CN115721768A - 一种抗炎丝素蛋白膜的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗炎丝素蛋白膜制备方法，通过超速离心法制备生姜外泌体，再生丝素蛋白由桑蚕丝脱胶，溶解，透析，冻干制备，溶解到六氟异丙醇中，两者进行混合后，进行静电纺丝，得到抗炎丝素蛋白膜，生姜外泌体，与丝素蛋白溶液进行静电纺丝制备成膜结合到一起，可用于皮肤伤口抗菌抗炎加快愈合。本发明的优点在于丝素纤维具有光滑、轻盈、透气、保湿、生物相容性好、可降解等特点，比纱布的性能更好。生姜外泌体具有抗菌抗炎作用，对伤口微生物和炎症有抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗炎丝素蛋白膜的制备方法及其产品和应用，与丝素蛋白溶液进行静电纺丝制备成膜结合到一起，可用于皮肤伤口抗菌抗炎加快愈合材料的制备。
背景技术
皮肤是人体中重要的组织器官，主要由表皮和真皮组成，皮肤组织的多层次结构决定了皮肤损伤的修复过程是十分复杂的。它保护身体免受外源性化学和物理因素的影响，参与代谢过程，是抵御病原微生物的第一道防线，并参与免疫过程。慢性伤口是由细菌感染引起的，为了缓解这个问题，需要使用具有抗菌抗炎特性的包扎材料。
生姜属姜科姜属植物，含挥发油、姜辣素、黄酮类等成分，具有抗炎、抗肿瘤、促消化等作用。丝素纤维具有光滑、轻盈、透气、保湿、生物相容性好、可降解等特点，从家蚕茧中提取的丝素蛋白具有良好的生物相容性、良好的力学性能、可调节的降解性和药物稳定性等特点，具有重要的应用价值。丝素蛋白具有良好的成膜性，成膜大小与厚薄易于调控。丝素蛋白膜极易赫附在创面上，具有高吸水性，可替代皮肤作为屏障预防切口感染。通过控制丝素膜微孔的大小，在利于水蒸气透过的同时也能防止细菌进人。Enomoto等发现，丝素蛋白纤维的极限拉伸强度>320 MPa，断裂应变>20%，具有非常好的强度和韧性。丝素蛋白符合作为皮肤支架材料所需的高拉伸性，可防止切口收缩期间破裂，同时保持了支架结构的完整性，保证了支架对创面的屏障功能。静电纺丝技术设计和构筑生物功能材料，以模拟细胞外基质的结构特征，从而可促进细胞生长和营养物质输送。静电纺丝技术已成为制造生物功能材料的有力工具，并可应用于组织工程、伤口愈合、药物/生物活性分子传递、诊断和仿生制造等领域。
电纺纳米纤维作为药物输送平台具有多种优点，包括高比表面积、基于聚合物选择的可接受的机械性能、高加工性以及表面修饰的可能性。Hashimoto等发现与传统的胶原蛋自材料相比，静电纺丝素蛋自纤维材料可促进人的表皮角质细胞中肉芽蛋自基因(修复生长因子)较高的表达，说明丝素蛋自材料能诱导上皮化和创伤修复。
发明内容
本发明目的在于提供一种抗炎丝素蛋白膜的制备方法。
本发明的再一目的在于：提供一种上述方法制备的抗炎丝素蛋白膜产品。
本发明的又一目的在于：提供一种上述产品的应用。
本发明目的通过下述方案实现：一种抗炎丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于通过超速离心法制备生姜外泌体，再生丝素蛋白由桑蚕丝脱胶，溶解，透析，冻干制备，溶解到六氟异丙醇中，两者进行混合后，进行静电纺丝，得到抗炎丝素蛋白膜，包括以下步骤：
（1）将粗滤过的生姜汁在 4℃下以 10,000 g 离心 1 小时，取上清液重复 2-3次，再用 100,000 g 离心 80 分钟，之后又进行超速离心浓缩并与 60% 碘乙醇按不同比例混合，最后在4℃下，以 40,000 rpm 转速超离心形成了平衡密度梯度，进而收集分析；
