CN115724984A - 自身免疫b细胞消除剂分子及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开涉及自身免疫B细胞消除剂的设计、制备方法和应用，所述自身免疫B细胞消除剂是基于多特异性免疫球蛋白G(IgG)的融合蛋白，其可以重定向和激活T细胞或NK细胞以消除选择性自身免疫B细胞。

Description

自身免疫B细胞消除剂分子及其用途

背景技术

自身免疫疾病由抗体介导的针对自体抗原的自身免疫应答引起。它是影响美国5％–8％人口的第三大不治之症。寻常型天疱疮(PV)是一种人类自身免疫疾病，其中免疫组库谱分析和疾病自身抗原已被表征(Kasperkiewicz,Ellebrecht et al.2017)。PV患者会产生针对导致皮肤和粘膜起泡的皮肤细胞粘附蛋白桥粒芯蛋白3(DSG3)的自身抗体。寻常型天疱疮是一种潜在致命性抗体介导的自身免疫疾病，其特征是皮肤和粘膜失去细胞粘附(也称为棘层松解)。

对于自身免疫疾病，护理标准依赖于慢性免疫抑制，这可能导致所有抗体的减少(Ellebrecht and Payne 2017)。然而，这些策略也会导致保护患者免受感染的有益抗体减少。因此，此类治疗与多种副作用相关，包括致命感染和继发性癌症的风险。例如，全身性皮质类固醇、硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯和环磷酰胺对PV的治疗有效，但非特异性地抑制淋巴细胞增殖。据报道，一种抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗，在治疗寻常型天疱疮方面具有优异的疗效。然而，据报道，在7％接受利妥昔单抗治疗的自身免疫疾病患者中超过80％的患者发生了复发和严重感染(Ran and Payne 2017)。

为了治疗自身免疫疾病，优选的疗法将仅消除引起疾病的自身免疫细胞，同时保留提供保护性免疫的免疫细胞，这种策略通常被称为靶向疗法。最近，已经报道了一种在T细胞中设计基于自身抗原的嵌合免疫受体的策略，这种策略可以指导T细胞特异性杀死表达针对DSG3的自身抗体的自身免疫B细胞(Ellebrecht,Bhoj et al.2016)。虽然已报道这种策略在治疗寻常型天疱疮方面是有效的，但作为一种细胞疗法，它与复杂的过程和高成本有关。本公开提供了新型生物制剂分子(自身免疫B细胞消除剂分子)，它可以使患者自身的T细胞或NK细胞与特定的自身免疫B细胞接合并消除至少部分自身免疫B细胞，从而为自身抗体介导的自身免疫疾病(包括寻常型天疱疮)提供了一种新型治疗方法。本公开还提供包含新型生物制剂分子的组合物和制备所述组合物和新型生物制剂分子的方法及其用途。

发明概述

本公开提供了一种分离的自身免疫B细胞消除剂分子，在一个实施方案中，其是双特异性免疫球蛋白G(IgG)Fc融合蛋白，其包含：第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端具有针对自身免疫B细胞的自身抗原(如DSG3)，随后是第一IgG Fc；以及第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端具有对T细胞表面标志物或NK细胞表面标志物具有结合特异性的IgGFv，随后是第二IgG Fc；以及任选的在所述第一多肽和第二多肽之一或两者C末端的免疫调节结构域。

本公开还提供了一种分离的自身免疫B细胞消除剂，在一个实施方案中，其是包含SEQ ID NO:1、2或3的氨基酸序列的双特异性Fc融合蛋白。

还提供了一种蛋白质，其包含本文所述的第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和第二多肽通过其各自免疫球蛋白Fc结构域之间的一个或多个二硫键连接。

本公开还提供了从具有突变(包括例如F405L和K409R突变)的两个亲本Fc融合蛋白通过受控的Fab臂交换来生成自身免疫B细胞消除剂的方法，所述突变能够促进重链异二聚化。

本公开还提供了表达构建体，其包含分别编码具有突变(如F405L和K409R突变)的两种亲本Fc融合蛋白的核酸序列。在一个实施方案中，前导肽在每个Fc融合多肽之前，以驱动Fc融合多肽从包含表达构建体的细胞中分泌出来。

本公开还提供了包含本公开的核酸序列的载体。

本公开还提供了包含本公开的载体的宿主细胞。

本公开还提供了一种由异源核酸转导或转染的分离的悬浮适应细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含编码如本文所述的重组多肽的序列。

本公开还提供了一种产生本公开的IgG Fc融合蛋白的方法，其包括在表达Fc融合蛋白的条件下培养本公开的宿主细胞，并纯化Fc融合蛋白。

本公开还提供了一种药物组合物，其包含本公开的自身免疫B细胞消除剂和药学上可接受的载体。

本公开还提供了通过相应的T细胞或NK细胞表面标志物的结合来检测自身免疫B细胞消除剂与T细胞或NK细胞的接合的方法。

本公开还提供了通过自身抗原(例如DSG3)与对所述自身抗原具有特异性的自身免疫B细胞上的B细胞受体结合，来检测自身免疫B细胞消除剂与自身免疫B细胞接合的方法。

本公开还提供了一种通过自身免疫B细胞消除剂结合至T细胞和自身免疫B细胞两者，或NK细胞和自身免疫B细胞两者，将T细胞或NK细胞与自身免疫B细胞接合，来刺激CD8+T细胞或NK细胞的激活和增殖的方法。

本公开还提供了一种通过自身免疫B细胞消除剂结合至T细胞和自身免疫的B细胞两者，或NK细胞和自身免疫B细胞两者，将T细胞或NK细胞与自身免疫B细胞接合，来通过激活的CD8+T细胞或NK细胞消除自身免疫B细胞的方法。

本公开还提供了一种在有需要的受试者中治疗自身免疫疾病的方法，其包括施用治疗有效量的自身免疫B细胞消除剂以刺激受试者的T细胞或NK细胞，以消除至少一些对自身免疫B细胞消除剂的自身抗原具有特异性的自身免疫B细胞。

本文描述的本公开的任何一个实施方案，如仅在描述本公开的特定方面的说明书一个部分中描述的那些，以及仅在实施例或附图中描述的那些，可以与任何其他一个或多个实施方案组合。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。本专利或专利申请出版物的带有彩色附图的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。

图1：示例性自身免疫B细胞消除剂的示意图(未按比例绘制，也不一定反映不同结构域之间的相对关系)：双特异性免疫球蛋白G(IgG)Fc融合蛋白，其包含：一种多肽，该多肽从N末端到C末端具有针对自身免疫B细胞的自身抗原(例如DSG3)，随后是IgG Fc；以及另一种多肽，该多肽从N末端到C末端具有对T细胞或NK细胞表面标志物有结合特异性的IgG Fv(如T细胞标志物CD3或NK细胞标志物NKG2A的抗体的单链Fv(ScFv))，随后是IgG Fc；以及任选的两个多肽C末端的免疫调节结构域(Mod)。还描述了结合至自身免疫B细胞的自身抗原和结合至CD3或NKG2A的ScFv。通过双重接合，自身免疫B细胞消除剂可以激活T细胞或NK细胞，从而促进消除附近的自身免疫B细胞。

图2：自身免疫B细胞消除剂的一个示例性构建体，其包含：第一链多肽，所述第一链多肽从N末端到C末端具有DSG3自身抗原，随后是IgG Fc和T细胞共刺激剂IL2；以及第二链多肽，所述第二链多肽从N末端到C末端具有抗T细胞标志物CD3的抗体的scFv，随后是IgGFc和T细胞共刺激剂IL2。尽管此处和下文明确提到了IgG，但任何其他Ig同种型(如IgM、IgA、IgD和IgE)或亚型(例如人类中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4或其他哺乳动物中的其他亚型)，或基于Ig或非基于Ig的支架也被考虑并且应该被理解为在本公开的范围内。

图3：自身免疫B细胞消除剂的一个示例性构建体，其包含：第一链多肽，所述第一链多肽从N末端到C末端具有DSG3自身抗原，随后是IgG Fc和NK细胞共刺激剂IL15；以及第二链多肽，所述第二链多肽从N末端到C末端具有抗NK细胞标志物NKG2A的抗体的scFv，随后是IgG Fc和NK细胞共刺激剂IL15。尽管此处和下文明确提到了IgG，但任何其他Ig同种型(如IgM、IgA、IgD和IgE)或亚型(例如人类中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4或其他哺乳动物中的其他亚型)，或基于Ig或非基于Ig的支架也被考虑并且应该被理解为在本公开的范围内。

图4：自身免疫B细胞消除剂的一个示例性构建体，其包含：第一链多肽，所述第一链多肽从N末端到C末端具有DSG3自身抗原，随后是IgG Fc和T细胞共刺激剂IL2；以及另外两种分别被指定为重链和轻链的多肽，其中重链在N末端到C末端的方向包含源自抗CD3ε和IgG C_H1结构域的抗体的V_H，随后是IgG Fc和T细胞共刺激剂IL2，并且其中轻链在N末端到C末端的方向包含源自抗CD3ε和IgG C_L结构域的抗体的V_L。重链和轻链可以通过C_H1和C_L之间的二硫键共价连接。

图5：自身免疫B细胞消除剂的一个示例性构建体，其包含：第一链多肽，所述第一链多肽从N末端到C末端具有DSG3自身抗原，随后是IgG Fc和NK细胞共刺激剂IL15；以及另外两种分别被指定为重链和轻链的多肽，其中重链在N末端到C末端的方向包含源自抗NKG2A和IgG C_H1结构域的抗体的V_H，随后是IgG Fc和NK细胞共刺激剂IL15，并且其中轻链在N末端到C末端的方向包含源自抗NKG2A和IgG C_L结构域的抗体的V_L。重链和轻链可以通过C_H1和C_L之间的二硫键共价连接。

图6：在称为Fab臂交换的过程中，通过Fc突变介导的异二聚化，从两个亲本Fc融合分子生成自身免疫B细胞消除剂的示例。

图7：SDS-PAGE凝胶显示了在还原条件下具有DSG3EC1结构域(DSG3EC1)、EC2结构域(DSG3EC2)、EC1至EC4结构域(DSG3EC1-EC4)和EC1至EC2结构域(DSG3EC1-EC2)的Fc融合蛋白的表达。此外，也显示了具有抗-CD3抗体(抗-CD3ScFv)、抗-CD3抗体(抗-CD3)和IL2连接在轻链C末端的抗-CD3抗体(抗-CD3_IL2)的ScFv的Fc融合蛋白的表达。

发明详述

在本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，都通过引用并入本文，如同完全阐述一样。

应当理解，本文中使用的某些术语仅用于描述特定实施方案而不旨在进行限制。除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。

尽管在实践中可以使用与本文中描述的那些相似或等效的任何方法和材料，但是在本文中描述了示例性材料和方法。

如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容另有明确规定，否则单数形式“一/一种”和“所述”包括复数所指对象。因此，例如，提及“一/一种细胞”包括两个或更多个细胞的组合等。

“自身抗原”是指刺激自身免疫应答的产生(如自身抗体的产生)的内源性抗原。自身抗原还包括自体抗原或来自正常组织的抗原，所述正常组织是可能导致自身免疫疾病发展的细胞介导的或抗体介导的免疫应答的靶标。自身抗原的实例包括但不限于：桥粒芯蛋白1、桥粒芯蛋白3及其片段。

“自身抗体”是指由对自身抗原具有特异性的B细胞产生的抗体。

“自身免疫疾病”是指由抗体介导的针对自身抗原的自身免疫应答引起的病症或病况。自身免疫疾病可能导致自身抗体的产生，这些抗体是针对自体抗原或自身抗原不当地和/或过度地产生的。

“桥粒芯蛋白1”或“DSG1”是指钙结合跨膜糖蛋白，其是在上皮细胞之间的细胞-细胞连接处发现的桥粒的组分。示例性的DSGl序列包括在GenBank登录号NM_001942和NP_001932发现的人DSGl或其片段，以及在NM_010079或NP_034209发现的小鼠DSG1序列或其片段。

“桥粒芯蛋白3”或“DSG3”是指钙结合跨膜糖蛋白，其是在上皮细胞之间的细胞-细胞连接处发现的桥粒的组分。示例性的DSG3序列包括在GenBank登录号NM_001944和NP_001935(P32926)发现的人DSG3或其片段，以及在NM_030596或NP_085099发现的小鼠DSG3序列或其片段。

“促炎细胞因子”是指促进炎症或炎性反应的细胞因子或因子。促炎细胞因子的实例，包括但不限于：趋化因子(例如，CCL、CXCL、CX3CL、XCL)、白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10和IL-15)、干扰素(例如，IFNy)和肿瘤坏死因子(例如，TNFα和TNFβ)。

“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(例如，CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(例如，CD8+细胞)、T调节细胞(例如，T_reg)和NK-T细胞。

如本文所用，术语“共刺激性配体”包括抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上的分子，所述抗原呈递细胞特异性结合T细胞上的同源共刺激性分子从而提供信号，所述信号除了由例如TCR(T细胞受体)/CD3复合物与负载有肽的MHC分子的结合所提供的主要信号外，还介导T细胞反应，包括但不限于：增殖、激活、分化等。共刺激性配体可包括但不限于：CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、Fas配体(FasL)、诱导型共刺激性配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM，结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3结合的配体。共刺激性配体，尤其还包括与存在于T细胞上的共刺激性分子结合的抗体，例如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，以及与CD83结合的配体。

“抗体”是广义的，包括免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包括单克隆抗体，其包括：鼠、人、人源化和嵌合的单克隆抗体、抗体片段、双特异性或多特异性抗体、二聚、四聚或多聚抗体、单链抗体、结构域抗体和包含所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型。

“全长抗体分子”由通过二硫键互连的两条重链(HC)和两条轻链(LC)及其多聚体(例如IgM)组成。每条重链由重链可变区(V_H)和重链恒定区(由结构域C_H1、铰链、C_H2和C_H3组成)组成。每条轻链由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区(C_L)组成。V_H和V_L区可进一步细分为高度可变的区域，称为互补决定区(CDR)，散布有框架区(FR)。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR片段组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。

根据重链恒定区氨基酸序列，免疫球蛋白可分为五个主要类别，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步细分为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。根据其恒定区的氨基酸序列，任何脊椎动物物种的抗体轻链都可以归为两种不同类型之一，即κ和λ。

除非另有明确说明，在整个说明书中，抗体恒定区中氨基酸残基是根据Kabat etal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)(incorporated byreference)中描述的EU索引进行编号的。

