CN115721603A - 用于非小细胞肺癌术后管理的载药水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药及生物技术领域，具体涉及用于非小细胞肺癌术后管理的载药水凝胶及其制备方法。本发明提供了一种载药水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将海藻酸钠水溶液与氧化海藻酸钠水溶液按比例混合，加入上述膜融合siRNA脂质体和局麻镇痛药物持续搅拌1‑4h，获得混合溶液；将混合溶液与2％氯化钙溶液混合，获得所述载药水凝胶。本发明构建载药水凝胶，可以同时递送STAT3siRNA和局麻镇痛药物，用于非小细胞肺癌术后综合管理，同时具有抗肿瘤复发、减少胸腔积液产生和镇痛三种疗效。
Description
技术领域
本发明属于医药及生物技术领域，具体涉及用于非小细胞肺癌术后管理的载药水凝胶及其制备方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，在中国，肺癌发病人数居全国病发首位，占全球35.8％。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的85％以上。现有的对于NSCLC的临床治疗多采用肿瘤切除术，尤其是对于I-II期和IIIA期NSCLC患者。然而，复杂的非小细胞肺癌解剖结构通常导致切除后不可避免的局部残留肿瘤微浸润，这可能会继续导致肿瘤复发和胸膜转移。胸膜转移或手术刺激常常导致胸膜腔内的恶性胸腔积液的产生(MPE)，这种积液具有强烈的免疫抑制作用，含有丰富的促肿瘤髓样免疫细胞，通常会导致呼吸困难，并对临床患者的术后管理形成巨大的挑战。目前MPE的护理标准包括导管引流或化学/外科手术，但基本上是姑息性的。以往的研究也试图改善免疫抑制微环境，如使用免疫检查点阻断、促炎性细胞因子和基因治疗等方法。同时，开胸手术或胸腔镜手术引起的明显术后疼痛不容忽视，尤其是在术后48小时。为了管理术后疼痛以减少并发症，经常使用多模式镇痛，区域镇痛技术是多模式镇痛的重要组成部分。总之，对非小细胞肺癌术后患者进行综合治疗，包括抗肿瘤复发、减少恶性胸腔积液产生和术后疼痛缓解，是极为重要的。目前尚缺乏用于非小细胞肺癌术后综合管理的一体化给药方案。
为了防止肿瘤复发与转移，临床上通常在术后辅以全身化疗或放疗来清除残余的肿瘤细胞。然而术后全身给药后，实际到达肿瘤切除部位的药物很少，残留病灶对系统性治疗的反应通常很差，此外较高的给药剂量还会带来明显的全身副作用；另外，肿瘤切除术后患者较虚弱，一般需在术后2周或更长时间才能进行化疗或放疗，辅助治疗的延时性可能导致错过杀灭残余肿瘤细胞的最佳时期。局部用药物制剂能够使药物直接定位于术后创面，降低全身给药毒性，提高病灶处的药物浓度，从而以更小的剂量有效地防止肿瘤原位复发甚至远端转移，并填补手术与全身化疗之间的空白期。考虑到区域镇痛治疗是术后疼痛管理中的一项重要策略，术后局部给药有望成为改善NSCLC患者预后的更理想的术后治疗方案。目前，已开发出多种具有长效释放功能的术后局部给药载体材料，包括支架、膜剂、水凝胶、泡沫剂和喷雾剂等。其中，水凝胶由于其良好的生物相容性、可降解性、易于包载多种治疗剂和释药可控等特点，受到了越来越多的关注。海藻酸钠(SA)是美国食品和药物管理局批准的一种材料，可以与钙阳离子交联，从而轻松制备水凝胶。海藻酸钠水凝胶的机械粘附性和稳定性也容易随着组成和结构的改变而改变。因此，它在生物医学领域具有巨大的前景，可以喷射或注射器注射到解剖复杂表面并递送多种治疗剂。
