CN115715761B

CN115715761B - 一种壳聚糖/海藻酸与花色苷界面协同作用稳定的Pickering乳液

Info

Publication number: CN115715761B
Application number: CN202211017645.7A
Authority: CN
Inventors: 李嘉诚; 冯玉红; 余高波; 黄俊浩
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2022-08-23
Filing date: 2022-08-23
Publication date: 2024-05-14
Anticipated expiration: 2042-08-23
Also published as: CN115715761A

Abstract

本发明提供了一种壳聚糖/海藻酸与花色苷界面协同作用稳定的Pickering乳液，包括油水两相，其稳定剂除了羟丙基壳聚糖和海藻酸钠外，还采用了提取自紫玉米苞叶的花色苷复合物。本发明采用HPCS‑Alg/PCBA作为稳定剂，羟丙基壳聚糖/海藻酸与花色苷界面协同作用稳定Pickering乳液，增强了Pickering乳液物理稳定性、热稳定性、氧化稳定性，有利于乳液的长期储存，也有助于理解多糖‑多酚在溶液和乳化体系中的相互作用，同时为多酚活性物质在生物医药、化妆品、食品、石油和废水处理等领域，尤其是界面胶体和食品领域的开发和应用提供新的思路。

Description

一种壳聚糖/海藻酸与花色苷界面协同作用稳定的Pickering 乳液

技术领域

本发明涉及一种Pickering乳液，尤其涉及一种壳聚糖/海藻酸与花色苷界面协同作用稳定的Pickering乳液。

背景技术

目前，水包油(O/W)乳化体系在化妆品、医药和食品工业等领域都发挥了重要作用。然而，乳液因具有庞大油水界面面积，易受到氧化侵蚀腐败变质而深受广大消费者和制造商的重视(Liu et al.,2016b；Tian et al.,2021)。相比于传统小分子稳定的乳液，Pickering乳液具有更为优异的物理/化学稳定性，因为它的稳定机理归因于胶体颗粒在油水界面的不可逆吸附，其既能稳定乳液又可在油水界面充当屏障阻隔促氧化剂和油脂的相互接触(Zhao et al.,2018)。特别是软胶体颗粒，它们不但具有良好的结构可控性、颗粒膜可逆弯曲性、折叠性，还能在油水界面形成致密的界面膜或三维网络聚集体结构防止油滴的移动、碰撞、团聚和氧化。例如，Atarian等人报道了，由壳聚糖-硬脂酸纳米凝胶稳定的Pickering乳液比传统吐温80表面活性剂稳定的Pickering乳液具有更高的氧化稳定性，因为乳液液滴的电荷会影响脂质氧化过程中过渡金属的吸收和去除(Atarian et al.,2019)。Kargar等人在文献中提到，Pickering乳液油水界面吸附的酪蛋白酸钠颗粒能极大的降低脂质氧化速率，因为较厚的界面膜阻隔了促氧化剂对油脂的侵蚀(Kargar et al.,2011)。由此可知，Pickering乳液的界面膜结构与体系物理/化学稳定性息息相关，然而关于Pickering乳液界面厚度、结构均匀性、组成等和乳液氧化稳定性之间的关系目前尚未得到很好的建立。

近年来，关于带电聚合物间的静电作用已被广泛报道，利用电荷引力作用形成软胶体颗粒增强Pickering乳液稳定性的例子也不在少数。例如，Xiong等人在pH＝5.5下利用卵清蛋白和壳聚糖的静电相互作用络合，成功地提高了乳液物理稳定性(Xiong et al.,2018)。Shahid等人指出，高度稳定的乳液可以通过调节带相反电荷的聚电解质的浓度进行调控(Shahid et al.,2021)。显然，多糖基颗粒由于具有出色的可再生性、生物相容性和可降解性，是一种很有潜力的软胶体颗粒设计材料。壳聚糖是自然界中唯一的阳离子多糖，但较差的溶解度限制了该多糖的应用。羟丙基壳聚糖(HPCS)是壳聚糖的一种重要的水溶性功能衍生物，其广泛应用于药物输送、组织工程和伤口愈合等领域(Rong et al.,2020)。海藻酸钠(Alg)是一种具有生物相容性的线性阴离子天然聚合物，含有(1→4)连接的β-d-甘露糖醛酸(M)和α-l-古洛糖醛酸(G)残基块，其常被充当两亲性生物聚合物的亲水骨架(Linet al.,2021；Yang et al.,2021b)。对此，Tang等人曾通过实验指出，使用海藻酸钠涂层可制备了稳定的CS-Pickering乳液(Tang et al.,2021)。然而，很少有研究报道关于羟丙基壳聚糖-海藻酸钠交联形成软胶体颗粒稳定Pickering乳液。

