CN115736107A - 虾青素在制备修复鸡肝损伤和/或提高鸡出肉率的饲料中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了虾青素在修复鸡肝损伤、提高鸡出肉率和/或制备鸡饲料中的应用。利用含有虾青素的鸡饲料饲喂鸡可以修复鸡由于黄曲霉毒素B1中毒导致的肝损伤，并且饲喂含有虾青素的鸡饲料可以有效提高鸡的饲料利用率，提高鸡的生长效率和繁殖力，同时还能降低鸡的患病率和死亡率，不仅解决了黄曲霉毒素B1对鸡养殖业的污染问题，还能提高鸡的产量，在一定程度上提高了鸡养殖业的经济效益。

Description

虾青素在制备修复鸡肝损伤和/或提高鸡出肉率的饲料中的 应用

技术领域

本发明涉及家禽饲料技术领域，具体地，涉及虾青素在制备修复鸡肝损伤和/或提高鸡出肉率的饲料中的应用。

背景技术

黄曲霉毒素B1(AFB1)是毒性最强的黄曲霉毒素(AF)之一，广泛存在于发霉的花生、玉米、小麦等农作物中，严重威胁动物的生命健康。

AFB1可以损害多种动物的组织器官，主要靶器官为肝脏，现有技术报道AFB1可以诱发多种动物肝细胞癌变，例如鱼类，家禽，非人灵长类动物，啮齿类动物以及各种实验动物等，不同物种对AFB1有不同的毒性反应。目前，AFB1对养禽业的污染非常普遍，肉鸡中毒最为常见。

尤其是在南方地区的潮湿环境下，农作物更易发霉产生AFB1造成肉鸡误食，食用AFB1污染的饲料不仅会损伤肉鸡的肝功能，还会降低其生长效率、繁殖力和饲料利用率等，同时也会使中毒鸡的免疫能力下降，提高对多种传染性疾病的感染能力，增加其患病率和死亡率，对肉鸡养殖业构成了严峻的威胁。

虾青素(Astaxanthin，AST)又名变胞藻黄素、虾红素、虾黄素和龙虾壳色素等，是一种淡红色的脂溶性很强的类胡萝卜素酮式含氧衍生物，其分子式为C₄₀H₅₂O₄，摩尔质量为596.84g/mol。AST熔点约为224℃，易溶于氯仿、苯、丙酮等有机溶剂，不溶于水，常使用二甲基亚枫(DMSO)溶解，AST广泛存在于自然界中各种生物中，例如酵母、微藻、磷虾、复杂植物和蜗牛等。

氧化应激是机体内氧化和抗氧化作用失衡的一种状态，被视为引起衰老和疾病的主要原因。过量的氧化分子可能通过链式反应与蛋白质，脂质和DNA反应，对其产生损伤，从而引发各种疾病。而这些过量的氧化分子可以被内源性抗氧化剂和外源性抗氧化剂抑制。AST作为类胡萝卜素中抗氧化活性最强的内源性抗氧化剂，被誉为全球最强抗衰老物质。AST的分子结构决定了其有效淬灭单线态氧和清除自由基的能力，从而抑制机体氧化损伤和一系列功能障碍和紊乱，起到强抗氧化的作用。

AST作为天然食品添加剂，因其强抗氧化、抗炎等特性也被广泛用于疾病治疗中，具有极高的研究价值。近年研究AST缓解因某些毒性物质引起的肝脏疾病越来越多，但在缓解AFB1致肉鸡肝毒性的研究尚未报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供虾青素在制备修复鸡肝损伤和/或提高鸡出肉率的饲料中的应用。

本发明的第一目的是提供虾青素在制备修复鸡肝损伤和/或提高鸡出肉率的饲料中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明以虾青素粉末作为实验对象，研究其对黄曲霉毒素B1(AFB1)诱导的鸡肝损伤的修复和/或提高鸡出肉率的作用。

本发明提供了虾青素在制备修复鸡肝损伤和/或提高鸡出肉率的饲料中的应用。

优选地，所述鸡肝损伤为黄曲霉毒素B1(AFB1)中毒导致的鸡肝损伤。

优选地，所述饲料为降低肝损伤鸡的活性氧簇表达水平的饲料。

优选地，所述饲料为降低肝损伤鸡的谷草转氨酶、谷丙转氨酶和/或血清碱性磷酸酶活性水平的饲料。

优选地，所述饲料为降低肝损伤鸡的总胆红素含量的饲料。

优选地，所述饲料为降低肝损伤鸡的丙二醛含量的饲料。

优选地，所述饲料为提高肝损伤鸡的超氧化物歧化酶和/或过氧化氢酶活性水平的饲料。

优选地，所述饲料为提高肝损伤鸡的总谷胱甘肽含量的饲料。

优选地，所述饲料为降低肝损伤鸡的Nrf2表达水平的饲料。

优选地，所述饲料为降低肝损伤鸡的HO-1表达水平的饲料。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了虾青素在制备修复鸡肝损伤和/或提高鸡出肉率的饲料中的应用。利用含有虾青素的鸡饲料饲喂鸡可以修复鸡由于黄曲霉毒素B1中毒导致的肝损伤，并且饲喂含有虾青素的鸡饲料可以有效提高鸡的饲料利用率，提高鸡的生长效率和繁殖力，同时还能降低鸡的患病率和死亡率，不仅解决了黄曲霉毒素B1对鸡养殖业的污染问题，还能提高鸡的产量，在一定程度上提高了鸡养殖业的经济效益。