（2）将桑蚕丝按1∶100的浴比在 0.5% Na2CO3 溶液中煮沸脱胶1次，1 h；用去离子水清洗净后，在烘箱中（60℃）干燥制备完全脱胶桑蚕丝；将完全脱胶桑蚕丝按1∶1 0的 浴比 分 别 在 CaCl2-H2O-C2H5OH（摩尔比为1∶8∶2）的温度（80±2）℃三元混合溶液体系中充分溶解；将所得溶液分装于透析袋（截留分子量10 kD）在蒸馏水中充分透析（时间3天，蒸馏水8 h更换一次）制得再生桑蚕丝素蛋白溶液，将得到的溶液在-80℃冻干；
（3）制备的1 g丝素蛋白溶解在9 g六氟异丙醇中，超声30 min，进行静电纺丝，纺丝时喷丝头采用20号针头，注射流量为0.2 mL/h，喷头与接收板距离13 cm，静电电压20kV，温度60℃，用将生姜外泌体涂覆的铝箔作为接收器。
所述的生姜外泌体制备方法，为超速离心法。
步骤（1）所述粗滤过的生姜汁离心速度在10,000 g-15,000之间。
步骤（3）所述的丝素蛋白和六氟异丙醇的比例应该在1:4-1:19之间。
步骤（3）所述的温度在25℃到60℃之间。
步骤（3）所述的静电电压10-40 kV之间。
本发明提供一种抗炎丝素蛋白膜，其特征在于根据上述任一所述方法制备得到。
本发明提供一种抗炎丝素蛋白膜在制备皮肤伤口抗菌抗炎加快愈合材料中的应用。
本发明的优点在于：
（1）丝素纤维具有光滑、轻盈、透气、保湿、生物相容性好、可降解等特点，比纱布的性能更好；
（2）生姜外泌体具有抗菌抗炎作用，对伤口微生物和炎症有抑制作用。
附图说明
附图1是实施例1所制备的纤维蛋白膜的扫描电镜成像图；
附图2是实施例1所制备的纤维蛋白膜与成纤维细胞孵育后的白介素分泌图。
具体实施方式
以下实施例以发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于下述的实施例。
实施例1
一种抗炎丝素蛋白膜，通过超速离心法制备生姜外泌体，再生丝素蛋白由桑蚕丝脱胶、溶解、透析、冻干制备，两者溶解到六氟异丙醇中进行混合后，进行静电纺丝，得到抗炎丝素蛋白膜，按以下步骤制备：
（1）将粗滤过的生姜汁在 4℃下以 10,000g离心1小时，取上清液重复 2-3 次，再用 100,000 g 离心80分钟，之后又进行超速离心浓缩并与 60%碘乙醇按不同比例混合，最后在4℃下，以40,000 rpm 转速超离心形成了平衡密度梯度，进而收集分析，得到生姜外泌体；
（2）将桑蚕丝按1∶100的浴比在 0.5% Na2CO3 溶液中煮沸脱胶1次，1 h；用去离子水清洗净后，在烘箱中60℃干燥制备完全脱胶桑蚕丝；将完全脱胶桑蚕丝按1∶10的浴比分别在摩尔比为1∶8∶2的CaCl2-H2O-C2H5OH三元混合溶液体系中充分溶解，温度为80±2℃；将所得溶液分装于透析袋，截留分子量10 kD，在蒸馏水中充分透析3天，蒸馏水8 h更换一次；制得再生桑蚕丝素蛋白溶液，将得到的溶液在-80℃冻干，得到丝素蛋白冻干粉；
（3）制备的1 g丝素蛋白溶解在9 g六氟异丙醇中，超声30 min，进行静电纺丝，纺丝时喷丝头采用20号针头，注射流量为0.2 mL/h，喷头与接收板距离13 cm，静电电压20kV，温度40℃，用将生姜外泌体涂覆的铝箔作为接收器，得到抗炎丝素蛋白膜。
所制备的纤维蛋白膜的扫描电镜成像图见图1。
所制备的纤维蛋白膜与成纤维细胞孵育后的白介素分泌图见图2所示，说明在制备皮肤伤口抗菌抗炎加快愈合材料中的应用中具有优异效果。
实施例2
一种抗炎丝素蛋白膜，步骤（2）和（3）与实施例1中的相应步骤相同，按以下步骤制备：
