参见图1至图7，本发明提供一种深海保压保温微生物采集过滤固定培养的系统，其可以在原位环境下大体积过滤并固定不同直径的微生物，从而得到大体积保温、保压未过滤和非保压过滤的海水，同时满足保温、保压原位培养微生物的要求，其可以包括：采水器，采水器具有外框架，外框架内设有进样结构和采样结构，其中，进样结构包括采样泵21、注液泵22、旋转执行器23、采样阀24和过滤结构25，带有采样泵21的管道和带有注液泵22的管道均连接至过滤结构25，旋转执行器23用于启闭采样阀24，以控制带有采样泵21的管道和带有注液泵22的管道连接至过滤结构25的任一管道通断；采样结构包括样品釜31，样品釜31也连接至过滤结构25，以承接经过过滤结构25的海水；另外，带有采样泵21的管道用于通入海水，过滤结构25用于初步从海水筛滤出微生物，带有注液泵22的管道用于往过滤结构25注入RNAlater固定液，以在原位固定微生物。在本方案中，海水通过带有采样泵21的管道进入过滤结构25，RNAlater固定液通过带有注液泵22的管道进入过滤结构25，对海水中的微生物进行原位固定，从而实现在深海、保温保压的条件下，对深海不同直径的微生物的分离。

参见图1，图1展示了一种深海保压保温微生物采集过滤固定培养的系统，其包括：采水器、增压系统6、保温箱、中央控制系统8和注气罐9。如图2-图5所示，采水器类似圆柱形，包括外框架、进样结构、采样结构、环境参数检测单元4和盛液仓5；进样结构包括采样泵21、注液泵22、旋转执行器23、采样阀24、过滤结构25；其中，带有采样泵21的管道和带有注液泵22的管道均连接至过滤结构25，旋转执行器23用于启闭采样阀24，以控制带有采样泵21的管道和带有注液泵22的管道连接至过滤结构25的任一管道通断。带有采样泵21的管道用于通入海水，过滤结构25用于初步从海水筛滤出微生物，带有注液泵22的管道用于往过滤结构25注入RNAlater固定液，以在原位固定微生物。进一步地，采样结构包括样品釜31、保护结构32和电子元件仓33；样品釜31也连接至过滤结构25，以承接经过过滤结构25的海水。

上述实施例中，进一步地，外框架包括上框架11和下框架12，上框架11和下框架12可以通过U形双头螺丝13固定上；框架的中上部设有固定板15；固定板15的上面设有旋转执行器23和采样阀24。进一步地，采样阀24包括采样阀24内部的顶杆241，顶杆241可以通过中央系统控制旋转执行器23收缩顶杆241，使得采样泵21吸入的海水进入过滤结构25和样品釜31。进一步地，过滤结构25包括过滤网251和一定孔径大小的滤盘，滤盘位于膜架内，滤盘数量不少于一个；过滤网251设置在采样泵21的吸水端，主要用于过滤海洋中较大的物质或者生物。另外，滤盘内的膜架上可根据实验需要安装不同孔径大小的双层滤膜，其中一层用于原核、真核、病毒分级过滤与固定，另一层为了防止水流过大导致第一层滤膜破裂影响微生物的收集。

进一步地，采样泵21、注液泵22和电子元件仓33位于下框架12内，均为深水电机驱动的定量泵；采样泵21主要用于吸取海水，注液泵22主要用于向过滤结构25内注入RNAlater进行原位固定微生物；采样泵21、注液泵22通过电子元件仓33控制，通过工作时间计算海水和RNAlater的流量；电子元件仓33包括控制单元、通讯单元和电池仓，控制单元主要用于控制旋转执行器23的旋转，通讯单元主要用于采样过程采水器的信号与中央控制系统8的传递；采样泵21和注液泵22分别通过单向阀26与过滤结构25相连，如图4所示，采样泵21通过第一单向阀261与过滤结构25相连，注液泵22通过第二单向阀262与过滤结构25相连。进一步地，电池仓位于上框架11中部的竖直方向，电池仓与采样泵21和注液泵22连接，为采样泵21和注液泵22的工作提供足够的电力支撑。盛液仓5位于上框架11的边缘并通过卡箍14固定，盛液仓5用于装原位固定微生物结构的RNAlater。