最近发现信号转导子和转录激活子3(STAT3)在非小细胞肺癌的发展中起着重要作用，包括促进血管生成、细胞存活、癌细胞干细胞、耐药性和抗肿瘤免疫逃避。由于高度保守的结构域和复杂的上游信号，针对STAT3通路的抗体或小分子抑制剂成药性很差。小干扰RNA(siRNA)抑制STAT3被认为是一种很有前景的抗癌策略。在肿瘤细胞中耗尽STAT3可以影响随后的凋亡转录调控；抑制STAT3还可以控制巨噬细胞的极化。脂质体已显示出克服传递障碍的巨大潜力，并广泛用于siRNA的靶向传递。通过纳米颗粒表面的功能化实现精确的亚细胞靶向性有望避免细胞内溶酶体降解并增强siRNA沉默效应。因此将siRNA脂质体负载到局部水凝胶平台中有望通过抑制STAT3通路来增强抗肿瘤疗效。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供用于非小细胞肺癌术后管理的载药水凝胶及其制备方法。所述载药水凝胶可以同时递送STAT3 siRNA和局麻镇痛药物，用于非小细胞肺癌术后综合管理，同时具有抗肿瘤复发、减少胸腔积液产生和镇痛三种疗效。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供了一种膜融合siRNA脂质体的制备方法，包括以下步骤：
将载siRNA的脂质体的溶液滴入相同体积的内质网膜溶液中，然后在室温下进行超声混合，并通过脂质体挤出器来回挤压，然后将所得混合物透析以进行纯化，得到所述膜融合siRNA脂质体。
第二方面，本发明提供了一种由上述制备方法制备得到的膜融合siRNA脂质体。
第三方面，本发明提供了一种载药水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将海藻酸钠水溶液与氧化海藻酸钠水溶液按比例混合，加入上述膜融合siRNA脂质体和局麻镇痛药物持续搅拌1-4h，获得混合溶液；
将混合溶液与2％氯化钙溶液混合，获得所述载药水凝胶。
第四方面，本发明提供了一种由上述载药水凝胶的制备方法制备得到的载药水凝胶。
第五方面，本发明提供了上述载药水凝胶的制备方法制备得到的产品或/和上述载药水凝胶在制备用于非小细胞肺癌术后综合管理的药物中的应用，所述药物同时具有抗肿瘤复发、减少胸腔积液产生和镇痛三种疗效。
上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：
(1)本发明构建载药水凝胶，可以同时递送siSTAT3和局麻镇痛药物，用于非小细胞肺癌术后综合管理，同时具有抗肿瘤复发、减少胸腔积液产生和镇痛三种疗效。
(2)本发明所构建的载药水凝胶具有良好的生物相容性、原料获取容易、成本低廉，优化的载药水凝胶具有足够的组织粘附能力，可以牢固覆盖在湿润不规则创面，力学性能符合肺脏收缩舒张规律，不易脱落。
(3)本发明构建的膜融合siRNA脂质体可以实现亚细胞水平上siRNA的高效递送，从而提高基因沉默效率，有效抑制STAT3蛋白。
(4)本发明证明了siSTAT3和局麻镇痛药物利多卡因两者联用，具有协同激活抗肿瘤免疫的功能，对于提高抗肿瘤疗效具有重要意义。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1制备的膜融合siSTAT3脂质体对于STAT3mRNA的敲低；
图2为实施例1制备的膜融合siSTAT3脂质体对于STAT3mRNA的敲低STAT3蛋白表达的影响；
图3为BMDMs细胞不同处理后STAT3蛋白的免疫荧光图,其中，NC组为空白对照组，PS组为jeiPEI试剂处理组；
图4为实施例2制备的载药水凝胶对离体肺组织的黏附效果图；
图5为实施例2制备的载药水凝胶的的流变学特性，其中G′为储存模量，G”为损耗模量；
图6为实施例2和对比例1制备的载药水凝胶的连续剪切/恢复下的储存模量变化图；
图7为实施例1制备的内质网膜、膜融合siSTAT3脂质体和siSTAT3脂质体的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图8为实施例2制备的载药水凝胶的冻干粉末扫描电镜图；
图9为实施例2和对比例1制备的载药水凝胶随时间的溶蚀变化；
