CN115698333A - 用于扩增和检测SARS-CoV-2的多核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本文公开了与通过核酸扩增测试(NAAT)检测SARS‑CoV‑2(例如用于扩增测试样品中的SARS‑CoV‑2和确定测试样品中SARS‑CoV‑2的存在和/或用于诊断COVID‑19)有关的引物和探针。具体地说，本公开内容描述了与SARS‑CoV‑2冠状病毒的N基因、ORF1ab或E基因结合，用于通过环介导等温扩增(LAMP)和分子信标杂交进行检测的引物和探针。
Description
相关申请的交叉引用
本申请是2020年6月25日提交的美国专利申请第16/912,462号的继续申请，该专利申请要求2020年3月23日提交的美国临时申请第62/993,523号和2020年4月14日提交的美国临时申请第63/009,803号的权益，其内容均通过引用以其整体并入。
本申请也是2020年6月25日提交的美国专利申请第16/912,446号的继续申请，该专利申请要求2020年3月23日提交的美国临时申请第62/993,523号和2020年4月14日提交的美国临时申请第63/009,803号的权益，其内容均通过引用以其整体并入。
序列表
本申请包括序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交并且在此通过引用以其整体并入。于2021年3月22日生成的所述ASCII副本被命名为TSM-055WO_SL.txt并且大小为23,595字节。
发明领域
本发明涉及分子生物学和核酸化学领域。本发明提供了用于检测SARS-CoV-2病毒的方法和试剂，该病毒是称为COVID-19的疾病的病原体。本发明还涉及医学诊断和预后领域。特别地，本发明涉及用于扩增和检测SARS-CoV-2病毒基因组中的某些基因的多核苷酸和方法。
背景
迫切需要为在全球传播的新型冠状病毒开发一种快速、负担得起的样品输入答案输出(sample-in answer-out)的护理点(POC)诊断平台。2020年3月11日，世界卫生组织(WHO)基于114个国家的118,000例病例和4,291例死亡，宣布由SARS-CoV-2病毒引起的COVID-19为大流行病。10天后，约翰霍普金斯冠状病毒资源中心(Johns HopkinsCoronavirus Resource Center)(https://coronavirus.jhu.edu/map.html)报告了全球329,858例确诊病例，死亡14,380例。三个月后，全球确诊病例超过850万例，并且死亡人数近50万人，几乎没有迹象表明疾病的传播在放缓。在整个这场公共卫生危机期间，无法对公众进行SARS-CoV-2感染的测试，显著阻碍了遏制该大流行病的努力。
本文公开的组合物和方法提供了用于使用环介导等温扩增检测SARS-CoV-2 RNA病毒的引物和探针。
发明概述
在一些实施方案中，本发明包括一种组合物，该组合物包含选自由组1至组17组成的组的多核苷酸组。在一些实施方案中，组合物还包含探针。在一些实施方案中，探针包含标记。在一些实施方案中，探针是标记的多核苷酸。在优选的实施方式中，标记是荧光团，其优选地共价附接到多核苷酸的末端。在特别优选的实施方案中，探针或多核苷酸是包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标。在一种实施方案中，荧光团是FAM，并且猝灭剂是Black Hole Quencher 1(BHQ1；LGC Biosearch Technologies)。在替代实施方式中，荧光团是ATTO 565或Alexa 594或Cy5，并且猝灭剂是BHQ1或BHQ2。
在一些实施方式中，组合物包含标记的多核苷酸，该多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:55的核苷酸5-27、SEQ ID NO.:56的核苷酸7-25、SEQ ID NO.:75的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:76的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:77的核苷酸5-29、SEQ IDNO.:78的核苷酸6-26、SEQ ID NO.:79的核苷酸5-29、SEQ ID NO.:80的核苷酸5-22、SEQ IDNO.:81的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:82的核苷酸4-22、SEQ ID NO.:83的核苷酸6-28、SEQ IDNO.:84的核苷酸6-25、SEQ ID NO.:85的核苷酸3-23和SEQ ID NO.:95的核苷酸2-24。在另外的实施方式中，标记的多核苷酸可以包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:55、SEQ ID NO.:56、SEQ ID NO.:75至85和SEQ ID NO.:95。在某些实施方式中，标记的多核苷酸的序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO.:55、SEQ ID NO.:56、SEQ ID NO.:75至85和SEQID NO.:95。
在某些实施方式中，组合物靶向SARS-CoV2的第一开放阅读框(ORF1ab)。在这样的实施方式中，多核苷酸组可以是组11或组13，并且标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:77的核苷酸5-29和SEQ ID NO.:79的核苷酸5-29。在一些实施方案中，标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:79，或者更优选地SEQ ID NO.:77。优选地，多核苷酸组为组11。在另一个靶向ORF1ab的实施方式中，多核苷酸组为组12，并且标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:78的核苷酸6-26。在一些实施方式中，标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:78。
