CN115746081A - 一种多肽衍生物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种多肽衍生物及其制备方法，包括：得到多肽衍生物中间体，对所述多肽衍生物中间体进行冻干预处理，得到冻干预处理后的多肽衍生物的中间体；对所述冻干预处理后的多肽衍生物的中间体进行脱保护，得到多肽衍生物。本申请冻干预处理提高了脱保护蛋白浓度上限。另一方面调整脱保护中终止方式和条件，降低了异构体杂质含量和提高了操作方法稳定性，进一步优化终止条件，也使脱保护后目的蛋白含量提高。
Description
技术领域
本申请属于多肽技术领域。具体而言，本申请涉及多肽衍生物及其制备方法。另外，本申请还涉及含该多肽衍生物的药物以及在制备药物中的用途等。
背景技术
在医药开发和生产过程中，为获得具有药学活性的目标产物，往往需要经历复杂且多个生产步骤，各个生产环节的条件环境也不相同，而各反应步骤中经常仅需要针对一个反应中心进行转换，为达到该目的，研发者需要精心挑选具有特定选择性的反应试剂和反应条件。同时，为达到该目的的另一种方式是，对当下步骤中不希望发生反应的位置进行暂时性的结构修饰(即保护)，以达到在该步骤下目标位置发生反应时，该结构修饰位置官能团不受影响，在完成整个反应后，可通过特定步骤将保护官能团恢复为修饰前的结构(即脱保护)。如醇、羧酸、胺类、醛、硫醇等都是常见的需要进行保护和脱保护的基团。
在实际应用中，脱保护方式也各有不同。US 6184309公开了一种使用酸催化从聚合物中除去保护基团的方法，其指出许多强和弱有机和无机酸能作为脱保护剂。US 2003/0212249报导了环孢菌素类似物的合成，其中三甲代甲硅烷基保护基团可以用乙酸或柠檬酸除去。US 5135683涉及脱保护的多羟基化合物的制备，其指出磷酸可作为除去环状缩酮保护基团的试剂。
然而，针对脱保护反应，仍然存在脱保护反应中存在异构体杂质、脱保护不完全、脱保护底物浓度受限等多种问题，对于化合物工业生产、制备与纯化带来巨大挑战。
发明内容
本申请中通过酰胺键将含有保护基团的十八烷烃脂肪酸与多肽(如GLP-1)进行偶联，为去除脂肪酸上的叔丁基保护基团，需要在强酸环境下对其进行脱保护操作。通常而言，考察脱保护操作成功与否的条件主要为脱保护的浓度以及脱保护产物中的杂质体含量等。脱保护过程中，脱保护蛋白浓度受到极大限制，当脱保护蛋白超过特定浓度，蛋白脱保护将不完全，导致脱保护不完全的样品含量急剧增加，严重影响蛋白质生产及纯化效益和效率。同时，常规强碱性溶液终止脱保护过程中，会产生难以分离去除的消旋异构体，不同批次生产时的异构体含量差异较大，尤其是在较大体系中尤为显著。为解决上述问题亟待改善相关工艺，寻找适宜高浓度蛋白脱保护，且杂质含量低，方法稳定性高的脱保护方法。
本申请技术方案如下：
1.一种多肽衍生物的制备方法，包括：
得到多肽衍生物中间体，所述多肽衍生物中间体为经含有保护基的羧酸酯修饰的多肽；
对所述多肽衍生物中间体进行冻干预处理，得到冻干预处理后的多肽衍生物的中间体；
对所述冻干预处理后的多肽衍生物的中间体进行脱保护，得到多肽衍生物。
2.根据项1所述的制备方法，
所述保护基选自C1～C21烷基、芳基中的任一种。
3.根据项2所述的制备方法，
所述保护基为甲基、乙基、叔丁基或苄基。
4.根据项1所述的制备方法，
所述羧酸酯为脂肪酸酯。
5.根据项4所述的制备方法，
所述脂肪酸为辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、二十一酸、二十二酸、二十三酸、二十四酸、棕榈油酸、油酸、亚麻油酸、蓖麻油酸、异柠檬酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸、1,8-辛二酸、1,7-庚二甲酸、1,10-癸二酸、十一烷二酸、十二烷二酸、十三烷二酸、十四烷二酸、十五烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸或十八烷二酸中的一种或两种以上。
6.根据项1所述的制备方法，
所述冻干预处理包括如下步骤：
预冻处理；
冷冻处理；
一次干燥处理；以及
进一步可以包括任选二次干燥处理。
7.根据项6所述的制备方法，
所述预冻处理的预冻温度为2～8℃，预冻处理的时间为大于等于2.0小时；或者
所述冷冻处理的冷冻温度为-30℃～-60℃，冷冻处理的时间为3小时以上；或者
所述一次干燥处理的温度为-10℃～0℃，一次干燥处理的真空度为0.05～2.0mbar，一次干燥处理的干燥时间为大于等于20小时；
所述二次干燥处理的温度为20℃～65℃，二次干燥处理的真空度为0.05～2.0mbar，二次干燥处理的干燥时间为大于0小时且在8小时以下。
8.根据项1所述的制备方法，
多肽选自胰岛素、胰高血糖素、肠促胰岛素、GLP-1、甲状旁腺素(PTH)、GLP-2、胃泌酸调节素、淀粉不溶素(Amylin)、肠高血糖素、生长激素抑制素、瘦素、YY肽、去氨加压素、骨钙蛋白、人生长激素、糖肽抗生素、非核糖体肽抗生素、促皮质素、降钙素、催产素、干扰素、纤维蛋白溶媒、抗利尿激素、白细胞介素、尿激酶、促甲状腺激素释放激素、甲硫氨酸脑啡肽、亮氨酸脑啡肽、前列腺素F2α受体调节剂、肥胖抑制素、分泌素、nesfatin、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)及上述多肽的类似物或片段中的一种或两种以上。
9.根据项8所述的制备方法，
所述多肽选自GLP-1、GLP-1的药学上可接受的盐、GLP-1类似物、GLP-1类似物的药学上可接受的盐。
10.根据项1所述的制备方法，
在所述脱保护步骤中：
冻干预处理后的多肽衍生物的中间体在酸催化剂溶液条件下进行脱保护，得到脱保护反应液；
将所述脱保护反应液加入到终止液中，调节pH值以终止反应，得到多肽衍生物。
11.根据项10所述的制备方法，
调节pH值至6.5～10.0以终止反应，得到多肽衍生物。
12.根据项11所述的制备方法，
调节pH值至7.5～9.5以终止反应，得到多肽衍生物。
13.根据项10所述的制备方法，
所述终止液包含缓冲盐溶液和碱性溶液。
14.根据项13所述的制备方法，
所述碱性溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、碳酸氢铵溶液中的一种或两种以上。
15.根据项13所述的制备方法，
所述缓冲盐溶液选自磷酸盐类缓冲溶液、Tris类缓冲溶液、有机酸类缓冲溶液、硼酸盐类缓冲溶液、氨基酸类缓冲溶液中的一种或两种以上。
16.根据项15所述的制备方法，
所述缓冲盐溶液选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、柠檬酸-NaOH-HCl缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(PB)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸二氢钾-NaOH缓冲溶液、巴比妥钠-HCl缓冲溶液、NH4HCO3缓冲溶液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液、NaHCO3缓冲溶液、Tris-HCl、甘氨酸-NaOH缓冲溶液、硼酸-硼砂缓冲溶液、Na2B7O4缓冲溶液中的一种或两种以上。
17.根据项14所述的制备方法，
所述碱性溶液为氢氧化钠溶液。
18.根据项13所述的制备方法，
所述缓冲盐溶液中缓冲盐的浓度为0.001M～0.6M，优选为0.01M～0.6M,更优选为0.01M～0.5M。
19.根据项14或17所述的制备方法，
所述碱性溶液的浓度为2～10M，优选为3～8M，更优选为4～6M。
20.根据项13所述的制备方法，
所述缓冲盐溶液和所述碱性溶液的体积比为(0.1～100)：1，优选为(0.1～70)：1，更优选为(1～50)：1。
21.根据项10所述的制备方法，
酸催化剂选自对甲苯磺酸、三氟乙酸、乙酸、甲磺酸、盐酸、磷酸和磺酸中的一种或两种以上。
22.一种多肽衍生物的制备方法，
得到多肽衍生物中间体，所述多肽衍生物中间体为含有保护基的羧酸酯修饰的多肽；
所述多肽衍生物的中间体在酸催化剂溶液条件下进行脱保护，得到脱保护反应液；
将所述脱保护反应液加入到终止液中，调节pH值以终止反应，得到多肽衍生物。
23.根据项22所述的制备方法，
调节pH值至6.5～10.0以终止反应，得到多肽衍生物。
24.根据项23所述的制备方法，
调节pH值至7.5～9.5以终止反应，得到多肽衍生物。
25.根据项22所述的制备方法，
所述终止液包含缓冲盐溶液和碱性溶液。
26.根据项25所述的制备方法，
所述碱性溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、碳酸氢铵溶液中的一种或两种以上。
27.根据项25所述的制备方法，
所述缓冲盐溶液选自磷酸盐类缓冲溶液、Tris类缓冲溶液、有机酸类缓冲溶液、硼酸盐类缓冲溶液、氨基酸类缓冲溶液中的一种或两种以上。
28.根据项27所述的制备方法，