目前，一种抗氧化剂界面吸附靶向吸附技术受到了广泛关注，因为该技术能极大的增强Pickering乳液的氧化稳定性。因此，许多天然抗氧化剂(如单宁酸(Yang et al.,2021a)、茶多酚(Tian et al.,2021)、花色苷等)已被用于抗氧化剂皮克林乳液制备。其中，花色苷是一种天然抗氧化剂，具有出色的抗氧化活性，且对人体和动物大脑、心脏、肝脏和肾脏等均具有良好的药理活性(Danielewski et al.,2020)。此外，许多研究表明，基于蛋白质的纳米颗粒可以通过非共价和共价相互作用与花色苷络合，形成物理/化学稳定性良好的Pickering乳液。如Yi等人通过将花色苷与乳清蛋白结合，成功制备了具有氧化稳定性高和物理稳定性强的Pickering乳液(Yi et al.,2020)。然而，关于花色苷对多糖基的Pickering乳液界面影响研究较少。受此启发，研究期望通过将软胶体颗粒与天然花色苷相结合来生产一种界面可调控的Pickering乳液。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种羟丙基壳聚糖/海藻酸与花色苷界面协同作用稳定的Pickering乳液，具有良好的物理稳定性、热稳定性、氧化稳定性。

本发明的第一个方面是提供一种壳聚糖/海藻酸与花色苷界面协同作用稳定的Pickering乳液，其特征在于，所述Pickering乳液包括油水两相，其稳定剂除了羟丙基壳聚糖和海藻酸钠外，还采用了提取自紫玉米苞叶的花色苷复合物(简称PCBA)。

其中，所述花色苷复合物为紫玉米苞叶的50-70％(v/v)乙醇提取物，优选为紫玉米苞叶的55-65％(v/v)乙醇提取物，更优选为紫玉米苞叶的60％(v/v)乙醇提取物。

添加的PCBA(即水相中花色苷复合物的浓度＞0)后，能与HPCS-Alg协同作用，增强Pickering乳液的物理稳定性、热稳定性以及抗氧化活性等。

优选地，水相中花色苷复合物的浓度≥0.001mg/mL，更优选为≥0.025mg/mL，更优选为≥0.05mg/mL，更优选为≥0.10mg/mL，更优选为≥0.15mg/mL，更优选为≥0.2mg/mL，更优选为≥0.30mg/mL。

优选地，水相中羟丙基壳聚糖的浓度为0.1-10mg/mL，更优选为0.5-8mg/mL，更优选为1-5mg/mL，更优选为2-3mg/mL。

优选地，水相中海藻酸钠的浓度为0.1-10mg/mL，更优选为0.5-8mg/mL，更优选为1-5mg/mL，更优选为2-3mg/mL。

优选地，水相中羟丙基壳聚糖和海藻酸钠的重量比为1:0.1-10，更优选为1:0.2-0.8，更优选为1:0.5-5，更优选为1:0.8-2，更优选为1:1。

优选地，水相和油相的体积比为1:0.1-10，例如1∶0.2、1∶0.3、1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8、1∶0.9、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、或1∶10等。

其中，所述油相包括与水不互溶或微溶于水的溶剂，所述溶剂优选为硅油、脂肪酯类、芳香烃、C链长度为6-16的烷烃和醇类、C链长度为22-50的石油烃类中的任意一种或者至少两种的混合物，进一步优选为脂肪酯类、C链长度为6-16的烷烃或醇类中的任意一种或者至少两种的混合物。

其中，所述油相可以为常见的用于制备乳液的油相，本发明在此不作特别限定，本领域技术人员可根据实际应用的需要合理选择。优选地，所述油相可以仅由与水不互溶或微溶于水的溶剂组成，优选地，所述油相中可包含其他可溶性物质，所述油溶性物质选自脂溶性药物、脂溶性标记物、脂溶性酶类或脂溶性蛋白中的任意一种或者至少两种的混合物。

其中，所述水相可以为常见的用于制备乳液的水相，本发明在此不作特别限定，本领域技术人员可根据实际应用的需要合理选择。优选地，所述水相包括水、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液中的任意一种或者至少两种的混合物。

