CN115739049A - 一种磷脂分子印迹方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子印迹法技术领域，具体是一种磷脂分子印迹方法及其应用，即反相微乳液定向分子表面印迹。该方法是先在油相中将表面活性剂自组装形成反相微乳液，在碱性条件下合成磁纳米粒子，将与表面活性剂带有相反电荷的模板分子锚定在油水界面上，最后利用自聚合作用在磁纳米粒子表面形成高分子薄层，最后移去模板分子和表面活性剂分子，得到了具有印迹空腔的分子印迹材料，本发明磷脂分子印迹方法，具有操作简单、颗粒均一、粒度可控和可重复性好的特点，可应用于外泌体的分离与富集。
Description
技术领域
本发明涉及分子印迹法技术领域，具体是一种磷脂分子印迹方法及其应用。
背景技术
磷脂是一类脂肪酸和醇所形成的酯类及其衍生物。磷脂作为两性分子，亲水头部是磷酸和含氮碱、疏水尾部是长烃基链。磷脂作为生物膜的主要成分，其亲水头部位于生物膜表面，疏水尾部位于膜内侧，常与蛋白质、胆固醇、糖脂等共同构成生物膜结构。磷脂在内分泌系统、心血管系统、神经系统疾病中是重要的监测指标，如甲状腺肿、磷脂综合征、冠状动脉粥样硬化和冠心病、脑梗死等疾病。此外磷脂在癌症的早期诊断也有重大意义，如胰腺癌、原发性肝癌、骨髓瘤、胃癌等。
外泌体作为细胞分泌的“废物”，携带蛋白质、核酸、脂类等物质介导细胞间通讯，尺寸在30-150nm之间，是具有膜结构的细胞外囊泡。外泌体广泛分布于血液，尿液，羊水，细胞培养液等体液中，被证实具有癌症早期检测作用，可能为疾病的治疗提供治疗靶标或发挥潜在治疗作用。但是其快速灵敏提取和检测也具有很强的挑战性。
目前报道的外泌体提取方法，主要包括传统的超速离心法，该方法可以得到大量的外泌体，但是纯度不足，仪器昂贵、耗时。其他离心方法有膜过滤离心法、密度梯度离心法。免疫磁珠法是磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进行抗原抗体反应，抗体成本较高且非中性非生理条件会影响外泌体活性。
尽管分子印迹技术已经比较成熟，但对于溶解性较差的物质，尤其是磷脂的分子印迹仍具有极大的挑战。
目前的磷脂印迹方法和技术主要是针对单个磷脂设计，能对一类磷脂进行印迹的通用方法和技术很有限，因此，针对以上现状，迫切需要开发一种磷脂分子印迹方法及其应用，以克服当前实际应用中的不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磷脂分子印迹方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种磷脂分子印迹方法，在反相微乳液体系中，自组装合成分子印迹材料，具体包括如下步骤：
（1）将表面活性剂分散在油相中，加入含有四水合氯化亚铁和六水合氯化铁的水相形成反相微乳液后，在碱性条件下合成磁性纳米粒子；
（2）将印迹模板分子加入到步骤（1）的微乳液反应体系中，模板分子和表面活性剂锚定在油水界面上；
（3）向步骤（2）中加入预聚液使其自聚合作用形成硅层；
（4）破乳，去除模板分子与表面活性剂分子，制备得到表面具有特定空腔的分子印迹材料。
作为本发明进一步的方案：所述的分子印迹材料为以磁纳米粒子为核心，表面包覆硅层的复合纳米材料，其粒径通过反相微乳液大小和包硅时间来控制。
作为本发明进一步的方案：在步骤（1）中，所述的反相微乳液是将表面活性剂与助溶剂加入有机相中自发组装形成的；
其中，表面活性剂为阳离子型表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵，加入的助溶剂为正丁醇，有机相为甲苯。
作为本发明进一步的方案：在步骤（1）中，所述的磁性纳米粒子是以共沉淀法合成的；
其中，Fe2+ 与Fe3+的摩尔比例为1:2，并向反相微乳液体系内加入适量的氨水，以提供碱性的反应条件，反应过程在氮气保护下进行。