（1）将粗滤过的生姜汁在 4℃下以 12,000g离心1小时，取上清液重复 2-3 次，再用 100,000 g 离心 80 分钟，之后又进行超速离心浓缩并与 60% 碘乙醇按不同比例混合，最后在4℃下，以 40,000 rpm 转速超离心形成了平衡密度梯度，进而收集分析，得到生姜外泌体；
（2）将桑蚕丝按1∶100的浴比在 0.5% Na2CO3 溶液中煮沸脱胶1次，1 h；用去离子水清洗净后，在烘箱中60℃干燥制备完全脱胶桑蚕丝；将完全脱胶桑蚕丝按1∶10的浴比分别在摩尔比为1∶8∶2的CaCl2-H2O-C2H5OH三元混合溶液体系中充分溶解，温度为80±2℃；将所得溶液分装于透析袋，截留分子量10 kD，在蒸馏水中充分透析3天，蒸馏水8 h更换一次；制得再生桑蚕丝素蛋白溶液，将得到的溶液在-80℃冻干，得到丝素蛋白冻干粉；
（3）制备的1 g丝素蛋白溶解在9 g六氟异丙醇中，超声30 min，进行静电纺丝，纺丝时喷丝头采用20号针头，注射流量为0.2 mL/h，喷头与接收板距离13 cm，静电电压20kV，温度在40℃，用将生姜外泌体涂覆的铝箔作为接收器，得到抗炎丝素蛋白膜。
实施例3
一种抗炎丝素蛋白膜，步骤（1）和（2）与实施例2对应的步骤相同，按以下步骤制备：
（1）将粗滤过的生姜汁在 4℃下以 12,000g离心1小时，取上清液重复 2-3 次，再用 100,000 g 离心 80 分钟，之后又进行超速离心浓缩并与 60% 碘乙醇按不同比例混合，最后在4℃下，以 40,000 rpm 转速超离心形成了平衡密度梯度，进而收集分析，得到生姜外泌体；
（2）将桑蚕丝按1∶100的浴比在 0.5% Na2CO3 溶液中煮沸脱胶1次，1 h；用去离子水清洗净后，在烘箱中60℃干燥制备完全脱胶桑蚕丝；将完全脱胶桑蚕丝按1∶10的浴比分别在摩尔比为1∶8∶2的CaCl2-H2O-C2H5OH三元混合溶液体系中充分溶解，温度为80±2℃；将所得溶液分装于透析袋，截留分子量10 kD，在蒸馏水中充分透析3天，蒸馏水8 h更换一次；制得再生桑蚕丝素蛋白溶液，将得到的溶液在-80℃冻干，得到丝素蛋白冻干粉；
（3）制备的1 g丝素蛋白溶解在9 g六氟异丙醇中，超声30 min，进行静电纺丝，纺丝时喷丝头采用20号针头，注射流量为0.2 mL/h，喷头与接收板距离13 cm，静电电压20kV，温度在40℃，用铝箔作为接收器，之后将生姜外泌体涂覆在成膜上。
实施例4
一种抗炎丝素蛋白膜，步骤（1）和（2）与实施例2相对应步骤相同，按以下步骤制备：
（1）将粗滤过的生姜汁在 4℃下以 12,000g离心1小时，取上清液重复 2-3 次，再用 100,000 g 离心 80 分钟，之后又进行超速离心浓缩并与 60% 碘乙醇按不同比例混合，最后在4℃下，以 40,000 rpm 转速超离心形成了平衡密度梯度，进而收集分析，得到生姜外泌体；
（2）将桑蚕丝按1∶100的浴比在 0.5% Na2CO3 溶液中煮沸脱胶1次，1 h；用去离子水清洗净后，在烘箱中60℃干燥制备完全脱胶桑蚕丝；将完全脱胶桑蚕丝按1∶10的浴比分别在摩尔比为1∶8∶2的CaCl2-H2O-C2H5OH三元混合溶液体系中充分溶解，温度为80±2℃；将所得溶液分装于透析袋，截留分子量10 kD，在蒸馏水中充分透析3天，蒸馏水8 h更换一次；制得再生桑蚕丝素蛋白溶液，将得到的溶液在-80℃冻干，得到丝素蛋白冻干粉；