附图说明

图1为不同剂量浓度的AFB1处理CEL细胞的细胞存活率图；

图2为不同剂量浓度的AST处理CEL细胞的细胞存活率图；

图3为AST处理经90μM的AFB1诱导的CEL细胞后的细胞存活率；

图4为AFB1饲喂肉鸡的肝脏病理切片图；

图5为AST干预饲喂肉鸡的肝脏病理切片图；

图6为AST对AFB1诱导的CEL细胞的ROS荧光显色观察图；

图7为AFB1饲喂肉鸡组织样品的GOT、GPT、ALP和TBIL的检测结果图；A：AFB1饲喂肉鸡组织样品GOT检测结果图；B：AFB1饲喂肉鸡组织样品GPT检测结果图；C：AFB1饲喂肉鸡组织样品ALP检测结果图；D：AFB1饲喂肉鸡组织样品TBIL检测结果图；

图8为AST干预饲喂肉鸡组织样品的GOT、GPT、ALP和TBIL的检测结果图；A：AST干预饲喂肉鸡组织样品GOT检测结果图；B：AST干预饲喂肉鸡组织样品GPT检测结果图；C：AST干预饲喂肉鸡组织样品ALP检测结果图；D：AST干预饲喂肉鸡组织样品TBIL检测结果图；

图9为AFB1诱导的CEL细胞的GOT、GPT和ALP的检测结果图；A：AFB1诱导的CEL细胞的GOT检测结果图；B：AFB1诱导的CEL细胞的GPT检测结果图；C：AFB1诱导的CEL细胞的ALP检测结果图；

图10为AST对AFB1诱导的CEL细胞的MDA、SOD和GSH的检测结果图；A：AST对AFB1诱导的CEL细胞的MDA检测结果图；B：AST对AFB1诱导的CEL细胞的SOD检测结果图；C：AST对AFB1诱导的CEL细胞的GSH检测结果图；

图11为AFB1饲喂肉鸡的肝脏组织中的MDA、SOD和CAT的检测结果图；A：AFB1饲喂肉鸡的肝脏组织中MDA检测结果图；B：AFB1饲喂肉鸡的肝脏组织中SOD检测结果图；C：AFB1饲喂肉鸡的肝脏组织中CAT检测结果图；

图12为AST干预饲喂肉鸡的肝脏组织中的MDA、GSH、SOD和CAT的检测结果图；A：AST干预饲喂肉鸡的肝脏组织中MDA检测结果图；B：AST干预饲喂肉鸡的肝脏组织中GSH检测结果图；C：AST干预饲喂肉鸡的肝脏组织中SOD检测结果图；D：AST干预饲喂肉鸡的肝脏组织中CAT检测结果图；

图13为AFB1诱导的CEL细胞中的Nrf2抗氧化信号通路下游抗氧化因子蛋白水平检测结果图；A：AFB1诱导的CEL细胞的电泳图；B：AFB1诱导的CEL细胞中Keap1蛋白对比图；C：AFB1诱导的CEL细胞中Nrf2蛋白对比图；D：AFB1诱导的CEL细胞中NQO1蛋白对比图；E：AFB1诱导的CEL细胞中HO-1蛋白对比图；F：AFB1诱导的CEL细胞中GCLC蛋白对比图；G：AFB1诱导的CEL细胞中GCLM蛋白对比图；

图14为AFB1饲喂肉鸡的肝脏组织中的Nrf2抗氧化信号通路下游抗氧化因子蛋白水平检测结果图；A：AFB1饲喂肉鸡的肝脏组织的电泳图；B：AFB1饲喂肉鸡的肝脏组织Nrf2蛋白对比图；C：AFB1饲喂肉鸡的肝脏组织HO-1蛋白对比图；

图15为AST干预饲喂肉鸡的肝脏组织中的Nrf2抗氧化信号通路下游抗氧化因子蛋白水平检测结果图；A：AST干预饲喂肉鸡的肝脏组织的电泳图；B：AST干预饲喂肉鸡的肝脏组织中Keap1蛋白对比图；C：AST干预饲喂肉鸡的肝脏组织中Nrf2蛋白对比图；D：AST干预饲喂肉鸡的肝脏组织中NQO1蛋白对比图；E：AST干预饲喂肉鸡的肝脏组织中HO-1蛋白对比图；F：AST干预饲喂肉鸡的肝脏组织中GCLC蛋白对比图；G：AST干预饲喂肉鸡的肝脏组织中GCLM蛋白对比图。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

下述实施例中鸡胚原代肝细胞(CEL)购于ATCC细胞库；肉鸡选用1日龄艾拔益加肉鸡(AA肉鸡)(哈尔滨益农禽业有限公司)，饲养于黑龙江八一农垦大学动物科技学院动物房，饲料为普通适于0～20日龄肉仔鸡饲料(温岭市城东兴源饲料厂)。