作为本发明进一步的方案：在步骤（2）中，所述的印迹模板是能够以一定的作用力锚定在油水界面上的磷脂，其中，所述作用力为静电作用力。
作为本发明进一步的方案：所述印迹模板为磷脂酰丝氨酸。
作为本发明进一步的方案：在步骤（3）中，所述预聚液为3-脲丙基三乙氧基硅烷与正硅酸四乙酯配制；
其中，3-脲丙基三乙氧基硅烷为功能单体，正硅酸四乙酯为交联剂；
所述正硅酸四乙酯均占预聚液总摩尔量的90%以上。
作为本发明进一步的方案：所述破乳是向印迹体系内加入乙醇，在超声条件下破坏乳状液体系。
作为本发明进一步的方案：去除模板分子与表面活性剂的方法是用乙醇、0.1mol/L氨水和水依次洗涤材料三次。
一种采用上述所述的磷脂分子印迹方法制得的印迹材料在体液样本中分离外泌体的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用分子印迹方法，制备表面印迹有磷脂酰丝氨酸（PS）空腔的材料，利用亲和原理捕获外泌体表面磷脂酰丝氨酸，该方法具有较高的外泌体提取纯度，磷脂分布在油水两相界面之间，通过UPTES的静电作用，包硅形成具有特定空间结构的印迹空腔，所得分子印迹聚合物展现出多个优异性能：颗粒均一，粒度可控，操作简单，可重复性好。
本发明通过分子印迹与反相微乳液体系结合，可以将印迹材料的高选择性与反相微乳液的两亲性材料的优势同时发挥出来，具有应用前景：
（1）阳离子表面活性剂与模板分子之间产生静电作用力，并利用模板分子的两亲性，将模板分子锚定在水油界面产生定向效应。其中模板分子的亲水头部朝向内侧，疏水尾部朝向外侧；
（2）聚合反应过程中，反相微乳液体系形成天然的“边界”，硅层厚度可控，粒径可控，空腔分布均匀，模板分子不易被共聚物包埋。
（3）模板分子去除后，印迹材料表面得到具有特定空间结构的印迹空腔，印迹空腔具有分布有序性和可控性。通过亲或疏水相互作用、静电相互作用和定向作用，分子印迹材料对模板分子具有高的选择性。
附图说明
图1为本发明实施例中分子印迹材料对血浆、羊水和尿液中外泌体的富集及western blot 结果的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
一种磷脂分子印迹方法，在反相微乳液体系中，自组装合成分子印迹材料，具体包括如下步骤：
（1）将表面活性剂分散在油相中，加入含有四水合氯化亚铁和六水合氯化铁的水相形成反相微乳液后，在碱性条件下合成磁性纳米粒子；
（2）将印迹模板分子加入到步骤（1）的微乳液反应体系中，模板分子和表面活性剂锚定在油水界面上；
（3）向步骤（2）中加入预聚液使其自聚合作用形成硅层；
（4）破乳，去除模板分子与表面活性剂分子，制备得到表面具有特定空腔的分子印迹材料。
所述的分子印迹材料为以磁纳米粒子为核心，表面包覆硅层的复合纳米材料，其粒径通过反相微乳液大小和包硅时间来控制。
在步骤（1）中，所述的反相微乳液是将表面活性剂与助溶剂加入有机相中自发组装形成的；
其中，表面活性剂为阳离子型表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵，加入的助溶剂为正丁醇，有机相为甲苯。
在步骤（1）中，所述的磁性纳米粒子是以共沉淀法合成的；
其中，Fe2+ 与Fe3+的摩尔比例为1:2，并向反相微乳液体系内加入适量的氨水，以提供碱性的反应条件，反应过程在氮气保护下进行。
在步骤（2）中，所述的印迹模板是能够以一定的作用力锚定在油水界面上的磷脂，其中，所述作用力为静电作用力。
所述印迹模板为磷脂酰丝氨酸。
在步骤（3）中，所述预聚液为3-脲丙基三乙氧基硅烷与正硅酸四乙酯配制；
其中，3-脲丙基三乙氧基硅烷为功能单体，正硅酸四乙酯为交联剂；
所述正硅酸四乙酯均占预聚液总摩尔量的90%以上。
在步骤（4）中，所述破乳是向印迹体系内加入乙醇，在超声条件下破坏乳状液体系。