图10为实施例2制备的载药水凝胶的利多卡因释放曲线。
图11为胸内注射观测对比例6制备的载药水凝胶在小鼠非小细胞肺癌模型中的生物分布图；
图12为分别注射实施例2、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5所制备的载药水凝胶的小鼠治疗后体重变化曲线；
图13为分别注射实施例2、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5所制备的载药水凝胶的小鼠治疗后生存曲线；
图14为分别注射实施例2、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5所制备的载药水凝胶的小鼠治疗后的生物自发光成像图片；
图15为分别注射实施例2、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5所制备的载药水凝胶的小鼠治疗结束后离体肺组织代表性照片及病理学切片；
图16为分别注射实施例2、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5所制备的载药水凝胶的小鼠治疗后的代表性胸部Micro-CT成像和超声成像图；
图17为分别注射实施例2、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5所制备的载药水凝胶的小鼠治疗后的M2巨噬细胞比例；
图18为分别注射实施例2、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5所制备的载药水凝胶的小鼠治疗后的M1巨噬细胞比例；
图19为分别注射实施例2、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5所制备的载药水凝胶的小鼠治疗后的CD8+T细胞比例；
图20为分别注射实施例2、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5所制备的载药水凝胶的小鼠治疗后的NK细胞比例。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一种典型具体实施方式中，提供了一种膜融合siRNA脂质体的制备方法，包括以下步骤：
将载siRNA的脂质体的溶液滴入相同体积的内质网膜溶液中，然后在室温下进行超声混合，并通过脂质体挤出器来回挤压，然后将所得混合物透析以进行纯化，得到所述膜融合siRNA脂质体。
本发明的又一种典型具体实施方式中，所述载siRNA的脂质体的制备方法包括：
在微流控装置中以可控流速混合溶解在乙醇中的脂质成分和水相中的siRNA，在微流控通道出口收集液体，透析纯化，得到所述载siRNA的脂质体；
优选的，所述siRNA为siSTAT3，序列为：
正义链为5’-GGGUCUGGCUAGACAAUAUTT-3’，如Seq NO.1所示；反义链为5’-AUAUUGUCUAGCCAGACCCTT-3’，如Seq NO.2所示；
优选的，乙醇相和水相的流速比为1:1-1:5，进一步优选为1:2；
优选的，乙醇中溶解的脂质成分包括DOTAP、DOPE、胆固醇，摩尔比为1:1:1；
优选的，siRNA与脂质的重量比为1:15-1:50，进一步优选为7:300。
本发明的又一种典型具体实施方式中，所述内质网膜通过超速离心法从RAW264.7细胞中提取。
本发明的一种典型具体实施方式中，提供了一种由上述制备方法制备得到的膜融合siRNA脂质体。
本发明的一种典型具体实施方式中，所述载siRNA的脂质体的溶液的质量浓度为10mg/mL。
本发明的一种典型具体实施方式中，所述内质网膜溶液为5mg/mL。
本发明的一种典型具体实施方式中，超声混合的时间为1分钟。
本发明的一种典型具体实施方式中，所述脂质体挤出器使用200nm聚碳酸酯膜。