本文使用常规的一字母和三字母氨基酸代码，如表1所示。

表1

“免疫球蛋白G(IgG)Fc融合蛋白”，或“免疫球蛋白G(IgG)Fc-融合蛋白”，是指具有至少一个免疫球蛋白G恒定结构域(例如IgG重链的C_H1、C_H2、C_H3结构域)的单体、二聚体或异二聚体蛋白。

哺乳动物IgG重链的恒定区序列依次被命名为C_H1-铰链-C_H2-C_H3。根据EU索引，IgG的“铰链”、“铰链区”或“铰链结构域”通常被定义为包括人IgG1的Glu216并在Pro230处终止，但在功能上，该链的柔性部分可能被认为包括另外的称为上铰链区和下铰链区的残基，例如从Glu216到Gly237，并且下铰链被称为Fc区的残基233至239，其中FcγR结合通常归因于所述残基233至239。通过放置形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基，其他IgG同种型的铰链区可以与IgG1序列对齐。尽管根据EU索引编号，边界可能略有不同，但C_H1结构域与V_H结构域相邻，氨基末端与免疫球蛋白重链分子的铰链区相邻，并包括免疫球蛋白重链的第一个(最氨基末端)恒定区，例如来自大约EU位置118-215。Fc结构域从氨基酸231延伸到氨基酸447；C_H2结构域从约Ala231到Lys340或Gly341，以及C_H3从约Gly341或Gln342到Lys447。C_H1区的IgG重链恒定区的残基终止于Lys。含有Fc结构域的分子包含至少抗体恒定区的C_H2和C_H3结构域，因此包含至少IgG重链恒定区的约Ala231至Lys447的区域。含有Fc结构域的分子任选地可以包含铰链区的至少一部分。

“表位”是指抗体特异性结合的抗原一部分。表位通常由部分(如氨基酸或多糖侧链)的化学活性(如极性、非极性或疏水性)表面基团组成，并且可能具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸组成。对于不连续的表位，来自抗原的线性序列不同部分的氨基酸，通过蛋白质分子的折叠在3维空间中非常接近。抗体“表位”取决于用于鉴定该表位的方法。

如本文所用，“前导序列”包括可由哺乳动物细胞加工的任何信号肽。这样的序列是本领域公知的。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白(质)”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合形式，其可包括编码和非编码氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸，以及具有修饰肽骨架的多肽。所述术语还包括具有多肽的共翻译(例如，信号肽切割)和翻译后修饰的多肽，例如二硫键形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、蛋白水解切割等。此外，如本文所用，“多肽”是指包括对天然序列的修饰如缺失、添加和替换的蛋白质(如本领域技术人员所知，本质上通常是保守的)，只要该蛋白质保持所需的活性。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变，也可以是偶然的，例如通过产生该蛋白质的宿主的突变，或由于PCR扩增或其他重组DNA方法导致的错误。

如本文所用，术语“重组”描述这样的核酸分子，例如基因组、cDNA、病毒、半合成和/或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作，其与与其特性相关的所有或部分多核苷酸序列无关。关于蛋白质或多肽，所使用的术语“重组”是指通过从重组多核苷酸表达产生的多肽。关于宿主细胞或病毒，所使用的术语“重组”是指其中已引入重组多核苷酸的宿主细胞或病毒。重组在本文中还用于指代已经通过引入异源材料(例如细胞、核酸、蛋白质或载体)而修饰的材料(例如细胞、核酸、蛋白质或载体)。

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，以包括核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。该术语仅指分子的一级结构。

“载体”是指能够在生物系统内被复制或能够在这样的系统之间被移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常包含元件如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标志物，其功能是促进在生物系统(如细胞、病毒、动物、植物)和重建的生物系统中利用能够复制载体的生物成分进行这些多核苷酸的复制或维持。载体多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA分子、cDNA或它们杂合体。

“表达载体”是指可用于在生物系统或重建的生物系统中以指导由表达载体中存在的由多核苷酸序列编码的多肽的翻译的载体。

如本文所用，术语“免疫突触”(immunological synapse/immune synapse)通常是指适应性免疫应答的两个相互作用免疫细胞之间的天然界面，包括例如抗原呈递细胞(APC)或靶细胞和效应细胞(例如淋巴细胞、效应T细胞、自然杀伤细胞等)之间的界面。APC和T细胞之间的免疫突触，通常由T细胞抗原受体和主要组织相容性复合物分子的相互作用启动(Bromley,Burack et al.2001)。

“价”是指分子中存在对抗原具有特异性的特定数量的结合位点。因此，术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”是指分子中存在对抗原具有特异性的一个、两个、四个和六个结合位点。

“激动剂”是指诱导其所结合的T细胞受体的至少一种生物活性的配体或抗体。示例性激动活性包括抗原特异性T细胞回忆应答的诱导，所述回忆应答通过从先前暴露于抗原的患者中分离的PBMC产生干扰素-γ(IFN-γ)以及诱导CD4+或CD8+T细胞增殖来进行评价。激动活性(例如激动)可以是交联依赖的或独立于抗体交联。

如本文所用，关于核酸序列、蛋白质或多肽所使用的术语“异源的”，描述了这些分子不是天然存在于该异源核酸序列、蛋白质或多肽所源自的细胞中。例如，插入到非人细胞的细胞中的编码人多肽的核酸序列，在该特定上下文中是异源核酸序列。尽管异源核酸可源自不同的生物体或动物物种，但此类核酸无需源自不同的生物体物种以成为异源。例如，在一些情况下，合成核酸序列或由其编码的多肽可能与其被引入的先前不含该合成核酸细胞异源。因此，合成核酸序列或由其编码的多肽可被认为与人细胞异源，例如，即使合成核酸序列或由其编码的多肽的一种或多种组分最初源自人细胞。

如本文所用，“宿主细胞”表示体内或体外真核细胞，或来自作为单细胞实体培养的多细胞生物体(例如细胞系)的细胞，所述真核细胞可以或已经被用作核酸的受体(例如，包含编码本公开的多聚多肽的核苷酸序列的表达载体)，并且包括已经被核酸遗传修饰的原始细胞的后代。应当理解，由于自然、偶然或故意的突变，单个细胞的后代在形态学或基因组或总DNA补体方面不一定与原始亲本完全相同。

“重组宿主细胞”(也称为“遗传修饰的宿主细胞”)是其中已引入异源核酸(例如表达载体)的宿主细胞。例如，遗传修饰的真核宿主细胞通过将异源核酸(例如对于真核宿主细胞而言是外源的外源核酸，或在真核宿主细胞中通常不存在的重组核酸)引入合适的真核宿主细胞而被遗传修饰。

如本文所用，术语“治疗(treatment/treating)”等是指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果在完全或部分预防疾病或其症状方面可以是预防性的，和/或在部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不良反应方面可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物(例如人)的疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病发生在可能易患该疾病但尚未诊断为患该病的受试者中；(b)抑制疾病，例如阻止其发展；以及(c)缓解疾病，例如，使疾病消退。

本文中可互换使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于：鼠类(例如大鼠、小鼠)、兔类动物(例如兔)、非人类灵长类动物、人类、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如，马、牛、绵羊、猪、山羊)等。

“治疗有效量”或“有效量”，是指当施用于哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时，足以实现这种疾病的治疗的药剂的量或两种药剂的组合量。“治疗有效量”将根据要治疗的受试者的药剂、疾病及其严重程度和年龄、体重等而变化。

应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在进行限制。

自身免疫B细胞消除剂的组合物

本文公开提供了一种新型自身免疫B细胞消除剂，在一个实施方案中，其是一种新型的基于双特异性IgG的Fc融合蛋白，具有使T细胞或NK细胞与自身免疫B细胞接合的能力。通过双重接合，所述自身免疫B细胞消除剂可以激活T细胞和NK细胞，从而促进消除附近的自身免疫B细胞(图1)。本部分进一步描述了本公开的某些示例性实施方案的自身免疫B细胞消除剂分子。

在某些具体实施方案中，本公开提供了分离的自身免疫B细胞消除剂，其是重组双特异性IgG Fc融合蛋白，包含：一条Fc融合蛋白链，所述Fc融合蛋白链从N末端到C末端具有自身抗原DSG3胞外域，随后是具有F405L突变的IgG1 Fc、接头和T细胞共刺激剂IL2；以及另一条Fc融合蛋白链，所述Fc融合蛋白链从N末端到C末端具有对T细胞表面标志物CD3具有结合特异性的单链Fv(ScFv)，随后是具有K409R突变的IgG1 Fc、接头和T细胞共刺激剂IL2(图2)。在一个实施方案中，重组自身免疫B细胞消除剂包含含有SEQ ID NO:1的DSG3 Fc融合多肽和含有SEQ ID NO:2的抗-CD3ScFv Fc融合多肽。

在某些特定的实施方案中，本公开提供了分离的自身免疫B细胞消除剂，其是重组双特异性IgG Fc融合蛋白，包含：一条Fc融合蛋白链，所述Fc融合蛋白链从N末端到C末端具有自身抗原DSG3，随后是具有F405L突变的IgG1 Fc、接头和NK细胞共刺激剂IL15；以及另一条Fc融合蛋白链，所述Fc融合蛋白链从N末端到C末端具有对NK细胞表面标志物NKG2A具有结合特异性的ScFv，随后是具有K409R突变的IgG1 Fc、接头和NK细胞共刺激剂IL15(图3)。在一个实施方案中，重组自身免疫B细胞消除剂包含含有SEQ ID NO:1的DSG3 Fc融合多肽和含有SEQ ID NO:3的抗-NKG2A ScFv Fc融合多肽。

SEQ ID NO:1

粗体：DSG3胞外域EC1至EC5

斜体：具有F405L突变的IgG1 Fc

粗斜体：IL2

SEQ ID NO:2

粗体：抗-CD3ScFv

斜体：具有K409R突变的IgG1 Fc

IL2

SEQ ID NO:3

粗体：抗-NKG2A ScFv

斜体：具有K409R突变的IgG1 Fc

粗斜体：IL2

针对自身免疫B细胞的自身抗原

本公开的自身免疫B细胞消除剂包含自身抗体结合域，也称为自身抗原或其片段。用于本公开的自身抗原的选择，取决于被靶向的自身抗体的类型。例如，可以选择自身抗原，因为它识别靶细胞(例如与特定疾病如一种自身免疫疾病的状态相关的B细胞)上的自身抗体。在一些情况下，自身抗体结合域部分包含结合自身抗体的自身抗原的表位。表位是被自身抗体特异性识别的自身抗原一部分。

在一个示例性实施方案中，自身免疫B细胞消除剂包括主要寻常型天疱疮自身抗原、桥粒芯蛋白3(DSG3)或其片段。DSG3的胞外域为自身免疫DSG3特异性B细胞提供了靶标。人桥粒芯蛋白3胞外域可包含与SEQ ID NO:4所示的人桥粒芯蛋白3胞外域EC1至EC5(人桥粒芯蛋白3的氨基酸50-615，uniprot P32926)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一个示例性实施方案中，自身免疫B细胞消除剂的自身抗原包含与SEQ ID NO:5所示的人桥粒芯蛋白3胞外域EC1至EC4(人桥粒芯蛋白3的氨基酸50-499，uniprot P32926)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一个示例性实施方案中，自身免疫B细胞消除剂的自身抗原可包含与SEQ IDNO:6所示的人桥粒芯蛋白3的EC1胞外域(人桥粒芯蛋白3的氨基酸50-148，uniprotP32926)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一个示例性实施方案中，自身免疫B细胞消除剂的自身抗原可包含与SEQ IDNO:7所示的人桥粒芯蛋白3的EC2胞外域(人桥粒芯蛋白3的氨基酸148-258，uniprotP32926)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一个示例性实施方案中，自身免疫B细胞消除剂的自身抗原可包含与SEQ IDNO:8所示的人桥粒芯蛋白3的EC1至EC2胞外域(人桥粒芯蛋白3的氨基酸50-258，uniprotP32926)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4

EWVKFAKPCREGEDNSKRNPIAKITSDYQATQKITYRISGVGIDQPPFGIFVVDKNTGDINITAIVDREETPSFLITCRALNAQGLDVEKPLILTVKILDINDNPPVFSQQIFMGEIEENSASNSLVMILNATDADEPNHLNSKIAFKIVSQEPAGTPMFLLSRNTGEVRTLTNSLDREQASSYRLVVSGADKDGEGLSTQCECNIKVKDVNDNFPMFRDSQYSARIEENILSSELLRFQVTDLDEEYTDNWLAVYFFTSGNEGNWFEIQTDPRTNEGILKVVKALDYEQLQSVKLSIAVKNKAEFHQSVISRYRVQSTPVTIQVINVREGIAFRPASKTFTVQKGISSKKLVDYILGTYQAIDEDTNKAASNVKYVMGRNDGGYLMIDSKTAEIKFVKNMNRDSTFIVNKTITAEVLAIDEYTGKTSTGTVYVRVPDFNDNCPTAVLEKDAVCSSSPSVVVSARTLNNRYTGPYTFALEDQPVKLPAVWSITTLNATSALLRAQEQIPPGVYHISLVLTDSQNNRCEMPRSLTLEVCQCDNRGICGTSYPTTSPGTRYGRPHSGR

SEQ ID NO:5

EWVKFAKPCREGEDNSKRNPIAKITSDYQATQKITYRISGVGIDQPPFGIFVVDKNTGDINITAIVDREETPSFLITCRALNAQGLDVEKPLILTVKILDINDNPPVFSQQIFMGEIEENSASNSLVMILNATDADEPNHLNSKIAFKIVSQEPAGTPMFLLSRNTGEVRTLTNSLDREQASSYRLVVSGADKDGEGLSTQCECNIKVKDVNDNFPMFRDSQYSARIEENILSSELLRFQVTDLDEEYTDNWLAVYFFTSGNEGNWFEIQTDPRTNEGILKVVKALDYEQLQSVKLSIAVKNKAEFHQSVISRYRVQSTPVTIQVINVREGIAFRPASKTFTVQKGISSKKLVDYILGTYQAIDEDTNKAASNVKYVMGRNDGGYLMIDSKTAEIKFVKNMNRDSTFIVNKTITAEVLAIDEYTGKTSTGTVYVRVPDFNDNCPTAVLEK