（3）制备的1 g丝素蛋白溶解在9 g六氟异丙醇中，所述的丝素蛋白和六氟异丙醇的质量比为1:4-1:19之间，超声30 min，进行静电纺丝，纺丝时喷丝头采用20号针头，注射流量为0.2 mL/h，喷头与接收板距离13 cm，静电电压40 kV，温度在40℃，用将生姜外泌体涂覆的铝箔作为接收器，得到抗炎丝素蛋白膜。
实施例5
一种抗炎丝素蛋白膜，步骤（1）和（2）与实施例2相对应步骤相同，按以下步骤制备：
（1）将粗滤过的生姜汁在 4℃下以 12,000g-15,000g离心1小时，取上清液重复2-3 次，再用 100,000 g 离心 80 分钟，之后又进行超速离心浓缩并与 60% 碘乙醇按不同比例混合，最后在4℃下，以 40,000 rpm 转速超离心形成了平衡密度梯度，进而收集分析，得到生姜外泌体；
（2）将桑蚕丝按1∶100的浴比在 0.5% Na2CO3 溶液中煮沸脱胶1次，1 h；用去离子水清洗净后，在烘箱中60℃干燥制备完全脱胶桑蚕丝；将完全脱胶桑蚕丝按1∶10的浴比分别在摩尔比为1∶8∶2的CaCl2-H2O-C2H5OH三元混合溶液体系中充分溶解，温度为80±2℃；将所得溶液分装于透析袋，截留分子量10 kD，在蒸馏水中充分透析3天，蒸馏水8 h更换一次；制得再生桑蚕丝素蛋白溶液，将得到的溶液在-80℃冻干，得到丝素蛋白冻干粉；
（3）制备的1 g丝素蛋白溶解在9 g六氟异丙醇中，超声30 min，进行静电纺丝，纺丝时喷丝头采用20号针头，注射流量为0.2 mL/h，喷头与接收板距离13 cm，静电电压20kV，温度在60℃之间，用将生姜外泌体涂覆的铝箔作为接收器，得到抗炎丝素蛋白膜。
Claims (9)
1.一种抗炎丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于，通过超速离心法制备生姜外泌体，再生丝素蛋白由桑蚕丝脱胶、溶解、透析、冻干制备，两者溶解到六氟异丙醇中进行混合后，进行静电纺丝，得到抗炎丝素蛋白膜，包括以下步骤：
（1）将粗滤过的生姜汁在 4℃下以 10,000g-15,000g离心1小时，取上清液重复 2-3次，再用 100,000 g 离心 80 分钟，之后又进行超速离心浓缩并与 60% 碘乙醇按不同比例混合，最后在4℃下，以 40,000 rpm 转速超离心形成了平衡密度梯度，进而收集分析，得到生姜外泌体；
（2）将桑蚕丝按1∶100的浴比在 0.5% Na2CO3 溶液中煮沸脱胶1次，1 h；用去离子水清洗净后，在烘箱中60℃干燥制备完全脱胶桑蚕丝；将完全脱胶桑蚕丝按1∶10的浴比分别在摩尔比为1∶8∶2的CaCl2-H2O-C2H5OH三元混合溶液体系中充分溶解，温度为80±2℃；将所得溶液分装于透析袋，截留分子量10 kD，在蒸馏水中充分透析3天，蒸馏水8 h更换一次；制得再生桑蚕丝素蛋白溶液，将得到的溶液在-80℃冻干，得到丝素蛋白冻干粉；
（3）制备的丝素蛋白溶解在六氟异丙醇中，所述的丝素蛋白和六氟异丙醇的质量比为1:4-1:19之间，超声30 min，进行静电纺丝，纺丝时喷丝头采用20号针头，注射流量为0.2mL/h，喷头与接收板距离13 cm，静电电压10-40 kV之间，温度在25℃到60℃之间，用将生姜外泌体涂覆的铝箔作为接收器，得到抗炎丝素蛋白膜。
2.根据权利要求1所述抗炎丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于，所述的生姜外泌体制备方法，步骤（3）所述的温度为60℃。
3.根据权利要求1或2所述抗炎丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于，其特征在于，按以下步骤制备：