所述缓冲盐溶液选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、柠檬酸-NaOH-HCl缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(PB)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸二氢钾-NaOH缓冲溶液、巴比妥钠-HCl缓冲溶液、NH4HCO3缓冲溶液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液、NaHCO3缓冲溶液、Tris-HCl、甘氨酸-NaOH缓冲溶液、硼酸-硼砂缓冲溶液、Na2B7O4缓冲溶液中的一种或两种以上。
29.根据项26所述的制备方法，
所述碱性溶液为氢氧化钠溶液。
30.根据项25所述的制备方法，
所述缓冲盐溶液中缓冲盐的浓度为0.001M～0.6M，优选为0.01M～0.6M,更优选为0.01M～0.5M。
31.根据项25或26所述的制备方法，
所述碱性溶液的浓度为2～10M，优选为3～8M，更优选为4～6M。
32.根据项25所述的制备方法，
所述缓冲盐溶液和所述碱性溶液的体积比为(0.1～100)：1，优选为(0.1～70)：1，更优选为(1～50)：1。
33.根据项22所述的制备方法，
酸催化剂选自对甲苯磺酸、三氟乙酸、乙酸、甲磺酸、盐酸、磷酸和磺酸中的一种或两种以上。
34.根据项22所述的制备方法，
对所述多肽衍生物的中间体进行冻干预处理，得到冻干预处理后的多肽衍生物的中间体；
对所述冻干预处理后的多肽衍生物的中间体进行脱保护，得到多肽衍生物。
35.根据项22所述的制备方法，
所述保护基选自C1-C21烷基、芳基中的任一种。
36根据项35所述的制备方法，
所述保护基为甲基、乙基、叔丁基或苄基。
37.根据项22所述的制备方法，
所述羧酸酯为脂肪酸酯。
38.根据项37所述的制备方法，
所述脂肪酸为辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、二十一酸、二十二酸、二十三酸、二十四酸、棕榈油酸、油酸、亚麻油酸、蓖麻油酸、异柠檬酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸、1,8-辛二酸、1,7-庚二甲酸、1,10-癸二酸、十一烷二酸、十二烷二酸、十三烷二酸、十四烷二酸、十五烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸或十八烷二酸中的一种或两种以上。
39.根据项34所述的制备方法，
所述冻干预处理包括如下步骤：
预冻处理；
冷冻处理；
一次干燥处理；以及
进一步可以包括任选二次干燥处理。
40.根据项39所述的制备方法，
所述预冻处理的预冻温度为2～8℃，预冻处理的时间为大于等于2.0小时；或者
所述冷冻处理的冷冻温度为-30℃～-60℃，冷冻处理的时间为3小时以上；或者
所述一次干燥处理的温度为-10℃～0℃，一次干燥处理的真空度为0.05-2.0mbar，一次干燥处理的干燥时间为大于等于20小时；
所述二次干燥处理的温度为20℃～65℃，二次干燥处理的真空度为0.05-2.0mbar，二次干燥处理的干燥时间为大于0小时且在8小时以下。
41.根据项22所述的制备方法，
多肽选自胰岛素、胰高血糖素、肠促胰岛素、GLP-1、甲状旁腺素(PTH)、GLP-2、胃泌酸调节素、淀粉不溶素(Amylin)、肠高血糖素、生长激素抑制素、瘦素、YY肽、去氨加压素、骨钙蛋白、人生长激素、糖肽抗生素、非核糖体肽抗生素、促皮质素、降钙素、催产素、干扰素、纤维蛋白溶媒、抗利尿激素、白细胞介素、尿激酶、促甲状腺激素释放激素、甲硫氨酸脑啡肽、亮氨酸脑啡肽、前列腺素F2α受体调节剂、肥胖抑制素、分泌素、nesfatin、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)及上述多肽的类似物或片段中的一种或两种以上。
42.根据项41所述的制备方法，
所述多肽选自GLP-1、GLP-1的药学上可接受的盐、GLP-1类似物、GLP-1类似物的药学上可接受的盐。
43.一种多肽衍生物的制备方法，包括：
得到多肽衍生物中间体，所述多肽衍生物中间体为含有保护基的羧酸酯修饰的多肽；对所述多肽衍生物的中间体进行冻干预处理，得到冻干预处理后的多肽衍生物的中间体；
所述冻干预处理后的多肽衍生物的中间体在酸催化剂溶液条件下进行脱保护，得到脱保护反应液；
将所述脱保护反应液加入到终止液中，调节pH值以终止反应，得到多肽衍生物。
44.根据项43所述的制备方法，
所述保护基选自C1～C21烷基、芳基中的任一种。
45.根据项44所述的制备方法，
所述保护基为甲基、乙基、叔丁基或苄基。
46.根据项43所述的制备方法，
所述羧酸酯为脂肪酸酯。
47.根据项46所述的制备方法，
所述脂肪酸为辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、二十一酸、二十二酸、二十三酸、二十四酸、棕榈油酸、油酸、亚麻油酸、蓖麻油酸、异柠檬酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸、1,8-辛二酸、1,7-庚二甲酸、1,10-癸二酸、十一烷二酸、十二烷二酸、十三烷二酸、十四烷二酸、十五烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸或十八烷二酸中的一种或两种以上。
48.根据项43所述的制备方法，
所述冻干预处理包括如下步骤：
预冻处理；
冷冻处理；
一次干燥处理；以及
进一步可以包括任选二次干燥处理。
49.根据项48所述的制备方法，
所述预冻处理的预冻温度为2～8℃，预冻处理的时间为大于等于2.0小时；或者
所述冷冻处理的冷冻温度为-30℃～-60℃，冷冻处理的时间为3小时以上；或者
所述一次干燥处理的温度为-10℃～0℃，一次干燥处理的真空度为0.05～2.0mbar，一次干燥处理的干燥时间为大于等于20小时；
所述二次干燥处理的温度为20℃～65℃，二次干燥处理的真空度为0.05～2.0mbar，二次干燥处理的干燥时间为大于0小时且在8小时以下。
50.根据项43所述的制备方法，
多肽选自胰岛素、胰高血糖素、肠促胰岛素、GLP-1、甲状旁腺素(PTH)、GLP-2、胃泌酸调节素、淀粉不溶素(Amylin)、肠高血糖素、生长激素抑制素、瘦素、YY肽、去氨加压素、骨钙蛋白、人生长激素、糖肽抗生素、非核糖体肽抗生素、促皮质素、降钙素、催产素、干扰素、纤维蛋白溶媒、抗利尿激素、白细胞介素、尿激酶、促甲状腺激素释放激素、甲硫氨酸脑啡肽、亮氨酸脑啡肽、前列腺素F2α受体调节剂、肥胖抑制素、分泌素、nesfatin、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)及上述多肽的类似物或片段中的一种或两种以上。
51.根据项50所述的制备方法，
所述多肽选自GLP-1、GLP-1的药学上可接受的盐、GLP-1类似物、GLP-1类似物的药学上可接受的盐。
52.根据项43所述的制备方法，
调节pH值至6.5～10.0以终止反应，得到多肽衍生物。
53.根据项52所述的制备方法，
调节pH值至7.5～9.5以终止反应，得到多肽衍生物。
54.根据项43所述的制备方法，
所述终止液包含缓冲盐溶液和碱性溶液。
55.根据项54所述的制备方法，
所述碱性溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、碳酸氢铵溶液中的一种或两种以上。
56.根据项54所述的制备方法，
所述缓冲盐溶液选自磷酸盐类缓冲溶液、Tris类缓冲溶液、有机酸类缓冲溶液、硼酸盐类缓冲溶液、氨基酸类缓冲溶液中的一种或两种以上，
57.根据项56所述的制备方法，
所述缓冲盐溶液选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、柠檬酸-NaOH-HCl缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(PB)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸二氢钾-NaOH缓冲溶液、巴比妥钠-HCl缓冲溶液、NH4HCO3缓冲溶液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液、NaHCO3缓冲溶液、Tris-HCl、甘氨酸-NaOH缓冲溶液、硼酸-硼砂缓冲溶液、Na2B7O4缓冲溶液中的一种或两种以上。
58.根据项54所述的制备方法，
所述碱性溶液溶液为氢氧化钠溶液。
59.根据项54所述的制备方法，
所述缓冲盐溶液中缓冲盐的浓度为0.001M～0.6M，优选为0.01M～0.6M,更优选为0.01M～0.5M。
60.根据项54或58所述的制备方法，
所述碱性溶液的浓度为2～10M，优选为3～8M，更优选为4～6M。
61.根据项54所述的制备方法，
所述缓冲盐溶液和所述碱性溶液的体积比为(0.1～100)：1，优选为(0.1～70)：1，更优选为(1～50)：1。
62.根据项43所述的制备方法，
酸催化剂选自对甲苯磺酸、三氟乙酸、乙酸、甲磺酸、盐酸、磷酸和磺酸中的一种或两种以上。