实施例1虾青素对AFB1诱导的CEL细胞毒性作用的影响

1、实验方法

(1)工作液的配制

AST工作液：将虾青素(AST，购自美国Sigma公司)溶于二甲基亚砜(DMSO)溶液中，配置成浓度为8mM的AST母液，将AST母液用双无培养基(无血清无双抗培养基)稀释成浓度分别为160、320、480、640、800、960μM的AST工作液。

AFB1工作液：将黄曲霉毒素B1(AFB1，购自青岛Pribolab公司)溶于二甲基亚砜(DMSO)溶液中，配置成浓度为3mM的AFB1母液，将AFB1母液用双无培养基稀释成浓度分别为15、30、45、90、180μM的AFB1工作液。

(2)CEL细胞的复苏、培养和传代

从液氮中取出冻存的CEL细胞，放入装有42℃温水的烧杯中摇晃至融化完全，然后再1000r/min的条件下进行离心3min，离心结束后保留细胞沉淀并立即转入提前灭菌30min的超净台内，将细胞沉淀在1mL完全培养基(含10％ FBS，1％双抗(青霉素和链霉素)，v/v)进行重悬，将重悬细胞液转入细胞瓶内，补充4mL完全培养基，混合均匀，显微镜下观察后放入37℃，体积分数为5％ CO₂培养箱中培养。

待显微镜观察下CEL细胞生长状态良好且细胞融合度达到90％时，按照1：2～1：3的比例进行传代，得到传代后的CEL细胞的细胞悬液。

(3)AST对AFB1诱导的CEL细胞毒性作用的影响

利用台盼蓝计数，将细胞按照1.2×10⁴细胞/孔的数量铺于96孔培养板中，具体为：每孔100μL步骤(2)得到的细胞悬液，待细胞贴壁后，弃掉培养液，用PBS清洗3遍，进行三组不同实验，具体如下：

实验组1：向不同的孔中分别加入100μL不同浓度的AFB1工作液(15、30、45、90、180μM)，每个浓度的AFB1工作液重复设置6个孔，作用24h后，向对应的孔中加入10μL的CCK-8溶液，用酶标仪检测各孔450nm处的OD值。

实验组2：向不同的孔中分别加入100μL不同浓度的AST工作液(160、320、480、640、800、960μM)，每个浓度的AST工作液重复设置6个孔，作用3h后，向对应的孔中加入10μL的CCK-8溶液，用酶标仪检测各孔450nm处的OD值。

实验组3：向不同的孔中分别加入100μL浓度分别为320、480、640μM的AST工作液，作用3h后，弃掉AST工作液，用PBS清洗3次后，再加入100μL浓度为90μM的AFB1工作液作用24h，向对应的孔中加入10μL的CCK-8溶液，用酶标仪检测各孔450nm处的OD值。

空白组：向只含有CEL细胞的孔中加入10μL的CCK-8溶液，并用酶标仪检测各孔450nm处的OD值，记为OD_(实验0)。

对照组设置为：向含有CEL细胞的孔中加入100μl双无培养基(无血清无双抗培养基)，再加入10μL的CCK-8溶液，并用酶标仪检测各孔450nm处的OD值，记为OD_(对照⁾。

分别根据三组不同的实验测得的OD值计算相应的细胞存活率，细胞存活率地计算公式如下：

细胞存活率(％)＝(OD_(实验)﹣OD_(对照))/(OD_(实验0)﹣OD_(对照))×100％

其中，OD_(实验)：具有CEL细胞、CCK-8溶液和工作液的孔的OD值，即实验组1～实验组3的OD值；OD_(对照)：具有双无培养基和CCK-8溶液的孔的OD值；OD_(实验0)：具有细胞和CCK-8溶液的孔的OD值。

2、实验结果

实验组1的CEL细胞存活率如图1所示，结果表明，CEL细胞的存活率随着AFB1浓度的增加而下降，并且呈现剂量依赖性，其中当AFB1的浓度为90μM时CEL细胞的存活率将近50％，此时对细胞造成一定损伤，故后续实施例选用AFB1浓度在90μM时为后续单一染毒浓度。

实验组2的CEL细胞存活率如图2所示，结果表明，与未加入AST的对照组相比，AST的剂量浓度在的剂量浓度在160μM，320μM，480μM，640μM时，CEL细胞存活率未有显著变化，说明AST的浓度在640μM之前的AST对细胞无明显的毒性作用。而AST的浓度为800μM和960μM时，细胞数量有所降低，说明此浓度对细胞生长有显著的抑制作用，最终确定AST浓度的最适范围在640μM以内。

实验组3的CEL细胞存活率如图3所示，结果表明，与90μM的AFB1处理的CEL细胞的存活率相比，AST(320，480和640μM)处理细胞后都能够恢复细胞活性，其中640μM的AST能够显著恢复细胞活性至80％以上。