本发明的一种典型具体实施方式中，透析温度为4℃，透析时间为2h。
本发明的又一种典型具体实施方式中，提供了一种载药水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将海藻酸钠水溶液与氧化海藻酸钠水溶液按比例混合，加入权利要求4所述的膜融合siRNA脂质体和局麻镇痛药物持续搅拌1-4h，获得混合溶液；
将混合溶液与2％氯化钙溶液混合，获得所述载药水凝胶。
本发明的又一种典型具体实施方式中，所述氧化海藻酸钠的制备方法包括：
将海藻酸钠0.5-2g和高碘酸钠0.5-2g溶解在去离子水中，并在25℃的黑暗中磁力搅拌溶液5-12小时。通过添加乙二醇0.5-3mL终止反应，并通过透析提纯产物72小时，然后冷冻干燥获得氧化海藻酸钠，低温密封保存备用。
优选地，所述海藻酸钠为1g。
优选地，所述高碘酸钠为1g。
优选地，所述乙二醇为1.5mL。
本发明的又一种典型具体实施方式中，所述海藻酸钠与氧化海藻酸钠比例为9:1-5:5。
本发明的又一种典型具体实施方式中，所述膜融合siRNA脂质体与海藻酸钠的质量比为0.01:1-0.04:1。
本发明的又一种典型具体实施方式中，所述局麻镇痛药物与海藻酸钠的质量比为0.1:1-0.5:1。
本发明的又一种典型具体实施方式中，所述海藻酸钠水溶液和氧化海藻酸钠水溶液的质量浓度保持一致，为10-30mg/mL。
本发明的又一种典型具体实施方式中，所述局麻镇痛药物为盐酸利多卡因、碳酸利多卡因、盐酸普鲁卡因、盐酸布比卡因及盐酸罗哌卡因的一种或多种，优选为盐酸利多卡因。
本发明的又一种典型具体实施方式中，所述2％氯化钙溶液与混合溶液的体积比为0.03:1-0.1:1；优选为0.05：1。
本发明的又一种典型具体实施方式中，提供了一种由上述载药水凝胶的制备方法制备得到的载药水凝胶。
所获得的同时递送siRNA和局麻镇痛药物的杂化水凝胶，既可以胸腔注射，又可以适用于非小细胞肺癌术后局部施用，具有良好的生物相容性和组织粘附性，同时具有抗肿瘤复发、减少胸腔积液产生和镇痛三种疗效，适用于非小细胞肺癌术后综合管理。
本发明的又一种典型具体实施方式中，提供了上述载药水凝胶的制备方法制备得到的产品或/和上述载药水凝胶在制备用于非小细胞肺癌术后综合管理的药物中的应用，所述药物同时具有抗肿瘤复发、减少胸腔积液产生和镇痛三种疗效。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
本发明实施例中siSTAT3的序列为：正义链为5’-GGGUCUGGCUAGACAAUAUTT-3’，如Seq NO.1所示；反义链为5’-AUAUUGUCUAGCCAGACCCTT-3’，如Seq NO.2所示。
实施例1
膜融合siSTAT3脂质体的制备
在微流控装置中以可控流速(乙醇为0.5mL/min，水溶液缓冲液为1.5mL/min)混合溶解在乙醇中的脂质成分和水相中的siSTAT3。其中，乙醇相和水相的流速比为1:2，乙醇中溶解的脂质成分是摩尔比为1:1:1的DOTAP、DOPE、胆固醇，脂质浓度是30mg/mL，siRNA浓度为700μg/mL。在微流控通道出口收集液体，透析纯化，得到载siSTAT3的脂质体，记为SL。根据内质网分离试剂盒的说明，通过超速离心法从RAW 264.7细胞中中提取内质网膜，记为EM。随后，将载siSTAT3的脂质体(10mg/mL)滴入相同体积的EM溶液(5mg/mL)中，然后在室温下进行1分钟超声混合，并通过脂质体挤出器200nm聚碳酸酯膜来回挤压，然后将所得混合物在4℃下透析2小时以进行纯化膜融合以获得siSTAT3脂质体，记为MSL。
实施例2
载药水凝胶的制备