上述实施例中，进一步地，样品釜31、保护结构32、环境参数检测单元4均位于该系统的中部；采样泵21、分配阀、采样阀24、过滤结构25、溢流结构、第一截止阀313、样品釜31和第二截止阀314分别通过管道依次连接；过滤结构25与样品釜31之间通过截流阀和第一截至阀313连接；参见图3(a)，样品釜31内设有采样腔311、蓄能腔312、第一截止阀313、第二截止阀314和压力传感器315；采样腔311和蓄能腔312之间设有第一活塞316(a)，在样品釜31的底部设有压力传感器315和第二截止阀314；第二截止阀314主要是往蓄能腔312内注入气体，压力传感器315主要用于监测蓄能腔312内的压力变化；第一截止阀313设置在样品釜31的上端，主要用于海水可以进入样品釜31。进一步地，保护结构32设有节流器321和溢流阀322，节流器321主要为了控制过滤结构25的过滤和采样速度，防止高压射流破坏过滤膜，不同预定工作深度的过滤结构25中设置不同的节流器321。溢流阀322是为了保证样品釜31被充满后可以继续进行过滤工作从而在过滤膜上获得大量微生物。进一步地，环境参数检测单元4可以包括海水深度测量仪41、叶绿素含量测量仪42、温度传感器43、溶解氧含量测量仪44、甲烷浓度传感器45以及盐度测量仪46，用于实时检测下潜或上升过程中海水深度、叶绿素含量、盐度、溶解氧浓度、甲烷浓度，并通过通讯系统传输至中央控制系统8。中央控制系统8可以包括服务器、计算机等，用于系统下潜或回收过程的环境信息采集实时采集、处理和存储等功能。参见图3(b)，在某些实施例中，还包括注气罐9，注气罐9包括第三截止阀91、第四截止阀92和第二活塞316(b)。在本实施例中，采用环境参数感知系统，可以实时了解深海环境的具体情况，并根据环境信息做出在实验过程中做出相应调整，避免盲采。

参见图6，在某些实施例中，还包括增压系统6，其主要是用于向蓄能腔312内注入气体一定量的气体，增压系统6主要包括空压机61、增压泵62、储气罐63、调压阀64及管阀件等配件；蓄能腔312内注入压力为采样水层压力的1/10。

参见图7，在某些实施例中，还包括保温箱，其主要用于对保压采集海水后的样品釜31进行保温培养，主要由箱体71、固定架72、制冷单元73、压缩机74和电源插头75等组成；箱体71包括箱盒711和箱盖712，箱盒711和箱盖712通过合页713连接；箱体71是由保温材料构成的长方形结构，内部为中空；箱体71中空部分的两端具有与样品釜31相匹配的固定架72，主要为了放置并固定样品釜31；制冷单元73和压缩机74位于箱体71的侧壁，主要用于控制对箱体71内的温度保持恒定，温控范围在3℃-40℃之间。

参见图8，基于同一发明构思，本发明还提供一种深海保压保温微生物采集过滤固定培养的方法，其利用上述的深海保压保温微生物采集过滤固定培养的系统进行，主要包括样品釜注压、原位样品采集、微生物原位过滤固定、微生物培养等四个步骤。本实施例中，样品釜31的体积可以设定为5L，盛液仓5的体积可以设定为2L。本方法可以包括以下步骤：

S1：对样品釜31内的采样腔311进行清洗灭菌，同一个膜架上，在滤盘上依次按孔径大小安装滤膜，每个滤盘上放至少一张滤膜，每个膜架间隔安装滤膜。

具体地，为了冲洗管路中的微生物和杂质，在采水器下水之前，首先将增压系统6与样品釜31的底部连接，在蓄能腔312内加入一定量的氮气，使样品釜31内的第一活塞316(a)到达顶端，此时关闭样品釜31底部的阀门，启动采样泵21吸取无菌水对整个系统的管路清洗，清洗的水从溢流阀322流出。清洗完毕后，开始安装过滤结构25中的滤膜，与保压采水样品釜31连接的过滤结构25不安装滤膜，与原位过滤海水的样品釜31连接的过滤结构25安装滤膜，每个滤盘上的滤膜孔径依次减小，且为防止水流过大击穿滤膜，每一张滤膜的下部均放置一张一定孔径的钢膜，再安装好整个过滤结构25。

S2：通过增压系统6往保压采样需要用到的样品釜31内的蓄能腔312注入一定压力的气体；非保压采样的样品釜31不采取任何措施。

具体地，打开第一截止阀313，并向样品釜31内加入一定量的氮气，整个样品釜31平衡24小时，并通过压力监测单元监测蓄能腔312内的压力是否发生变化，如有漏点，可采用气体捡漏剂检查，如没有则可以开始继续实验。试压结束后，放掉样品釜31内采样腔311内的气体，将第一截止阀313与溢流阀322连接并打开第一截止阀313。明确需要采集的海水深度，通过增压系统6往需要保压采水的样品釜31的蓄能腔312内注入气体，所注入的压力为海水采样深度压力的1/10，非保压的样品釜31可不进行任何操作，同时关闭第二截止阀314并断开第二截止阀314与增压系统6的连接，然后在盛液仓5内加入2L的RNAlater固定液。

