CN115721456A - 具有表面双曲面结构的支架及其制造方法与应用 - Google Patents

Abstract

公开了具有表面双曲面结构的支架及其制造方法与应用。所述支架内部具有连通孔隙，所述孔隙的表面的所有点均具有双曲面结构。本发明要求保护的支架的内部具有多孔特征，孔洞表面的每一个点其均具有双曲面结构；由于支架的表面光滑，可以避免应力集中，因此在相同孔隙率下，可以承受更大的外部作用力；同时支架内部的孔洞是连通的，对流体具有更好的通透性，也更有利于组织的长入；此外，支架具有很大的内部表面积，有利于后期在支架的表面进行镀膜等表面处理。

Description

具有表面双曲面结构的支架及其制造方法与应用

技术领域

本发明大体上涉及具有表面双曲面结构的支架，具体地，涉及具有表面双曲面结构的生物支架及其制造方法与应用。

背景技术

组织工程支架是指能与组织活体细胞结合并能植入生物体不同组织，并根据具体替代组织具备的功能的支架体系。其包括用于骨、软骨、血管、神经、皮肤和人工器官等的支架。

双曲面是自然界中常见的拓扑结构。例如，珊瑚，一种可追溯到5亿年前的活化石，在其矿化表面保持双曲面特征。巧合的是，经过数百万年的自然选择，植物树叶也形成了这种双曲面结构。双曲面结构在一个点上在两个垂直方向上具有正曲率和负曲率，这被认为有利于促进珊瑚钙化且通过扩大叶子的表面积来增强光合作用。哺乳动物骨小梁的微观结构也证明具有这种双曲面结构。也就是说，双曲面结构可能是自然界进化导向优化的普遍结果。

具有双曲面结构的组织工程支架体系可以应用于多种组织支架中，例如骨、软骨、血管、神经、皮肤等，但是人们对其具体应用仍然没有深入了解。

以骨支架为例，具有双曲面结构的骨支架在骨重建中的潜在作用从未被触及。每年，全球有超过200万例骨移植手术，涉及的医疗保健服务支出超过25亿美元。目前，骨组织工程支架被认为是治疗由外伤、肿瘤和其他传染病引起的大骨缺损的最有效方法，因为与自体及异体移植物相比，它们的来源广泛、可批量生产且更加可控。但是，由于成骨和血管生成能力不足，目前的骨组织工程支架无法在大骨缺损中获得良好的临床结果。为了增强骨组织工程支架的成骨和血管生成潜力，可以进行干细胞的接种或与生长因子和/或药物的掺入。然而，由于生长因子/药物的不可控释放和短半衰期，以及干细胞不可避免的伦理和道德问题，导致这些策略具有明显的局限性。

因此，最近的研究集中在调控支架的物理刺激以调节细胞行为和功能以增强支架成骨和成血管能力。例如，凹面或凸面的表面形貌对干细胞的行为和功能具有显着影响，因为它们可以影响干细胞膜上的蛋白质聚集或使细胞核变形，从而激活不同的细胞信号通路(例如,Rho、Wnt、FAK、TGF-β/BMP)来调控干细胞分化，促进骨修复。然而，具有骨小梁仿生双曲面结构的骨组织工程支架尚未被制备，且双曲面结构对再生的细胞行为和功能的影响也从未被提及。

本发明测目的是制造具有特定双曲面结构的生物支架，应用于例如骨、软骨、血管、神经、皮肤和人工器官等的人体组织、器官中。

发明内容

根据本公开的一个方面，公开了一种具有表面双曲面结构的支架。所述支架内部具有多个孔隙，所述多个孔隙的表面的所有点均具有双曲面结构。

另一方面，公开了一种制造上述支架的方法。其包括以下步骤：1)准备原材料；2)将所述原材料制备为3D打印墨水；3)利用3D打印技术将所制备的3D打印墨水打印为支架。