将海藻酸钠1g和高碘酸钠1g溶解在去离子水中，并在25℃中避光搅拌溶液6小时。通过添加乙二醇1.5mL终止反应，并通过透析纯化72小时，然后冷冻干燥获得氧化海藻酸钠。将质量浓度为20mg/mL的海藻酸钠水溶液与质量浓度为20mg/mL氧化海藻酸钠以体积比为8:2比例混合，按照每毫克海藻酸钠加入含有20μgsiSTAT3的包膜脂质体和330μg盐酸利多卡因的比例搅拌混合1小时，然后取1mL混合溶液和50μL 2％氯化钙溶液混合，获得载药水凝胶，记为MSL@LID@SOG。
实施例3
载药水凝胶的制备
将海藻酸钠1g和高碘酸钠1g溶解在去离子水中，并在25℃中避光搅拌溶液6小时。通过添加乙二醇1.5mL终止反应，并通过透析纯化72小时，然后冷冻干燥获得氧化海藻酸钠。将质量浓度为20mg/mL的海藻酸钠水溶液与质量浓度为20mg/mL氧化海藻酸钠以体积比为5:5比例混合，按照每毫克海藻酸钠加入含有20μg siSTAT3的包膜脂质体和330μg盐酸利多卡因的比例搅拌混合1小时，然后取1mL混合溶液和50μL 2％氯化钙溶液混合，获得载药水凝胶。
实施例4
载药水凝胶的制备
将海藻酸钠1g和高碘酸钠1g溶解在去离子水中，并在25℃中避光搅拌溶液6小时。通过添加乙二醇1.5mL终止反应，并通过透析纯化72小时，然后冷冻干燥获得氧化海藻酸钠。将质量浓度为10mg/mL的海藻酸钠水溶液与质量浓度为10mg/mL氧化海藻酸钠以体积比为8:2比例混合，按照每毫克海藻酸钠加入含有15μg siSTAT3的包膜脂质体和350μg盐酸利多卡因的比例搅拌混合1小时，然后取1mL混合溶液和50μL 2％氯化钙溶液混合，获得载药水凝胶。
实施例5
载药水凝胶的制备
将海藻酸钠1g和高碘酸钠1g溶解在去离子水中，并在25℃中避光搅拌溶液6小时。通过添加乙二醇1.5mL终止反应，并通过透析纯化72小时，然后冷冻干燥获得氧化海藻酸钠。将质量浓度为30mg/mL的海藻酸钠水溶液与质量浓度为30mg/mL氧化海藻酸钠以体积比为8:2比例混合，按照每毫克海藻酸钠加入含有25μg siSTAT3的包膜脂质体和300μg盐酸利多卡因的比例搅拌混合1小时，然后取1mL混合溶液和50μL 2％氯化钙溶液混合，获得载药水凝胶。
对比例1
与实施例2不同的是，仅使用质量浓度为20mg/mL的海藻酸钠水溶液而不使用质量浓度为20mg/mL的氧化海藻酸钠水溶液，制备得到的载药水凝胶记为MSL@LID@SG。
对比例2
与实施例2不同的是，不加入含有20μg siSTAT3的包膜脂质体，制备得到的载药水凝胶记为LID@SOG。
对比例3
与实施例2不同的是，不加入盐酸利多卡因，制备得到的载药水凝胶记为MSL@SOG。
对比例4
与对比例3不同的是，将含有20μg siSTAT3的包膜脂质体替换为含有20μgsiSTAT3的脂质体，记为SL@SOG。
对比例5
与实施例2不同的是，不加入含有20μg siSTAT3的包膜脂质体和盐酸利多卡因，制备得到的水凝胶记为SOG。
对比例6
与实施例2不同的是，使用膜融合Cy5-siSTAT3脂质体替代膜融合siSTAT3脂质体。
实验例1
为了验证实施例1所制备的膜融合siSTAT3脂质体在小鼠非小细胞肺癌细胞(LLC)中干扰mRNA合成的能力，LLC细胞被接种在6孔细胞培养板中12小时，然后以10nM siSTAT3的浓度给予不同的处理。24小时后，使用商业化RNA快速纯化试剂盒从细胞裂解液中纯化RNA，并使用cDNA合成试剂盒进行逆转录，然后加入SYBR试剂在罗氏LightCycler480 II仪器上进行实时定量PCR分析。根据制造商的说明制备商业转染剂jetPEI和等量siSTAT3的复合物，并进行类似分析。用于RT-PCR分析的特异引物序列如下。
(1)小鼠STAT3 5′-ACGAAAGTCAGGTTGCTGGT-3′，其核苷酸序列如SEQ NO.3所示，和5′-GCTGCCGTTGTTAGACTCCT-3′，其核苷酸序列如SEQ NO.4所示；