在步骤（4）中，去除模板分子与表面活性剂的方法是用乙醇、0.1mol/L氨水和水依次洗涤材料三次。
实施例1:分子印迹纳米复合材料粗产品的制备
（1）油相的配制
将表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（7.2892g，0.020mol）分散在120mL油相甲苯中，在其中加入6ml 助溶剂正丁醇。
（2）反相微乳液的形成
将四水合氯化亚铁（0.3428g，1.724mmol）与六水合氯化铁（0.9320g，3.448mmol）加入去离子水（9.4396g，5.238mmol）中，即为水相，将其在氮气保护下缓慢加入所配制的油相中，可见溶液变为澄清，说明形成了反相微乳液。此时亚铁离子与铁离子都被分散在反相微乳液滴中的水相中。
（3）磁核的形成
在此溶液中加入少量的氨水，pH为8.5左右，可见整个微乳液体系立即变黑，说明形成了磁核。
（4）印迹模板的锚定
将印迹模板磷脂酰丝氨酸（印迹模板与功能单体的摩尔比保持1:1）加入微乳液体系中，由于印迹模板分子带负电，十六烷基三甲基溴化铵为阳离子表面活性剂，两者之间的静电作用力使得模板分子锚定在油水界面上，产生相应的定向效应。
（5）自聚合
向微乳液体系中加入预聚液使其自聚合，以磷脂酰丝氨酸为印迹模板时，预聚液构成为正硅酸四乙酯（0.0314mol），3-脲丙基三乙氧基硅烷(1.65mmol)。在室温条件下老化6h，在不断搅拌下使得二氧化硅涂层形成。
（6）破乳
加入20mL 乙醇破坏稳定的黑色微乳液。通过在2000rpm 下离心40 分钟分离黑色产物。即得到分子印迹纳米复合材料粗产品。
（7）非印迹材料的制备
对于非印迹材料，除了不加入印迹分子以外，其余步骤保持不变。
（8）模板的去除
采用索氏提取的方法来除去材料中的十六烷基三甲基溴化铵以及印迹模板，具体步骤如下：
索氏提取所用的溶液为200 mL 的乙醇溶液，提取时间为24 小时。提取结束后，材料在60℃下真空干燥12 小时以除去表面残余溶剂分子。
实施例2 ：印迹材料对血浆样品外泌体的富集
（1）从-80℃冰箱取血浆样本于37℃解冻，在4℃条件下，取5000g离心10分钟，上清液即为血浆待测样本。
（2）分别取血浆样本2、5、10、20μL，加入2mLPBS缓冲液（pH7.4）重悬分子印迹材料，室温震荡孵育30min。
（3）磁力架收集沉淀后，用1mLPBS缓冲液(pH7.4)重悬材料，重复操作3次，得到的沉淀即为表面吸附外泌体的磁性纳米材料。
（4）向沉淀中加入20μL RIPA裂解液，冰上裂解30min，加适量蛋白凝胶电泳的Loading Buffer，煮样100℃加热5min，离心取上清进行蛋白凝胶电泳，结果如图1所示。
SDS-PAGE结果中可以看出，材料可以有效富集血浆中的外泌体，随着血浆样本量的增加，富集到的外泌体增多。血浆用量为10μL就有良好的富集效果。
实施例3 ：印迹材料对羊水外泌体的富集
（1）从-80℃冰箱取羊水样本于37℃解冻，在4℃条件下，取5000g离心10分钟，上清液即为羊水待测样本。
（2）取1mL羊水样本加入1mLPBS缓冲液（pH7.4）重悬分子印迹材料，室温震荡孵育30min。
（3）磁力架收集沉淀后，用1mLPBS缓冲液(pH7.4)重悬材料，重复操作3次，得到的沉淀即为表面吸附外泌体的磁性纳米材料。
（4）向沉淀中加入20μL RIPA裂解液，冰上裂解30min，加适量蛋白凝胶电泳的Loading Buffer，煮样100℃加热5min，离心取上清进行蛋白凝胶电泳，结果如图1所示。
SDS-PAGE结果中可以看出，材料可以有效富集羊水中的外泌体，随着羊水样本量的增加，富集到的外泌体增多。羊水用量为0.5mL就有良好的富集效果。
实施例4：印迹材料对尿液样品外泌体的富集