S3：将光缆与微生物采集过滤固定培养的系统的中央控制系统8连接。

具体地，将微生物采集过滤固定培养的系统的中央控制系统8与船上的光缆连接，检测通讯设置是否正常，若正常即可开始下潜工作。

S4：在微生物采集过滤固定培养的系统下潜过程中，实时记录海洋环境的环境参数，为下一步序列过滤海水或保压采集海水做准备。

具体地，在微生物采集过滤固定培养的系统下潜过程中，打开中央控制系统8内的相关环境参数采集单元，收集相关环境参数，示例性地，可以是叶绿素最大层位，也可以是溶解氧最大层位等。此外，在同一个海水层位，采水器可以开启两个通道，一个通道采集的保压水用于培养微生物，另一个通道采集的保压水直接用来上船后取样分析保压水的所有的参数指标，示例性的，参数指标可以包括溶解氧、营养盐和溶解气含量，以及微生物扩增子等。

S5：到达关注第一海水层位后，通过旋转执行器23打开顶杆241，无需开启采样泵21，第一海水层的海水直接进入提前注气过的样品釜31内的采样腔311。

具体地，第一海水层为深层海水层，到达关注深层海水层位后，通过旋转执行器23打开顶杆241，无需开启采样泵21，深层海水可以直接进入提前注气过的样品釜31内的采样腔311，通过中央控制系统8观察到当蓄能腔312内的内的压力不再变化，则该层位海水采集完毕，通过旋转执行器23关闭顶杆241。

S6：保压海水采集完后，通过旋转执行器23打开顶杆241，开启采样泵21，第一海水层的海水直接通过过滤结构25过滤微生物，其中一部分海水流至未注气的样品釜31，剩余排放至海里；过滤结束后，开启注液泵22，往过滤结构25的滤膜上注入RNAlater固定液。

具体地，再次旋转旋转执行器23并打开采样泵21，使得海水中的微生物经过过滤结构25被过滤，过滤后的海水进入采样腔311(样品釜31的蓄能腔312未注气)，当采样腔311内的海水已满时，多余的海水则通过溢流阀322移除排放至环境中，当过滤到满足微生物的宏基因或者代谢组学测序水量后，如过滤海水的体积达到100L水量后，即可关闭采样泵21。为了原位固定海水微生物，开启注液泵22，将盛液仓5内的300ml的RNAlater固定液注射到过滤结构25的滤膜上。当原位生物固定结束后，即可开始进行下一个层位的海水采集与过滤。

S7：到达关注第二海水层位后，通过旋转执行器23打开顶杆241，开启采样泵21吸取海水，第二海水层的海水直接进入提前注气过的样品釜31内的采样腔311。

具体地，第二海水层为浅海水层，到达采样的浅海水层位后，通过旋转执行器23打开顶杆241，开启采样泵21，浅层海水可以直接进入提前注气过的样品釜31内的采样腔311，通过中央控制系统8观察到当蓄能腔312内的内的压力不再变化，则该层位海水采集完毕，通过旋转执行器23关闭顶杆241。再次旋转旋转执行器23并打开采样泵21，使得海水中的微生物经过过滤结构25被过滤，过滤后的海水进入采样腔311(样品釜31的蓄能腔312未注气)，当采样腔311内的海水已满时，多余的海水则通过溢流阀322移除并排放至环境中，当过滤到满足微生物的宏基因或者代谢组学测试水量后，即可关闭采样泵21。为了原位固定海水微生物，开启注液泵22，将盛液仓5内的RNAlater固定液注射到过滤结构25的滤膜上。当原位生物固定结束后，即可开始进行下一个层位的海水采集与过滤。

S8：重复S5和S6的步骤，进行非保压和保压海水采集，实现原位过滤并固定海水微生物。

具体地，其他层位可以重复上述步骤，实现原位过滤固定微生物、非保压和保压海水采集。整个采水过程，可以人为选择在深层海水保压采样时，是否开启采样泵21，上述方案选择开启采样泵21，是因为深层海水压力较大，可以通过压力使得海水充满样品釜31，该处的深层和浅层海水无明显的划分界限。