实施例2AA肉鸡急性肝损伤模型的建立及相应样品的制备

1、实验方法

(1)将40只健康的1日龄AA肉鸡正常饲喂饲料3天后，随机分成4组，每组10只，命名为高剂量组、中剂量组、低剂量组和对照组1。高剂量组使用5mg/kg的AFB1拌粮饲喂(每1kg饲料含有5mg的AFB1)，中剂量组使用3mg/kg的AFB1拌粮饲喂(每1kg饲料含有3mg的AFB1)，低剂量组使用1mg/kg的AFB1拌粮饲喂(每1kg饲料含有1mg的AFB1)，得到AFB1饲喂肉鸡。对照组1饲喂饲料。

从第四天开始，对每组AA肉鸡每日饲喂对应饲料，饲喂7天。最后一次饲喂结束后，禁食，24h后对每组AA肉鸡进行心脏采血得到心脏血并断头处死，取其肝脏进行病理切片观察并将肝脏置于-80℃保存。

(2)将60只健康的1日龄AA肉鸡正常饲喂饲料3天后，随机分成6组，每组10只，命名为对照组2、联苯双酯阳性对照组、AST干预组1、AST干预组2、AST干预组3和AFB1模型组。

对照组2饲喂饲料，联苯双酯(DDB)阳性对照组饲喂含有25mg/kg的DDB和5mg/kg的AFB1的饲料，AST干预组1饲喂含有20mg/kg的AST和5mg/kg的AFB1的饲料，AST干预组2饲喂含有40mg/kg的AST和5mg/kg的AFB1的饲料，AST干预组3饲喂含有80mg/kg的AST和5mg/kg的AFB1的饲料，AFB1模型组饲喂含有5mg/kg的AFB1的饲料，得到AST干预饲喂肉鸡。

从第四天开始，对每组AA肉鸡每日饲喂对应饲料，饲喂7天。最后一次饲喂结束后，禁食，24h后对每组AA肉鸡进行心脏采血得到心脏血并断头处死，取其肝脏进行病理切片观察并将肝脏置于-80℃保存。

(3)将步骤一得到的4组AA肉鸡的心脏血和步骤二得到的6组AA肉鸡的心脏血分别置于不同的离心管中，在4℃，3000rpm/min的条件下离心15min获得每组样品对应的血清，即为步骤一得到的AFB1饲喂肉鸡组织样品和步骤二得到的AST干预饲喂肉鸡组织样品。

(4)将实施例1步骤(2)传代后的CEL细胞按照1×10⁶细胞/孔的数量铺于6孔培养板中，每孔2ml，培养24h，然后向不同的孔中分别加入浓度分别为320、480、640μM的AST工作液作用3h，弃掉AST工作液，用PBS清洗3次后，再加入浓度为90μM的AFB1工作液作用24h，再用PBS清洗3次，收集细胞沉淀，加入PBS后在冰浴条件下进行超声破碎，破碎完全的液体即为待测样品。

2、实验结果

AFB1饲喂肉鸡的肝脏病理切片如图4所示。结果显示：对照组肝组织正常，肝小叶结构完整、中央静脉、生发中心及肝细胞索清晰可见，然而用不同浓度AFB1饲粮处理的肉鸡肝组织切片，肝细胞肿胀，肝小叶结构不完整，肝细胞索紊乱，高剂量组尤为严重。这说明实验采用连续饲喂7d肉鸡5mg/kg的AFB1日粮已经造成严重的肝脏损伤。

AST干预饲喂肉鸡的肝脏病理切片如图5所示。结果显示：对照组中肝细胞呈卵圆型，条索状，围绕中央静脉呈放射状排列，间质未见炎细胞浸润和水肿；与对照组比，AFB1组肝细胞肿胀，空泡变性，间质炎细胞浸润；与AFB1组相比，DDB组肝细胞索杂乱，间质炎细胞浸润，并未有明显的改善作用；而在AST处理组中可以看到，随着AST浓度的增加，肝细胞肿胀程度不断减轻，间质炎细胞数量不断减少。以上结果说明，AST在改善肝组织病理损伤时效果优于DDB。

实施例3CEL细胞内活性氧簇(ROS)表达水平检测

1、实验方法

将实施例1步骤(2)中生长状态良好且细胞融合度达到90％左右的CEL细胞，按1.2×10⁴细胞/孔的数量铺于96孔培养板中，具体为：每孔100μL实施例1步骤(2)得到的细胞悬液，培养24h，向不同的孔中分别加入浓度分别为320、480、640μM的AST工作液，作用3h后弃掉AST工作液，用PBS清洗3次后，再加入浓度为90μM的AFB1工作液作用24h，再用PBS清洗3次，加入100μL浓度为10μM的DCFH-DA溶液，在37℃下避光孵育30min，接着用PBS溶液以5min/次的速度清洗3次后，弃掉液体。向每孔中加入100μL PBS，在荧光显微镜观察细胞内ROS荧光强度。

使用同样的方法对不添加AST和AFB1的CEL细胞(空白对照组)和只添加AFB1的CEL细胞(AFB1组)检测ROS荧光强度。

2、实验结果

荧光显微镜的观察结果如图6所示，结果表示AFB1组所产生的绿色荧光强度相较于空白对照组显著增加，说明CEL细胞经AFB1刺激后，ROS表达水平明显增加。而随着AST的加入，CEL细胞所呈现的绿色荧光强度显著减弱，且是以剂量依赖的方式降低了AFB1刺激细胞引起ROS的过多产生。