SEQ ID NO:6

EWVKFAKPCREGEDNSKRNPIAKITSDYQATQKITYRISGVGIDQPPFGIFVVDKNTGDINITAIVDREETPSFLITCRALNAQGLDVEKPLILTVKIL

SEQ ID NO:7

DINDNPPVFSQQIFMGEIEENSASNSLVMILNATDADEPNHLNSKIAFKIVSQEPAGTPMFLLSRNTGEVRTLTNSLDREQASSYRLVVSGADKDGEGLSTQCECNIKVK

SEQ ID NO:8

EWVKFAKPCREGEDNSKRNPIAKITSDYQATQKITYRISGVGIDQPPFGIFVVDKNTGDINITAIVDREETPSFLITCRALNAQGLDVEKPLILTVKILDINDNPPVFSQQIFMGEIEENSASNSLVMILNATDADEPNHLNSKIAFKIVSQEPAGTPMFLLSRNTGEVRTLTNSLDREQASSYRLVVSGADKDGEGLSTQCECNIKVK

在一个实施方案中，自身免疫B细胞消除剂包含在胞外域之前的人桥粒芯蛋白3前肽(人桥粒芯蛋白3的氨基酸24-49：ELRIETKGQYDEEEMTMQQAKRRQKR)。人DSG3前肽阻止DSG3蛋白在细胞合成途径内与其自身粘附，并在高尔基体晚期被弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样肽酶切割。

结合T细胞表面标志物

在一个实施方案中，本公开的自身免疫B细胞消除剂包含对T细胞表面标志物具有结合特异性的IgG Fv。通过这种相互作用，自身免疫B细胞消除剂可以将T细胞带到自身免疫B细胞附近。通过这种接合，可以激活T细胞以消除自身免疫B细胞。

可以采用某些T细胞表面标志物来接合T细胞，包括但不限于：CD3、CD4和CD8。CD3ε是众所周知的T细胞表面标志物，通过它与T细胞接合。在一个示例性实施方案中，自身免疫B细胞消除剂包括对CD3ε具有结合特异性的IgG Fv。CD3ε可包含与SEQ ID NO:9所示的人CD3ε具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9

DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDV

对CD3ε具有结合特异性的抗体已被充分记录，包括但不限于OKT3单克隆抗体。在一个示例性实施方案中，自身免疫B细胞消除剂包括源自OKT3抗体的Fv，作为对CD3ζ具有结合特异性的Fv。对CD3ε具有结合特异性的Fv的V_H，可包含与SEQ ID NO:10所示的源自OKT3抗体的V_H具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。对CD3ε具有结合特异性的Fv的V_L，可包含与SEQ IDNO:11所示的源自OKT3抗体的V_L具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS

SEQ ID NO:11

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN

在一个示例性实施方案中，对CD3ε具有结合特异性的自身免疫B细胞消除剂的Fv，可包含两条具有源自OKT3抗体的V_H和V_L序列的多肽链。一种多肽，被指定为重链，其在N末端到C末端方向包含源自OKT3抗体的V_H和IgG C_H1结构域，随后是作为Fc融合多肽链的IgG Fc。另一种多肽，被指定为轻链，其在N末端到C末端方向包含源自OKT3抗体的V_L和IgG C_L结构域(图4)。所述重链和轻链通过C_H1和C_L之间的二硫键共价连接。在另一个实施方案中，重链的Fv部分可包含与SEQ ID NO:12所示的源自OKT3抗体的V_H和IgG C_H1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。轻链的Fv部分可包含与SEQ ID NO:13所示的源自OKT3抗体的V_L和IgG C_L具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK

SEQ ID NO:13

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

在一个示例性实施方案中，对CD3ε具有结合特异性的自身免疫B细胞消除剂的Fv，可包含一条具有源自OKT3抗体的V_H和V_L序列的ScFv多肽链。在进一步的实施方案中，ScFv可以是两种形式，从N末端到C末端的方向，或者V_H随后是V_L，或者V_L随后是V_H。在V_H随后是V_L的形式中，ScFv可包含与SEQ ID NO:14所示的源自OKT3抗体的V_H随后是接头和源自OKT3抗体的V_L具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在V_L随后是V_H的形式中，ScFv可包含与SEQ ID NO:15所示的源自OKT3抗体的V_L随后是接头和源自OKT3抗体的V_H具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:14

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN

SEQ ID NO:15

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS

结合NK细胞表面标志物

在一个实施方案中，本公开的自身免疫B细胞消除剂包含对NK细胞表面标志物具有结合特异性的IgG Fv。通过这种相互作用，自身免疫B细胞消除剂可以将NK细胞带到自身免疫B细胞附近。通过这种接合，可以激活NK细胞以消除自身免疫B细胞。

某些NK细胞表面标志物可用于接合NK细胞，包括但不限于：自然杀伤组2成员D(NKG2D)(CD314)、NKp30(CD337)、NKp46(CD335)和NKp44(CD336)、受体复合物CD94/NKG2C或FCγRIIIa(CD16a)和自然杀伤组2成员A(NKG2A)。

NKG2A是众所周知的NK细胞表面标志物，通过它与NK细胞结合。在一个示例性实施方案中，自身免疫B细胞消除剂包括对NKG2A具有结合特异性的IgG Fv。NKG2A可包含与SEQID NO:16所示的人NKG2A具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:16

MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKNSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASVVTIVVIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL

对NKG2A具有结合特异性的抗体已被充分记录，包括但不限于莫那利珠单抗(Monalizumab)单克隆抗体。莫那利珠单抗是一种检查点抑制剂，其通过结合和阻断抑制性受体NKG2A来促进NK细胞的抗肿瘤免疫(A Andre,Denis et al.2018)。在一个示例性实施方案中，自身免疫B细胞消除剂包括源自莫那利珠单抗抗体的Fv，作为对NKG2A具有结合特异性的Fv。对NKG2A具有结合特异性的Fv的V_H，可包含与SEQ ID NO:17所示的源自莫那利珠单抗抗体的V_H具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。对NKG2A具有结合特异性的Fv的V_L，可包含与SEQ ID NO:18所示的源自莫那利珠单抗抗体的V_L具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:17

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGRIDPYDSETHYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO:18

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPRTFGGGTKVEIK

在一个示例性实施方案中，对NKG2A具有结合特异性的自身免疫B细胞消除剂的Fv，可包含两条具有源自莫那利珠单抗抗体的V_H和V_L序列的多肽链。一种多肽，被指定为重链，其在N末端到C末端的方向包含源自莫那利珠单抗抗体的V_H和IgG C_H1结构域，随后是作为Fc融合多肽链的IgG Fc。另一种多肽，被指定为轻链，其在N末端到C末端的方向包含源自莫那利珠单抗抗体的V_L和IgG C_L结构域。所述重链和轻链通过C_H1和C_L之间的二硫键共价连接(图5)。在另一个实施方案中，重链的Fv部分可包含与SEQ ID NO:19所示的源自莫那利珠单抗抗体的V_H和IgG C_H1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。轻链的Fv部分可包含与SEQ IDNO:20所示的源自莫那利珠单抗抗体的V_L和IgG C_L具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGRIDPYDSETHYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK

SEQ ID NO:20

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

在一个示例性实施方案中，对NKG2A具有结合特异性的自身免疫B细胞消除剂的Fv，可包含一条具有源自莫那利珠单抗抗体的V_H和V_L序列的ScFv多肽链。在进一步的实施方案中，ScFv可以是两种形式，从N末端到C末端的方向，或者V_H随后是V_L，或者V_L随后是V_H。在V_H随后是V_L的形式中，ScFv可包含与SEQ ID NO:21所示的源自莫那利珠单抗抗体的V_H随后是接头和源自莫那利珠单抗抗体的V_L具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在V_L随后是V_H的形式中，ScFv可包含与SEQ ID NO:22所示的源自莫那利珠单抗抗体的V_L随后是接头和源自莫那利珠单抗抗体的V_H具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:21

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGRIDPYDSETHYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPRTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO:22

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPRTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGRIDPYDSETHYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVSS

自身抗体

自身抗体是由B细胞产生的对自体抗原或自身抗原具有特异性的抗体。针对特定的自身抗原，可以针对自身抗原的不同表位产生多种自身抗体。通过靶向自身抗原，自身抗体可以介导对自身组织或细胞的自身免疫应答。自身免疫疾病导致自身抗体的产生，所述自身抗体针对自体抗原或自身抗原的不当产生和/或过度产生。自身抗体可以作为游离抗体，也可以作为自身免疫B细胞表面的B细胞受体(BCR)一部分。

本公开的自身免疫B细胞消除剂包含自身抗体结合域，也称为自身抗原或其片段。通过接合自身抗体作为自身免疫B细胞上BCR的一部分，自身免疫B细胞消除剂可以将自身免疫B细胞带到T细胞或NK细胞附近，这些T细胞或NK细胞通过对T细胞或NK细胞具有结合特异性的IgG Fv与自身免疫B细胞消除剂接合。这将促进T细胞或NK细胞的激活，从而消除附近的自身免疫B细胞。

在一个示例性实施方案中，自身抗体是由自身免疫B细胞针对寻常型天疱疮自身抗原DSG3产生的抗体。DSG3由五个胞外钙粘蛋白(EC)结构域组成，其中对细胞粘附很重要的残基位于EC1和EC2中。EC1、EC2、EC3、EC4和EC5的自身抗体，出现在91％、71％、51％、19％和12％的寻常型天疱疮血清中(Ohyama,Nishifuji et al.2012)。

针对DSG3的自身抗体的非限制性实例包括：

称为F779的DSG3特异性自身抗体(Cho,Lo et al.2014)，其中V_H序列如SEQ IDNO:23所示，V_L序列如SEQ ID NO:24所示。

SEQ ID NO:23

QVQLVQSGADVKKPGASVKVSCTASGNTFTTYSLHWVRQAPGQGLEWMGVIDPSGGSTSYAQKFQGRLTMTRDTSTSTFYMELSSLRSEDTAVYYCARSIESISGRTLGYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:24

DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSETLVHSDGNTYLSWLQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQATEFPYTFGQGTKLEIK

称为PVB28的DSG3特异性自身抗体(Di Zenzo,Di Lullo et al.2012)，其中V_H序列如SEQ ID NO:25所示，V_L序列如SEQ ID NO:26所示。

SEQ ID NO:25

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSNGSISSGHFYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYRSGSPSYNPSLKSRVTISKDMSKNQFFLRLTSVTAADTAVYYCARDGAAGLYLEKWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:26

EIVLTQSPATLSVSPGGRATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPGLLIYGASTRAAGIPARFSAGGSGTEFTLNISSLQSEDFAVYYCQQYNHWPPMYSFGQGTKLEIK

接头

本公开的自身免疫B细胞消除剂可包括一种或多种插入在例如IgG Fv到T细胞或NK细胞表面标志物和IgG恒定结构域之间，和/或IgG恒定结构域和免疫调节多肽之间的接头肽。

可以容易地选择合适的接头(也称为“间隔子”)，并且可以是许多合适长度中的任何一个，如1-30个氨基酸(例如，在1至30之间的任何整数，或1个氨基酸(例如，Gly)至约20个氨基酸，2-15、3-12、4-10、5-9、6-8或7-8个氨基酸)。

示例性接头包括甘氨酸聚合物(G)_n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)_n、(GSGGS)_n和(GGGS)_n，其中n是至少一的整数，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)，甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、丙氨酸-脯氨酸、免疫球蛋白同种型和亚型铰链，其可包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM和本领域已知的其他柔性接头。Gly和Ser均相对非结构化，因此可以作为组份之间的中性系链。

在某些实施例中，接头是甘氨酸聚合物。甘氨酸进入的phi-psi空间甚至比丙氨酸显著更多，并且比具有更长侧链的残基的限制要少得多(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。示例性接头可包含氨基酸序列，包括但不限于：GGSG、GGSGG、GSSGG、GSGGG、GGSGG、GSSSG等。

免疫球蛋白(Ig)恒定链

在一个实施方案中，本公开的自身免疫B细胞消除剂包含免疫球蛋白(Ig)恒定区的一部分，该部分包含Ig C_H1多肽和Fc多肽，或包含合适的支架多肽，所述支架多肽可以在功能上等同于Ig恒定区。合适的支架多肽包括基于抗体的支架多肽和非基于抗体的支架。

非基于抗体的支架，包括例如白蛋白、XTEN(扩展重组)多肽、转铁蛋白、Fc受体多肽、弹性蛋白样多肽(参见例如Hassouneh et al.(2012)Methods Enzymol.502:215；例如，包含五肽重复单元(Val-Pro-Gly-X-Gly)的多肽，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸)、白蛋白结合多肽、丝样多肽(参见，例如Valluzzi et al.(2002)Philos Trans R Soc Lond BBiol Sci.357:165)、丝弹性蛋白样多肽(SELP；参见，例如Megeed et al.(2002)Adv DrugDeliv Rev.54:1075)等。所有引用的内容均以引用方式并入。

合适的XTEN多肽，包括例如WO 2009/023270、WO 2010/091122、WO2007/103515、US2010/0189682和US 2009/0092582中公开的那些；也可以参见Schellenberger et al.(2009)Nat Biotechnol.27:1186。所有引用的内容均以引用方式并入。合适的白蛋白多肽包括例如人血清白蛋白。

在一些情况下，合适的支架多肽将是半衰期延长的多肽。因此，在一些情况下，与缺乏支架多肽的对照自身免疫B细胞消除剂相比，合适的支架多肽增加了自身免疫B细胞消除剂的体内半衰期(例如，血清半衰期)。例如，在一些情况下，与缺乏支架多肽的对照自身免疫B细胞消除剂相比，支架多肽使自身免疫B细胞消除剂的体内半衰期(例如，血清半衰期)增加至少约10％、15％、20％、25％、50％、2倍、2.5倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍或超过100倍。

作为实例，在一些情况下，与缺乏Fc多肽的对照自身免疫B细胞消除剂相比，Fc多肽使自身免疫B细胞消除剂的体内半衰期(例如，血清半衰期)增加至少约10％、15％、20％、25％、50％、2倍、2.5倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍或超过100倍。

本公开的自身免疫B细胞消除剂的Fc多肽，可以是人IgG1 Fc、人IgG2 Fc、人IgG3Fc、人IgG4 Fc等。

在某些实施方案中，Fc多肽包含与Fc区的氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，Fc区包含与人IgG1 Fc多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，Fc多肽包含与人IgG2 Fc多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；例如，Fc多肽包含与人IgG2 Fc多肽的氨基酸99-325具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，Fc多肽包含与人IgG3 Fc多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；例如，Fc多肽包含与人IgG3 Fc多肽的氨基酸19-246具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，Fc多肽包含与人IgG4 Fc多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；例如，Fc多肽包含与人IgG4 Fc多肽的氨基酸100-327具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，Fc多肽包含与人IgM Fc多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；例如，Fc多肽包含与人IgM Fc多肽的氨基酸1-276具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，Fc多肽包含与人IgA Fc多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；例如，Fc多肽包含与人IgA Fc多肽的氨基酸1-234具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是IgG Fc结构域。在某些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是IgA Fc结构域。在某些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是IgM Fc结构域。在某些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是人免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是IgG1 Fc结构域。