S9：上岸后收集相应的滤膜，将样品釜31放置在保温箱内，按照原有层位温度培养保压海水。

具体地，上岸后，首先关闭第一截止阀313，再打开相应的过滤结构25，收集相应的滤膜，同时卸下样品釜31。卸下的保温、保压采水样品釜31置于保温箱内，根据样品釜31保温、保压采集海水时的海水温度，将电源插头75与电源连接，开启保温箱的制冷单元73，使得保温箱内的温度为原有海水层位的温度。每个样品釜31均按照上述方式进行的温度设置，使得每个样品均按照原有层位单独控温，最后过根据研究需要，进行原位微生物的特性研究。需要指出的是，每个保温箱单独控制一个样品釜31，样品釜31的保温、保压培养按照上述操作方式即可。本实施例中的海水过滤量和RNAlater固定液的注射量均可根据实验需求进行人为调控。

S10：培养过程中，因实验需要取出海水后，导致样品釜31内的压力下降，采用增压系统6进行补充，多次实验取出海水后，样品釜31内微生物所需营养下降，加入一定量的非保压过滤海水继续培养研究。

参见图9，在某些实施例中，为满足在原位环境下，进行深海微生物的保压、保温连续培养，可以采用不同物质的量的甲烷培养相同层位海水，从而可以探究相同层位海水中微生物氧化甲烷的特性，明晰相同层位不同物质的量的甲烷对甲烷氧化速率的影响，以及相关微生物的变化特性等。具体步骤如下：

首先将增压系统6与注气罐9的第四截止阀92相连接，并注入不同物质的量的甲烷气体，此时关闭第四截止阀92，并断开增压系统6与第四截止阀92的连接，将增压系统6与注气罐9的第三截止阀91相连接，注气罐9的第四截止阀92与样品釜31的第一截止阀313相连接，并打开第一截止阀313、第三截止阀91、第四截止阀92，通过增压系统6往注气罐9内注入氮气，氮气推动第二活塞316(b)，使得注气罐9内的甲烷气体全部进入样品釜31内，此时关闭第一截止阀313、第三截止阀91、第四截止阀92。注气过程，如果样品釜31的压力增高较多，可以通过人为打开第二截止阀314，放掉蓄能腔312内的部分气体，样品釜31变化的压力可以通过压力传感器315在中央控制系统8查看。培养过程中，如果需要取样分析，可以将取样装置与第一截止阀313连接，并缓慢打开第一截止阀313，取出部分溶液和气体。因为取样等原因，导致样品釜31内的压力减小，可以通过增压系统6与第二截止阀314连接，往蓄能腔312内注入一定量的氮气，使得蓄能腔312内的压力达到原有培养压力。如果样品釜31内的溶液减少，可以打开注气罐9的第四截止阀92，将非保压采集的海水定量加入到注气罐9内，将增压系统6与注气罐9的第三截止阀91相连接，注气罐9的第四截止阀92与样品釜31的第一截止阀313相连接，并打开第一截止阀313、第三截止阀91、第四截止阀92，通过增压系统6往注气罐9内注入氮气，氮气推动第二活塞316(b)，使得注气罐9内的非保压海水全部进入样品釜31内，此时关闭第一截止阀313、第三截止阀91、第四截止阀92。往复循环，即可满足在原位环境下，深海微生物的保压、保温的连续培养及取样分析。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种深海保温保压微生物采集过滤固定培养的系统，其特征在于，包括：

采水器，其具有外框架，所述外框架内设有进样结构和采样结构，其中，所述进样结构包括采样泵、注液泵、旋转执行器、采样阀和过滤结构，带有所述采样泵的管道和带有所述注液泵的管道均连接至所述过滤结构，所述旋转执行器用于启闭所述采样阀，以控制带有所述采样泵的管道和带有所述注液泵的管道连接至所述过滤结构的任一管道通断；所述采样结构包括样品釜，所述样品釜也连接至所述过滤结构，以承接经过所述过滤结构的海水；

带有所述采样泵的管道用于通入海水，所述过滤结构用于初步从海水筛滤出微生物，带有所述注液泵的管道用于往所述过滤结构注入RNAlater固定液，以在原位固定微生物。

2.根据权利要求1所述的深海保温保压微生物采集过滤固定培养的系统，其特征在于，所述采样结构还包括保护结构和电子元件仓，其中，所述电子元件仓包括控制单元、通讯单元和电池仓，其中，所述控制单元用于控制所述旋转执行器动作，所述通讯单元通过电信号连接有中央控制系统，带有所述采样泵的管道和带有所述注液泵的管道分别设有单向阀，所述电池仓用于给所述采样泵和所述注液泵供电。