说明AST可以通过自身抗氧化性抑制AFB1对CEL细胞造成的氧化损伤。

实施例4谷草转氨酶、谷丙转氨酶和血清碱性磷酸酶活性水平检测及总胆红素含量检测

对实施例2中得到的AFB1饲喂肉鸡组织样品、AST干预饲喂肉鸡组织样品和待测样品分别进行谷草转氨酶、谷丙转氨酶和血清碱性磷酸酶活性水平检测及总胆红素含量检测，所有检测均在96孔板中进行操作。

1、实验方法

(1)谷草转氨酶(GOT)活性水平检测

在测定孔中加入20μL的37℃预温过的GOT基质液和5μL的AFB1肉鸡组织样品，混匀后在37℃下反应30min，反应结束后加入20μL的2，4-二硝基苯肼液，混匀在37℃下反应20min，接着加入200μL浓度0.4mol/L的氢氧化钠溶液，混匀，在室温下反应15min。

对照孔中加入20μL的37℃预温过的GOT基质液，加入20μL的2，4-二硝基苯肼液和5μL的AFB1饲喂肉鸡组织样品，混匀后在37℃下反应20min，接着加入200μL浓度0.4mol/L的氢氧化钠溶液，混匀，在室温下反应15min。

在510nm处测定OD值并依据标准曲线算出各组GOT酶活力；标准曲线依据试剂盒检测说明书得出(C010-2-1)。

对AST干预饲喂肉鸡组织样品和待测样品采用上述同样的方法测定其GOT酶活力。

(2)谷丙转氨酶(GPT)活性水平检测

同谷草转氨酶活性水平检测方法的区别在于将GOT基质液替换为GPT基质液，其余方法步骤一致。

在510nm处测定OD值并依据标准曲线算出各组GPT酶活力，标准曲线依据试剂盒检测说明书得出(C009-2-1)。

(3)血清碱性磷酸酶(ALP)活性水平检测

空白对照组设置为在一个孔中添加50μL检测缓冲液和50μL显色底物(试剂盒内自带，P0321S)；标准品对照组设置为在一个孔中添加xμL标准品工作液和(100-x)μL检测缓冲液；实验组设置为为在一个孔中添加50μL显色底物、(50-y)μL检测缓冲液和yμL样品。

所述样品为AFB1饲喂肉鸡组织样品、AST干预饲喂肉鸡组织样品或待测样品。

将空白对照组、标准品对照组和实验组分别混匀，在37℃下反应30min后，向每个孔中加入100μL反应终止液(试剂盒内自带，P0321S)，在405nm处分别检测OD值并根据标准曲线算出各组ALP值；标准曲线依据试剂盒检测说明书得出(P0321S)。

(4)总胆红素(TBIL)含量检测

在测定孔中加入7μL样品和200μL试剂一，混匀后在37℃下反应5min，在405nm测定吸光度值A1，接着向孔中加入50μL试剂二，混匀后在37℃下反应5min，在405nm测定吸光度值A2；其中试剂一和试剂二均为试剂盒自带试剂，试剂盒为总胆红素试剂盒C019-1-1。

样品包括AFB1饲喂肉鸡组织样品或AST干预肉鸡组织样品。

空白孔与测定孔的区别在于将7μL样品替换为7μL蒸馏水，其余一致。

计算出吸光度的变化值，并据此计算TBIL含量，具体公式如下：

TBIL计算公式：ΔA＝A1-A2；TBIL含量(μM)＝1359×(ΔA_测定ΔA_空白)+0.2059。

2、实验结果

AFB1饲喂肉鸡组织样品的GOT、GPT、ALP和TBIL的检测结果如图7所示。结果显示：AFB1饲喂肉鸡组织样品中的GOT和GPT酶活性与对照组相比略微升高，无明显差异，中剂量组和高剂量组中GOT和GPT酶活性与对照组相比均显著升高；AFB1饲喂肉鸡组织样品中的ALP酶活性与对照组相比也有升高；在AFB1饲喂肉鸡组织样品中的TBIL含量与对照组相比均显著升高，且高剂量组升高更为明显，这表明AFB1饲喂处理肉鸡会使肉鸡肝细胞受到损伤。

AST干预饲喂肉鸡组织样品的GOT、GPT、ALP和TBIL的检测结果如图8所示。结果显示：与对照组相比，AFB1模型组对应的组织样品中的GOT、GPT和ALP酶活性以及TBIL含量均明显增加；在经过AST和DDB干预后，组织样品中的GOT、GPT和ALO酶活性以及TBIL含量明显降低，并且40mg/kg的AST和80mg/kg的AST的作用效果优于DDB阳性对照组，这表明AST可以缓解AFB1诱导的肉鸡急性肝损伤。

待测样品的GOT、GPT和ALP的活性水平检测结果如图9所示。结果显示：正常培养的CEL细胞，在AFB1的作用下GOT、GPT和ALP酶活力显著升高，而经过AST刺激后，CEL细胞中的GOT、GPT和ALP酶活力随着AST的浓度增加而下降，证明AST对AFB1诱导的细胞损伤具有抑制作用。