例如，在某些实施方案中，本公开的自身免疫B细胞消除剂包括IgG抗体重链C_H1恒定域(C_H1)。IgG抗体C_H1结构域可以是人C_H1、非人灵长类C_H1、鼠C_H1结构域等。

在一些情况下，C_H1结构域包含与SEQ ID NO:27所示的C_H1氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:27

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK

本公开的自身免疫B细胞消除剂包括IgG抗体轻链恒定域(C_L)。

抗体C_L结构域可以是两种明显不同的类型中的任何一种，即κ和λ。本公开的自身免疫B细胞消除剂的IgG抗体轻链恒定域(C_L)可以是人C_L、非人灵长类C_L、鼠C_L多肽等。

在一些情况下，C_L结构域包含与SEQ ID NO:28所示的人C_L氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:28

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

本公开的自身免疫B细胞消除剂包含IgG抗体Fc结构域(Fc)。IgG抗体Fc结构域可以是人Fc、非人灵长类Fc、鼠Fc多肽等。Fc结构域可以是人IgG1 Fc、人IgG2 Fc、人IgG3 Fc、人IgG4 Fc等。

在一些情况下，Fc结构域包含与SEQ ID NO:29所示的IgG1 Fc序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些情况下，Fc结构域包含与SEQ ID NO:30所示的IgG2 Fc序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

Fc结构域包含与SEQ ID NO:31所示的IgG3 Fc序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

Fc结构域包含与SEQ ID NO:32所示的IgG4 Fc序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:29

KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:30

TVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:31

RVELKTPLGDTTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:32

RVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

通过IgG Fc异二聚化生成自身免疫B细胞消除剂

本公开的自身免疫B细胞消除剂的IgG Fc结构域，可包含促进具有不对称构型的自身免疫B细胞消除剂生成的F405L和K409R(EU编号)突变。

F405L和K409R(EU编号)突变促进在称为F_ab臂交换的过程中生成具有不对称构型的自身免疫B细胞消除剂(Labrijn,Meesters et al.2014)。F_ab臂交换反应是C_H3结构域的二硫键异构化反应和解离-缔合的结果。首先，产生了本文公开的两种亲本Fc融合蛋白：一种具有自身免疫B细胞消除剂的一个IgG臂的同二聚化，所述自身免疫B细胞消除剂具有不对称构型的并带有F405L Fc突变；以及一种具有自身免疫B细胞消除剂的另一个IgG臂的同二聚化，所述自身免疫B细胞消除剂具有不对称构型的并带有K409R Fc突变。亲本自身免疫B细胞消除剂铰链区的重链二硫键被还原，并且亲本自身免疫B细胞消除剂的重链被分离。F405L和K409R突变相对于重链的同二聚化更偏好于异二聚化。因此，亲本自身免疫B细胞消除剂之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本自身免疫B细胞消除剂的半胱氨酸残基形成重链间二硫键。所得产物是异二聚自身免疫B细胞消除剂，其中一半来自一种亲本自身免疫B细胞消除剂，另一半来自另一种亲本自身免疫B细胞消除剂(图6)。通过设计合适的亲本自身免疫B细胞消除剂，可以生成具有不对称构型的自身免疫B细胞消除剂。

本公开的自身免疫B细胞消除剂上的F405L和K409R突变，可以在人Fc、非人灵长类Fc、鼠Fc结构域等上进行工程改造。本公开的自身免疫B细胞消除剂上的F405L和K409R突变，可以在人IgG1 Fc、人IgG2 Fc、人IgG3 Fc、人IgG4 Fc等上进行工程改造。

在一些情况下，具有F405L突变的Fc结构域包含与SEQ ID NO:33所示的具有F405L突变的IgG1 Fc具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些情况下，具有K409R突变的Fc结构域包含与SEQ ID NO:34所示的具有K409R突变的IgG1 Fc具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:33

KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:34

KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

本公开的具有不对称构型的自身免疫B细胞消除剂，可以通过促进Fc异二聚化的其他Fc突变和工程化过程产生，包括但不限于杵入臼(Knob-in-Hole)和静电匹配相互作用。

在杵入臼策略中(参见，例如，国际公开WO 2006/028936，其以引用方式并入)中，形成人IgG中C_H3结构域界面的选择的氨基酸，可以在影响C_H3结构域相互作用的位置突变以促进异二聚体形成。具有小侧链(臼)的氨基酸被引入一个Fc结构域，而具有大侧链(杵)的氨基酸被引入具有不对称构型的自身免疫B细胞消除剂的另一个Fc域。两条重链共表达后，由于带有“臼”的重链与带有“杵”的重链优先相互作用，形成异二聚体。形成杵和臼的示例性C_H3替换对包括：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。

在静电匹配相互作用策略中，如US 2010/0015133 A1、US 2009/0182127 A1、US2010/028637 A1或US 2011/0123532 A1中所述，可以设计突变以在一个C_H3表面产生带正电荷的残基，并在第二个C_H3表面产生带负电荷的残基。重链的异二聚化可以通过两个突变的Fc之间的静电匹配相互作用形成。

通过Fc突变的自身免疫B细胞消除剂的多聚化

本公开的自身免疫B细胞消除剂的IgG Fc结构域，可包含在与自身免疫B细胞、T细胞或NK细胞相互作用时促进自身免疫B细胞消除剂的多聚化的突变，尽管这种工程化的自身免疫B细胞消除剂在溶液中作为单体存在。通过在T细胞或NK细胞表面形成自身免疫B细胞消除剂的多聚体，多个自身免疫B细胞消除剂复合物可以协同激活T细胞或NK细胞。此外，许多属于肿瘤坏死因子超家族的共刺激性分子，如4-1BB配体、OX40配体、CD27配体和GITR配体，通过促进同源肿瘤坏死因子受体的聚集和激活，以多聚体发挥它们的T细胞共刺激活性。多聚自身免疫B细胞消除剂，可以促进激活T细胞所需的TNF家族的多个共刺激性分子的聚集。

促进本公开的自身免疫B细胞消除剂多聚化的Fc突变，包括但不限于如描述于Diebolder,Beurskens et al.2014中的E345R突变、E430G突变、E345R/E430G突变、E345R/E430G/Y440R突变。此类突变还可包括但不限于描述于Zhang,Armstrong et al.2017中的T437R突变、T437R/K248E突变、T437R/K338A突变。

可在人Fc、非人灵长类Fc、鼠Fc结构域等上，工程改造促进本公开的自身免疫B细胞消除剂多聚化的Fc突变。

可在人IgG1 Fc、人IgG2 Fc、人IgG3 Fc、人IgG4 Fc等上，工程改造促进本公开的自身免疫B细胞消除剂多聚化的Fc突变。

在一些情况下，具有E345R突变的Fc结构域包含与如SEQ ID NO:35所示的具有E345R突变的IgG1 Fc具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些情况下，具有T437R/K248E突变的Fc结构域包含与如SEQ ID NO:36所示的具有T437R/K248E突变的IgG1 Fc具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:35

KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:36

KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPEDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYRQKSLSLSPGK

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂可包含促进自身免疫B细胞消除剂的异二聚化和多聚化的Fc突变。此类突变包括但不限于：E345R/F405L、E345R/K409R、E430G/F405L、E430G/K409R、E345R/E430G/F405L、E345R/E430G/K409R、E345R/E430G/Y440R/F405L、E345R/E430G/Y440R/K409R、T437R/F405L、T437R/K409R、T437R/K248E/F405L、T437R/K248E/K409R、T437R/K338A/F405L、T437R/K338A/K409R。

可以在人IgG1 Fc、人IgG2 Fc、人IgG3 Fc、人IgG4 Fc等上，工程改造此类突变。

在一些情况下，具有E345R/F405L突变的Fc结构域包含与SEQ ID NO:37所示的具有E345R/F405L突变的IgG1 Fc具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些情况下，具有E345R/K409R突变的Fc结构域包含与SEQ ID NO:38所示的具有E345R/K409R突变的IgG1 Fc具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:37

KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:38

KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRRPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

通过Fc工程改造生成自身免疫B细胞消除剂

本公开的自身免疫B细胞消除剂的IgG Fc结构域，任选地可以包含与亲本野生型抗原特异性T细胞调节剂相比，促进自身免疫B细胞消除剂的半衰期延长的Fc突变，包括但不限于选自M252Y/S254T/T256E、M428L/N434S、T250Q/M428L、N434A和T307A/E380A/N434A的任何一组突变，根据EU索引进行残基编号。参见美国专利US6,277,375(通过引用并入)。

本公开的自身免疫B细胞消除剂上的此类突变，可以在人Fc、非人灵长类Fc、鼠Fc结构域等上进行工程改造。本公开的自身免疫B细胞消除剂上的此类突变，可在人IgG1 Fc、人IgG2 Fc、人IgG3 Fc、人IgG4 Fc等上进行工程改造。

本公开的自身免疫B细胞消除剂的IgG Fc结构域，任选地可以包含促进增强对蛋白酶的蛋白水解降解的抗性的Fc突变，所述蛋白酶在自身免疫B细胞消除剂的残基222-237之间或残基222-237处切割野生型自身免疫B细胞消除剂(EU编号)，所述突变包括但不限于与亲本野生型自身免疫B细胞消除剂相比，具有G236缺失的E233P/L234V/L235A突变，根据EU索引进行残基编号。参见WO2012687746A1；US9611328B2，两者均通过引用并入)。

本公开的自身免疫B细胞消除剂上的此类突变，可以在人Fc、非人灵长类Fc、鼠Fc结构域等上进行工程改造。本公开的自身免疫B细胞消除剂上的此类突变，可在人IgG1 Fc、人IgG2 Fc、人IgG3 Fc、人IgG4 Fc等上进行工程改造。

本公开的自身免疫B细胞消除剂的IgG Fc结构域，任选地可以包含Fc突变，与具有野生型Fc结构域的含Fc分子相比，该Fc突变允许降低对至少一种Fcγ受体(FcγR)的亲和力。该Fc可包含具有突变V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S的突变的IgG2恒定区的抗体Fc结构域，其中根据EU编号系统进行残基编号。该Fc还可包含：含有突变L234A、L235A、G237A、P238A、H268A、A330S和P331S的突变的IgG1恒定域；或含有突变S228P、F234A、L235A、G237A、P238A和任选的G236缺失的突变的IgG4恒定域，其中结合分子可以结合靶分子而不触发显著的靶标的补体依赖性裂解或细胞介导的破坏。参见美国专利US8,961,967；Tam et al.2017，两者均通过引用并入。

免疫调节结构域

本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域，可以是激活性免疫调节结构域，或抑制性免疫调节结构域。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂包括单个免疫调节结构域。在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂包括两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8个或更多个)免疫调节结构域。在一些情况下，两个或更多个免疫调节结构域在多肽链中串联。在一些情况下，两个或更多个免疫调节结构域在分别的多肽链中。在一些情况下，这两种免疫调节多肽在分别的多肽链中并且彼此以二硫键连接。

本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域，在一些情况下是T细胞调节因子(Chen and Flies 2013)。在一些情况下，T细胞调节结构域是一种刺激性(激活性)T细胞调节因子。在一些情况下，T细胞调节结构域是抑制性T细胞调节因子。

本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域，在一些情况下是NK细胞调节因子。在一些情况下，NK细胞调节结构域是一种刺激性(激活性)NK细胞调节因子。在一些情况下，NK细胞调节结构域是抑制性NK细胞调节因子。

免疫调节结构域可以是抗体、肽配体、T细胞或NK细胞共刺激性多肽、细胞因子或毒素。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是基于抗体或非基于抗体的识别部分，其特异性结合在T细胞或NK细胞表面表达的共刺激性肽。基于抗体的识别部分包括：例如抗体；保留与抗原(包括但不限于：Fab、Fv、单链Fv(scFv)和Fd片段)特异性结合的抗体片段；嵌合抗体；人源化抗体；单链抗体(scAb)、单结构域抗体(dAb)；单结构域重链抗体；单结构域轻链抗体等。

合适的非基于抗体的识别部分包括：例如亲和体；工程化Kunitz结构域；单体(adnectin)；抗凝素；适体；设计的锚蛋白重复结构域(DARPin)；富含半胱氨酸多肽(例如，富含半胱氨酸的扭结菌素肽(knottin peptide))的结合位点；高亲和性多聚体(avimer)；afflin等。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是T细胞共刺激性多肽。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是T细胞共刺激性多肽，并且是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员；例如，FasL多肽、41BBL多肽、CD40多肽、OX40L多肽、CD30L多肽、CD70多肽等。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是T细胞共刺激性多肽并且是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员；例如，CD7多肽、CD86多肽、ICAM多肽等。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是T细胞共刺激性多肽，并且是单体。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是T细胞共刺激性多肽，并且是单链二聚体、三聚体或多聚体。

在某些实施方案中，本公开的自身免疫B细胞消除剂的合适免疫调节结构域，包括但不限于：CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、ICAM、PD-L1、FasL和PD-L2。

在某些实施方案中，本公开的自身免疫B细胞消除剂的合适的免疫调节结构域，包括例如CD7、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4和HVEM。

在某些实施方案中，本公开的自身免疫B细胞消除剂的合适免疫调节结构域，包括PD-L1肽、PD-L1的Ig可变结构域、4-1BBL、B7-1/CD80W88A(小鼠)或W84A(人)突变、或抗CD28单链Fv。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是PD-L1多肽。在一些情况下，本公开的多聚多肽的PD-L1多肽包含与SEQ ID NO:39所示的PD-L1氨基酸序列的氨基酸19-290具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:39

FTVTVPKDLYVVYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是4-1BBL多肽。在一些情况下，本公开的多聚多肽的4-1BBL多肽包含与SEQ ID NO:40所示的4-1BBL氨基酸序列的氨基酸50-254具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:40

ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是ICOS-L多肽。在一些情况下，本公开的多聚多肽的ICOS-L多肽包含与SEQ ID NO:41所示的ICOS-L氨基酸序列的氨基酸19-302具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:41

DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNLTVGSQTGNDIGERDKITENPVSTGEKNAATWSILAVLCLLVVVAVAIGWVCRDRCLQHSYAGAWAVSPETELTGHV

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是OX40L多肽。在一些情况下，本公开的多聚多肽的OX40L多肽包含与SEQ ID NO:42所示的OX40L氨基酸序列的氨基酸1-183具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:42

MERVQPLEENVGNAARPRFERNKLLLVASVIQGLGLLLCFTYICLHFSALQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是PD-L2多肽。在一些情况下，本公开的多聚多肽的PD-L2多肽包含与SEQ ID NO:43所示的PD-L2氨基酸序列的氨基酸20-273具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:43

LFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPTWLLHIFIPFCIIAFIFIATVIALRKQLCQKLYSSKDTTKRPVTTTKREVNSAI

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是CD80(B7-1)多肽。在一些情况下，本公开的多聚多肽的CD80多肽包含与SEQ ID NO:44所示的CD80氨基酸序列的氨基酸35-288具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:44

VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFWNTTKQEHFPDNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是CD86多肽。在一些情况下，本公开的多聚多肽的CD86多肽包含与SEQ ID NO:45所示的CD86氨基酸序列的氨基酸31-329具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:45

YFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是FasL多肽。在一些情况下，本公开的多聚多肽的Fas多肽包含与SEQ ID NO:46所示的FasL氨基酸序列的氨基酸1-281具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:46

MQQPFNYPYPQIYWVDSSASSPWAPPGTVLPCPTSVPRRPGQRRPPPPPPPPPLPPPPPPPPLPPLPLPPLKKRGNHSTGLCLLVMFFMVLVALVGLGLGMFQLFHLQKELAELRESTSQMHTASSLEKQIGHPSPPPEKKELRKVAHLTGKSNSRSMPLEWEDTYGIVLLSGVKYKKGGLVINETGLYFVYSKVYFRGQSCNNLPLSHKVYMRNSKYPQDLVMMEGKMMSYCTTGQMWARSSYLGAVFNLTSADHLYVNVSELSLVNFEESQTFFGLYKL

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是IL-2多肽。在一些情况下，本公开的多聚多肽的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:47所示的IL-2氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:47

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是IL-7多肽。在一些情况下，本公开的多聚多肽的IL-7多肽包含与SEQ ID NO:48所示的IL-7氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:48

DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是CCL19多肽。在一些情况下，本公开的多聚多肽的CCL19多肽包含与SEQ ID NO:49所示的CCL19氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:49

GTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是TGFβII型受体胞外域(TGFβRII)多肽。在一些情况下，本公开的多聚多肽的TGFβRII多肽包含与SEQ IDNO:50所示的TGFβRII氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:50

GIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是抗-PD1抗体的单链Fv多肽。在一些情况下，本公开的多聚多肽的抗-PD1抗体的单链Fv多肽包含与SEQID NO:51或SEQ ID NO:52所示的抗-PD1抗体的单链Fv多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:51

QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO:52

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是配体或多肽刺激性或阻断性NK细胞表面受体。通过免疫调节结构域来刺激激活受体或阻断NK细胞激活的抑制性受体，自身免疫B细胞消除剂可以促进NK细胞的激活和增殖，以消除自身免疫B细胞消除剂接合的自身免疫B细胞。多肽刺激或阻断的NK细胞表面标志物可以是单链单体、二聚体、三聚体或多聚体。

在某些实施方案中，本公开的自身免疫B细胞消除剂的合适的免疫调节结构域包括刺激NK细胞激活和增殖的细胞因子，其包括但不限于IL-2和IL-15。

在某些实施方案中，本公开的自身免疫B细胞消除剂的合适免疫调节结构域包括阻断NK细胞的抑制性受体的配体或多肽，其包括但不限于杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是IL15。在一些情况下，本公开的IL15包含与SEQ ID NO:53所示的IL15氨基酸序列的氨基酸49-162具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:53

NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域是可以阻断抑制性受体KIR的抗-KIR抗体的单链Fv多肽。在一些情况下，本公开的多聚多肽的抗-KIR抗体的单链Fv多肽包含与SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:55所示的抗-KIR抗体的单链Fv多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:54

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSFYAISWVRQAPGQGLEWMGGFIPIFGAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSYYYDYDMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO:55

EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSFYAISWVRQAPGQGLEWMGGFIPIFGAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSYYYDYDMDVWGQGTTVTVSS

前导序列

在某些实施方案中，选择前导肽以驱动将主题自身免疫B细胞消除剂分泌到细胞培养物上清液中作为分泌蛋白。可以使用任何已知分泌蛋白/肽的任何前导肽。

如本文所用，“前导肽”或“信号肽”或“前导序列”包括长度通常为16-30个氨基酸的短肽，其存在于大多数通往分泌途径的新合成蛋白质的N末端。尽管先导肽在序列上极其异质，并且许多原核生物和真核生物的先导肽即使在不同物种之间在功能上也可以互换，但蛋白质分泌的效率可由先导肽/信号肽的序列决定。

在某些实施方案中，前导肽来自存在于某些细胞器(如内质网、高尔基体或核内体)内、从细胞分泌或插入到大多数细胞膜中的蛋白质。

在某些实施方案中，前导肽来自真核蛋白质。

在某些实施方案中，前导肽来自分泌的蛋白质，例如，细胞外分泌的蛋白质。

在某些实施方案中，前导肽来自跨膜蛋白。

在某些实施方案中，前导肽包含一段被信号肽酶识别和切割的氨基酸。

在某些实施方案中，前导肽不包含信号肽酶的切割识别序列。

在某些实施方案中，前导肽是组织纤溶酶原激活剂(tPA)、单纯疱疹病毒糖蛋白D(HSV gD)、生长激素、细胞因子、脂蛋白输出信号、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BB或GM-CSFR、或酿酒酵母(S.cerevisiae)粘合因子α-1信号肽。

在一些实施方案中，本文所述的前导序列可以是哺乳动物CD4或CD8前导序列，包括但不限于：例如人CD4或CD8前导序列、非人灵长类CD4或CD8前导序列、啮齿动物CD4或CD8前导序列等。在一些实施方案中，CD4或CD8前导序列包含与人CD4或CD8前导序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少有95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，选择β-2-微球蛋白前导肽作为主题自身免疫B细胞消除剂的前导肽，以驱动自身免疫B细胞消除剂分泌到细胞培养物上清液中。

另外的多肽

自身免疫B细胞消除剂的多肽链，可以包括一种或多种除上述那些之外的多肽。合适的另外的多肽包括表位标签和亲和结构域。一种或多种另外的多肽可以包括在自身免疫B细胞消除剂的N末端、C末端或内部。

合适的表位标签包括但不限于：血凝素(HA；例如，YPYDVPDYA)；FLAG(例如，DYKDDDDK)；c-myc(例如，EQKLISEEDL)等。

亲和结构域包括可与结合伴侣相互作用的肽序列，例如，固定在固相载体上的结合伴侣，可用于鉴定或纯化。编码多个连续单一氨基酸(如组氨酸)的DNA序列，当与表达的蛋白质融合时，可以通过与树脂柱(如镍琼脂糖凝胶)的高亲和力结合来一步纯化重组蛋白质。示例性亲和结构域包括：His5(HHHHH)、HisX6(HHHHHH)、C-myc(EQKLISEEDL)、Flag(DYKDDDDK)、StrepTag(WSHPQFEK)、血凝素，例如HA标签(YPYDVPDYA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白、纤维素结合结构域、RYIRS、Phe-His-His-Thr、几丁质结合结构域、S-肽、T7肽、SH2结构域、C端RNA标签、WEAAAREACCRECCARA、金属结合结构域，例如锌结合结构域或钙结合结构域，诸如来自钙结合蛋白的那些，例如钙调蛋白、肌钙蛋白C、钙调磷酸酶B、肌球蛋白轻链、恢复蛋白、S-调控蛋白、视锥蛋白、VILIP、神经钙蛋白、海马钙蛋白、频蛋白(frequenin)、钙牵蛋白、钙蛋白酶大亚基、S100蛋白、小清蛋白、钙结合蛋白D9K、钙结合蛋白D28K和钙视网膜蛋白、内含肽、生物素、链霉亲和素、MyoD、Id、亮氨酸拉链序列和麦芽糖结合蛋白。

自身免疫B细胞消除剂可以包括一个或多个与自身免疫B细胞消除剂共价连接的非多肽部分。合适的非多肽部分包括：例如生物相容性脂肪酸及其衍生物；羟基烷基淀粉(HAS)，例如羟基乙基淀粉(HES)；聚乙二醇；透明质酸(HA)；肝素前体(heparosan)聚合物(HEP)；基于磷酸胆碱的聚合物；葡聚糖；聚唾液酸(PSA)等。在一些情况下，与不包含非多肽部分的对照自身免疫B细胞消除剂相比，非多肽部分增加了自身免疫B细胞消除剂的体内半衰期。

在一些情况下，自身免疫B细胞消除剂包括可检测标志物。合适的可检测标志物包括：放射性同位素，如¹²³I(碘)、¹⁸F(氟)、⁹⁹Tc(锝)、(铟)、₆₇Ga(镓)、放射性Gd同位素(¹⁵³Gd)；造影剂，如钆(Gd)、镝和铁；生成可检测产物的酶(例如，萤光素酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)；荧光蛋白；显色蛋白、染料(例如异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白等)；发出荧光的金属，例如¹⁵²Eu或其他镧系元素；化学发光化合物，例如鲁米诺、异鲁米诺、吖啶盐等；生物发光化合物等。

T细胞调节

根据本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域的性质，自身免疫B细胞消除剂可以激活或抑制靶T细胞。“靶T细胞”包括CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞。在一些情况下，靶CD4⁺T细胞是辅助T细胞(例如Th1、Th2或Th17细胞)。在一些情况下，靶CD4⁺T细胞是CD4^-/CD25⁺/FoxP3⁺调节性T(Treg)细胞。在一些情况下，靶T细胞是CD8⁺T细胞，并且是细胞毒性T细胞。在一些情况下，靶T细胞是记忆T细胞，可以是CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞，其中记忆T细胞通常是CD45RO⁺。在一些情况下，靶T细胞是NK-T细胞。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂增强T细胞归巢和运输。例如，在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶T细胞接触时增加靶T细胞向治疗部位的外渗。在一些情况下，与未与自身免疫B细胞消除剂接触的靶T细胞的外渗水平相比，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶标T细胞接触时，使靶T细胞向治疗部位的外渗增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或超过100倍。增加的外渗可以增加治疗部位的T细胞数量。在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶T细胞接触时增加治疗部位的T细胞数量

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂增加一种或多种介导或调节由靶T细胞进行的淋巴细胞运输的蛋白质的靶T细胞中表达。例如，在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶T细胞接触时，增加靶T细胞中一种或多种粘附分子和/或趋化因子受体分子的水平。例如，在一些情况下，与未与自身免疫B细胞消除剂接触的靶T细胞产生的粘附分子和/或趋化因子受体分子的水平相比，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶T细胞接触时，使靶T细胞中一种或多种粘附分子和/或趋化因子受体分子的表达增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或超过100倍。粘附分子的实例包括由CD8T细胞产生的粘附分子，其中此类粘附分子的实例包括但不限于CD44、LFA-1和VLA-4。趋化因子受体的实例包括由CD8T细胞产生的趋化因子受体，其中此类趋化因子受体的实例包括但不限于CCR5、CCR7和CXCR3。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂导致记忆T细胞的生成，所述记忆T细胞能够针对先前经历的表位进行快速细胞毒性应答。例如，在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶T细胞接触时，导致生成包含0.5％或更多抗原特异性T细胞库的记忆T细胞。例如，在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶T细胞接触时，导致产生包含0.5％或更多、1％或更多、2％或更多、3％或更多、4％或更多、5％或更多、10％或更多、15％或更多、或20％或更多的抗原特异性T细胞库的记忆T细胞。记忆T细胞的细胞表面标志物的一个实例是CD45RO。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂增加靶T细胞的增殖。例如，在一些情况下，与未与自身免疫B细胞消除剂接触的靶T细胞的增殖相比，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶T细胞接触时，使靶T细胞增殖增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或超过100倍。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂增加T细胞对靶细胞的细胞毒活性。例如，在一些情况下，与T细胞对未与自身免疫B细胞消除剂接触的靶细胞的细胞毒活性相比，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶标T细胞接触时，使T细胞对靶细胞的细胞毒活性提高至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或超过100倍。T细胞的靶标包括识别自身免疫B细胞消除剂的自身抗原的自身免疫B细胞。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂增加靶T细胞产生的细胞因子。例如，在一些情况下，与未与自身免疫B细胞消除剂接触的靶T细胞产生的细胞因子水平相比，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶T细胞接触时，使T细胞产生的细胞因子增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少5倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或超过100倍。细胞因子的实例包括：Th1细胞产生的细胞因子，例如IL-2、IFN-γ和TNF-α；Th17细胞产生的细胞因子，例如IL-17、IL-21和IL-22；Treg细胞产生的细胞因子，例如TGF-β、IL-35和IL-10。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂抑制靶T细胞产生的细胞因子。例如，在一些情况下，与未与自身免疫B细胞消除剂接触的靶T细胞产生的细胞因子水平相比，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶T细胞接触时，抑制靶T细胞产生的细胞因子至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％、或超过90％。细胞因子的实例包括Th2细胞产生的细胞因子，例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。