优选地，所述水相还包括其他水溶性物质，所述水溶性物质为盐类、抗体、蛋白多肽药物酶类、细胞因子或糖类中的任意一种或者至少两种的混合物。所述盐类物质为氯化钠、乙酸钠、氯化钾、氯化钙等。

本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的Pickering乳液的制备方法，其特征在于，取羟丙基壳聚糖、海藻酸钠和花色苷复合物溶解和/或分散于水相中，加入油相，高速剪切，即得。

其中，所述花色苷复合物提取方法如下：以紫玉米苞叶为原料，采用50-70％(v/v)乙醇为溶剂，加入醋酸为酸化剂，加热提取或超声提取。

优选地，采用55-65％(v/v)乙醇为溶剂，更优选采用60％(v/v)乙醇为溶剂。

优选地，料液比10-50g/mL，更优选为20-40g/mL，更优选为30mL/g。

优选地，加热提取温度为30-50℃，更优选为35-45℃，更优选为40℃。

优选地，加热提取时间为1-3h，更优选为1.5h。

优选地，超声提取的超声功率为200-500W，更优选为250-400W，更优选为300W。

优选地，超声提取时间为8-15min，优选为10min。

本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的Pickering乳液的用途，其用于生物医药、化妆品、食品、石油和废水处理领域。

本发明采用HPCS-Alg/PCBA作为稳定剂，羟丙基壳聚糖/海藻酸与花色苷界面协同作用稳定Pickering乳液，增强了Pickering乳液物理稳定性、热稳定性、氧化稳定性，有利于乳液的长期储存，也有助于理解多糖-多酚在溶液和乳化体系中的相互作用，同时为多酚活性物质在生物医药、化妆品、食品、石油和废水处理等领域，尤其是界面胶体和食品领域的开发和应用提供新的思路。

附图说明

图1为(a)Alg(b)HPCS(c)HPCS-Alg(d)HPCS-Alg含0.05mg/mL PCBA与(e)HPCS-Alg含0.15mg/mL PCBA样品水溶液自组装形貌表征。

图2为PCBA，Alg，HPCS，HPCS-Alg及HPCS-Alg/PCBA傅立叶红外光谱图。

图3为Alg，HPCS，HPCS-Alg及HPCS-Alg/PCBA稳定Pickering乳液的外观和显微成像图。

图4(a)PCBA含量变化对Pickering乳液TSI值，(b)PCBA含量变化对Pickering乳液外观影响，(c)不同PCBA含量下HPCS-Alg稳定乳液的CLSM图像。

图5为PCBA对Pickering乳液的热稳定性影响：(a1)不含PCBA(a2)含0.2mg/mLPCBA。

图6(a)QCM-D研究的HPCS-Alg/PCBA在油水界面的吸附行为示意图；(b)ΔD，Δf的随时间变化过程；(c)胶体颗粒界面膜质量和厚度随时间变化过程。

图7为PCBA浓度不同的Pickering乳液SEM图像。(注:HPCS和Alg均为2mg/mL，油:水＝1:1)。

图8(a)过氧化异丙苯标准的曲线；(b)1，1，3，3-四乙氧基丙烷标准的曲线(c-f)Pickering乳液氧化产物苯过氧化氢和丙二醛的含量测定(b和c：以葵花籽油为油相，e和f：以葵花籽油为油相)。

图9为PCBA对HPCS-Alg聚电解质胶体颗粒稳定Pickering乳液氧化稳定性的机理推测。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1、HPCS-Alg/PCBA稳定Pickering乳液制备

(1)PCBA的制备

以紫玉米苞叶为原料，采用50-70％(v/v)乙醇为溶剂，加入醋酸为酸化剂，加热提取或超声提取：

通过摇床振荡辅助提取花色苷，优化了紫玉米苞叶中花色苷的提取条件，其优化结果为乙醇浓度60％(v/v)，提取时间1.5h，提取温度40℃，料液比30g/mL，醋酸为酸化剂。另外超声波辅助提取花色苷优化结果为乙醇浓度60％(v/v)，超声时间10min，超声功率300W，料液比30g/mL，酸化剂：醋酸。最高提取率为52mg/g，这说明紫玉米苞叶中含有丰富的花色苷。