实施例5丙二醛和总谷胱甘肽含量检测以及超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性水平检测

1、实验方法

(1)丙二醛(MDA)含量检测

细胞样品制备：收集实施例1步骤(2)传代后的CEL细胞的细胞沉淀，加入500μL的MDA提取液(BC0025)，利用细胞超声破碎仪处理细胞，将破碎后的细胞置于4℃环境中，在8000×g的离心条件下离心10min，留取上清，置冰上，得到细胞样品。

组织样品制备：利用电子天平分别称取50mg实施例2步骤1和步骤2保存的肝脏组织，随后分别加入4℃的质量体积比为100mg：1mL的MDA提取液，再用预冷的研磨棒对肝脏组织研磨，吸出肝脏组织匀浆液，接着在4℃，10000rpm/min的条件下离心10min，留取上清，即为AFB1饲喂肉鸡的组织样品和AST干预饲喂肉鸡的组织样品。

用BCA试剂盒分别检测AFB1饲喂肉鸡的组织样品和AST干预饲喂肉鸡的组织样品中的蛋白浓度。

在1.5mL离心管中加入300μL的MDA检测工作液、100μL试剂三和100μL样本作为测定管(BC0025)。样本包括本步骤制备得到的细胞样品、AFB1饲喂肉鸡的组织样品和AST干预饲喂肉鸡的组织样品。

将测定管内试剂充分混匀，利用浮漂将其放入100℃水浴中反应1h，再转入4℃冷却。再10000×g的离心条件下离心10min，去200μL上清液加入96孔板中。运用酶标仪检测450nm、532nm和600nm处各孔的OD值。

空白管与测定管的区别在于将100μL样本替换为100μL蒸馏水，对空白管进行同等处理。

根据公式计算出样本中的MDA含量，具体公式如下：

ΔA＝A_测定-A_空白；

细胞MDA含量(nmol/10⁴cell)＝0.01×(12.9×(ΔA₅₃₂-ΔA₆₀₀)-2.58×ΔA₄₅₀)；

组织MDA含量(nmol/mgprot)＝5×(12.9×(ΔA₅₃₂-ΔA₆₀₀)-2.58×ΔA₄₅₀)÷Cpr；

Cpr为样本蛋白浓度，通过BCA蛋白定量试剂盒(碧云天)检测得到。

(2)总谷胱甘肽(GSH)含量检测

本步骤中所有试剂均为试剂盒(S0052)内自带试剂。

细胞样品制备：收集实施例1步骤(2)传代后的CEL细胞的细胞沉淀，利用PBS缓冲液冲洗细胞，在4℃，8000rpm/min的条件下离心5min，留取沉淀，向沉淀中加入细胞沉淀体积三倍量的蛋白去除试剂S溶液，并用移液枪反复吹打充分混匀。然后利用-80℃和37℃水浴进行反复冻融2次，接着在4℃，10000×g的离心条件下离心10min，留取上清，得到细胞样品。

组织样品制备：利用电子天平分别称取30mg实施例2步骤1和步骤2保存的肝脏组织，加入0.5mL蛋白去除试剂S溶液用预冷的研磨棒进行研磨。研磨结束后，在4℃，10000×g的条件下离心10min，留取上清，即为AFB1饲喂肉鸡的组织样品和AST干预饲喂肉鸡的组织样品。

将40mg/mL的NADPH储备液与总谷胱甘肽检测缓冲液按照1：79的体积比混合均匀，即为0.5mg/mL的NADPH。

配制总谷胱甘肽检测工作液，具体如表1所示，

试剂	1个样品	10个样品	20个样品
				5倍稀释谷胱甘肽还原酶	6.6μL	66μL	132μL
DTNB储备液	6.6μL	66μL	132μL
				总谷胱甘肽检测缓冲液	150μL	1.5mL	3mL

使用96孔板细胞培养板，在一个孔中加入10μL蛋白去除试剂S溶液和150μL总谷胱甘肽检测工作液，在室温下孵育5min后再向其中添加0.5mg/mL的NADPH，作为空白对照组；

在一个孔中加入10μL总谷胱甘肽标准品和150μL总谷胱甘肽检测工作液，在室温下孵育5min后再向其中添加0.5mg/mL的NADPH，作为标准曲线组；

在一个孔中加入xμL样品、(10-x)μL蛋白去除试剂S溶液和150μL总谷胱甘肽检测工作液，在室温下孵育5min后再向其中添加0.5mg/mL的NADPH，作为样品组。

样品包括本步骤制备得到的细胞样品、AFB1饲喂肉鸡的组织样品和AST干预饲喂肉鸡的组织样品。

分别将每组样品在室温下反应25min后，在412nm分别检测每组样品OD值。并根据标准曲线组绘制标准曲线，样品组的总谷胱甘肽的含量根据标准曲线计算GSH含量；标准曲线依据试剂盒检测说明书得出(S0052)。

(3)超氧化物歧化酶(SOD)活力检测

细胞样品制备：收集实施例1步骤(2)传代后的CEL细胞，将适量的预冷PBS加入到细胞中，用细胞超声破碎仪将细胞充分破碎，将破碎后的细胞在4℃，5000rpm/min的条件下进行离心5min，取上清即为细胞样品。