附图说明

当结合附图进行时，本公开的上述和其他目的和特征将从本公开的以下描述变得显而易见。

图1示出了双曲面构型示意图；

图2示出了根据本发明的一个实施方式的TPMS支架的设计和特征；

图3A-3F示出了根据本发明的一个实施方式的TPMS支架的图像、性能等。G0、G2、G4和G6支架分别为高斯曲率为0、-2、-4、-6的TPMS支架。

图4A示出了G0、G2、G4和G6支架的生物相容性。

图4B示出了细胞培养后的存活率。

图4C示出了rMSCs在支架上的增殖效率。

图5A-5D示出了G0、G2、G4和G6支架的成骨诱导能力。

图6A-6D示出了G0、G2、G4和G6支架对细胞形貌的调控作用。

图7A-7C示出了G0、G2、G4和G6支架对细胞核形貌的调控作用。

图8A-8C示出了G0、G2、G4和G6在植入兔股骨缺损后4周和8周的显微CT扫描与骨质定量结果。

图9A-9C示出了G0、G2、G4和G6在植入兔股骨缺损后4周和8周的组织学染色结果。

具体实施方式

虽然本发明容许许多不同形式的实施方式，但在附图中示出且在本文中将详细描述本发明的优选实施方式，其中要理解本公开应被视为本发明的原理的举例说明，且并不意图将本发明的广泛方面限制于所示的实施方式。出于本详细描述的目的，词语“和”和“或”应为连词和反意连词；词语“所有”意指“任何和所有”；词语“任何”意指“任何和所有”；并且词语“包括”意指“包括但不限于”。

双曲面是指双曲线绕其对称轴旋转而生成的曲面。双曲面是一种二次曲面，如图1所示，其分为单叶双曲面、双叶双曲面。单页双曲面由以下等式限定：

双叶双曲面由以下等式限定：

双曲面的高斯曲率小于0。

本发明旨在将上述双曲面应用于各种支架，制造具有双曲面结构的支架，使得支架内部具有多个孔隙，孔隙的表面的所有点都具有双曲面结构，也即，高斯曲率小于0；每个点可以具有不同的曲率。这些孔隙可以彼此连通。

上述双曲面结构可以根据需要采取任何合适的架结构，例如三重周期性最小表面(TPMS)结构。TPMS结构是一种由连续和光滑的曲面组成的结构，允许大的表面积和连续的内部通道，可很好地避免应力集中。其在表面的每一个点，均具有典型的双曲面结构(高斯曲率都小于0)。

本发明所要求保护的支架可以应用于多种场合，例如作为生物支架应用于骨、软骨、血管、神经、皮肤和人工器官等的人体组织、器官中。

本发明所要求保护的支架可以根据具体的应用场景由任何合适的材料通过适合的制备方法制成。例如使用β-磷酸三钙(β-TCP)陶瓷粉末通过3D打印制成骨支架体系。β-TCP陶瓷粉末对于骨再生有公认的良好骨传导性和骨诱导性。

还可以使用诸如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)等高分子聚合材料，通过光固化打印成皮肤支架体系。使用GelMA具有优异的生物相容性，而与胶原性能相近，可以有效地促进表皮的再生。

还可以使用诸如钛合金、镁合金等金属材料，通过打印制备关节假体。镁合金具有良好的力学支撑，并且可以形成良好的骨整合界面，降低假体植入后骨溶解的风险。

在制备上述具有双曲面结构的支架时，为进一步改进材料的性能，可以根据需要，在打印的陶瓷浆料中添加例如ZnCl₂、CuCl₂、MgCl₂、SrCl₂等原料，使得所制成的支架具有一种或者多种具有生物活性的金属离子，例如，Zn²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Sr²⁺、Mn²⁺、Al³⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ag⁺、Li⁺等金属离子，使得支架具有所需的性能和功能。例如，Zn²⁺的掺杂可以使双曲面结构支架具备免疫调控作用，调节支架植入后的免疫反应，促进M2巨噬细胞的极化，从而促进骨整合；Cu²⁺的掺杂可以使双曲面结构支架具备抗菌作用，有效的抑制骨支架植入后的细菌增殖，减少植入物感染的风险；Mg²⁺与Sr²⁺均具备促进新生血管生成的能力，使双曲面结构支架具备促血管化的能力，提高植入物位置的早期血管生成，促进营养物质交换与干细胞的增殖，促进骨再生的进程。在制备金属支架后，可进一步通过电催化表面沉积的方法，使得所制成的支架具有一种或者多种不同表面微纳米结构，使得支架具备有促进细胞粘附，成骨细胞分化等作用，进而促进骨修复。