63.一种多肽衍生物，其中，所述多肽衍生物经项1～64任一项所述方法制备而得。
与现有技术相比，本申请的有益效果为：
本申请提供了一种新的多肽衍生物脱保护工艺，一方面，通过在传统酸催化剂作用下进行脱保护反应进行前增加对脱保护蛋白冻干预处理环节，有效提高了脱保护蛋白浓度上限，极大提高蛋白质生产中脱保护工艺的效益和效率；另一方面，通过调整脱保护终止液添加方式，由常规的将脱保护液加入脱保护反应液中调整为将反应液加入脱保护液中，极大降低了脱保护过程中异构体杂质含量且提高了操作方法稳定性，进一步的，通过对该终止方式中增加缓冲溶液、调整缓冲溶液成分体积等优化，进一步提高了脱保护效果和稳定性。克服了多肽分子脱保护过程中的技术瓶颈，具备明显的工业化大规模生产实用性。
具体实施方式
下面所给出的定义是为了更清楚地说明它们在说明书和权利要求书中使用的含义和范围。
本申请的“多肽”或“肽”或“蛋白质”可以交替使用。“多肽”或“肽”或“蛋白质”是包含两种或两种以上的氨基酸的任意链，无论翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)的情况如何，包括天然发生或非天然发生的氨基酸或氨基酸类似物，其中任意链中的氨基酸通过肽键共价连接。在一些实施方式中可以为天然存在的蛋白质、或者是非重组细胞或基因工程或重组细胞产生的蛋白质，并且包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。
在本领域中，众所周知可以在多肽的结构中进行诸如取代、添加或替换的某些修饰和变化而基本上不改变该多肽的生物学功能，从而得到生物学等同的多肽。
本申请的“多肽”或“肽”或“蛋白质”可包含有异常连接、交联和末端帽子，非肽键或其它修饰基团。这些修饰基团也在本申请范围之内。术语“修饰基团”是指包括直接附着于所述肽结构的结构，以及那些间接附着于所述肽结构的结构。例如，所述修饰基团可以偶联于肽结构的氨基末端或羧基末端，或偶联于所述核心结构域侧翼的肽。或者，所述修饰基团可以连接于肽结构的至少一个氨基酸残基的侧链，或偶联于所述核心结构域侧翼的肽或肽模拟区域(例如，通过赖氨酰残基的ε氨基，通过天冬氨酸残基或谷氨酸残基的羧基，通过酪氨酰残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基的羟基，或在氨基酸侧链上的其它适合的反应基团)。共价偶联于所述肽结构的修饰基团可通过本领域中公知的方式和方法结合于连接性化学结构，包括，例如酰胺，烷氨基，氨基甲酸盐或尿素键。
在本申请的一些实施方式中，多肽选自胰岛素、胰高血糖素、肠促胰岛素、GLP-1、甲状旁腺素(PTH)、GLP-2、胃泌酸调节素、淀粉不溶素(Amylin)、肠高血糖素、生长激素抑制素、瘦素、YY肽、去氨加压素、骨钙蛋白、人生长激素、糖肽抗生素、非核糖体肽抗生素、促皮质素、降钙素、催产素、干扰素、纤维蛋白溶媒、抗利尿激素、白细胞介素、尿激酶、促甲状腺激素释放激素、甲硫氨酸脑啡肽、亮氨酸脑啡肽、前列腺素F2α受体调节剂、肥胖抑制素、分泌素、nesfatin、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)及上述多肽的类似物或片段中的一种或两种以上。
在本申请的一些实施方式中，所述多肽选自GLP-1、GLP-1的药学上可接受的盐、GLP-1类似物、GLP-1类似物的药学上可接受的盐。
在本申请中，“多肽衍生物”是指多肽的功能基团(如氨基酸残基)被某些化合物(如小分子化合物)修饰后所得到的产物。所述修饰包括但不限于酰基化、酰胺化、酯化、硫酯化。
在本申请中，多肽衍生物中间体为经含有保护基的羧酸酯修饰的多肽。
在本申请中，需要对多肽衍生物中的羧基进行保护，不对羧基的位置进行限定，此时的羧基可以是多肽衍生物分子中任何位置的羧基，例如，羧基可以为来源于多肽衍生物分子中的氨基酸骨架上的羧酸，也可以来源于多肽衍生物分子中的侧链上的羧酸。所采用的羧基的保护基团的种类并不重要，只要衍生的保护羧酸的基团(如含有保护基的羧酸酯)对随后的反应条件稳定，且可以在不破坏分子的其余部分的情况下，在适宜的时机去除即可。
在本申请中，羧酸酯指的是-C(O)OR，其中R为烷基、芳基、芳烷基和脂环，所有羧酸酯可任选取代。
在本申请的一些实施方式中，烷基表示二价烷基或亚烷基；
在本申请的一些实施方式中，芳基表示具有5-14个环原子和至少一个具有共轭π电子系统的环的芳基并包括碳环芳基、杂环芳基和联芳基，所有这些基团可任选取代，碳环芳基为其中芳族环上的环原子是碳原子的基团。碳环芳基包括单环碳环芳基和多环或稠合化合物，例如任选取代的萘基。杂环芳基或杂芳基为具有1-4个杂原子作为芳族环的环原子且其余的环原子是碳原子的基团。适宜的杂原子包括氧、硫、氮和硒。适宜的杂芳基包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低级烷基吡咯基、吡啶基-N-氧化物、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等，所有杂芳基可任选被取代。
在本申请的一些实施方式中，联芳基表示包含多于一个芳族环的芳基，包括稠合环系统和用其它的芳基取代的芳基，这样的基团可任选取代。
在本申请的一些实施方式中，脂环表示兼有脂族和环状化合物性质的化合物。这样的环状化合物包括(但不限于)芳族、环烷基和桥接环烷基化合物。环状化合物包括杂环。这样的基团可任选取代。
在本申请的一些实施方式中，“多肽类似物”是指在功能上基本上类似于天然肽或蛋白或其片段的分子。
在本申请的一些实施方式中，GLP-1类似物是指将被选择，以保持天然底物的体外或体内活性的一种或更多种。体外和体内活性可采用适于GLP-1类似物的、本领域普通技术人员可利用的任何方案加以测量。可被测量以确定GLP-1类似物是否保持相同或相似功能活性的示例性功能活性包括类似物在基于细胞的测定或无细胞测定中结合其受体(一种或多种)的能力、类似物诱导应答于GLP-1R的细胞变化(例如，增殖、分化、存活、生长、迁移等等)、类似物调节在细胞中应答于GLP-1的一个或更多个其它基因或蛋白质的表达的能力。
GLP-1类似物具有与天然GLP-1或其片段基本上相似的活性(例如，活性为天然GLP-1的大约80％、90％、100％、110％或120％)。在一些实施方式中，类似物活性较天然GLP-1低(例如，活性为该天然多肽的大约50％、60％、70％或75％)。我们注意到，如果活性降低仍提供在足够的时间期间内提供足够的类似物局部浓度的能力，活性稍微低一些的类似物可能是有用的，例如在体内或在细胞培养物中。因此，例如通过蛋白酶抗性得到的半衰期增加可补偿类似物的构建所导致的活性降低。在另外的实施方式中，类似物比天然GLP-1活性更强(例如，活性为天然GLP-1的大约130％、150％、175％、200％、300％、500％、800％或甚至1000％)。在前述的任一种中，“活性”指天然GLP-1的一种或多种功能。例如，类似物的活性(例如，生物功能)可以是受体结合、作为转录激活子或抑制子起作用的能力、参与特定的信号转导通路的能力、或影响细胞行为(例如，增殖、分化、存活或迁移)的能力。
在本申请的一些实施方式中，所述多肽衍生物通过脂肪酸以酰胺键的形式对多肽进行偶联。
在本申请的一些实施方式中，脂肪酸为C1～C25脂肪酸。例如甲酸、乙酸、C3脂肪酸、C4脂肪酸、C5脂肪酸、C6脂肪酸、C7脂肪酸、C8脂肪酸、C9脂肪酸、C10脂肪酸、C11脂肪酸、C12脂肪酸、C13脂肪酸、C14脂肪酸、C15脂肪酸、C16脂肪酸、C17脂肪酸、C18脂肪酸、C19脂肪酸、C20脂肪酸、C21脂肪酸、C22脂肪酸、C23脂肪酸、C24脂肪酸或C25脂肪酸。
本申请中，所述的C1～C21脂肪酸包括直链脂肪酸和支链脂肪酸。
本申请中，所述的C1～C21脂肪酸包括饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。
在本申请的一些实施方式中，所述脂肪酸为辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、二十一酸、二十二酸、二十三酸、二十四酸、棕榈油酸、油酸、亚麻油酸、蓖麻油酸、异柠檬酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸、1,8-辛二酸、1,7-庚二甲酸、1,10-癸二酸、十一烷二酸、十二烷二酸、十三烷二酸、十四烷二酸、十五烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸或十八烷二酸中的一种或两种以上。
在本申请中，术语“药学上可接受的盐”是指保持了本申请的多肽类似物的衍生物的生物有效性和性质的盐，并且其通常在生物上或在其它方面不是不期望的。在许多情形下，本申请的多肽类似物的衍生物通过氨基和/或羧基或与其类似的基团的存在，可形成酸和/或碱盐。
可使用无机酸及有机酸来形成药学上可接受的酸加成盐，例如，乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、chlortheophyllonate、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八烷酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、巴莫酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐及三氟乙酸盐。