(2)小鼠GAPDH 5′-TGTCTCCTGCGACTTCAACA-3′，其核苷酸序列如SEQ NO.5所示和5′-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT-3′，其核苷酸序列如SEQ NO.6所示。
同样的处理48小时后，用RIPA缓冲液对细胞在冰上进行裂解20分钟，然后在12000rpm离心5分钟获得蛋白上清液。通过western blotting实验分析STAT3的相对蛋白表达量。结果表明，如图1所示负载10nM siSTAT3的膜融合脂质体可以实现约70％的STAT3mRNA干扰。如图2所示，在western blotting实验中，siSTAT3膜融合脂质体组观察到几乎看不见的条带，这比jeiPEI试剂的蛋白敲低效率高两倍。
实验例2
为了验证实施例1所制备的膜融合siSTAT3脂质体在巨噬细胞中传递siSTAT3干扰mRNA合成的能力，BMDMs细胞被接种在共聚焦小皿中12小时，然后以10nM siSTAT3的浓度给予不同的处理48小时后，免疫荧光法监测STAT3的表达情况。用商品免疫染色固定液固定，免疫染色透化缓冲液透化，免疫染色阻断缓冲液封闭。接下来，用STAT3兔单克隆抗体在4℃孵育过夜，然后与抗兔Alexa Fluor448偶联二抗体室温孵育60分钟。DAPI染色细胞核，如图3所示，在高速共聚焦平台下观察发现膜修饰的siSTAT3脂质体能最大程度降低STAT3蛋白的表达。
实验例3
在实施例2制备得到的载药水凝胶的形成过程中，加入适量结晶紫溶液标记凝胶，然后用注射器注射到从新西兰兔分离的离体肺表面，监测到当海藻酸钠溶液与氧化海藻酸钠的比例为8：2时，形成的水凝胶在生物组织表面具有良好的生物粘附性能，如图4所示。
实验例4
使用流变仪测定实施例2和对比例1制备得到的载药水凝胶的流变学性能，测定时，剪切速率范围为0-100s-1，应变幅度为0.2％，以获得水凝胶的储存模量和损耗模量，如图5所示，储存模量显著大于损耗模量是水凝胶的典型特征。之后，实施例2和对比例1所获得水凝胶在6rads-1和0.2％应变下扫描2分钟，迅速经受200％剪切20s(频率为6rad s-1)，以评估形变后凝胶的恢复能力。如图6所示，与单独的海藻酸钠水凝胶相比，实施例2获得的杂化水凝胶在多个应变周期中表现出更好的剪切恢复，这更适合肺的舒张和收缩节律特征。
实验例5
使用马尔文粒径测量系统测定脂质体的粒径分布和zeta电位。采用Westernblotting分析鉴定内质网膜和最终获得脂质体的蛋白谱。简言之，在100℃下将BCA蛋白检测试剂盒定量的含有等量总蛋白的不同样品煮沸5分钟，然后添加到10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中，以分离不同分子量的蛋白质。随后，将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上,用考马斯蓝G-250染色，以验证两者的蛋白谱是否相等。结果显示，siSTAT3脂质体的直径约为146.03±0.232nm，略大于膜融合siSTAT3脂质体直径123.67±4.55nm。如图7所示，膜融合siSTAT3脂质体在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳中保留的蛋白质组分与纯内质网膜的电泳条带一致，siSTAT3脂质体中未检测到蛋白质信号。
实验例6
为了表征凝胶的微观结构，将实验例2制备得到的载药水凝胶水凝胶冷冻在-80℃冰箱过夜预冻，冷冻干燥24小时。在扫描电子显微镜下观察其表面形态。通过重量测定来评估水凝胶的溶胀行为，取500μL最终制备的水凝胶记录重量为W0，然后添加5毫升PBS以在37℃下膨胀。将不同时间溶胀水凝胶的重量记录为Wt。根据以下公式计算相对平衡溶胀率(RSR％)：RSR％＝(Wt-W0)/W0×100％。如图8所示，实施例2制备的载药水凝胶的冻干粉末具有多孔网络结构。如图9所示，实施例2制备的载药水凝胶的最大相对溶胀率为23.42％，这有利于其在组织中的长期存在和被组织液溶胀后药物的稳定释放。