NK细胞调节

根据本公开的自身免疫B细胞消除剂的免疫调节结构域的性质，自身免疫B细胞消除剂可以激活或抑制靶NK细胞。NK细胞是一类淋巴细胞，其通常约占人类淋巴细胞的10％。NK细胞的主要功能是提供针对肿瘤和受感染(靶)细胞的先天细胞免疫应答。NK细胞的特点是具有CD3-/CD56+表型，显示多种激活和抑制细胞表面受体。使激活NK细胞受体与靶细胞上相应配体结合连接，会触发NK细胞直接对靶细胞发挥细胞毒作用并分泌多种细胞因子，所述细胞因子执行诸如刺激和招募免疫系统的其他元件以对抗靶标的功能。激活的NK细胞通过分泌穿孔素酶和颗粒酶、刺激细胞凋亡启动受体和其他不太明确的机制来裂解靶细胞。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂增强NK细胞运输。例如，在某些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶NK细胞接触时，增加靶NK细胞向治疗部位的外渗。在一些情况下，与未与自身免疫B细胞消除剂接触的靶NK细胞的外渗水平相比，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶NK细胞接触时，使靶NK细胞向治疗部位的外渗增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少高20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或超过100倍。增加的外渗可以增加治疗部位的NK细胞数量。在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶NK细胞接触时，增加治疗部位的NK细胞数量。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂增加靶NK细胞的增殖。例如，在一些情况下，与未与自身免疫B细胞消除剂接触的靶NK细胞的增殖相比，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶NK细胞接触时，使靶NK细胞的增殖增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或超过100倍。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂增加靶NK细胞的细胞因子产生。例如，在一些情况下，与未与自身免疫B细胞消除剂接触的靶NK细胞产生的细胞因子水平相比，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶NK细胞接触时，使NK细胞的细胞因子产生增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少5倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或超过100倍。细胞因子的实例包括炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-10。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂刺激靶NK细胞与凋亡受体配体的结合。例如，在一些情况下，与未与自身免疫B细胞消除剂接触的靶NK细胞与受体配体结合的水平相比，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶NK细胞接触时，使NK细胞与凋亡受体配体的结合增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少5倍、至少15倍、至少20倍、至少至少25倍、至少50倍、至少100倍或超过100倍。凋亡受体配体的实例包括肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体和Fas配体。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂增强靶NK细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。例如，在一些情况下，与未与自身免疫B细胞消除剂接触的靶NK细胞产生的ADCC活性相比，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶NK细胞接触时，使靶NK细胞的ADCC增强至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％、或超过90％。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂增加靶NK细胞释放的细胞质颗粒毒素。例如，在一些情况下，与未与自身免疫B细胞消除剂接触的靶NK细胞释放的细胞质颗粒毒素相比，本公开的自身免疫B细胞消除剂在与靶NK细胞接触时，使NK细胞释放的细胞质颗粒毒素增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％，至少75％、至少2倍、至少5倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或超过100倍。细胞质颗粒毒素的实例包括穿孔素、颗粒酶A、颗粒酶B和颗粒溶素。

核酸

提供了编码本文所述的任何重组多肽的核酸。在一个实施方案中，核酸是DNA。在一个实施方案中，核酸是cDNA。在一个实施方案中，核酸是RNA。在一个实施方案中，核酸是mRNA。

在一个实施方案中，重组核酸是载体。在一个实施方案中，载体是病毒载体。在一个实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。

本公开提供了包含编码本公开的自身免疫B细胞消除剂的核苷酸序列的核酸。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的单独多肽链在单独的核酸中编码。

在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的所有多肽链都编码在单个核酸中。

在一些情况下，编码本公开的多聚多肽的单独多肽链的核苷酸序列可操作地连接至转录控制元件，例如启动子(如在真核细胞中有功能的启动子)，其中启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。

在一些情况下，转录控制元件是在真核细胞中有功能的启动子。

在一些情况下，编码本公开的自身免疫B细胞消除剂的第一多肽和第二多肽的核苷酸序列，包括插入在编码第一多肽的核苷酸序列和编码第二多肽的核苷酸序列之间的蛋白水解可切割接头。

在一些情况下，编码本公开的自身免疫B细胞消除剂的第一多肽和第二多肽的核苷酸序列，包括插入在编码第一多肽的核苷酸序列和编码第二个多肽的核苷酸序列之间的内部核糖体进入位点(IRES)。

在一些情况下，编码本公开的自身免疫B细胞消除剂的第一多肽和第二多肽的核苷酸序列，包括插入在编码第一多肽的核苷酸序列和编码第二个多肽的核苷酸序列之间的核糖体跳跃信号(或顺式作用水解酶元件，CHYSEL)。

本文描述了核酸的实例，其中在编码本公开的自身免疫B细胞消除剂的第一多肽和第二多肽的核苷酸序列之间，提供了蛋白水解可切割接头。

在这些实施方案的任一个中，可以使用IRES或核糖体跳跃信号代替编码蛋白水解可切割接头的核苷酸序列。

在一些情况下，第一核酸(例如，重组表达载体、mRNA、病毒RNA等)包含编码本公开的自身免疫B细胞消除剂的第一多肽链的核苷酸序列；且第二核酸(例如，重组表达载体、mRNA、病毒RNA等)包含编码本公开的自身免疫B细胞消除剂的第二多肽链的核苷酸序列。

在一些情况下，编码第一多肽的核苷酸序列和编码第二多肽的第二核苷酸序列，各自可操作地连接至转录控制元件，例如启动子(如在真核细胞中有功能的启动子)，其中启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。

重组表达载体

本公开提供了包含本公开的核酸的重组表达载体。在一些情况下，重组表达载体是非病毒载体。在一些实施方案中，重组表达载体是病毒构建体，例如重组腺相关病毒构建体(参见例如美国专利US7,078,387，通过引用并入本文)、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体、重组逆转录病毒构建体、非整合病毒载体等。

合适的表达载体包括但不限于：病毒载体(例如，基于痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒的病毒载体(参见，例如，Li et al.,Invest Opthalmol Vis Sci35:2543 2549,1994；Borras et al.,Gene Ther 6:515-524,1999；Li and Davidson,PNAS 92:7700-7704,1995；Sakamoto et al.,H Gene Ther 5:1088-1097,1999；WO 94/12649；WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984以及WO 95/00655，均通过引用并入本文)；腺相关病毒(参见，例如，Ali et al.,Hum Gene Ther 9:81-86,1998,Flannery et al.,PNAS 94:6916-6921,1997；Bennett et al.,Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857-2863,1997；Jomary et al.,Gene Ther 4:683-690,1997；Rolling et al.,Hum Gene Ther 10:641-648,1999；Ali et al.,Hum Mol Genet 5:591-594,1996；Srivastava in WO 93/09239,Samulski et al.,J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson et al.,Virol.(1988)166:154-165；以及Flotte et al.,PNAS(1993)90:10613-10617，均通过引用并入本文)；SV40；单纯疱疹病毒；人类免疫缺陷病毒(参见，例如，Miyoshi et al.,PNAS94:10319-23,1997；Takahashi et al.,J Virol 73:7812-7816,1999，均通过引用并入本文)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾脏坏死病毒和源自逆转录病毒(如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)的载体)等。

许多合适的表达载体是本领域技术人员已知的，并且许多是可商购的。以下载体是作为实例提供的；对于真核宿主细胞：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(法玛西亚公司)。然而，可以使用任何其他载体，只要它与宿主细胞相容。

根据所使用的宿主/载体系统，可以在表达载体中使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种，包括：组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等(参见，例如，Bitter et al.(1987)Methods in Enzymology153:516-544)。

在一些实施方案中，编码靶向DNA的RNA和/或定点修饰多肽的核苷酸序列可操作地连接至控制元件，例如转录控制元件(如启动子)。转录控制元件可以在真核细胞(例如哺乳动物细胞)；或原核细胞(例如细菌或古细菌细胞)中起作用。在一些实施方案中，编码靶向DNA的RNA和/或定点修饰多肽的核苷酸序列与多个控制元件可操作地连接，所述控制元件允许编码靶向DNA的RNA和/或定点修饰多肽的核苷酸序列在原核和真核细胞中表达。

合适的真核启动子(在真核细胞中有功能的启动子)的非限制性实例，包括来自即刻早期巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)和小鼠金属硫蛋白-I的那些。选择合适的载体和启动子，完全在本领域普通技术人员的水平之内。表达载体还可包含用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可包括用于扩增表达的适当序列。

遗传修饰的宿主细胞

提供了用编码本文所述的任何重组多肽的核酸转化的细胞。

可以用编码任何重组多肽的核酸转化的细胞的实例包括：分离的哺乳动物细胞(包括但不限于人胚肾(HEK)、中国仓鼠卵巢(CHO)、NS0(鼠骨髓瘤)细胞、人羊膜细胞(CAP、CAP-T))；酵母细胞(包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris))；植物细胞(包括但不限于烟草NT1、BY-2)；昆虫细胞(包括但不限于SF9、S2、SF21、Tni(例如High 5))；或细菌细胞(包括但不限于大肠杆菌(E.coli))。

本公开提供了一种遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是用本公开的核酸进行遗传修饰的。

合适的宿主细胞包括真核细胞，如酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在一些情况下，宿主细胞是哺乳动物细胞系的细胞。合适的哺乳动物细胞系包括：人细胞系、非人灵长类动物细胞系、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞系等。

合适的哺乳动物细胞系包括但不限于：HeLa细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)No.CCL-2)、CHO细胞(例如，ATCC No.CRL9618、CCL61、CRL9096)、293细胞(例如ATCCNo.CRL-1573)、Vero细胞、NIH3T3细胞(例如，ATCC No.CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC No.CCL10)、PC12细胞(ATCC No.CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCCNo.CRL1651)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC No.CCLI.3)、人胚肾(HEK)细胞(ATCCNo.CRL1573)、HLHepG2细胞等。

产生多聚多肽的方法

本公开提供了产生本公开的多聚多肽的方法。

所述方法通常包括在培养基中培养宿主细胞，所述宿主细胞用包含编码自身免疫B细胞消除剂的核苷酸序列的重组表达载体进行遗传修饰；并且从遗传修饰的宿主细胞和/或培养基中分离所述自身免疫B细胞消除剂。

用包含编码自身免疫B细胞消除剂的核苷酸序列的重组表达载体进行遗传修饰的宿主细胞也称为“表达宿主”。

如上所述，在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的单独多肽链，在单独的重组表达载体中编码。在一些情况下，本公开的自身免疫B细胞消除剂的所有多肽链在单个重组表达载体中编码。

可以使用蛋白质纯化的标准方法，从表达宿主细胞(例如，从表达宿主细胞的裂解物)和/或培养宿主细胞的培养基中分离自身免疫B细胞消除剂。

例如，可以制备表达宿主的裂解物，并且使用高效液相色谱(HPLC)、排阻色谱、凝胶电泳、亲和色谱或其他纯化技术来纯化该裂解物。

或者，当自身免疫B细胞消除剂从表达宿主细胞分泌到培养基中时，可以使用HPLC、排阻色谱、凝胶电泳、亲和色谱或其他纯化技术，从培养基中纯化自身免疫B细胞消除剂。

在一些情况下，例如，当自身免疫B细胞消除剂包含亲和标签时，可以使用亲和标签的固定化结合伴侣来纯化自身免疫B细胞消除剂。

组合物

除了本公开的自身免疫B细胞消除剂之外，本公开的组合物可包含以下的一种或多种：盐，例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等；缓冲剂，例如Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等；增溶剂；去污剂，例如非离子去污剂如Tween-20等；蛋白酶抑制剂；甘油等。

组合物可包含药学上可接受的赋形剂，其中多种是本领域已知的，并且不需要在本文中详细讨论。药学上可接受的赋形剂已在多种出版物中得到充分描述，包括例如“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”,第19版(1995),或更新的版本,Mack Publishing Co；A.Gennaro(2000)“Remington:The Science and Practice ofPharmacy”,第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel et al.,第7版,Lippincott,Williams,&Wilkins；以及Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe et al.,eds.,第3版.Amer.Pharmaceutical Assoc。

药物组合物可包含本公开的自身免疫B细胞消除剂和药学上可接受的赋形剂。在一些情况下，主题药物组合物将适合施用于受试者，例如，将是无菌的。例如，在一些实施方案中，主题药物组合物将适合施用于人类受试者，例如，其中组合物是无菌的，并且不含可检测的热原和/或其他毒素。

组合物可以包括水溶液、粉末形式、颗粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊剂、悬浮剂、喷雾剂等。组合物可以根据各种给药途径进行配制。

当本公开的多聚多肽作为可注射形式(例如，经皮下、腹膜内和/或静脉内)直接施用到组织中时，制剂可以作为即用剂型，或作为非水性形式(例如，可重构的储存稳定粉末)或水性形式(如由药学上可接受的载体和赋形剂组成的液体)提供。还可以提供含蛋白质的制剂，以提高施用后主题蛋白质的血清半衰期。例如，蛋白质可以制备成胶体在脂质体制剂中提供，或使用延长血清半衰期的其他常规技术提供。有多种方法可用于制备脂质体，如描述于例如Soak et al.1980Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467，美国专利US4,235,871、US4,501,728和US4,837,028(均通过引用并入)。制剂也可以以控释或缓释形式提供。

适用于肠胃外施用的制剂的其他实例包括：等渗无菌注射液、抗氧化剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。例如，主题药物组合物可以存在于容器中，例如无菌容器(如注射器)。制剂可以存在于单位剂量或多剂量的密封容器中(如安瓿和小瓶)，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需在紧邻使用前添加无菌液体赋形剂，例如注射用水。可从无菌粉末、颗粒剂和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。

本公开的自身免疫B细胞消除剂在制剂中的浓度可以广泛变化(例如，按重量计，从小于约0.1％、通常为或至少约2％至多达20％至50％或更多)，通常主要根据液体体积、粘度和基于患者的因素按照选择的特定施用模式和患者的需要进行选择。

在一些情况下，所使用的组合物将包含按重量计至少80％、至少约85％、至少约95％或至少约99.5％的所需产物(例如，如本文公开的自身免疫B细胞消除剂)，与产品制备及其纯化方法相关的污染物有关。百分比可以基于总蛋白质。

本公开提供了包含本公开的组合物(例如液体组合物)的容器。容器可以是例如注射器、安瓿等。在一些情况下，容器是无菌的。在一些情况下，容器和组合物都是无菌的。

制剂

合适的制剂如上所述，其中合适的制剂包括药学上可接受的赋形剂。

在一些情况下，合适的制剂包含：a)本公开的自身免疫B细胞消除剂；以及b)药学上可接受的赋形剂。

在一些情况下，合适的制剂包含：a)包含编码本公开的自身免疫B细胞消除剂的核苷酸序列的核酸；以及b)药学上可接受的赋形剂；在一些情况下，核酸是mRNA。

在一些情况下，合适的制剂包含：a)包含编码本公开的自身免疫B细胞消除剂的第一多肽的核苷酸序列的第一核酸；b)包含编码本公开的自身免疫B细胞消除剂的第二多肽的核苷酸序列的第二核酸；以及c)药学上可接受的赋形剂。

在一些情况下，合适的制剂包含：a)包含编码本公开的自身免疫B细胞消除剂的核苷酸序列的重组表达载体；以及b)药学上可接受的赋形剂。

合适的药学上可接受的赋形剂如上所述。

适合治疗的受试者

适合用本公开的方法治疗的受试者包括患有自身免疫病的个体，其包括：已被诊断为患有自身免疫病的个体，以及已经对自身免疫病治疗但未能对该治疗做出反应的个体。

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，本文描述的或通过引用并入的各种元素的所有组合均在本公开的范围内。