可由其衍生盐的无机酸包括，例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。
可由其衍生盐的有机酸包括，例如，乙酸、丙酸、羟乙酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。可与无机碱及有机碱来形成药学上可接受的碱加成盐。
可由其衍生盐的无机碱包括，例如，铵盐及周期表第I族至第XII族的金属。在某些实施方案中，所述盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌及铜；尤其适宜的盐包括铵盐、钾盐、钠盐、钙盐及镁盐。
可由其衍生盐的有机碱可包括，例如，伯、仲和叔胺、取代胺包括天然存在的取代胺、环状胺、碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙基胺、胆碱盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪及氨丁三醇。
本申请的药学上可接受的盐可通过惯用化学方法从母体化合物、碱性或酸性部分来合成。通常，这些盐可通过使这些化合物的游离酸形式与化学计量的适当碱(例如Na或K的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)进行反应来制备，或通过使这些化合物的游离碱形式与化学计量的适当酸进行反应来制备。这些反应通常是在水或有机溶剂、或二者的混合物中进行。通常，在可行的情况下，使用非水性介质，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是合乎需要的。
本申请提供了一种多肽衍生物的制备方法，其中，得到多肽衍生物中间体，所述多肽衍生物中间体是含有保护基的羧酸酯修饰的多肽；对所述多肽衍生物中间体进行冻干预处理，得到冻干预处理后的多肽衍生物的中间体；对所述冻干预处理后的多肽衍生物的中间体进行脱保护，得到多肽衍生物。
在本申请中，多肽衍生物中间体可以为湿固体，即得到多肽衍生物中间体的湿固体，所述多肽衍生物中间体是含有保护基的羧酸酯修饰的多肽；对所述多肽衍生物中间体的湿固体进行冻干预处理，得到冻干预处理后的多肽衍生物的中间体；对所述冻干预处理后的多肽衍生物的中间体进行脱保护，得到多肽衍生物。
在本申请的一些实施方式中，所述保护基选自C1-C21烷基、芳基中的任一种。
在本申请的一些实施方式中，所述保护基选自C1-C10烷基、芳基中的任一种。
在本申请的一些实施方式中，所述保护基为甲基、乙基、叔丁基或苄基。
在本申请的一些实施方式中，所述羧酸酯为脂肪酸酯。
在本申请的一些实施方式中，所述脂肪酸为辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、二十一酸、二十二酸、二十三酸、二十四酸、棕榈油酸、油酸、亚麻油酸、蓖麻油酸、异柠檬酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸、1,8-辛二酸、1,7-庚二甲酸、1,10-癸二酸、十一烷二酸、十二烷二酸、十三烷二酸、十四烷二酸、十五烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸或十八烷二酸中的一种或两种以上。
本申请通过在传统酸催化剂脱保护反应进行前增加对脱保护蛋白冻干预处理环节，有效提高了脱保护蛋白浓度上限，极大提高蛋白质生产中脱保护工艺的效益和效率。
在本申请的一些实施方式中，所述冻干预处理包括：预冻处理；冷冻处理；一次干燥处理；以及进一步可以包括任选二次干燥处理。
在本申请的一些实施方式中，所述冻干预处理包括：预冻处理、冷冻处理及一次干燥处理。
在本申请的一些实施方式中，所述冻干预处理包括：预冻处理、冷冻处理、一次干燥处理和二次干燥处理。
在本申请的一些实施方式中，所述预冻处理的预冻温度为2～8℃，预冻处理的时间大于等于2.0小时；或者所述冷冻处理的冷冻温度为-30℃～-60℃，冷冻处理的时间为3小时以上；或者所述一次干燥处理的温度为-10℃～0℃，一次干燥处理的真空度为0.05～2.0mbar，一次干燥处理的干燥时间大于等于20小时；所述冻干预处理可进一步包括二次干燥处理，二次干燥处理的温度为20℃～65℃，二次干燥处理的真空度为0.05～2.0mbar，二次干燥处理的干燥时间为大于0小时且在8小时以下；
例如，所述预冻处理的预冻温度可以为2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃或其之间的任意范围；
预冻处理的时间可以为2.0小时、2.1小时、2.2小时、2.3小时、2.4小时、2.5小时、2.6小时、2.7小时、2.8小时、2.9小时、3.0小时、3.1小时、3.2小时、3.3小时、3.4小时、3.5小时、3.6小时、3.7小时、3.8小时、3.9小时、4.0小时、4.1小时、4.2小时、4.3小时、4.4小时、4.5小时、4.6小时、4.7小时、4.8小时、4.9小时、5.0小时、5.1小时、5.2小时、5.3小时、5.4小时、5.5小时、5.6小时、5.7小时、5.8小时、5.9小时、6.0小时、6.1小时、6.2小时、6.3小时、6.4小时、6.5小时、6.6小时、6.7小时、6.8小时、6.9小时、7.0小时、7.1小时、7.2小时、7.3小时、7.4小时、7.5小时、7.6小时、7.7小时、7.8小时、7.9小时、8.0小时、8.1小时、8.2小时、8.3小时、8.4小时、8.5小时、8.6小时、8.7小时、8.8小时、8.9小时、9.0小时、9.1小时、9.2小时、9.3小时、9.4小时、9.5小时、9.6小时、9.7小时、9.8小时、9.9小时、10.0小时及以上或其之间的任意范围；
所述冷冻处理的冷冻温度可以为-30℃、-31℃、-32℃、-33℃、-34℃、-35℃、-36℃、-37℃、-38℃、-39℃、-40℃、-41℃、-42℃、-43℃、-44℃、-45℃、-46℃、-47℃、-48℃、-49℃、-50℃、-51℃、-52℃、-53℃、-54℃、-55℃、-56℃、-57℃、-58℃、-59℃、-60℃或其之间的任意范围；
冷冻处理的时间可以为3.1小时、3.2小时、3.3小时、3.4小时、3.5小时、3.6小时、3.7小时、3.8小时、3.9小时、4.0小时、4.1小时、4.2小时、4.3小时、4.4小时、4.5小时、4.6小时、4.7小时、4.8小时、4.9小时、5.0小时、5.1小时、5.2小时、5.3小时、5.4小时、5.5小时、5.6小时、5.7小时、5.8小时、5.9小时、6.0小时、6.1小时、6.2小时、6.3小时、6.4小时、6.5小时、6.6小时、6.7小时、6.8小时、6.9小时、7.0小时、7.1小时、7.2小时、7.3小时、7.4小时、7.5小时、7.6小时、7.7小时、7.8小时、7.9小时、8.0小时、8.1小时、8.2小时、8.3小时、8.4小时、8.5小时、8.6小时、8.7小时、8.8小时、8.9小时、9.0小时、9.1小时、9.2小时、9.3小时、9.4小时、9.5小时、9.6小时、9.7小时、9.8小时、9.9小时、10.0小时及以上或其之间的任意范围；
一次干燥处理的温度可以为-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃或其之间的任意范围；
一次干燥处理的真空度可以为0.05mbar、0.1mbar、0.15mbar、0.2mbar、0.25mbar、0.3mbar、0.35mbar、0.4mbar、0.45mbar、0.5mbar、0.55mbar、0.6mbar、0.65mbar、0.7mbar、0.75mbar、0.8mbar、0.85mbar、0.9mbar、0.95mbar、1.0mbar、1.05mbar、1.1mbar、1.15mbar、1.2mbar、1.25mbar、1.3mbar、1.35mbar、1.4mbar、1.45mbar、1.5mbar、1.55mbar、1.6mbar、1.65mbar、1.7mbar、1.75mbar、1.8mbar、1.85mbar、1.9mbar、1.95mbar、2.0mbar或其之间的任意范围；