（1）将粗滤过的生姜汁在 4℃下以 10,000g离心1小时，取上清液重复 2-3 次，再用100,000 g 离心80分钟，之后又进行超速离心浓缩并与 60%碘乙醇按不同比例混合，最后在4℃下，以40,000 rpm 转速超离心形成了平衡密度梯度，进而收集分析，得到生姜外泌体；
（2）将桑蚕丝按1∶100的浴比在 0.5% Na2CO3 溶液中煮沸脱胶1次，1 h；用去离子水清洗净后，在烘箱中60℃干燥制备完全脱胶桑蚕丝；将完全脱胶桑蚕丝按1∶10的浴比分别在摩尔比为1∶8∶2的CaCl2-H2O-C2H5OH三元混合溶液体系中充分溶解，温度为80±2℃；将所得溶液分装于透析袋，截留分子量10 kD，在蒸馏水中充分透析3天，蒸馏水8 h更换一次；制得再生桑蚕丝素蛋白溶液，将得到的溶液在-80℃冻干，得到丝素蛋白冻干粉；
（3）制备的1 g丝素蛋白溶解在9 g六氟异丙醇中，超声30 min，进行静电纺丝，纺丝时喷丝头采用20号针头，注射流量为0.2 mL/h，喷头与接收板距离13 cm，静电电压20 kV，温度40℃，用将生姜外泌体涂覆的铝箔作为接收器，得到抗炎丝素蛋白膜。
4.根据权利要求1或2所述抗炎丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于，其特征在于，按以下步骤制备：将粗滤过的生姜汁在 4℃下以 12,000g离心1小时，取上清液重复 2-3 次，再用 100,000 g 离心 80 分钟，之后又进行超速离心浓缩并与 60% 碘乙醇按不同比例混合，最后在4℃下，以 40,000 rpm 转速超离心形成了平衡密度梯度，进而收集分析，得到生姜外泌体；
（1）将桑蚕丝按1∶100的浴比在 0.5% Na2CO3 溶液中煮沸脱胶1次，1 h；用去离子水清洗净后，在烘箱中60℃干燥制备完全脱胶桑蚕丝；将完全脱胶桑蚕丝按1∶10的浴比分别在摩尔比为1∶8∶2的CaCl2-H2O-C2H5OH三元混合溶液体系中充分溶解，温度为80±2℃；将所得溶液分装于透析袋，截留分子量10 kD，在蒸馏水中充分透析3天，蒸馏水8 h更换一次；制得再生桑蚕丝素蛋白溶液，将得到的溶液在-80℃冻干，得到丝素蛋白冻干粉；
（3）制备的1 g丝素蛋白溶解在9 g六氟异丙醇中，超声30 min，进行静电纺丝，纺丝时喷丝头采用20号针头，注射流量为0.2 mL/h，喷头与接收板距离13 cm，静电电压20 kV，温度在40℃，用将生姜外泌体涂覆的铝箔作为接收器，得到抗炎丝素蛋白膜。
5.根据权利要求1或2所述抗炎丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于，其特征在于，按以下步骤制备：
（1）将粗滤过的生姜汁在 4℃下以 12,000g离心1小时，取上清液重复 2-3 次，再用100,000 g 离心 80 分钟，之后又进行超速离心浓缩并与 60% 碘乙醇按不同比例混合，最后在4℃下，以 40,000 rpm 转速超离心形成了平衡密度梯度，进而收集分析，得到生姜外泌体；
（2）将桑蚕丝按1∶100的浴比在 0.5% Na2CO3 溶液中煮沸脱胶1次，1 h；用去离子水清洗净后，在烘箱中60℃干燥制备完全脱胶桑蚕丝；将完全脱胶桑蚕丝按1∶10的浴比分别在摩尔比为1∶8∶2的CaCl2-H2O-C2H5OH三元混合溶液体系中充分溶解，温度为80±2℃；将所得溶液分装于透析袋，截留分子量10 kD，在蒸馏水中充分透析3天，蒸馏水8 h更换一次；制得再生桑蚕丝素蛋白溶液，将得到的溶液在-80℃冻干，得到丝素蛋白冻干粉；