组织样品制备：利用电子天平分别称取30mg实施例2步骤1和步骤2保存的肝脏组织，随后分别加入4℃预冷的PBS，用研磨棒将组织研磨，研磨后得到肝脏组织匀浆液并吸出。将肝脏组织匀浆液在4℃，12000rpm/min的条件下离心10min，用移液枪吸取上清液即为AFB1饲喂肉鸡的待测样品和AST干预饲喂肉鸡的待测样品。

本步骤中的所有样品均包括本步骤制备得到的细胞样品、AFB1饲喂肉鸡的待测样品和AST干预饲喂肉鸡的待测样品。

Cu/Zn-SOD抑制实验：取4μL的Cu/Zn-SOD抑制剂A加入到96μL样品中，在离心管中混匀后，37℃反应1h，再将4μL稀释40倍后的Cu/Zn-SOD抑制剂B加入离心管中，在37℃下反应15min，备用。

Cu/Zn-SOD抑制剂A和Cu/Zn-SOD抑制剂B均为试剂盒S0103自带试剂。

WST-8/酶工作液的配制：将SOD检测缓冲液、WST-8和酶溶液按照体积比为151：8：1混合得到。检测一次样本需要160μL的WST-8/酶工作液。

反应启动工作液的配置：将40×反应启动液和SOD检测缓冲液按照1：39的体积比进行稀释，用移液枪反复吹打混匀，备用。

SOD检测缓冲液、酶溶液和40×反应启动液均为试剂盒S0103自带试剂。

SOD酶活力测定实验：

使用96孔板细胞培养板，空白对照组1设置为在一个孔中加入20μL的SOD检测缓冲溶液、160μL的WST-8/酶工作液和20μL的反应启动工作液，混匀后，在37℃反应30min后，在450nm处测定OD值，记为A(空白对照1)。

空白对照组2设置为在一个孔中加入40μL的SOD检测缓冲溶液和160μL的WST-8/酶工作液，混匀后，在37℃反应30min后，在450nm处测定OD值，记为A(空白对照2)。

样品组设置为在一个孔中加入20μL的样品、160μL的WST-8/酶工作液和20μL的反应启动工作液，混匀后，在37℃反应30min后，在450nm处测定OD值，记为A(样品)。

根据测定的吸光度值计算SOD酶活力，计算公式如下：

抑制百分率(％)＝((A(空白对照1)-A(空白对照2))-A(样品))/(A(空白对照1)-A(空白对照2))×100％，

样品中SOD酶活力＝抑制百分率/(1-抑制百分率)。

(4)过氧化氢酶(CAT)活性检测

组织样品制备：利用电子天平分别称取30mg实施例2步骤1和步骤2保存的肝脏组织，随后加入4℃预冷的PBS，用研磨棒将组织研磨，研磨后得到肝脏组织匀浆液并吸出。将肝脏组织匀浆液在4℃，12000rpm/min的条件下离心10min，用移液枪吸取上清液得到AFB1饲喂肉鸡的待测样品和AST干预饲喂肉鸡的待测样品，用BCA试剂盒检测待测样品浓度，备用。

对照组设置为：在离心管中加入1.0mL的试剂一和0.1mL的试剂二混匀，在37℃反应1min，接着向离心管中加入1.0mL的试剂三、0.1mL的试剂四和0.05mL的待测样品。混匀后得到混合溶液，吸取200μL混合溶液在96孔板中，在405nm处测定OD值，记为A(对照)。

样品组设置为：在离心管中加入0.05mL的待测样品、1.0mL的试剂一盒0.1mL的试剂二混匀，在37℃反应1min，接着向离心管中加入1.0mL的试剂三和0.1mL的试剂四。混匀后得到混合溶液，吸取200μL混合溶液在96孔板中，在405nm处测定OD值，记位A(样品)。

过氧化氢酶活性计算公式如下，

ΔA＝A(对照)-A(样品)；

CAT活力(U/mgprot)＝ΔA×235.65÷V(样)÷T÷Cpr；

V(样)为样品体积，T为反应温度，Cpr为样本蛋白浓度，通过BCA蛋白定量试剂盒(碧云天)检测得到

2、实验结果

AFB1诱导的CEL细胞中的MDA、SOD和GSH的检测结果如图10所示。结果显示：与对照组相比，AFB1刺激的CEL细胞中的MDA含量显著升高，SOD和GSH水平显著降低，经过不同剂量的AST处理后，SOD和GSH水平明显升高，MDA含量显著降低，呈剂量依赖性，证明AST对AFB1诱导的细胞损伤具有抑制作用。

AFB1饲喂肉鸡的肝脏组织中的MDA、SOD和CAT的检测结果如图11所示。结果显示：与对照组相比，使用AFB1拌粮饲喂的肉鸡肝脏组织中的MDA含量显著上升，且高剂量组达到最高，CAT和SOD活性液明显下降，SOD活性降低更明显，说明AFB1浓度的增加会减弱肝脏抗氧化的能力。