从下面的实验细节将更好地理解本公开。然而，本领域技术人员将容易理解，所讨论的具体方法和结果仅仅是对本公开的说明，如在所附权利要求中更充分地描述的。

实施例

提供以下实施例以更详细地描述本公开。它们旨在说明而非限制本公开。

实施例1：自身免疫B细胞消除剂的设计

自身免疫B细胞消除剂包含表2中列出的双特异性Fc融合蛋白。DSG3EC1至EC4胞外域用作自身抗原，并且源自抗-CD3抗体的ScFv用于接合T细胞。作为T细胞刺激剂的IL2，任选地在Fc融合多肽的C末端进行工程改造。DSG3或ScFv和Fc之间的接头序列是IEGRMD，并且Fc和IL2之间的接头序列是GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。F405L突变被工程化到具有ScFv的Fc融合蛋白的Fc中，其中ScFv针对CD3具有结合特异性。将409R突变工程化到具有DSG3自身抗原的Fc融合蛋白的Fc中。

将自身免疫B细胞消除剂构建体克隆到哺乳动物表达载体中，其中自身免疫B细胞消除剂的表达处于CMV启动子的控制之下。表2列出了设计的自身免疫B细胞消除剂的DSG3-Fc链和抗-CD3ScFv Fc链的多肽序列的SEQ ID NOs。

表2

SEQ ID NO:56

粗体：DSG3胞外域EC1至EC4

斜体：具有F405L突变的IgG1 Fc

粗斜体：IL2

SEQ ID NO:57

粗体：DSG3胞外域EC1至EC4

斜体：具有F405L突变的IgG1 Fc

SEQ ID NO:58

粗体：抗-CD3ScFv

斜体：具有K409R突变的IgG1 Fc

SEQ ID NO:59

粗体：抗-NKG2A ScFv

斜体：具有K409R突变的IgG1 Fc

实施例2：自身免疫B细胞消除剂的生成

作为双特异性Fc融合蛋白的自身免疫B细胞消除剂由两种亲本Fc融合蛋白生成：一种Fc融合蛋白具有对CD3具有结合特异性的ScFv，另一种Fc融合蛋白具有DSG3自身抗原。受控的Fab臂交换将用于从其亲本Fc融合蛋白生成自身免疫B细胞消除剂。

按照转染试剂盒说明书(Thermo Scientific)将表达两种亲本Fc融合蛋白的构建体转染到Expi293细胞中。转染后五天将细胞离心，上清液通过0.2μm过滤器。通过亲和色谱在蛋白A琼脂糖柱(GE Healthcare Life Sciences)上进行亲本Fc融合蛋白纯化。纯化的Fc融合蛋白通过透析缓冲液交换到DPBS，pH7.2；通过280nm处的紫外吸光度确定蛋白质浓度。

作为概念验证研究，具有DSG3EC1结构域(DSG3EC1)、EC2结构域(DSG3EC2)、EC1至EC4结构域(DSG3EC1-EC4)和EC1至EC2结构域(DSG3EC1-EC2)的Fc融合蛋白被表达。还原条件下的SDS-PAGE分析揭示了这些具有预期分子量的Fc融合蛋白的稳健表达(图7)。初步基于ELISA的结合测定表明，抗-DSG3自身抗体PVB28可识别具有DSG3EC1至EC4的Fc融合蛋白。此外，也表达了具有抗-CD3抗体(抗-CD3ScFv)、抗-CD3抗体(抗-CD3)和在轻链C末端连接有IL2的抗-CD3抗体(抗-CD3_IL2)的ScFv的Fc融合蛋白。还原条件下的SDS-PAGE分析揭示了这些抗CD3分子的稳健表达(图7)。初步基于ELISA的结合测定表明，这些抗-CD3分子可以结合包被的重组CD3。

对于受控的Fab臂交换，将等摩尔量的两种亲本Fc融合蛋白混合在一起，并在75mM2-巯基乙胺(2-MEA)存在下还原5小时。用DPBS透析反应混合物，以允许双特异性自身免疫B细胞消除剂形成。

双特异性自身免疫B细胞消除剂的形成，可以通过亲本Fc融合蛋白和双特异性自身免疫B细胞消除剂的SDS-PAGE分析来评价。在还原条件下，自身免疫B细胞消除剂显示两个蛋白质条带，其大小与对应于每个亲本Fc融合蛋白的蛋白质条带相同。在非还原条件下，自身免疫B细胞消除剂作为单个蛋白质条带迁移，其大小与两个亲本Fc融合蛋白的平均大小相同。

自身免疫B细胞消除剂的形成也将通过ELISA测定来评价。在该测定中，将人CD3包被在板上，然后加入自身免疫B细胞消除剂。洗涤非特异性结合后，通过小鼠抗-DSG3抗体，随后是HRP-缀合的抗-小鼠二抗检测自身免疫B细胞消除剂中DSG3的存在。对于自身免疫B细胞消除剂，将观察到显著的ELISA结合信号，而在添加了两种亲本Fc融合蛋白的情况下，未检测到ELISA信号。该数据表明，形成了能够与CD3和DSG3自身反应性抗体接合的自身免疫B细胞消除剂。

自身免疫B细胞消除剂的形成也可以通过分析型HPLC来评价。自身免疫B细胞消除剂在两个亲本Fc融合蛋白之间作为一个条带迁移。从峰下面积判断，可以估计，90％的亲本Fc融合蛋白通过Fab臂交换反应形成了自身免疫B细胞消除剂。

实施例3:CD8+T细胞特异性识别的自身免疫B细胞消除剂

自身免疫B细胞消除剂通过识别CD3的ScFv与重组CD3的结合，将通过ELISA测定来评价。将重组人CD3包被在ELISA板上，然后加入自身免疫B细胞消除剂。洗涤非特异性结合后，将通过HRP-缀合的抗-人IgG二抗来检测自身免疫B细胞消除剂的存在。

自身免疫B细胞消除剂通过识别CD3的ScFv与表达在CD8+T细胞表面的CD3的结合，将通过流式细胞术测定来评价。自身免疫B细胞消除剂将与从供体PBMC分离的CD8+T细胞一起孵育。自身免疫B细胞消除剂与T细胞的结合，将通过荧光缀合的抗-人IgG二抗进行检测。

实施例4：自身免疫B细胞特异性识别的自身免疫B细胞消除剂

自身免疫B细胞消除剂通过DSG3自身抗原与自身免疫抗体的结合，将通过ELISA测定来评价。针对DSG3的小鼠自身免疫抗体包被在ELISA板上，然后加入自身免疫B细胞消除剂。洗涤非特异性结合后，将通过HRP缀合的抗人IgG二抗来检测自身免疫B细胞消除剂的存在。

自身免疫B细胞消除剂通过DSG3自身抗原与表达在细胞表面的抗DSG3B细胞受体的结合，将通过流式细胞术测定来评价。将表达小鼠抗-人DSG3自身抗体的重链和轻链以及CD79a和CD79b辅助受体的构建体转染到K562细胞中，以创建在细胞表面表达重组抗-DSG3B细胞受体的合成B细胞。自身免疫B细胞消除剂将与合成B细胞一起孵育。自身免疫B细胞消除剂与抗-DSG3BCR的结合，将通过荧光缀合的抗-人IgG二抗进行检测。

实施例5：自身免疫B细胞消除剂对CD8+T细胞激活的激动活性

将开发几种基于T细胞的测定，以评价自身免疫B细胞消除剂是否可以调节CD8+T细胞的激活和增殖。在一种测定形式中，将重组抗-DSG3自身抗体包被在细胞板上。加入自体免疫B细胞消除剂和从供体PBMC分离的CD8+T细胞，并孵育5天。由自身免疫B细胞消除剂介导的T细胞激活，将通过对激活的T细胞所释放的细胞因子(如IFNγ和TNFα)的定量来评价。

在另一种测定形式中，将表达抗-人DSG3自身抗体的重链和轻链的构建体连同CD79a和CD79b辅助受体转染到K562细胞中，以创建在细胞表面表达重组抗-DSG3B细胞受体的合成B细胞。此类合成B细胞将与CD8+T细胞以及自身免疫B细胞消除剂一起培养5天。由自身免疫B细胞消除剂介导的T细胞激活，将通过对激活的T细胞所释放的细胞因子(如IFNγ和TNFα)的定量来评价。

不同T细胞共刺激剂在促进自身免疫B细胞消除剂介导的T细胞激活中的作用，将通过上述测定来评价。将递增数量的具有不同T细胞共刺激剂的自身免疫B细胞消除剂添加到测定中，并评价和比较这些自身免疫B细胞消除剂在驱动T细胞激活方面的效力和功效。除了单一类型的共刺激剂，在相同的自身免疫B细胞消除剂上工程化改造的不同共刺激剂的组合，也可以评价其潜在的协同作用。

实施例6：自身免疫B细胞消除剂介导的CD8+T细胞对自身免疫B细胞的细胞毒性

自身免疫B细胞消除剂介导的CD8+T细胞对抗-DSG3自身免疫B细胞的杀伤，将在细胞毒性测定中评价。在该测定中，将表达抗-人DSG3自身抗体的重链和轻链的构建体以及CD79a和CD79b辅助受体转染到K562细胞中，以创建在细胞表面表达重组抗-DSG3B细胞受体的合成B细胞。此类合成B细胞将被荧光染料标记，并与CD8+T细胞以及自身免疫B细胞消除剂一起培养。T细胞对荧光标记的靶细胞的消除，将通过流式细胞术测定进行评价。此外，CD107a T细胞激活标志物表达的诱导以及细胞毒性，也将通过流式细胞术测定进行评价。

不同T细胞共刺激剂在促进自身免疫B细胞消除剂介导的细胞毒性方面的作用，将通过相同的测定进行评价。将数量递增的具有不同T细胞共刺激剂的自身免疫B细胞消除剂添加到测定中，并评价和比较这些自身免疫B细胞消除剂在驱动T细胞介导的细胞毒性方面的效力和功效。除了单一类型的共刺激剂，在相同的自身免疫B细胞消除剂上工程化改造的不同共刺激剂的组合，也可以评价其潜在的协同作用。

实施例7：自身免疫B细胞消除剂在小鼠中的体内活性

为了评价自身免疫B细胞消除剂的体内细胞毒性活性，将创建替代性自身免疫B细胞消除剂，其中在分子上工程化改造识别小鼠CD3的ScFv以替代识别人CD3的ScFv。NSG(NOD-scid-γ)小鼠将被注射表达抗-人DSG3抗体的生物发光杂交瘤的多克隆混合物，然后注射替代性自身免疫B细胞消除剂。将评估替代性自身免疫B细胞消除剂介导的小鼠CD8+T细胞对抗-DSG3杂交瘤细胞的杀伤。

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本文引用的所有参考文献，包括这些参考文献/出版物的全部公开内容，以及本文提及的所有专利、专利申请出版物和书籍，均通过引用整体并入本主题申请。

序列表

<110> 拓创生物科技（苏州）有限公司

<120> 自身免疫B细胞消除剂分子及其用途

<130> TPE01672

<160> 59

<170> PatentIn 版本3.5

<210> 1

<211> 956

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 1

Glu Trp Val Lys Phe Ala Lys Pro Cys Arg Glu Gly Glu Asp Asn Ser

1 5 10 15

Lys Arg Asn Pro Ile Ala Lys Ile Thr Ser Asp Tyr Gln Ala Thr Gln

20 25 30

Lys Ile Thr Tyr Arg Ile Ser Gly Val Gly Ile Asp Gln Pro Pro Phe

35 40 45

Gly Ile Phe Val Val Asp Lys Asn Thr Gly Asp Ile Asn Ile Thr Ala

50 55 60

Ile Val Asp Arg Glu Glu Thr Pro Ser Phe Leu Ile Thr Cys Arg Ala

65 70 75 80

Leu Asn Ala Gln Gly Leu Asp Val Glu Lys Pro Leu Ile Leu Thr Val

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Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 11

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1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

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Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

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Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn

100 105

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<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

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Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 13

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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 14

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Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 15

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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser

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<213> 人工序列

<220>

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<400> 16

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu

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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

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Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe

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Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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<210> 21

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

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245

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<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 22

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100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln

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180 185 190

Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu

195 200 205

Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp

210 215 220

Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 23

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Ser Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Val Ile Asp Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 24

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Glu Thr Leu Val His Ser

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65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala

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100 105 110

<210> 25

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 25

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asn Gly Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

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Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Met Ser Lys Asn Gln Phe

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Cys Ala Arg Asp Gly Ala Ala Gly Leu Tyr Leu Glu Lys Trp Gly Gln

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<210> 26

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 26

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gly Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Gly Leu Leu Ile

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 27

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 28

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

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65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 29

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

65 70 75 80

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 30

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 30

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

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Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

20 25 30

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

35 40 45

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

50 55 60

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

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Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

85 90 95

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

100 105 110

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

115 120 125

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

130 135 140

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

145 150 155 160

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

165 170 175

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

180 185 190

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 31

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 31

Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro

1 5 10 15

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

20 25 30

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

35 40 45

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

50 55 60

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

65 70 75 80

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

85 90 95

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

100 105 110

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

115 120 125

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

130 135 140

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

145 150 155 160

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

165 170 175

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

180 185 190

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

195 200 205

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

210 215 220

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230 235

<210> 32

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 32

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

1 5 10 15

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

35 40 45

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

50 55 60

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

65 70 75 80

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

85 90 95

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

100 105 110

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

115 120 125

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

130 135 140

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

145 150 155 160

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

165 170 175

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

180 185 190

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

195 200 205

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

225 230

<210> 33

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 33

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

1 5 10 15

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

35 40 45

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

50 55 60

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

65 70 75 80

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

85 90 95

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

100 105 110

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

115 120 125

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130 135 140

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

165 170 175

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu

180 185 190

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

195 200 205

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

210 215 220

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 34

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 34

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

35 40 45

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

50 55 60

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

65 70 75 80

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

100 105 110

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

115 120 125

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

130 135 140

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

165 170 175

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

180 185 190

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

195 200 205

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

210 215 220

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 35

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 35

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

1 5 10 15

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

35 40 45

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

50 55 60

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

65 70 75 80

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

100 105 110

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

115 120 125

Gln Pro Arg Arg Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

165 170 175

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

180 185 190

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

195 200 205

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

210 215 220

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 36

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 36

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

1 5 10 15

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Glu Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