一次干燥处理的干燥时间可以为20小时、20.1小时、20.2小时、20.3小时、20.4小时、20.5小时、20.6小时、20.7小时、20.8小时、20.9小时、21.0小时、21.1小时、21.2小时、21.3小时、21.4小时、21.5小时、21.6小时、21.7小时、21.8小时、21.9小时、22.0小时、22.1小时、22.2小时、22.3小时、22.4小时、22.5小时、22.6小时、22.7小时、22.8小时、22.9小时、23.0小时、23.1小时、23.2小时、23.3小时、23.4小时、23.5小时、23.6小时、23.7小时、23.8小时、23.9小时、24.0小时、24.1小时、24.2小时、24.3小时、24.4小时、24.5小时、24.6小时、24.7小时、24.8小时、24.9小时、25.0小时、25.1小时、25.2小时、25.3小时、25.4小时、25.5小时、25.6小时、25.7小时、25.8小时、25.9小时、26.0小时、26.1小时、26.2小时、26.3小时、26.4小时、26.5小时、26.6小时、26.7小时、26.8小时、26.9小时、27.0小时、27.1小时、27.2小时、27.3小时、27.4小时、27.5小时、27.6小时、27.7小时、27.8小时、27.9小时、28.0小时、28.1小时、28.2小时、28.3小时、28.4小时、28.5小时、28.6小时、28.7小时、28.8小时、28.9小时、29.0小时、29.1小时、29.2小时、29.3小时、29.4小时、29.5小时、29.6小时、29.7小时、29.8小时、29.9小时、30.0小时及以上或其之间的任意范围；
二次干燥处理的温度可以为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃或其之间的任意范围；
二次干燥处理的真空度可以为0.05mbar、0.1mbar、0.15mbar、0.2mbar、0.25mbar、0.3mbar、0.35mbar、0.4mbar、0.45mbar、0.5mbar、0.55mbar、0.6mbar、0.65mbar、0.7mbar、0.75mbar、0.8mbar、0.85mbar、0.9mbar、0.95mbar、1.0mbar、1.05mbar、1.1mbar、1.15mbar、1.2mbar、1.25mbar、1.3mbar、1.35mbar、1.4mbar、1.45mbar、1.5mbar、1.55mbar、1.6mbar、1.65mbar、1.7mbar、1.75mbar、1.8mbar、1.85mbar、1.9mbar、1.95mbar、2.0mbar或其之间的任意范围；
二次干燥处理的干燥时间可以为0.01小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时或其之间的任意范围。
在本申请的一些实施方式中，所述冻干预处理包括：预冻处理、冷冻处理及一次干燥处理；其中，所述预冻处理的预冻温度为2～8℃，预冻处理的时间大于等于2.0小时；冷冻处理的冷冻温度为-30℃～-60℃，冷冻处理的时间为3小时以上；一次干燥处理的温度为-10℃～0℃，一次干燥处理的真空度为0.05～2.0mbar，一次干燥处理的干燥时间大于等于20小时。
在本申请的一些实施方式中，所述冻干预处理包括：预冻处理、冷冻处理、一次干燥处理和二次干燥处理，其中，所述预冻处理的预冻温度为2～8℃，预冻处理的时间大于等于2.0小时；冷冻处理的冷冻温度为-30℃～-60℃，冷冻处理的时间为3小时以上；一次干燥处理的温度为-10℃～0℃，一次干燥处理的真空度为0.05～2.0mbar，一次干燥处理的干燥时间大于等于20小时；二次干燥处理的温度为20℃～65℃，二次干燥处理的真空度为0.05-2.0mbar，二次干燥处理的干燥时间为大于0小时且在8小时以下。
在本申请的一些实施方式中，在所述脱保护步骤中：将冻干预处理后的多肽衍生物的中间体在酸催化剂溶液条件下进行脱保护，得到脱保护反应液；将所述脱保护反应液加入到终止液中，调节pH值以终止反应，得到多肽衍生物。
在本申请的一些实施方式中，调节pH值至6.5～10.0以终止反应，得到多肽衍生物。
在本申请的一些实施方式中，调节pH值至7.5～9.5以终止反应，得到多肽衍生物。
在本申请的一些实施方式中，调节pH值可以至6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0或其之间的任意范围。
在本申请的一些实施方式中，所述终止液包含缓冲盐溶液和碱性溶液。
在本申请的一些实施方式中，所述碱性溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、碳酸氢铵溶液中的一种或两种以上。
在本申请的一些实施方式中，所述缓冲盐溶液选自磷酸盐类缓冲溶液、Tris类缓冲溶液、有机酸类缓冲溶液、硼酸盐类缓冲溶液、氨基酸类缓冲溶液中的一种或两种以上。
在本申请的一些实施方式中，所述缓冲盐溶液选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、柠檬酸-NaOH-HCl缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(PB)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸二氢钾-NaOH缓冲溶液、巴比妥钠-HCl缓冲溶液、NH4HCO3缓冲溶液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液、NaHCO3缓冲溶液、Tris-HCl、甘氨酸-NaOH缓冲溶液、硼酸-硼砂缓冲溶液、Na2B7O4缓冲溶液中的一种或两种以上。
在本申请的一些实施方式中，所述碱性溶液为氢氧化钠溶液。
在本申请的一些实施方式中，所述缓冲盐溶液中缓冲盐的浓度为0.001M～0.6M，优选为0.01M～0.6M,更优选为0.01M～0.5M；
例如，所述缓冲盐溶液中缓冲盐的浓度可以为0.001M、0.01M、0.02M、0.03M、0.04M、0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.1M、0.11M、0.12M、0.13M、0.14M、0.15M、0.16M、0.17M、0.18M、0.19M、0.2M、0.21M、0.22M、0.23M、0.24M、0.25M、0.26M、0.27M、0.28M、0.29M、0.3M、0.31M、0.32M、0.33M、0.34M、0.35M、0.36M、0.37M、0.38M、0.39M、0.4M、0.41M、0.42M、0.43M、0.44M、0.45M、0.46M、0.47M、0.48M、0.49M、0.5M、0.51M、0.52M、0.53M、0.54M、0.55M、0.56M、0.57M、0.58M、0.59M、0.6M或其之间的任意范围。
在本申请的一些实施方式中，所述碱性溶液的浓度为2～10M，优选为3～8M，更优选为4～6M；
例如，所述碱性溶液的浓度可以为2M、2.1M、2.2M、2.3M、2.4M、2.5M、2.6M、2.7M、2.8M、2.9M、3.0M、3M、3.1M、3.2M、3.3M、3.4M、3.5M、3.6M、3.7M、3.8M、3.9M、4.0M、4.1M、4.2M、4.3M、4.4M、4.5M、4.6M、4.7M、4.8M、4.9M、5.0M、5.1M、5.2M、5.3M、5.4M、5.5M、5.6M、5.7M、5.8M、5.9M、6.0M、6.1M、6.2M、6.3M、6.4M、6.5M、6.6M、6.7M、6.8M、6.9M、7.0M、7.1M、7.2M、7.3M、7.4M、7.5M、7.6M、7.7M、7.8M、7.9M、8M、8.1M、8.2M、8.3M、8.4M、8.5M、8.6M、8.7M、8.8M、8.9M、9M、9.1M、9.2M、9.3M、9.4M、9.5M、9.6M、9.7M、9.8M、9.9M、10M或其之间的任意范围。
在本申请的一些实施方式中，所述氢氧化钠溶液中氢氧化钠的浓度为2～10M，优选为3～8M，更优选为4～6M；
例如，所述氢氧化钠溶液中氢氧化钠的浓度可以为2M、2.1M、2.2M、2.3M、2.4M、2.5M、2.6M、2.7M、2.8M、2.9M、3.0M、3M、3.1M、3.2M、3.3M、3.4M、3.5M、3.6M、3.7M、3.8M、3.9M、4.0M、4.1M、4.2M、4.3M、4.4M、4.5M、4.6M、4.7M、4.8M、4.9M、5.0M、5.1M、5.2M、5.3M、5.4M、5.5M、5.6M、5.7M、5.8M、5.9M、6.0M、6.1M、6.2M、6.3M、6.4M、6.5M、6.6M、6.7M、6.8M、6.9M、7.0M、7.1M、7.2M、7.3M、7.4M、7.5M、7.6M、7.7M、7.8M、7.9M、8M、8.1M、8.2M、8.3M、8.4M、8.5M、8.6M、8.7M、8.8M、8.9M、9M、9.1M、9.2M、9.3M、9.4M、9.5M、9.6M、9.7M、9.8M、9.9M、10M或其之间的任意范围。
在本申请的一些实施方式中，所述缓冲盐溶液和所述碱性溶液的体积比为(0.1～100)：1；
例如，所述缓冲盐溶液和所述碱性溶液的体积比可以为0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、或其之间的任意范围。
在本申请的一些实施方式中，酸催化剂选自对甲苯磺酸、三氟乙酸、乙酸、甲磺酸、盐酸、磷酸和磺酸中的一种或两种以上。
在本申请的一些实施方式中，在所述脱保护步骤中，酸催化剂为三氟乙酸，终止液包含缓冲盐溶液和碱性溶液，调节pH值至6.5～10.0以终止反应，得到多肽衍生物。