根据需要，可以对本发明的支架的表面进行表面处理，从而，使得支架在某方面具有更佳的或者所需的性能。例如，可以将支架表面施加生物活性薄膜以释放/生成生物活性分子，从而增强支架的生物活性。对骨支架而言，所述生物活性薄膜可以是例如在支架上原位催化体内循环物质生成一氧化氮(NO)或者装载含亚硝基硫醇类药物能稳定释放NO。NO是可以促进血管生成的内源性生物活性气体，可调节骨再生信号通路。NO生成支架对新生血管能力受损的患者特别有帮助，例如骨缺损大的患者或接受血管生成抑制剂的癌症患者，其可在支架上原位生成一氧化氮，增强支架的生物活性。

可以基于3D打印，针对不同的制备材料，通过合适的制备方法来制造本发明的具有双曲面结构的支架。其包括以下步骤：

1)准备原材料；所述原材料可以是前述陶瓷粉末、金属材料和高分子聚合物等等。

2)将所述原材料制备为3D打印墨水。

3)利用3D打印技术将所制备的墨水材料打印为支架。

以使用β-TCP制造TPMS支架为例，其包括以下步骤：1)提供纳米β-TCP粉末、可光交联的光敏树脂和光引发剂。2)将纳米β-TCP粉末与可光交联的光敏树脂混合，充分球磨混匀，添加适当比例的光引发剂，配置成可打印的浆料。3)将事先设计好的TPMS支架导入打印机，对结构进行分层，必然时添加支撑。通过优化打印和后处理参数，最终能够制备具有不同高斯曲率的支架。

对于金属材料，可通过选择性激光熔融技术(SLM)制备钛合金TPMS支架。经过钛合金粉末的制备与筛选，然后优化打印参数，最终能够制备具有不同高斯曲率的支架。本发明要求保护的支架的内部具有多孔结构，空隙表面的每一个点其均具有双曲面结构；因而具有很好的力学性能，由于支架的表面是光滑的，可以避免应力集中，因此在相同孔隙率下，可以承受更大的力；同时支架内部的孔洞是连通的，对流体具有更好的通透性，也更有利于组织的长入；此外，支架具有很大的内部表面积，有利于后期在支架的表面进行镀膜或电催化沉积制备表面纳米结构等处理。

下面参考图2和图3A-3F说明根据本发明的一个具体实施例的具有双曲面结构的支架。在该实施例中，设计了三重周期性最小表面(TPMS)骨结构支架，适于骨移植、骨矫正等医学临床应用。该支架在表面的每个点均体现了仿生双曲面结构。该实施例是用β-磷酸三钙(β-TCP陶瓷粉末)通过3D打印(例如，基于光刻的3D打印技术)而成，具有0，-2、-4和-6mm^-2不同平均高斯曲率，其具有60％的孔隙率。这些支架分别表示为G0、G2、G4和G6，其中，G0是具有60％孔隙率和0高斯曲率的常规桁架支架，用作对照，G2、G4和G6的曲率在天然小梁骨范围内。

图2示出了TPMS支架的设计和特征。发明人从珊瑚矿化、树叶光合作用以及小梁骨的微观结构得到启发，设计了TPMS骨支架，用于在临床植入患者体内，协助患者的骨再生。

图3A-3F示出了支架的图像、性能等。图3A示出了G0、G2、G4和G6的图形表示。图3B示出了利用有限元分析(FEA)计算的所有支架的平均高斯曲率，其中G2、G4和G6组从-2到-6mm^-2呈现明显不同的高斯曲率分布，而G0组支架在所有表面点上均呈现0高斯曲率分布。

图3C示出了通过高分辨率微CT分析对G0、G2、G4和G6的空间内部结构的评价的接过。如图所示，所有支架都表现出良好的通透性，这有利于组织再生中营养交换和新组织浸润。

图3D是G0、G2、G4和G6支架的孔隙率的量化。图3E是其SEM图像。图3F示出了抗压强度。*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001表示统计显著性。