此外，经花色苷结构鉴定结果可知，PCBA样品中可能含有7种花色苷，其中6种可能为矢车菊-3-O-葡萄糖苷，天竺葵素-3-葡萄糖苷、矢车菊-3-(6′-丙二酰葡萄糖苷)、天竺葵素-3-(6′-丙二酰葡萄糖苷)、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷和牵牛花素-3-O-葡萄糖苷。其中矢车菊-3-O-葡萄糖苷含量最高，约为34mg/g。另外，实验发现玉米籽粒和苞叶花色苷总含量差别悬殊，但有玉米果实中约有3种花色苷在PCBA中未检测出。

(2)HPCS-Alg/PCBA稳定Pickering乳液

预先用纯水配置羟丙基壳聚糖(HPCS)(5mg/mL)、海藻酸钠(Alg)(5mg/mL)和PCBA(源于紫玉米苞叶提取的花色苷)(4mg/mL)作为储备溶液。按一定比例量取PCBA，HPCS和Alg溶液混合均匀，用纯水配置成PCBA不同浓度的水相(水相中HPCS浓度2mg/mL、Alg浓度2mg/mL、PCBA浓度0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.30mg/mL)，再加入油相(油水体积比＝1：1)，然后立即使用高速剪切机以19000r/min的转速对样品进行乳化3min，静置得到HPCS-Alg/PCBA稳定Pickering乳液。

(2)HPCS稳定Pickering乳液

用纯水配置浓度为2mg/mL的羟丙基壳聚糖溶液，再加入油相(油水体积比＝1：1)，然后立即使用高速剪切机以20000r/min的转速对样品进行乳化5min，静置得到HPCS稳定Pickering乳液(简称HPCS乳液)。

(3)Alg稳定Pickering乳液

用纯水配置浓度为2mg/mL的海藻酸钠溶液，再加入油相(油水体积比＝1：1)，然后立即使用高速剪切机以25000r/min的转速对样品进行乳化3min，静置得到Alg稳定Pickering乳液(简称Alg乳液)。

(4)PCBA稳定Pickering乳液

用纯水配置浓度为0.2mg/mL的PCBA溶液，再加入油相(油水体积比＝1：1)，然后立即使用高速剪切机以15000r/min的转速对样品进行乳化10min，静置得到PCBA稳定Pickering乳液(简称PCBA乳液)。

(5)HPCS-Alg稳定Pickering乳液

预先用纯水配置浓度为5mg/mL的羟丙基壳聚糖(HPCS)溶液和浓度为5mg/mL的海藻酸钠(Alg)溶液，然后按一定比例将二者混合用纯水配置成含HPCS 2mg/mL、Alg 2mg/mL的水溶液，再加入油相(油水体积比＝1：1)，然后立即使用高速剪切机以30000r/min的转速对样品进行乳化2min，静置得到HPCS-Alg稳定Pickering乳液(简称HPCS-Alg/PCBA乳液)。

2、胶体颗粒的显微结构表征

分别取100μL新鲜制备的HPCS乳液、Alg乳液、HPCS-Alg乳液和HPCS-Alg/PCBA乳液滴在铜网上，待样品充分干燥后，在通以加速电压下将负载样品的铜网使用JEM 2100透射电子显微镜对胶体颗粒形貌进行记录。

为了测试PCBA对HPCS-Alg胶体颗粒分散性的影响，试验表征了HPCS、Alg、HPCS-Alg及不同PCBA浓度下HPCS-Alg的自组装形貌。测试结果如图1所示。单独Alg溶液呈线性分布，单独HPCS溶液为球形聚集分布，而HPCS-Alg胶体颗粒轮廓清晰，粒径增大，这主要归因于HPCS与Alg间的静电吸引作用。然而当PCBA浓度仅为0.05mg/mL时，HPCS-Alg/PCBA胶体颗粒不但分散均匀，而且粒径偏小。且当PCBA含量提升至0.15mg/mL时，胶体颗粒有所团聚。研究推测这种现象应归因于PCBA和HPCS-Alg之间力的相互作用，并表明PCBA对HPCS-Alg胶体颗粒具有一定的分散效果，其可能有利于构建稳定的Pickering乳液。

3、傅立叶红外光谱分析

首先，将新鲜制备的将新鲜制备的PCBA乳液、HPCS乳液、Alg乳液、HPCS-Alg乳液和HPCS-Alg/PCBA乳液进行冷冻干燥得到干燥的样品，然后取微量样品与KBr均匀混合。最后使用FTIR-650(G)在400-4000cm-1波段内记录样品的光谱。