实验例7
为了探究实施例2中制备得到的载药水凝胶中盐酸利多卡因的释放行为。1mL水凝胶与10mL释放介质(PBS，pH＝7.4)以每分钟50转的速度在37摄氏度孵育。在预定的时间点，提取0.5mL释放介质样品，并用0.5mL新鲜释放介质替换。使用高效液相色谱法测定释放的利多卡因，以计算累积释放曲线。流动相由60％甲醇和含0.1％庚烷磺酸钠的50％去离子水组成。如图10所示，盐酸利多卡因在体外表现出10天的持续释放特性，约75％的药物在72小时内释放，水凝胶中包裹治疗药物的典型释放特征是随着时间的推移释放速率逐渐降低，这很适合发挥盐酸利多卡因有效的治疗作用，即包括术后快速止痛和长期抗癌作用。
实验例8
C57BL/6J小鼠(20±2g)胸腔内注射5*105转染荧光素酶的非小细胞肺癌细胞(LLC-luc)，大约7天后可以成功建立原位非小细胞肺癌模型，并且成功诱导了恶性胸腔积液的产生。在原位肺癌模型中胸腔内注射含有20μg Cy5-siSTAT3的脂质体的水凝胶。之后通过小动物活体成像系统获得实时光学图像，以确定Cy5 siRNA的释放、降解和分布。如图11所示，给药后胸腔内CY5荧光信号迅速增加，接下来，游离Cy5-siSTAT3的荧光信号迅速减少，荧光信号仅持续三天。而经过脂质体保护、凝胶负载的Cy5-siSTAT3荧光信号在小鼠体内持续14天。
实验例8
在成功建立的非小细胞肺癌原位肿瘤模型小鼠中，胸腔内注射不同处理的水凝胶体系，分别为MSL@LID@SOG、，MSL@SOG,SL@SOG,LID@SOG，SOG，每组5只小鼠，其中，siRNA的浓度为1mg kg-1，LID的浓度为20mg kg-1。每隔三天记录一次小鼠的体重，存活试验的终点确定为体重下降超过峰值体重的20％或身体状况恶化。每3天测量小鼠体重(图12)，观测小鼠生存变化。使用小动物活体成像系统每7天检测一次肿瘤发展，按照每只小鼠每克体重腹腔注射10ul(15mg/ml)的荧光素钾盐溶液，然后使用生物自发光模式拍摄，根据发光强度来确定肿瘤发展程度。给药14天后，对所有小鼠进行Micro-CT扫描，使用数据处理工作站自动计算平均肺密度，并使用多模式小动物超声/光声成像系统监测肺部胸腔积液的发生。第21天，通过胸腔穿刺技术获得小鼠胸腔积液标本然后处死所有小鼠，收集组织。将右下肺叶固定在4％多聚甲醛(w/v)中，随后进行HE和免疫组织化学染色，收集剩余肺叶。如图13所示，空白凝胶SOG组中80％的小鼠在18天内死亡。如图14和图15所示，与空白凝胶SOG组相比，凝胶中添加盐酸利多卡因和负载siSTAT3的包膜脂质体组的肿瘤负担显著降低，病理切片显示肺部结节相对较少。同时，如图16所示，在空白凝胶SOG组中，Micro-CT图像显示了阴影的弥漫分布和增加的肺密度，胸部超声显示了恶性胸腔积液的产生，这都是非小细胞肺癌发生发展的典型特征。
收集的肺叶使用美天旎肺脏解离试剂盒将收集的肺分离为单个细胞，然后将细胞悬浮液通过70μm过滤器过滤，用40％Percoll离心纯化，并通过红细胞裂解液裂解。所有样品使用用抗鼠CD16/32封闭30min.然后使用活死僵尸染料、CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、NK1.1、CD11b、F4/80、CD206和iNOS等流式抗体按照制造商的标准程序进行染色。染色后，将细胞用PBS洗涤两次，并用流式细胞仪进行分析。结果显示，保护癌细胞凋亡的M2巨噬细胞的比例在MDL@LID@SOG治疗组显著降低，而具有抗肿瘤免疫激活效应的M1巨噬细胞数量增加，如图17-18所示。如图19-20所示，治疗后CD8+T细胞增加，NK细胞也显著增加，这可能归因于盐酸利多卡因的作用，这些激活的抗肿瘤免疫反应进一步提高了协同治疗的抗肿瘤疗效。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种膜融合siRNA脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将载siRNA的脂质体的溶液滴入相同体积的内质网膜溶液中，然后在室温下进行超声混合，并通过脂质体挤出器来回挤压，然后将所得混合物透析以进行纯化，得到所述膜融合siRNA脂质体。