（1）从-80℃冰箱取尿液样本于37℃解冻，在4℃条件下，取5000g离心10分钟，上清液即为尿液待测样本。
（2）取0.5mL尿液样本加入1.5mLPBS缓冲液（pH7.4）重悬分子印迹材料，室温震荡孵育30min。
（3）磁力架收集沉淀后，用1mLPBS缓冲液(pH7.4)重悬材料，重复操作3次，得到的沉淀即为表面吸附外泌体的磁性纳米材料。
（4）向沉淀中加入20μL RIPA裂解液，冰上裂解30min，加适量蛋白凝胶电泳的Loading Buffer，煮样100℃加热5min，离心取上清进行蛋白凝胶电泳，结果如图1所示。
SDS-PAGE结果中可以看出，材料可以有效富集尿液中的外泌体，随着尿液样本量的增加，富集到的外泌体增多。尿液用量为0.5mL就有良好的富集效果。
需要说明的是，在本发明中，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种磷脂分子印迹方法，其特征在于，在反相微乳液体系中，自组装合成分子印迹材料，具体包括如下步骤：
（1）将表面活性剂分散在油相中，加入含有四水合氯化亚铁和六水合氯化铁的水相形成反相微乳液后，在碱性条件下合成磁性纳米粒子；
（2）将印迹模板分子加入到步骤（1）的微乳液反应体系中，模板分子和表面活性剂锚定在油水界面上；
（3）向步骤（2）中加入预聚液使其自聚合作用形成硅层；
（4）破乳，去除模板分子与表面活性剂分子，制备得到表面具有特定空腔的分子印迹材料。
2.根据权利要求1所述的磷脂分子印迹方法，其特征在于，所述的分子印迹材料为以磁纳米粒子为核心，表面包覆硅层的复合纳米材料，其粒径通过反相微乳液大小和包硅时间来控制。
3.根据权利要求1所述的磷脂分子印迹方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述的反相微乳液是将表面活性剂与助溶剂加入有机相中自发组装形成的；
其中，表面活性剂为阳离子型表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵，加入的助溶剂为正丁醇，有机相为甲苯。
4.根据权利要求3所述的磷脂分子印迹方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述的磁性纳米粒子是以共沉淀法合成的；
其中，Fe2+ 与Fe3+的摩尔比例为1:2，并向反相微乳液体系内加入适量的氨水，以提供碱性的反应条件，反应过程在氮气保护下进行。
5.根据权利要求1所述的磷脂分子印迹方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述的印迹模板是能够以一定的作用力锚定在油水界面上的磷脂，其中，所述作用力为静电作用力。
6.根据权利要求5所述的磷脂分子印迹方法，其特征在于，所述印迹模板为磷脂酰丝氨酸。
7.根据权利要求6所述的磷脂分子印迹方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述预聚液为3-脲丙基三乙氧基硅烷与正硅酸四乙酯配制；
其中，3-脲丙基三乙氧基硅烷为功能单体，正硅酸四乙酯为交联剂；
所述正硅酸四乙酯均占预聚液总摩尔量的90%以上。
8.根据权利要求1所述的磷脂分子印迹方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述破乳是向印迹体系内加入20mL乙醇，在超声条件下破坏乳状液体系。
9.根据权利要求8所述的磷脂分子印迹方法，其特征在于，在步骤（4）中，去除模板分子与表面活性剂的方法是用乙醇、0.1mol/L氨水和水依次洗涤材料三次。
10.一种采用权利要求1-9中任一项权利要求所述的磷脂分子印迹方法制得的印迹材料在体液样本中分离外泌体的应用。
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