为了明确PCBA与HPCS-Alg胶体颗粒间的相互作用，实验就PCBA乳液、HPCS乳液、Alg乳液、HPCS-Alg乳液和HPCS-Alg/PCBA乳液干燥后的样品的的红外光谱进行了表征，结果如图2所示。在PCBA光谱中，3433cm^-1特征峰为-OH伸缩振动，1715cm^-1峰为C＝O伸缩振动；1626cm^-1峰对应C＝O和芳香族化合物中的C-O-C的伸缩振动；1397cm^-1为苯环骨架的C-C伸缩振动。此外，1071cm^-1和1030cm^-1为苯环C-H变形峰，1280cm^-1为弱吡喃环黄酮类化合物的特征峰。在Alg红外光谱图中，3422cm^-1对应Alg骨架上的O-H伸缩振动；2923cm^-1为Alg骨架上-CH₂的伸缩振动峰；1607cm^-1和1414cm^-1为-COOH不对称伸缩振动峰；1029cm^-1处的吸收峰为-COOH的伸缩振动峰(Chen et al.,2017)。此外，在HPCS红外光谱图中，3401cm^-1处的特征峰为N-H伸缩振动，2973cm^-1和1378cm^-1特征峰对应-CH₃伸缩振动和弯曲振动。1659cm^-1为C＝O的特征峰，1561cm^-1为N-H弯曲振动，1060cm^-1为C-O伸缩振动。其次在HPCS-Alg聚电解质红外光谱图中，3401cm^-1处的峰归属于N-H和O-H伸缩振动，1612cm^-1是一个新峰，归因于-NH₂和-COOH之间的静电相互作用。最后，在HPCS-Alg/PCBA红外光谱图中，配合物中没有发现有新的特征吸收峰出现，说明PCBA和HPCS-Alg之间没有形成共价键。然而，N-H和O-H在3401cm^-1处的吸收峰移动至3420cm^-1，实验推测HPCS-Alg聚电解质和PCBA之间可能存在氢键作用。

4、PCBA对Pickering乳液稳定性影响分析

(1)乳液微观形貌观察

为了探究HPCS，Alg及PCBA对乳液稳定性的影响，实验首先利用光学显微镜对新鲜制备的HPCS乳液、Alg乳液、HPCS-Alg乳液和HPCS-Alg/PCBA乳液微观结构进行观察，然后通过Image J软件测量液滴尺寸分布。试验结果如图3所示。Alg无法稳定乳液，水油相分离明显。HPCS具有一定的乳化能力，其乳化液滴粒径主要分布在22μm左右。由HPCS-Alg稳定的乳液乳化层高度明显比HPCS稳定的乳液更高，且该样品的液滴尺寸缩减为12μm。而由HPCS-Alg/PCBA稳定的Pickering乳液，该乳液乳化层最厚，液滴尺寸最小，仅为5.5μm。由此可知，HPCS-Alg聚电解质胶体颗粒可形成稳定的Pickering乳液，而PCBA与HPCS-Alg聚电解质的相互作用可通过缩减液滴尺寸提高Pickering乳液的稳定性。

(2)多重光散射分析和激光共聚焦可视化观察

基于以上试验，为了进一步确定PCBA含量对Pickering乳液物理稳定性的影响，实验研究了不同PCBA浓度对Pickering乳液物理稳定性的影响。样品完成制备后，立即置于Turbiscan乳液稳定性分析仪中进行检测。仪器检测原理是基于多重光散射，即记录了透过样品的透射光强度和背散射光强度的变化，根据计算结果得到Turbiscan稳定性指数TSI值，该值随时间变化而变化，TSI值越大，说明样品越不稳定。测试结果如图4a所示，随着PCBA浓度升高，TSI值逐渐下降，这说明由HPCS-Alg/PCBA形成的Pickering乳液物理稳定性随PCBA含量升高而增强，该结果与乳液外观趋势一致(图4b)。

此外试验还通过CLSM观察了乳液的微观界面结构，乳液的显微结构通过FV1000激光共聚焦显微镜观察。在乳液剪切之前，使用1％体积分数的罗丹明B(10^-3mol/L)对HPCS-Alg多糖水溶液进行染色。形成乳液后取适量滴在载玻片上，最后于560nm激发光条件下记录Pickering乳液显微成像。研究结果如图4c所示，红色内圈是油相，红色荧光圈为罗丹明B染色的HPCS-Alg多糖聚电解质胶体颗粒。由此可知，该乳液为水包油乳液，它的稳定机理归因于多糖聚电解质胶体颗粒在油水界面的不可逆吸附。此外，从乳液轮廓大小亦可以清楚地观察到，随着PCBA含量的增加，乳液滴尺寸逐渐减小，其说明PCBA可通过减小乳液液滴尺寸提高Pickering乳液的物理稳定性。