35 40 45

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

50 55 60

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

65 70 75 80

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

115 120 125

Gln Pro Arg Arg Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

165 170 175

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

180 185 190

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

195 200 205

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Arg

210 215 220

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 37

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 37

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

1 5 10 15

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

35 40 45

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

50 55 60

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

65 70 75 80

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

115 120 125

Gln Pro Arg Arg Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

165 170 175

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu

180 185 190

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

195 200 205

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

210 215 220

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 38

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 38

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

1 5 10 15

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

35 40 45

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

50 55 60

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

65 70 75 80

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

100 105 110

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

115 120 125

Gln Pro Arg Arg Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

130 135 140

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

165 170 175

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu

180 185 190

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

195 200 205

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

210 215 220

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 39

<211> 271

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 39

Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Tyr Gly Ser Asn

1 5 10 15

Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu Ala

20 25 30

Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln Phe

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Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg Gln

50 55 60

Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala Leu

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Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys Met

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Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val Asn

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Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser

165 170 175

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210 215 220

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Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys Gly Ile Gln

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<210> 40

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 40

Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala

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Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro

50 55 60

Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp

65 70 75 80

Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe

85 90 95

Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val

100 105 110

Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala

115 120 125

Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg

130 135 140

Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly

145 150 155 160

Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala

165 170 175

Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr

180 185 190

Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

195 200 205

<210> 41

<211> 284

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 41

Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val

20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His

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Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn

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Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val

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115 120 125

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130 135 140

Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp Asn Ser

145 150 155 160

Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg

165 170 175

Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr Pro Ser

180 185 190

Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln Asn Leu

195 200 205

Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile

210 215 220

Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr Trp Ser

225 230 235 240

Ile Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala Ile Gly

245 250 255

Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gln His Ser Tyr Ala Gly Ala Trp

260 265 270

Ala Val Ser Pro Glu Thr Glu Leu Thr Gly His Val

275 280

<210> 42

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 42

Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg

1 5 10 15

Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln

20 25 30

Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser

35 40 45

Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val

50 55 60

Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln

65 70 75 80

Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn

85 90 95

Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu

100 105 110

Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln

115 120 125

Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr

130 135 140

Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu

145 150 155 160

Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn

165 170 175

Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu

180

<210> 43

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 43

Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile Glu His Gly

1 5 10 15

Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser His Val Asn

20 25 30

Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn Asp Thr Ser

35 40 45

Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu Pro Leu Gly

50 55 60

Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp Glu Gly Gln

65 70 75 80

Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr Lys Tyr Leu

85 90 95

Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr His Ile Leu

100 105 110

Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln Ala Thr Gly

115 120 125

Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val Pro Ala Asn

130 135 140

Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val Thr Ser Val

145 150 155 160

Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys Val Phe Trp

165 170 175

Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Asp Leu Gln Ser

180 185 190

Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro Thr Trp Leu Leu His Ile Phe Ile

195 200 205

Pro Phe Cys Ile Ile Ala Phe Ile Phe Ile Ala Thr Val Ile Ala Leu

210 215 220

Arg Lys Gln Leu Cys Gln Lys Leu Tyr Ser Ser Lys Asp Thr Thr Lys

225 230 235 240

Arg Pro Val Thr Thr Thr Lys Arg Glu Val Asn Ser Ala Ile

245 250

<210> 44

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 44

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Leu

195 200 205

Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val

210 215 220

Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg

225 230 235 240

Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val

245 250

<210> 45

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 45

Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln

1 5 10 15

Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn

20 25 30

Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val

35 40 45

His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr

50 55 60

Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys

65 70 75 80

Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met

85 90 95

Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val

100 105 110

Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser

115 120 125

Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg

130 135 140

Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln

145 150 155 160

Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser

165 170 175

Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr

180 185 190

Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp

195 200 205

Pro Gln Pro Pro Pro Asp His Ile Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro

210 215 220

Thr Val Ile Ile Cys Val Met Val Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp

225 230 235 240

Lys Lys Lys Lys Arg Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr

245 250 255

Met Glu Arg Glu Glu Ser Glu Gln Thr Lys Lys Arg Glu Lys Ile His

260 265 270

Ile Pro Glu Arg Ser Asp Glu Ala Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys

275 280 285

Thr Ser Ser Cys Asp Lys Ser Asp Thr Cys Phe

290 295

<210> 46

<211> 281

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 46

Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp

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Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys

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Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro

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Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro

50 55 60

Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly

65 70 75 80

Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly

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Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala

100 105 110

Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu

115 120 125

Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg

130 135 140

Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu

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Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr

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Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr

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Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser

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His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met

210 215 220

Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala

225 230 235 240

Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His

245 250 255

Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser

260 265 270

Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

275 280

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 47

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

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Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe

65 70 75 80

Asp Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu

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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 48

Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu

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Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser

20 25 30

Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp

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Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg

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Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu

65 70 75 80

Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val

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Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser

100 105 110

Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 49

Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro

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Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp

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Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 50

Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val

1 5 10 15

Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys

20 25 30

Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn

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Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala

50 55 60

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65 70 75 80

Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser

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Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe

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Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser

115 120 125

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130 135

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 51

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

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Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

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Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala

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<213> 人工序列

<220>

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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu

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Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys

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Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg

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Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp

165 170 175

Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

180 185 190

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195 200 205

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225 230 235

<210> 53

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 53

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1 5 10 15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 54

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr

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Gly Gly Phe Ile Pro Ile Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

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65 70 75 80

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100 105 110

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln

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Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 55

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

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65 70 75 80

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln

115 120 125

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Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg

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Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Phe Ile Pro Ile

165 170 175

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Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 56

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 56

Glu Trp Val Lys Phe Ala Lys Pro Cys Arg Glu Gly Glu Asp Asn Ser

1 5 10 15

Lys Arg Asn Pro Ile Ala Lys Ile Thr Ser Asp Tyr Gln Ala Thr Gln

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Lys Ile Thr Tyr Arg Ile Ser Gly Val Gly Ile Asp Gln Pro Pro Phe

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<210> 57

<211> 687

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 57

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245 250 255

Phe Phe Thr Ser Gly Asn Glu Gly Asn Trp Phe Glu Ile Gln Thr Asp

260 265 270

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275 280 285

Glu Gln Leu Gln Ser Val Lys Leu Ser Ile Ala Val Lys Asn Lys Ala

290 295 300

Glu Phe His Gln Ser Val Ile Ser Arg Tyr Arg Val Gln Ser Thr Pro

305 310 315 320

Val Thr Ile Gln Val Ile Asn Val Arg Glu Gly Ile Ala Phe Arg Pro

325 330 335

Ala Ser Lys Thr Phe Thr Val Gln Lys Gly Ile Ser Ser Lys Lys Leu

340 345 350

Val Asp Tyr Ile Leu Gly Thr Tyr Gln Ala Ile Asp Glu Asp Thr Asn

355 360 365

Lys Ala Ala Ser Asn Val Lys Tyr Val Met Gly Arg Asn Asp Gly Gly

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530 535 540

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<210> 58

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 58

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130 135 140

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser

145 150 155 160

Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

165 170 175

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro

180 185 190

Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

210 215 220

Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn

225 230 235 240

Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

245 250 255

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

260 265 270

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

275 280 285

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

290 295 300

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

305 310 315 320

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

325 330 335

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

340 345 350

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

355 360 365

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

370 375 380

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

385 390 395 400

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

405 410 415

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

420 425 430

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

435 440 445

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

450 455 460

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 59

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的

<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

130 135 140

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

145 150 155 160

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr

165 170 175

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Lys

180 185 190

Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

195 200 205

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

210 215 220

Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gly

225 230 235 240

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser

245 250 255

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

260 265 270

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

275 280 285

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

290 295 300

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

305 310 315 320

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

325 330 335

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

340 345 350

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

355 360 365

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

370 375 380

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

385 390 395 400

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

405 410 415

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

420 425 430

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

435 440 445

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

450 455 460

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

465 470 475 480

Ser Pro Gly Lys

Claims (43)

1.一种自身免疫B细胞消除剂，其包含：

A)第一多肽，其在N末端到C末端的方向上包含：

I)针对自身免疫B细胞的自身抗原；和

II)第一Ig Fc多肽；

B)第二多肽，其在N末端到C末端的方向上包含：

I)对T细胞表面标志物或NK细胞表面标志物具有结合特异性的免疫球蛋白(Ig)Fv；和

II)第二Ig Fc多肽；

C)一个或多个免疫调节结构域；

其中所述一个或多个免疫调节结构域融合至所述第一多肽或第二多肽或两者的C末端。

2.根据权利要求1所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述自身免疫B细胞消除剂能够使T细胞或NK细胞与对自身抗原具有结合特异性的自身免疫B细胞接合并激活T细胞或NK细胞，并进一步消除至少一些自身免疫B细胞。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述针对自身免疫B细胞的自身抗原是桥粒芯蛋白3(DSG3)胞外域。

4.根据权利要求3所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述DSG3自身抗原包含与SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求3-4中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述DSG3自身抗原包含SEQ ID NO:5至8中任一个所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1-2中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述Ig Fv包含V_H和V_L作为单链Fv(ScFv)。

7.根据权利要求1-2中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述Ig Fv包含两种多肽，所述多肽包含：

a)重链多肽，其在N末端到C末端的方向上包含V_H和C_H1；

b)轻链多肽，其在N末端到C末端的方向上包含V_L和C_L。

8.根据权利要求1-2中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述Ig是IgG，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。

9.根据权利要求1-2中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述T细胞表面标志物是CD3。

10.根据权利要求9所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述T细胞表面标志物CD3包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少85％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

11.根据权利要求1-2中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述NK细胞表面标志物是NKG2A。

12.根据权利要求11所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述NK细胞表面标志物NKG2A包含与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少85％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

13.根据权利要求1-2中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述对T细胞表面标志物具有结合特异性的Ig Fv是对CD3具有结合特异性的Ig Fv。

14.根据权利要求13所述的自身免疫B细胞消除剂，其中对CD3具有结合特异性的Ig Fv的V_H和V_L分别包含与SEQ ID NO:10所示的IgV_H氨基酸序列和与SEQ ID NO:11所示的Ig V_L氨基酸序列具有至少85％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

15.根据权利要求1-2中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述对NK细胞表面标志物具有结合特异性的Ig Fv是对NKG2A具有结合特异性的Ig Fv。

16.根据权利要求15所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述对NKG2A具有结合特异性的Ig Fv的V_H和V_L分别包含与SEQ ID NO:17所示的Ig V_H氨基酸序列和与SEQ ID NO:18所示的Ig V_L氨基酸序列具有至少85％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述Fc多肽是IgG1Fc多肽、IgG2 Fc多肽、IgG3 Fc多肽或IgG4 Fc多肽。

18.根据权利要求17所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述Fc多肽包含与SEQ ID NO:29至32所示的任一氨基酸序列具有至少85％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述Fc多肽包含与没有所述突变的亲本Fc融合蛋白相比能够促进重链异二聚化的突变，包括F405L突变或K409R突变，根据EU索引进行残基编号。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述Fc多肽包含与没有所述突变的亲本Fc融合蛋白相比增强基于Ig的融合蛋白的多聚化的突变，包括E345R突变，任选地还包含E430G突变、S440Y突变或E430G/S440Y突变，根据EU索引进行残基编号。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述Fc多肽包含与没有所述突变的亲本Fc融合蛋白相比增强基于Ig的融合蛋白的多聚化的突变，包括T437R突变，任选地还包含K248E突变，根据EU索引进行残基编号。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其还包含插入在所述Fc多肽和所述免疫调节结构域之间的接头。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述免疫调节结构域选自：IL-2多肽、IL-7多肽、CCL19多肽、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽、PD-L1多肽、FasL多肽和PD-L2多肽。

24.根据权利要求1-22中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述免疫调节结构域选自：源自抗-PD1抗体的ScFv、源自抗-TGFβII抗体的ScFv和TGFβII受体。

25.根据权利要求23或24所述的自身免疫B细胞消除剂，其中所述免疫调节结构域是单体、单链二聚体、单链三聚体或单链多聚体。

26.根据权利要求1-25中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其包含串联的2个或更多个免疫调节结构域。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其包含非共价结合的不同多肽。

28.根据权利要求1-26中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂，其包含共价连接的不同多肽。

29.一种产生具有针对自身免疫B细胞的自身抗原的第一多肽和具有对T细胞或NK调用表面标志物有结合特异性的Fv的第二多肽作为亲本Fc融合蛋白的方法，其包括在表达亲本Fc融合蛋白的条件下，培养包含编码权利要求1-28中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂的核酸的宿主细胞，并分离所述Fc融合蛋白。

30.一种从两个亲本Fc融合蛋白生成权利要求1-28中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂的方法，其包括使用受控的Fab臂交换或其他类似方法修饰所述两个亲本Fc融合蛋白。

31.一种药物组合物，其包含权利要求1-28中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂和药学上可接受的载体。

32.一种包含编码权利要求1-31中任一项所述的第一多肽的核苷酸序列的核酸，其以N末端到C末端的顺序包含：

a)前导肽；

b)针对自身免疫B细胞的自身抗原；

c)Ig Fc多肽；和

f)任选的免疫调节结构域。

33.一种包含编码权利要求1-31中任一项所述的第二多肽的核苷酸序列的核酸，其以N末端到C末端的顺序包含：

a)前导肽；

b)对T细胞表面标志物或NK细胞表面标志物具有结合特异性的免疫球蛋白(Ig)Fv；

c)Ig Fc多肽；和

f)任选的免疫调节结构域。

34.根据权利要求32-33中任一项所述的核酸，其中所述前导肽是CD4前导肽。

35.根据权利要求32-33中任一项所述的核酸，其中所述核苷酸序列与转录控制元件可操作地连接。

36.根据权利要求35所述的核酸，其中所述转录控制元件是在真核细胞中有功能的启动子。

37.一种包含权利要求32-36种任一项所述的核酸的重组表达载体。

38.根据权利要求37所述的重组表达载体，其中所述载体是病毒载体或非病毒载体。

39.一种用权利要求37或38所述的重组表达载体遗传修饰的宿主细胞。

40.一种使T细胞或NK细胞与自身免疫B细胞接合并激活T细胞或NK细胞，并且进一步消除此类自身免疫B细胞的方法，其中所述自身免疫B细胞对权利要求1-28中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂上的自身抗原具有结合特异性。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述接合是在体外的。

42.根据权利要求40所述的方法，其中所述接合是在体内的。

43.一种选择性消除个体的自身免疫B细胞的方法，所述方法包括向个体施用有效量的权利要求1-28和31中任一项所述的自身免疫B细胞消除剂。

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