本申请提供了一种多肽衍生物的制备方法，其中，得到多肽衍生物中间体，所述多肽衍生物中间体是含有保护基的羧酸酯修饰的多肽；所述多肽衍生物的中间体中加入到酸催化剂溶液中进行脱保护，得到脱保护反应液；将所述脱保护反应液加入到终止液中，调节pH值以终止反应，得到多肽衍生物。
在本申请的一些实施方式中，对所述多肽衍生物进行冻干预处理，得到冻干预处理后的多肽衍生物的中间体；对所述冻干预处理后的多肽衍生物的中间体进行脱保护，得到多肽衍生物。
本申请提供了一种多肽衍生物的制备方法，其中，得到多肽衍生物中间体的湿固体，所述多肽衍生物中间体是含有保护基的羧酸酯修饰的多肽；所述多肽衍生物的中间体的湿固体中加入到酸催化剂溶液中进行脱保护，得到脱保护反应液；将所述脱保护反应液加入到终止液中，调节pH值以终止反应，得到多肽衍生物。
在本申请的一些实施方式中，对所述湿固体进行冻干预处理，得到冻干预处理后的多肽衍生物的中间体；对所述冻干预处理后的多肽衍生物的中间体进行脱保护，得到多肽衍生物。
在具体实施方式中，针对pH值的描述参见上述关于脱保护中pH值的描述。
在具体实施方式中，所述终止液的描述参见上述关于脱保护中终止液的描述。
在具体实施方式中，酸催化剂的描述参见上述关于脱保护中酸催化剂的描述。
在具体实施方式中，保护基的描述参见上述关于保护基的描述。
在具体实施方式中，脂肪酸和羧酸酯的描述分别参见上述关于脂肪酸和羧酸酯的描述。
在具体实施方式中，所述冻干预处理的描述参见上述关于冻干预处理的描述。
本申请还提供了一种多肽衍生物的制备方法，包括：得到多肽衍生物中间体，所述多肽衍生物中间体是含有保护基的羧酸酯修饰的多肽；对所述多肽衍生物进行冻干预处理，得到冻干预处理后的多肽衍生物的中间体；将所述冻干预处理后的多肽衍生物的中间体加入到酸催化剂溶液中进行脱保护，得到脱保护反应液；将所述脱保护反应液加入到终止液中，调节pH值以终止反应，得到多肽衍生物。
本申请还提供了一种多肽衍生物的制备方法，包括：得到多肽衍生物中间体的湿固体，所述多肽衍生物中间体是含有保护基的羧酸酯修饰的多肽；对所述湿固体进行冻干预处理，得到冻干预处理后的多肽衍生物的中间体；将所述冻干预处理后的多肽衍生物的中间体加入到酸催化剂溶液中进行脱保护，得到脱保护反应液；将所述脱保护反应液加入到终止液中，调节pH值以终止反应，得到多肽衍生物。在具体实施方式中，针对pH值的描述参见上述关于脱保护中pH值的描述。
在具体实施方式中，所述终止液的描述参见上述关于脱保护中终止液的描述。
在具体实施方式中，酸催化剂的描述参见上述关于脱保护中酸催化剂的描述。
在具体实施方式中，保护基的描述参见上述关于保护基的描述。
在具体实施方式中，脂肪酸和羧酸酯的描述分别参见上述关于脂肪酸和羧酸酯的描述。
在具体实施方式中，所述冻干预处理的描述参见上述关于冻干预处理的描述。
本申请提供了一种多肽衍生物，其中，所述多肽衍生物经上述方法制备而得。
本申请提供了一种多肽衍生物制备方法，通过在传统酸催化剂脱保护反应进行前增加对脱保护蛋白冻干预处理环节，有效提高了脱保护蛋白浓度上限，极大提高蛋白质生产中脱保护工艺的效益和效率。
本申请提供了一种多肽衍生物制备方法，通过调整脱保护终止液添加方式，由常规的将脱保护液加入脱保护反应液中调整为将反应液加入脱保护液中，极大降低了脱保护过程中异构体杂质含量且提高了操作方法稳定性，进一步的，通过对该终止方式中增加缓冲溶液、调整缓冲溶液成分体积等优化，进一步提高了脱保护效果和稳定性。
实施例
实施例1GLP-1衍生物中间体的制备
1.1GLP-1多肽的合成、表达与纯化
按照WO2019201328实施例1-4所述的GLP-1多肽类似物制备方法合成Val8Glu22Lys30Arg26,34-GLP-1(7-37)多肽分子。概括而言，通过发酵工艺得到含有目标融合蛋白的可溶性菌体，之后称取100g菌体加入到破菌缓冲溶液中，搅拌混匀，菌体破碎两次，离心收集上清。通过阴离子层析捕获目标融合蛋白并洗脱，加入20mmol/L PB(pH7.4)的酶切稀释液稀释后酶切过夜，去除标签序列，室温反应24h后酸沉终止。离心收集沉淀并水洗，复溶后通过复合模式层析对目标蛋白进行纯化收集，稀释后酸沉离心水洗，得到GLP-1湿固体沉淀。
1.2脂肪酸侧链的合成
称取20mg式I所示的脂肪酸(赛诺邦格生物科技股份有限公司)溶于0.2mL ACN中，向其中依次加入0.6mL的20mg/mL的四氟苯酚、0.6mL的20mg/mL的EDCI、0.8mL的ACN，室温下反应1.5h进行活化，得到活化后的脂肪酸。
1.3GLP-1衍生物中间体制备
称取1g GLP-1湿固体沉淀溶于25mL水中，使用1mol/L NaOH调节pH至7.5～8.5，通过RP-HPLC检测其纯度约为98％，浓度8mg/mL，方法如下：
色谱柱：Sepax C8 4.6*250mm 5μm 200A；
流动相A：30％ACN+70％H2O+0.2％TFA，
流动相B：70％ACN+30％H2O+0.2％TFA；
洗脱梯度：
| Time(min) | 0 | 30 | 52 | 57 | 57.01 | 67 |
| B％ | 25 | 55 | 100 | 100 | 25 | 25 |
流速1.0mL/min；柱温15℃；检测器UV-280nm
得到经纯化的GLP-1复溶后样品。
量取4.75mL复溶后GLP-1样品，之后向其中加入4.75mL ACN以及19uL DIPEA，再加入上述活化后的脂肪酸，室温下反应1～2h后倒入50mL的水中，使用10％盐酸及1mol/LNaOH调节pH至5.1酸沉12～48h，离心水洗，得到GLP-1衍生物中间体湿固体。
实施例2冻干预处理
取实施例1制备的GLP-1衍生物中间体湿固体，铺盘冻干，冻干条件为样品预冻：温度4℃，维持2h，然后降温至-45℃冷冻，维持冷冻温度3h；一次干燥：预冻后升高温度至-5℃，气压0.2mbar条件下冻干40h，以完成一次干燥，干燥结束后，得到冻干预处理的多肽衍生物的中间体。
各取5mg、10mg、20mg、40mg、60mg、80mg、100mg、125mg、150mg、200mg、250mg冻干预处理的多肽衍生物的中间体分别加入1mL含水10％的TFA溶液进行溶解，使其浓度分别为5mg/mL，10mg/mL，20mg/mL，40mg/mL，60mg/mL，80mg/mL，100mg/mL，125mg/mL，150mg/mL，200mg/mL以及250mg/mL，10～30℃下搅拌反应1～2h，之后向反应液中加入5mol/L的NaOH2.5mL终止反应，并使用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至pH7.5～9.5，不断搅拌至溶液澄清，得到经冻干预处理的反应后溶液。
将上述方法获得的经冻干预处理的反应后溶液采用RP-HPLC检测脱保护终止后产物，，RP-HPLC测定条件如下：
色谱柱：Sepax C8 4.6*250mm 5μm 200A；
流动相A：30％ACN+70％H2O+0.2％TFA，
流动相B：70％ACN+30％H2O+0.2％TFA；
洗脱梯度：
| Time(min) | 0 | 30 | 52 | 57 | 57.01 | 67 |
| B％ | 25 | 55 | 100 | 100 | 25 | 25 |
流速1.0mL/min；柱温15℃；检测器UV-280nm
所述不同脱保护蛋白浓度下经冻干后脱保护考察结果分别如表1所示。
表1
| 脱保护蛋白浓度 | 脱保护不完全样品含量(％) | 纯度(％) | 其余杂质(％) |
| 5mg/mL | 1.65 | 63.8 | 34.6 |
| 10mg/mL | 1.03 | 64.9 | 34.1 |
| 20mg/mL | 0.97 | 65.3 | 33.7 |
| 40mg/mL | 1.28 | 63.2 | 35.5 |
| 60mg/mL | 3.60 | 62.7 | 33.7 |
| 80mg/mL | 2.97 | 61.3 | 35.7 |
| 100mg/mL | 3.41 | 60.9 | 35.7 |
| 125mg/mL | 1.35 | 61.2 | 37.5 |
| 150mg/mL | 1.27 | 61.3 | 37.4 |
| 200mg/mL | 15.6 | 47.9 | 36.5 |
| 250mg/mL | 26.8 | 37.0 | 36.2 |
对比例1
各取实施例1制备的15mg GLP-1衍生物中间体湿固体分别加入6mL、3mL、2mL、1.5mL含水10％的TFA溶液进行溶解，使其浓度分别为2.5mg/mL，5mg/mL，7.5mg/mL以及10mg/mL，在10～30℃下搅拌反应1～2h，之后向反应液中加入5mol/L的NaOH 2.5mL终止反应，并使用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至pH7.5～9.5不断搅拌至溶液澄清，得到非冻干预处理的反应后溶液。
将非冻干预处理的反应后溶液采用RP-HPLC检测脱保护终止后产物，RP-HPLC测定条件如下：
色谱柱：Sepax C8 4.6*250mm 5μm 200A；
流动相A：30％ACN+70％H2O+0.2％TFA，
流动相B：70％ACN+30％H2O+0.2％TFA；
洗脱梯度：