(3)乳液热稳定性研究

最后，为了进一步研究乳液的热稳定性，将新鲜制备的含0.2mg/mL PCBA(图5中a1)的Pickering乳液(即HPCS-Alg/PCBA乳液)和不含PCBA(图5中a2)的Pickering乳液(即HPCS-Alg乳液)密封于玻璃瓶中，然后在70℃条件下水浴加热2小时，处理前后用光学显微镜和摄像机记录乳液显微粒径和外观变化，对比分析。结果如图5所示。热处理前，a1、a2样品粒径大小差异明显，a1样品液滴尺寸主要分布在11μm左右，而a2样品液滴尺寸仅约为5.5μm，a1样品明显有水相析出而a2样品油水分离不明显。热处理后，a1样品液滴尺寸增至15μm左右，而a2样品液滴粒径尺寸仍在5.5μm左右；并且由外观图可知，a样品水相进一步析出而b样品基本没有变化。因此可知，PCBA的添加提高了Pickering乳液的热稳定性。

5、HPCS-Alg/PCBA在油水界面的聚集行为

(1)油水界面微观结构表征

为了进一步了解HPCS，Alg及PCBA在油水界面的自组装过程以及各分子间的相互作用力，QCM-D被用于模拟油水界面乳化剂的吸附过程(图6a)。实验已知样品在油膜表面的吸附会导致频率(Δf)降低，而耗散(ΔD)为每个振荡周期消耗的能量除以系统中存储的能量之和，研究通过实时检测频率和耗散的变化有助于更深入的了解界面膜形成的过程和交联方式。

实验采用Q-Sense E4的QCM-D模型研究油/水界面HPCS-Alg/PCBA吸附动力学行为和界面流变学性质。QCM-D检测温度为25℃，流速为50μL/min。在纯水建立稳定的频率Δf和耗散ΔD基线后，先后通以HPCS溶液，Alg溶液，PCBA溶液最后通以纯水建立最终的油水平衡界面。

QCM-D测量结果如图6b和图6c所示。纯水建立平衡基线后，HPCS溶液被最先注入QCM腔室。在该过程中，由于HPCS胶体颗粒在油膜上发生吸附作用，Δf值迅速下降至-12Hz，ΔD值上升至10×10^-6，相应吸附质量和吸附层厚度分别为956ng/cm^-2和9.43nm，这说明有大量HPCS胶体颗粒沉积在油涂层传感器上并形成了柔性界面膜。待HPCS建立吸附平衡曲线后，Alg溶液紧接着被通入QCM腔室，从图中可观察到Δf值迅速下降至-30Hz，ΔD值上升到19.5×10^-6，该过程对应的吸附层质量和厚度又分别增加了836ng/cm^-2和8.72nm，由此可说明该吸附层是柔软而富有弹，且其作用机制应主要归因于静电吸附交联作用。

然而，当通道溶液更换为PCBA溶液时，发现PCBA小分子可在吸附层表面发生快速吸附，相应Δf和ΔD值分别降至-97Hz和17.5×10^-6。与此同时，PCBA层的质量和厚度分别为868ng/cm^-2和8.46ng cm^-2，那这也就意味着PCBA分子与HPCS-Alg吸附层存在较强的相互作用力，且由于ΔD值的降低说明PCBA与HPCS-Alg层发生交联作用，相应界面颗粒膜结构逐渐由柔性开始向刚性疏水膜转变。最后，QCM流通相更换为纯水，目的是冲洗掉吸附不牢固的多糖和多酚分子，然而这一过程中Δf和ΔD值在冲洗直至平衡变化微小，这说明PCBA在HPCS-Alg聚电解质胶体颗粒上的吸附过程是牢固的。此外试验还发现，与PCBA分子交联后有利于HPCS-Alg乳化剂形成更厚的界面膜结构。