3.根据权利要求1所述的深海保温保压微生物采集过滤固定培养的系统，其特征在于，所述外框架包括上框架和下框架，所述上框架通过固定板连接有所述旋转执行器和所述采样阀，所述采样阀具有顶杆，所述旋转执行器控制所述采样阀的顶杆动作；所述上框架的边缘固定有与所述带有所述注液泵的管道连通的盛液仓，所述盛液仓存放有RNAlater固定液。

4.根据权利要求1所述的微生物采集过滤固定培养的系统，其特征在于，所述过滤结构包括过滤网和膜架，所述膜架中内至少设有一个设定孔径的滤盘，所述滤盘上安装有不同孔径的双层滤膜，所述过滤网设置于所述采样泵的吸水端。

5.根据权利要求1所述的深海保温保压微生物采集过滤固定培养的系统，其特征在于，所述样品釜内部通过一可上下活动的第一活塞划分为采样腔和蓄能腔，所述采样腔的上端设有第一截止阀；所述蓄能腔的下端设有第二截止阀以及用于监测所述蓄能腔的压力的压力传感器。

6.根据权利要求1所述的深海保温保压微生物采集过滤固定培养的系统，其特征在于，还包括保护结构，所述保护结构设置在所述过滤结构和所述样品釜之间，所述保护结构包括节流器和溢流阀，所述节流器用于控制所述过滤结构的过滤和采样速度；所述溢流阀用于保证所述样品釜被充满后所述过滤结构能继续进行过滤。

7.根据权利要求2所述的深海保温保压微生物采集过滤固定培养的系统，其特征在于，还包括用于监测所述系统各物理参数的环境参数检测单元，所述环境参数检测单元通过电信号连接所述中央控制系统。

8.根据权利要求5所述的深海保温保压微生物采集过滤固定培养的系统，其特征在于，还包括增压系统，所述增压系统用于向所述蓄能腔注入设定量的气体，其中，所述增压系统包括连接有增压泵的空压机，以及连接在所述空压机的出口的储气罐，所述储气罐通过带有调压阀的进气通道连接至所述样品釜。

9.根据权利要求1所述的深海保温保压微生物采集过滤固定培养的系统，其特征在于，还包括保温箱，所述保温箱包括由保温材料构成的箱体，所述箱体内通过固定架固定有所述样品釜，且所述箱体上设有制冷单元和压缩机，所述制冷单元和压缩机配合使用以控制所述箱体内的温度；所述箱体包括箱盒和转动连接在所述箱盒上的箱盖。

10.一种深海保温保压微生物采集过滤固定培养的方法，其利用权利要求1-9任一项所述的微生物采集过滤固定培养的系统进行，其特征在于，包括：

S1：对样品釜内的采样腔进行清洗灭菌，同一个膜架上，在滤盘上依次按孔径大小安装滤膜，每个滤盘上放至少一张滤膜，每个膜架间隔安装滤膜；

S2：通过增压系统往保压采样需要用到的样品釜内的蓄能腔注入一定压力的气体；非保压采样的样品釜不采取任何措施；

S3：将光缆与微生物采集过滤固定培养的系统的中央控制系统连接；

S4：在微生物采集过滤固定培养的系统下潜过程中，实时记录海洋环境的环境参数，为下一步序列过滤海水或保压采集海水做准备；

S5：到达关注第一海水层位后，通过旋转执行器打开顶杆，无需开启采样泵，第一海水层的海水直接进入提前注气过的样品釜内的采样腔；

S6：保压海水采集完后，通过旋转执行器打开顶杆，开启采样泵，第一海水层的海水直接通过过滤结构过滤微生物，其中一部分海水流至未注气的样品釜，剩余排放至海里；过滤结束后，开启注液泵，往过滤结构的滤膜上注入RNAlater固定液；

S7：到达关注第二海水层位后，通过旋转执行器打开顶杆，开启采样泵吸取海水，第二海水层的海水直接进入提前注气过的样品釜内的采样腔；

S8：重复S5和S6的步骤，进行非保压和保压海水采集，实现原位过滤并固定海水微生物；

S9：上岸后收集相应的滤膜，将样品釜放置在保温箱内，按照原有层位温度培养保压海水；

S10：培养过程中，因实验需要取出海水后，导致样品釜内的压力下降，采用增压系统进行补充，多次实验取出海水后，样品釜内微生物所需营养下降，加入一定量的非保压过滤海水继续培养研究。

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