| Time(min) | 0 | 30 | 52 | 57 | 57.01 | 67 |
| B％ | 25 | 55 | 100 | 100 | 25 | 25 |
流速1.0mL/min；柱温15℃；检测器UV-280 nm
所述不同脱保护蛋白浓度下非冻干后脱保护考察结果分别如表2所示。
表2
由表1和表2可知，若不进行冻干预处理，脱保护的蛋白浓度只能保持在5 mg/mL的较低的水平下，脱保护不完全样品的含量为0.957％。随着蛋白浓度升高至7.5mg/mL，脱保护不完全样品含量急剧增加至33.0％。因此，脱保护的处理浓度无法进一步提升。而进行冻干预处理后，可使脱保护蛋白处理浓度达到250mg/mL，其脱保护不完全样品含量仍低于常规操作下7.5mg/mL蛋白浓度的脱保护不完全样品含量，尤其是在200 mg/mL浓度范围以下脱保护不完全样品的含量均维持在较低水平，即冻干后脱保护效率得到了极大的提升，对工业大规模生产具有明显的实用性。
实施例3脱保护终止液的优化
将脱保护反应液加入到预配好的终止液中，之后调整pH至中性即可。具体如下：如实施例2制备的冻干预处理的多肽衍生物的中间体100 mg，加入1 mL含水10％的TFA溶液中进行溶解，10～30℃下搅拌反应1～2 h，得到脱保护反应液。将脱保护反应液加入到预配好的终止液中(预配好的终止液，具体组成和含量如表3所示)中，之后再使用1 mol/L的NaOH溶液调节pH值至pH 7.5～9.5，不断搅拌至溶液澄清。反应终止后采用RP-HPLC方法对样品的纯度及蛋白含量进行检测，RP-HPLC方法如下：
色谱柱：Sepax C8 4.6*250mm 5μm 200A；
流动相A：30％ACN+70％H2O+0.2％TFA，
流动相B：70％ACN+30％H2O+0.2％TFA；洗脱梯度：
| Time(min) | 0 | 30 | 52 | 57 | 57.01 | 67 |
| B％ | 25 | 55 | 100 | 100 | 25 | 25 |
不同实验组具体终止液的组成和浓度见表3.表3
| 实验组 | 终止液条件 | 终止后pH | 终pH |
| M1 | 100mL 0.2M NH<sub>4</sub>Ac+3mL 5M NaOH | N/A | 8.31 |
| M2 | 100mL 0.2M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>+2mL 5M NaOH | N/A | 7.64 |
| M3 | 100mL 0.2M Tris-Base+2mL 5M NaOH | N/A | 8.05 |
| M4 | 40mL 0.2M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>+3mL 5M NaOH | 7.89 | 7.70 |
| M5 | 30mL 0.2M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>+3mL 5M NaOH | 7.93 | 7.62 |
| M6 | 20mL 0.2M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>+3mL 5M NaOH | 7.96 | 7.53 |
| M7 | 60mL 0.1M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>+3mL 5M NaOH | 7.87 | 7.87 |
| M8 | 40mL 0.1M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>+3mL 5M NaOH | 8.06 | 7.89 |
| M9 | 30mL 0.1M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>+3mL 5M NaOH | 8.21 | 7.87 |
| M10 | 20mL 0.1M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>+3mL 5M NaOH | 8.39 | 7.80 |
| M11 | 10mL 0.1M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>+3mL 5M NaOH | 8.61 | 7.78 |
| M12 | 40mL 0.05M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>+3mL 5M NaOH | 8.86 | 7.74 |
| M13 | 30mL 0.05M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>+3mL 5M NaOH | 8.71 | 7.65 |
| M14 | 20mL 0.05M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>+3mL 5M NaOH | 8.97 | 7.53 |
| M15 | 40mL 0.1M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>+2.0mL 5M NaOH | 6.66 | 7.51 |
| M16 | 40mL 0.1M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>+2.5mL 5M NaOH | 7.31 | 7.53 |
| M17 | 40mL 0.1M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>+3.5mL 5M NaOH | 8.74 | 7.56 |
结果如表4所示
表4
对比例2
取实施例2制备的冻干预处理的多肽衍生物的中间体10g，加入到100mL含水10％的TFA溶液进行溶解，10～30℃下搅拌反应1～2h，之后向反应液中加入5mol/L的NaOH终止反应，并使用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至pH7.5～9.5，不断搅拌至溶液澄清。反应终止后采用RP-HPLC方法对样品的纯度及蛋白含量进行检测，RP-HPLC方法如下：
色谱柱：Sepax C8 4.6*250mm 5μm 200A；
流动相A：30％ACN+70％H2O+0.2％TFA，
流动相B：70％ACN+30％H2O+0.2％TFA；
洗脱梯度：
| Time(min) | 0 | 30 | 52 | 57 | 57.01 | 67 |
| B％ | 25 | 55 | 100 | 100 | 25 | 25 |
流速1.0mL/min；柱温15℃；检测器UV-280nm。
相同的实验条件重复重复7次，分别记为批次1、批次2、批次3、批次4、批次5、批次6和批次7。
结果见表5。
使用上述终止工艺终止后样品结果汇总如表5所示。
表5
| 样品批号 | 纯度(％) | 异构体含量(％) |
| 批次1 | 67.3 | 4.44 |
| 批次2 | 65.5 | 0.76 |
| 批次3 | 72.0 | 2.67 |
| 批次4 | 69.3 | 0.85 |
| 批次5 | 69.9 | 1.00 |
| 批次6 | 73.0 | 0.74 |
| 批次7 | 73.6 | 7.44 |
由表5可知，将5.0mol/L的氢氧化钠溶液加入到脱保护反应液中并调节pH过程中,一方面终点处的pH值较难控制，易造成溶液pH偏高，尤其体系较大时，pH值达到10以上时，或者局部碱浓度过高，均会产生难以分离去除的消旋异构体，不同批次生产时的异构体含量差异较大。
由表4可知，不同的缓冲盐类型(实验M1～M3)，使用不同缓冲体系终止反应至接近中性条件，令人意外的发现，将脱保护反应液分别加入相同浓度和体积的NH4Ac、Tris-Base、Na2HPO4缓冲溶液和NaOH的体系中，各组终止后异构体杂质含量均明显降低。
进一步的，对磷酸盐缓冲溶液的浓度、终止液缓冲盐体积以及氢氧化钠的体积进行考察，结果列于表4中(M4-14)。值得关注的，相同种类缓冲溶液的不同体积(M4～M6、M7～M11、M12～M14组内)、不同浓度(M4～M6、M7～M11、M12～M14组间)，以及相同缓冲溶液下不同NaOH终止体积(M15～M17)均可降低特异性异构体含量至0.2％以下，同时值得注意的是，脱保护目的蛋白含量也显著提高。
Claims (25)
1.一种多肽衍生物的制备方法，其特征在于，包括：
得到多肽衍生物中间体，所述多肽衍生物中间体为经含有保护基的羧酸酯修饰的多肽；
对所述多肽衍生物中间体进行冻干预处理，得到冻干预处理后的多肽衍生物的中间体；
对所述冻干预处理后的多肽衍生物的中间体进行脱保护，得到多肽衍生物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述保护基选自C1～C21烷基、芳基中的任一种。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述保护基为甲基、乙基、叔丁基或苄基。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述羧酸酯为脂肪酸酯。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述冻干预处理包括如下步骤：