AST干预饲喂肉鸡的肝脏组织中的MDA、GSH、SOD和CAT的检测结果如图12所示。结果显示：与对照组比，AFB1组的MDA含量能够明显增加，以及SOD、GSH和CAT水平明显降低，与AFB1组相比，DDB能够降低MDA含量，增加GSH活性，不存在显著差异，在增加SOD和CAT活性时，具有显著性，经过AST的干预后，能够显著降低MDA含量以及升高SOD、GSH和CAT的表达水平。这表明，AST能缓解AFB1诱导的肉鸡肝脏氧化损伤。

实施例6Nrf2抗氧化信号通路的抗氧化蛋白表达水平的检测

1、实验方法

(1)细胞样品制备：将实施例1步骤(2)制备得到的细胞悬液按照每孔2mL接种于6孔板内，培养24h。接着向不同的孔中加入实施例1步骤(1)制备得到的AST工作液至终浓度为320μM、480μM和640μM，作用3h后，弃去液体，接着加入实施例1步骤(1)制备得到的AFB1工作液至终浓度为90μM，作用24h后，弃去液体，用PBS清洗3次，弃上清，向沉淀中加入含有1mM蛋白抑制剂(PMSF)的RIPA裂解液，4℃反应30min，用1000μL移液枪将液体吸出至1.5mL离心管中，4℃，1200rpm离心10min，收集上清液，记为细胞总蛋白。

(2)组织样品制备：取实施例2步骤(1)得到的AFB1饲喂肉鸡，以高剂量组肉鸡为例，取其肝脏，切片后加入RIPA裂解液，用预冷的研磨棒充分研磨，研磨结束后析出匀浆液置于1.5mL离心管中，冰上处理30min，随后在4℃，12000rpm离心10min，收集上清液记为低剂量组肉鸡蛋白。

对实施例2步骤(1)和实施例2步骤(2)所有组别的AA肉鸡进行同等处理，得到对应的肉鸡蛋白。

(3)采用BCA蛋白定量试剂盒分别对步骤(1)和步骤(2)得到的蛋白进行检测，得到各蛋白的定量结果，计算相应的控制比。

(4)电泳显影：

以步骤(1)得到的细胞总蛋白为例，进行电泳，具体如下：

将细胞总蛋白与5×Loading Buffer按照体积比为1：4混合均匀，置于90℃水浴锅中加热8min，接着进行瞬时离心，进行电泳；电泳条件为：浓缩胶80V，45min，分离胶120V，1h。

电泳结束后进行显影，记录电泳结果。

对步骤(2)得到的肉鸡蛋白进行同等处理，得到对应的电泳结果。

2、实验结果

AFB1诱导的CEL细胞中的Nrf2抗氧化信号通路下游抗氧化因子蛋白水平检测结果如图13所示。结果显示：AFB1刺激的CEL细胞中的Keap-1蛋白表达量显著增加，而Nrf2及下游蛋白HO-1、NQO1、GCLC和GCLM的表达量一致地减少。与AFB1组相比，AST的加入使Keap-1蛋白的表达量显著地减少。此外，Nrf2及下游蛋白HO-1、NQO1、GCLC和GCLM的表达量随着AST的增加显著升高。说明AST通过Nrf2抗氧化信号通路来缓解AFB1对CEL细胞造成的损伤。

AFB1饲喂肉鸡的肝脏组织中的Nrf2抗氧化信号通路下游抗氧化因子蛋白水平检测结果如图14所示。结果显示：与对照组相比，Nrf2和HO-1的蛋白表达水平随着AFB1的剂量增加显著降低，综上结果说明，连续饲喂7d肉鸡5mg/kg的AFB1日粮造成肉鸡急性肝脏损伤。

AST干预饲喂肉鸡的肝脏组织中的Nrf2抗氧化信号通路下游抗氧化因子蛋白水平检测结果如图15所示。结果显示：与正常对照组相比，AFB1模型组肝脏Nrf2、NQO1、HO-1、GCLM和GCLC表达量均显著降低，keap-1表达量升高，而在AST干预后，Nrf2、NQO1、HO-1、GCLM和GCLC表达量显著高于模型组，keap-1表达量显著低于模型组；在DDB的作用下，keap-1表达量显著降低，Nrf2及其下游蛋白表达量显著增加。实验结果说明AST通过上调Nrf2信号通路及其下游基因的表达，减少AFB1造成的肝脏氧化应激损伤。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.虾青素在制备修复鸡肝损伤和/或提高鸡出肉率的饲料中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鸡肝损伤为黄曲霉毒素B1中毒导致的鸡肝损伤。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料为降低肝损伤鸡的活性氧簇表达水平的饲料。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料为降低肝损伤鸡的谷草转氨酶、谷丙转氨酶和/或血清碱性磷酸酶活性水平的饲料。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料为降低肝损伤鸡的总胆红素含量的饲料。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料为降低肝损伤鸡的丙二醛含量的饲料。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料为提高肝损伤鸡的超氧化物歧化酶和/或过氧化氢酶活性水平的饲料。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料为提高肝损伤鸡的总谷胱甘肽含量的饲料。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料为降低肝损伤鸡的Nrf2表达水平的饲料。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料为降低肝损伤鸡的HO-1表达水平的饲料。

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