（3）制备的1 g丝素蛋白溶解在9 g六氟异丙醇中，超声30 min，进行静电纺丝，纺丝时喷丝头采用20号针头，注射流量为0.2 mL/h，喷头与接收板距离13 cm，静电电压20 kV，温度在40℃，用铝箔作为接收器，之后将生姜外泌体涂覆在成膜上。
6.根据权利要求1或2所述抗炎丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于，其特征在于，按以下步骤制备：
（1）将粗滤过的生姜汁在 4℃下以 12,000g离心1小时，取上清液重复 2-3 次，再用100,000 g 离心 80 分钟，之后又进行超速离心浓缩并与 60% 碘乙醇按不同比例混合，最后在4℃下，以 40,000 rpm 转速超离心形成了平衡密度梯度，进而收集分析，得到生姜外泌体；
（2）将桑蚕丝按1∶100的浴比在 0.5% Na2CO3 溶液中煮沸脱胶1次，1 h；用去离子水清洗净后，在烘箱中60℃干燥制备完全脱胶桑蚕丝；将完全脱胶桑蚕丝按1∶10的浴比分别在摩尔比为1∶8∶2的CaCl2-H2O-C2H5OH三元混合溶液体系中充分溶解，温度为80±2℃；将所得溶液分装于透析袋，截留分子量10 kD，在蒸馏水中充分透析3天，蒸馏水8 h更换一次；制得再生桑蚕丝素蛋白溶液，将得到的溶液在-80℃冻干，得到丝素蛋白冻干粉；
（3）制备的1 g丝素蛋白溶解在9 g六氟异丙醇中，所述的丝素蛋白和六氟异丙醇的质量比为1:4-1:19之间，超声30 min，进行静电纺丝，纺丝时喷丝头采用20号针头，注射流量为0.2 mL/h，喷头与接收板距离13 cm，静电电压40 kV，温度在40℃，用将生姜外泌体涂覆的铝箔作为接收器，得到抗炎丝素蛋白膜。
7.根据权利要求1或2所述抗炎丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于，其特征在于，按以下步骤制备：
（1）将粗滤过的生姜汁在 4℃下以 12,000g-15,000g离心1小时，取上清液重复 2-3次，再用 100,000 g 离心 80 分钟，之后又进行超速离心浓缩并与 60% 碘乙醇按不同比例混合，最后在4℃下，以 40,000 rpm 转速超离心形成了平衡密度梯度，进而收集分析，得到生姜外泌体；
（2）将桑蚕丝按1∶100的浴比在 0.5% Na2CO3 溶液中煮沸脱胶1次，1 h；用去离子水清洗净后，在烘箱中60℃干燥制备完全脱胶桑蚕丝；将完全脱胶桑蚕丝按1∶10的浴比分别在摩尔比为1∶8∶2的CaCl2-H2O-C2H5OH三元混合溶液体系中充分溶解，温度为80±2℃；将所得溶液分装于透析袋，截留分子量10 kD，在蒸馏水中充分透析3天，蒸馏水8 h更换一次；制得再生桑蚕丝素蛋白溶液，将得到的溶液在-80℃冻干，得到丝素蛋白冻干粉；
（3）制备的1 g丝素蛋白溶解在9 g六氟异丙醇中，超声30 min，进行静电纺丝，纺丝时喷丝头采用20号针头，注射流量为0.2 mL/h，喷头与接收板距离13 cm，静电电压20 kV，温度在60℃之间，用将生姜外泌体涂覆的铝箔作为接收器，得到抗炎丝素蛋白膜。
8.一种抗炎丝素蛋白膜，其特征在于根据权利要求1-7任一所述方法制备得到。
9.一种根据权利要求8所述抗炎丝素蛋白膜在制备皮肤伤口抗菌抗炎加快愈合材料中的应用。
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