预冻处理；
冷冻处理；
一次干燥处理。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
所述冻干预处理进一步可以包括二次干燥处理。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述预冻处理的预冻温度为2～8℃，预冻处理的时间为大于等于2.0小时；或者
所述冷冻处理的冷冻温度为-30℃～-60℃，冷冻处理的时间为3小时以上；或者
所述一次干燥处理的温度为-10℃～0℃，一次干燥处理的真空度为0.05～2.0mbar，一次干燥处理的干燥时间为大于等于20小时；
所述二次干燥处理的温度为20℃～65℃，二次干燥处理的真空度为0.05～2.0mbar，二次干燥处理的干燥时间为大于0小时且在8小时以下。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
多肽选自胰岛素、胰高血糖素、肠促胰岛素、GLP-1、甲状旁腺素(PTH)、GLP-2、胃泌酸调节素、淀粉不溶素(Amylin)、肠高血糖素、生长激素抑制素、瘦素、YY肽、去氨加压素、骨钙蛋白、人生长激素、糖肽抗生素、非核糖体肽抗生素、促皮质素、降钙素、催产素、干扰素、纤维蛋白溶媒、抗利尿激素、白细胞介素、尿激酶、促甲状腺激素释放激素、甲硫氨酸脑啡肽、亮氨酸脑啡肽、前列腺素F2α受体调节剂、肥胖抑制素、分泌素、nesfatin、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)及上述多肽的类似物或片段中的一种或两种以上。
9.根据权利要求1～8任一项所述的制备方法，其特征在于，
在所述脱保护步骤中：
冻干预处理后的多肽衍生物的中间体在酸催化剂溶液条件下进行脱保护，得到脱保护反应液；
将所述脱保护反应液加入到终止液中，调节pH值以终止反应，得到多肽衍生物。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，
调节pH值至6.5～10.0以终止反应，得到多肽衍生物，
优选地，调节pH值至7.5～9.5以终止反应，得到多肽衍生物。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，
所述终止液包含缓冲盐溶液和碱性溶液，
优选地，所述碱性溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、碳酸氢铵溶液中的一种或两种以上，优选为氢氧化钠溶液，
进一步优选地，所述缓冲盐溶液选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、柠檬酸-NaOH-HCl缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(PB)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸二氢钾-NaOH缓冲溶液、巴比妥钠-HCl缓冲溶液、NH4HCO3缓冲溶液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液、NaHCO3缓冲溶液、Tris-HCl、甘氨酸-NaOH缓冲溶液、硼酸-硼砂缓冲溶液、Na2B7O4缓冲溶液中的一种或两种以上。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，
所述缓冲盐溶液中缓冲盐的浓度为0.001M～0.6M，优选为0.01M～0.6M,更优选为0.01M～0.5M，
优选地，所述碱性溶液的浓度为2～10M，优选为3～8M，更优选为4～6M。
13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，
所述缓冲盐溶液和所述碱性溶液的体积比为(0.1～100)：1，优选为(0.1～70)：1，更优选为(1～50)：1。
14.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，
酸催化剂选自对甲苯磺酸、三氟乙酸、乙酸、甲磺酸、盐酸、磷酸和磺酸中的一种或两种以上。
15.一种多肽衍生物的制备方法，其特征在于，
得到多肽衍生物中间体，所述多肽衍生物中间体为含有保护基的羧酸酯修饰的多肽；
所述多肽衍生物的中间体在酸催化剂溶液条件下进行脱保护，得到脱保护反应液；
将所述脱保护反应液加入到终止液中，调节pH值以终止反应，得到多肽衍生物。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，
调节pH值至6.5～10.0以终止反应，得到多肽衍生物；
优选地，调节pH值至7.5～9.5以终止反应，得到多肽衍生物。
17.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，
所述终止液包含缓冲盐溶液和碱性溶液；
优选地，所述碱性溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、碳酸氢铵溶液中的一种或两种以上，优选为氢氧化钠溶液；
进一步优选地，所述缓冲盐溶液选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、柠檬酸-NaOH-HCl缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(PB)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸二氢钾-NaOH缓冲溶液、巴比妥钠-HCl缓冲溶液、NH4HCO3缓冲溶液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液、NaHCO3缓冲溶液、Tris-HCl、甘氨酸-NaOH缓冲溶液、硼酸-硼砂缓冲溶液、Na2B7O4缓冲溶液中的一种或两种以上。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，
所述缓冲盐溶液中缓冲盐的浓度为0.001M～0.6M，优选为0.01M～0.6M,更优选为0.01M～0.5M；
优选地，所述碱性溶液的浓度为2～10M，优选为3～8M，更优选为4～6M；
进一步优选地，所述缓冲盐溶液和所述碱性溶液的体积比为(0.1～100)：1，优选为(0.1～70)：1，更优选为(1～50)：1。
19.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，
酸催化剂选自对甲苯磺酸、三氟乙酸、乙酸、甲磺酸、盐酸、磷酸和磺酸中的一种或两种以上。
20.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，
所述羧酸酯为脂肪酸酯。
21.根据权利要求15～20任一项所述的制备方法，其特征在于，
对所述多肽衍生物的中间体进行冻干预处理，得到冻干预处理后的多肽衍生物的中间体；
对所述冻干预处理后的多肽衍生物的中间体进行脱保护，得到多肽衍生物；
所述冻干预处理包括如下步骤：
预冻处理；
冷冻处理；
一次干燥处理。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述冻干预处理进一步可以包括二次干燥处理。
23.根据权利要求21或22所述的制备方法，其特征在于，所述预冻处理的预冻温度为2～8℃，预冻处理的时间为大于等于2.0小时；或者
所述冷冻处理的冷冻温度为-30℃～-60℃，冷冻处理的时间为3小时以上；或者
所述一次干燥处理的温度为-10℃～0℃，一次干燥处理的真空度为0.05～2.0mbar，一次干燥处理的干燥时间为大于等于20小时；
所述二次干燥处理的温度为20℃～65℃，二次干燥处理的真空度为0.05～2.0mbar，二次干燥处理的干燥时间为大于0小时且在8小时以下。
24.根据权利要求15～23任一项所述的制备方法，其特征在于，
多肽选自胰岛素、胰高血糖素、肠促胰岛素、GLP-1、甲状旁腺素(PTH)、GLP-2、胃泌酸调节素、淀粉不溶素(Amylin)、肠高血糖素、生长激素抑制素、瘦素、YY肽、去氨加压素、骨钙蛋白、人生长激素、糖肽抗生素、非核糖体肽抗生素、促皮质素、降钙素、催产素、干扰素、纤维蛋白溶媒、抗利尿激素、白细胞介素、尿激酶、促甲状腺激素释放激素、甲硫氨酸脑啡肽、亮氨酸脑啡肽、前列腺素F2α受体调节剂、肥胖抑制素、分泌素、nesfatin、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)及上述多肽的类似物或片段中的一种或两种以上。
25.一种多肽衍生物，其中，所述多肽衍生物经权利要求1～24任一项所述方法制备而得。
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