(2)乳液表观形貌表征

为了可视化观察HPCS-Alg聚电解质在油滴表面的分布情况，实验采用油相固化法对样品进行表征。乳化前，苯乙烯(含2％mol AIBN)作为油相代替大豆油，乳化后敞口置于65℃的烘箱中诱导乳液固化。24h后收集固化的乳液，经去离子水洗涤后置于真空干燥箱40℃干燥一夜。最后取微量固化的乳液粘置于导电胶上，喷洒金粉，使用Verios G4 UC扫描电镜对样品进行观察记录。

为了进一步探究PCBA对Pickering乳液稳定性的影响，实验就苯乙烯(含2mol％AIBN)代替大豆油对乳液进行固化处理，并利用SEM观察乳化剂胶体颗粒在油水界面的形貌分布。结果如图7所示，仅由HPCS-Alg胶体颗粒稳定的Pickering乳液，大部分HPCS-Alg胶体颗粒在油水界面分散不均匀，并且存在低覆盖率的现象。

然而，当PCBA浓度仅为0.025mg/mL和0.05mg/mL时，在苯乙烯油滴表面能明显观察到HPCS-Alg胶体颗粒呈致密、均匀有序的方式吸附排列。由此可知，PCBA能有效缩减HPCS-Alg聚电解质胶体颗粒尺寸，通过促进了乳化剂在油水界面的吸附增强Pickering乳液的物理稳定性。但当PCBA含量为0.10mg/mL时，苯乙烯表面吸附的胶体颗粒数量有所下降，并当PCBA浓度升高为0.15和0.20mg/mL时，HPCS-Alg胶体颗粒转而吸附在液滴和液滴间形成三维桥架结构。这为PCBA进一步增强乳液物理稳定性提供了直接的证据，而0.10mg/mL PCBA则为桥接三维结构出现的转折点。因此可知，PCBA含量变化可敏感调控HPCS-Alg聚电解质胶体颗粒在油水界面的分散形貌。

6、乳液氧化稳定性研究

Pickering乳液氧化稳定性由脂质过氧化氢和丙二醛(MDA)的定量检测进行评估(Ju et al.,2020)。先在油/水比为1：1下形成乳液，而后于40℃的电加热培养箱中储存一周以加速乳液样品的氧化，最后对乳液进行取样分析。脂质过氧化氢检测，先取0.3mL乳液样品与1.5mL异辛烷和异丙醇(3：1，V/V)混合，涡旋振荡30s后于3000rpm离心5分钟。然后取200μL上清液与2.8mL甲醇/丁醇(2：1，V/V)溶液均匀混合，最后添加15μLNH4SCN(3.94M)和15μL二价铁离子溶液(0.132M BaCl2和0.144M FeSO4.7H2O以1:1的比例混合并通过0.22μm过滤器)。静置等待反应20分钟后，于λ＝510nm用UV-vis测试样品吸光度，同时以超纯水作为空白对照，以过氧化氢异丙苯制定标准曲线对脂质过氧化氢进行定量分析。

丙二醛测量方法为：取2mL经热存储的乳液与4mL硫代巴比妥酸(TBA)测试溶液(15％三氯乙酸和0.375％ TBA溶解在0.25M HCl中)在试管中混合。而后试管敞口在水浴中煮沸15min并迅速冷却至室温条件(Ju et al.,2020)。最后，取下层水相通过1.2μm微孔膜进行过滤。并于UV-visλ＝532nm记录样品的吸光度，最后使用1，1，3，3-四乙氧基丙烷作为外标进行量化。

为了进一步探究PCBA对HPCS-Alg聚电解质胶体颗粒稳定Pickering乳液氧化稳定性的影响，实验就大豆油和葵花籽油为模型模拟油脂的氧化过程。测试结果如图8(c-f)所示，经测定，无论是由大豆油还是葵花籽油形成的乳液样品，经过一周的热存储氧化后，其一次氧化产物脂质过氧化氢和二次氧化产物丙二醛含量均明显升高，说明乳液正在经历氧化、腐败进程。然而，在没有添加PCBA的HPCS-Alg乳液中，脂质氧化速率最高；但随着乳化体系内PCBA浓度增大，氧化产物的含量明显减少，这就说明乳液的氧化稳定性在添加PCBA后得到了增强。对此，试验就其氧化稳定性增强归因于以下两点：(1)PCBA通过氢键作用与HPCS-Alg聚电解质胶体颗粒交联牢固吸附在油水界面，并在该处充分发挥了花色苷自身良好的抗氧化活性从而阻止油脂氧化；(2)PCBA能调控HPCS-Alg聚电解质胶体颗粒在油水界面形成致密且较厚的物理屏障，它有助于阻隔油脂与氧化剂接触，进而抑制油脂氧化。此外本研究还就其稳定机理推测如示意图9所示。