2.如权利要求1所述的膜融合siRNA脂质体的制备方法，其特征在于，所述载siRNA的脂质体的制备方法包括：
在微流控装置中以可控流速混合溶解在乙醇中的脂质成分和水相中的siRNA，在微流控通道出口收集液体，透析纯化，得到所述载siRNA的脂质体；
优选的，所述siRNA为siSTAT3，序列为：
正义链为5’-GGGUCUGGCUAGACAAUAUTT-3’，如Seq NO.1所示；反义链为5’-AUAUUGUCUAGCCAGACCCTT-3’，如Seq NO.2所示；
优选的，乙醇相和水相的流速比为1:1-1:5，进一步优选为1:2；
优选的，乙醇中溶解的脂质成分包括DOTAP、DOPE、胆固醇，摩尔比为1:1:1；
优选的，siRNA与脂质的重量比为1:15-1:50，进一步优选为7:300。
3.如权利要求1所述的膜融合siRNA脂质体的制备方法，其特征在于，所述内质网膜通过超速离心法从RAW 264.7细胞中提取；
或，所述载siRNA的脂质体的溶液的质量浓度为10mg/mL；
或，所述内质网膜溶液为5mg/mL；
或，超声混合的时间为1分钟；
或，所述脂质体挤出器使用200nm聚碳酸酯膜；
或，透析温度为4℃，透析时间为2h。
4.一种由权利要求1-3任一项制备得到的膜融合siRNA脂质体。
5.一种载药水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将海藻酸钠水溶液与氧化海藻酸钠水溶液按比例混合，加入权利要求4所述的膜融合siRNA脂质体和局麻镇痛药物持续搅拌1-4h，获得混合溶液；
将混合溶液与2％氯化钙溶液混合，获得所述载药水凝胶。
6.如权利要求5所述的载药水凝胶的制备方法，其特征在于，所述氧化海藻酸钠的制备方法包括：
将海藻酸钠0.5-2g和高碘酸钠0.5-2g溶解在去离子水中，并在25℃的黑暗中磁力搅拌溶液5-12小时。通过添加乙二醇0.5-3mL终止反应，并通过透析提纯产物72小时，然后冷冻干燥获得氧化海藻酸钠，低温密封保存备用；
优选地，所述海藻酸钠为1g；
优选地，所述高碘酸钠为1g；
优选地，所述乙二醇为1.5mL。
7.如权利要求5所述的载药水凝胶的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠溶液与氧化海藻酸钠溶液的体积比为9:1-5:5；
或，所述膜融合siRNA脂质体与海藻酸钠的质量比为0.01:1-0.04：1；
或，所述局麻镇痛药物与海藻酸钠的质量比为0.1:1-0.5:1；
或，所述海藻酸钠水溶液和氧化海藻酸钠水溶液的质量浓度保持一致，为10-30mg/mL；
所述局麻镇痛药物为盐酸利多卡因、碳酸利多卡因、盐酸普鲁卡因、盐酸布比卡因及盐酸罗哌卡因的一种或多种，优选为盐酸利多卡因。
8.如权利要求5所述的载药水凝胶的制备方法，其特征在于，所述2％氯化钙溶液与混合溶液的体积比为0.03:1-0.1:1；优选为0.05：1。
9.一种由权利要求5-8任一项所述的载药水凝胶的制备方法制备得到的载药水凝胶。
10.权利要求5-8任一项所述的载药水凝胶的制备方法制备得到的产品或/和权利要求9所述的载药水凝胶在制备用于非小细胞肺癌术后综合管理的药物中的应用，其特征在于，所述药物同时具有抗肿瘤复发、减少胸腔积液产生和镇痛三种疗效。
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