此外，支架的几何完整性通过将其CAD模型与由micro-CT重建的相应3D形状进行比较来评估。所有支架在整个3D结构中都呈现出高度重叠。从数量上讲，所有支架G0、G2、G4和G6的孔隙率、平均孔径和支柱厚度的重现性范围为93.33％-98.89％(表1)。

表1通过微CT确定的G0、G2、G4和G6支架的重现性

图4A示出了G0、G2、G4和G6支架的生物相容性。如图所示，各组支架均具备优异的生物相容性，hMSCs(人间充质干细胞)培养3天后未见明显细胞死亡。图4B示出了细胞培养后的存活率，各组支架均大于90％。图4C示出了hMSCs在支架上的增殖效率，G6在3天与7天的的增殖显著高于其他组。*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001表示统计显着性。

图5A-5D示出了G0、G2、G4和G6支架的成骨诱导能力。骨诱导可以有效地促进hMSCs的成骨分化。图5A示出了随着曲率的提升，支架提高了碱性磷酸酶染色的阳性率，图5B示出了G2、G4和G6支架可以显著提高细胞碱性磷酸酶活性。图5C和D示出了G2、G4和G6支架显著促进后期成骨指标茜素红染色。*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001表示统计显著性。

图6A-6D示出了G0、G2、G4和G6支架对细胞形貌的调控作用。图6A示出了不同支架的曲面高度与对应hMSCs在不同支架上细胞骨架与黏着斑蛋白的染色。如图所示，随着曲率的提升，细胞形貌逐渐狭长并且黏着斑附着位置向细胞核靠近。

图6B示出了hMSCs贴附后细胞面积的相对值。如图所示，随着曲率的提升，hMSCs的附着面积逐渐减小。图6C示出了hMSCs贴附后细胞尺寸的纵横比，如图所示，随着曲率的提升，hMSCs的纵横比逐渐上升。*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001表示统计显著性。

图6C示出了hMSCs贴附后黏着斑蛋白在细胞核附近的表达数量。如图所示，随着曲率的提升，hMSCs细胞核的黏着斑表达逐渐上升。*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001表示统计显著性。

图7A-7C示出了G0、G2、G4和G6支架对细胞核形貌的调控作用。图7A示出了不同支架上hMSCs的细胞核形貌。如图所示，随着曲率的提升，细胞形貌逐渐呈皱缩改变，G6组最为明显。图7C示出了细胞核膜蛋白表达的相对强度，如图所示，随着曲率的提升，核膜蛋白表达逐渐上升。*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001表示统计显著性。

图8A-8C示出了G0、G2、G4和G6在植入兔股骨缺损后4周和8周的micro-CT扫描与骨质定量结果。图8A示出了G0、G2、G4和G6植入兔股骨缺损后显微CT扫描的三维重建，如图所示，随着曲率的提升，兔股骨缺损区域新生骨质逐渐增多。

图8B示出了植入区域骨密度的定量，如图所示，随着曲率的提升缺损区域骨密度逐渐提高。图8B示出了植入区域骨组织与总组织体积比，如图所示，随着曲率的提升缺损区域骨组织与总组织体积比逐渐提高。*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001表示统计显著性。

图9A-9C示出了G0、G2、G4和G6在植入兔股骨缺损后4周和8周的组织学染色结果。图9A示出了G0、G2、G4和G6植入兔股骨缺损后HE染色结果，如图所示，支架植入后可以有效的促进新生组织的长入，随着曲率的提升，兔股骨缺损区域新生骨质逐渐增多。

图9B示出了G0、G2、G4和G6植入兔股骨缺损后Masson三色染色结果，如图所示，随着曲率的提升，兔股骨缺损区域新生成熟骨质逐渐增多。图9C示出了G0、G2、G4和G6植入兔股骨缺损后骨组织面积定量结果，随着曲率的提升，兔股骨缺损区域新生骨质面积逐渐增多。

实验表明，与孔隙率相同的40MPa对照组G0相比，G2、G4和G6支架的抗压强度显著提高到60MPa左右。这表明，本发明的最小表面设计可以有效地减少应力集中并促进压缩过程中的载荷分布。值得注意的是，TPMS支架的抗压强度与具有相同孔隙率的天然小梁骨的机械性能相当。