本发明利用HPCS-Alg多糖聚电解质与PCBA通过氢键交联构建了一种新型抗氧化Pickering乳液，其有望用于食品、生物医药、化妆品、石油和废水处理等领域，尤其是食品领域。通过多尺度分析结果表明，PCBA在用于形成Pickering乳液时有助于提高该产品的物理稳定性、热稳定性以及抗氧化活性。此外研究还发现，由于PCBA和HPCS-Alg之间存在较强的氢键相互作用，其能有效调控HPCS-Alg胶体颗粒在水溶液中自组装的尺寸和分布。另外，与由HPCS-Alg聚电解质形成Pickering乳液界面结构相比，0.05mg/mL PCBA的添加有助于乳化剂颗粒形成致密均匀的界面膜结构；且当PCBA浓度高于0.10mg/mL时，胶体乳化剂颗粒在界面的吸附进而转变为了三维桥连结构。这为PCBA提高乳液物理/氧化稳定性提供了有利条件。最后，乳液氧化稳定性试验证实，乳液氧化稳定性与PCBA浓度存在剂量依赖关系，说明抗氧化Pickering乳液构建成功。该实验结果将有助于理解多糖-多酚在溶液和乳化体系中的相互作用，同时为多酚活性物质在界面胶体和食品领域的开发和应用提供新的思路。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种稳定的Pickering乳液，其特征在于，所述Pickering乳液包括油水两相，水相和油相的体积比为1:0.1-10；该Pickering乳液的制备方法为，取羟丙基壳聚糖、海藻酸钠和花色苷复合物溶解和/或分散于水相中，加入油相，高速剪切，即得；

所述花色苷复合物为紫玉米苞叶的50-70％(v/v)乙醇提取物；所述花色苷复合物提取方法如下：以紫玉米苞叶为原料，采用50-70％(v/v)乙醇为溶剂，加入醋酸为酸化剂，加热提取或超声提取；

水相中花色苷复合物的浓度为≥0.001mg/mL，水相中羟丙基壳聚糖的浓度为0.1-10mg/mL，水相中海藻酸钠的浓度为0.1-10mg/mL，水相中羟丙基壳聚糖和海藻酸钠的重量比为1:0.1-10。

2.根据权利要求1所述的Pickering乳液，其特征在于，所述花色苷复合物为紫玉米苞叶的55-65％(v/v)乙醇提取物，或者为紫玉米苞叶的60％(v/v)乙醇提取物。

3.根据权利要求1或2所述的Pickering乳液，其特征在于，水相中花色苷复合物的浓度为≥0.025mg/mL，或者为≥0.05mg/mL，或者为≥0.10mg/mL，或者为≥0.15mg/mL，或者为≥0.2mg/mL，或者为≥0.30mg/mL。

4.根据权利要求1或2所述的Pickering乳液，其特征在于，水相中花色苷复合物的浓度为≥0.025mg/mL，或者为≥0.05mg/mL，或者为≥0.10mg/mL，或者为≥0.15mg/mL，或者为≥0.2mg/mL，或者为≥0.30mg/mL。

5.根据权利要求1或2所述的Pickering乳液，其特征在于，水相中羟丙基壳聚糖和海藻酸钠的重量比为1:0.2-0.8，或者为1:0.5-5，或者为1:0.8-2，或者为1:1。

6.一种如权利要求1-5中任意一项所述的Pickering乳液的制备方法，其特征在于，取羟丙基壳聚糖、海藻酸钠和花色苷复合物溶解和/或分散于水相中，加入油相，高速剪切，即得。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述花色苷复合物提取方法如下：以紫玉米苞叶为原料，采用50-70％(v/v)乙醇为溶剂，加入醋酸为酸化剂，加热提取或超声提取。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，采用55-65％(v/v)乙醇为溶剂，或采用60％(v/v)乙醇为溶剂；

料液比10-50g/mL，或为20-40g/mL，或为30g/mL；

加热提取温度为30-50℃，或为35-45℃，或为40℃；加热提取时间为1-3h，或为1.5h；

超声提取的超声功率为200-500W，或为250-400W，或为300W；超声提取时间为8-15min，或为10min。