实验表明，G0、G2、G4和G6支架具有优异的生物相容性，可以有效地促进hMSCs的成骨分化；并可以增强hMSCs的血管生成旁分泌作用，并且通过调节高斯曲率可以进一步调节上述的旁分泌作用。

实验表明，本发明的支架在支持新骨形成方面的巨大潜力。可以促进新血管形成和浸润，这对于完全骨再生至关重要；可以显着增强体内新骨重建，并为临床骨缺损治疗提供良好的前景。

实验表明，上述实施例中的支架可以很好地支持人间充质干细胞(hMSCs)的存活和增殖。此外，它们可以在体外显着增强hMSCs的成骨分化和血管生成旁分泌。这些独特的功能使本发明的支架更接近于安全有效的骨修复移植物，具有巨大的临床转化潜力。它将为制造可编程成骨界面作为临床骨移植物奠定基础。

上述实施例可以应用在临床上转化为商业化，将使全世界患有骨缺损的患者受益，包括外伤、先天性异常、感染(骨髓炎)和癌症导致的组织切除等。也将通过合适的材料(例如，用于骨软骨再生的透明质酸)应用于范围广泛的组织再生支架(例如，骨软骨再生)。

以上具体实施方式说明了用β-磷酸三钙(β-TCP陶瓷粉末)通过3D打印制成的三重周期性最小表面(TPMS)骨结构支架。然而本领域普通技术人员明白，本发明不限于此，可以根据需要，使用前述各种材料，利用前述各种适合的制造方法，制造处具有各种结构、形状和性能的支架，应用于例如骨、软骨、血管、神经、皮肤和人工器官等的人体组织、器官的多种场合。

本文所述的发明主题的各种实施方式的特征，无论对其并入其中的示例实施方式多么重要，并不作为整体限制发明主题，并且对本发明、其元件、操作和应用的任何提及不作为整体限制，而仅用于限定这些示例实施方式。因此，此详细描述不限制仅由所附权利要求书限定的实施方式。此外，由于本领域技术人员可以容易地想到许多修改和改变，因此不希望将发明主题限于所示和描述的确切构造和操作，并且因此在发明主题的范围内，可以采取所有合适的修改和等同物。

Claims (15)

1.一种具有表面双曲面结构的支架，所述支架内部具有多个孔隙，

其特征在于，所述多个孔隙的表面的所有点均具有双曲面结构。

2.如权利要求1所述的支架，其特征在于，所述双曲面结构是三重周期性最小表面结构，且支架的高斯曲率为0至-6。

3.如权利要求1所述的支架，其特征在于，所述支架具有20％-90％的孔隙率。

4.如权利要求1所述的支架，其特征在于，所述多个孔隙彼此连通。

5.如权利要求1所述的支架，其特征在于，所述支架由陶瓷材料、金属材料、或高分子聚合物制成。

6.如权利要求5所述的支架，其特征在于，所述陶瓷材料是β-磷酸三钙。

7.如权利要求5所述的支架，其特征在于，所述金属材料是钛合金或者镁合金。

8.如权利要求5所述的支架，其特征在于，所述高分子聚合物是聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸酐化明胶或者聚醚醚酮。

9.如权利要求1所述的支架，其特征在于，所述支架添加一种或者多种具有生物活性的金属离子。

10.如权利要求9所述的支架，其特征在于，所述一种或多种金属离子是从由以下离子组成的组中选择出：Zn²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Sr²⁺、Mn²⁺、Al³⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ag⁺、Li⁺。

11.如权利要求1所述的支架，其特征在于，所述支架具有大比表面积，并且被施加表面处理。

12.如权利要求11所述的支架，其特征在于，所述支架的多个孔隙的表面被施加生物活性薄膜，以释放生物活性分子，增强支架的生物活性。

13.如权利要求11所述的支架，其特征在于，所述生物活性薄膜具备释放/生成一氧化氮功能。

14.如权利要求1-13中任意一项所述的支架，其特征在于，所述支架是用于临床治疗的生物支架。

15.一种制造如权利要求1-14中之一所述的支架的方法，其包括以下步骤：

1)准备原材料；

2)将所述原材料制备为3D打印墨水；

3)利用3D打印技术将所制备的3D打印墨水打印为支架。

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