在某些实施方式中，组合物靶向基因N，其编码一种核蛋白，该蛋白将正链病毒基因组RNA包装成螺旋状核糖核衣壳(RNP)，并通过其与病毒基因组和膜蛋白M的相互作用在病毒体组装期间发挥基础性作用。在这样的实施方式中，多核苷酸组可以是组5或组9，并且标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:75的核苷酸5-22、SEQ IDNO.:76的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:80的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:81的核苷酸5-22、SEQ IDNO.:82的核苷酸4-22、SEQ ID NO.:83的核苷酸6-28、SEQ ID NO.:84的核苷酸6-25、SEQ IDNO.:85的核苷酸3-23。在一些实施方案中，标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:75、SEQ ID NO.:76、SEQ ID NO.:80、SEQ ID NO.:81、SEQ ID NO.:82、SEQID NO.:83、SEQ ID NO.:84和SEQ ID NO.:85。优选地，多核苷酸组为组9。类似地，标记的多核苷酸的序列优选地为SEQ ID NO.:83。在靶向N基因的第二实施方案中，多核苷酸组为组1或组4，并且标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:55的核苷酸5-27。在这样的实施方案中，标记的多核苷酸优选地包含SEQ ID NO.:55。在靶向N基因的又另一种实施方案中，多核苷酸组为组3或组8，并且标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:56的核苷酸7-25。更优选地，标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:56。
在某些实施方式中，组合物靶向编码包膜蛋白的基因E。在这样的实施方式中，多核苷酸组选自由以下组成的组：组14、组15、组16和组17，并且标记的多核苷酸包含SEQ IDNO.:95的核苷酸2-24。更优选地，标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:95。在优选的实施方式中，分子信标的多核苷酸序列由SEQ ID NO.:95组成。
在某些实施方式中，用于检测SARS-CoV-2的存在的组合物包含SEQ ID NO.:49、SEQ ID NO.:50、SEQ ID NO.:51、SEQ ID NO.:52、SEQ ID NO.:53和SEQ ID NO.:54。在这样的实施方式中，组合物还可以包含分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和SEQ IDNO.:83。在另一种实施方式中，组合物还包含SEQ ID NO.:63、SEQ ID NO.:64、SEQ ID NO.:65、SEQ ID NO.:66、SEQ ID NO.:67和SEQ ID NO.:68。
在又另一种实施方案中，用于检测SARS-CoV-2的存在的组合物包含SEQ ID NO.:63、SEQ ID NO.:64、SEQ ID NO.:65、SEQ ID NO.:66、SEQ ID NO.:67和SEQ ID NO.:68。该组合物还可以包含分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和SEQ ID NO.:77。
本发明的又另一方面提供了一种组合物，该组合物包含：第一多核苷酸组和第二多核苷酸组，该第一多核苷酸组包含SEQ ID NO.:49、SEQ ID NO.:50、SEQ ID NO.:51、SEQID NO.:52、SEQ ID NO.:53和SEQ ID NO.:66；该第二多核苷酸组包含SEQ ID NO.:63、SEQID NO.:64、SEQ ID NO.:65、SEQ ID NO.:66、SEQ ID NO.:67和SEQ ID NO.:68。在一些实施方式中，组合物还包含：包含SEQ ID NO.:83的核苷酸6-28的第一标记的多核苷酸，以及包含SEQ ID NO.:77的核苷酸5-29的第二标记的多核苷酸。在一些实施方式中，第一多核苷酸包含SEQ ID NO.:83，并且第二标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:77。
在本文描述的许多实施方式中，探针是包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标。在其中多核苷酸组为组5或组9的实施方式中，分子信标包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:75的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:76的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:80的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:81的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:82的核苷酸4-22、SEQ ID NO.:83的核苷酸6-28、SEQ ID NO.:84的核苷酸6-25和SEQ ID NO.:85的核苷酸3-23。更优选地，分子信标包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:75、SEQ ID NO.:76、SEQ ID NO.:80、SEQ IDNO.:81、SEQ ID NO.:82、SEQ ID NO.:83、SEQ ID NO.:84和SEQ ID NO.:85。甚至更优选地，分子信标的多核苷酸序列由选自由以下组成的组的序列组成：SEQ ID NO.:75、SEQ IDNO.:76、SEQ ID NO.:80、SEQ ID NO.:81、SEQ ID NO.:82、SEQ ID NO.:83、SEQ ID NO.:84和SEQ ID NO.:85。在其它实施方式中，其中多核苷酸组是组1或组4，分子信标包含SEQ IDNO.:55的核苷酸5-27，并且更优选地包含SEQ ID NO.:55。在优选的实施方式中，分子信标的多核苷酸序列由SEQ ID NO.:55组成。在其中多核苷酸组为组3或组8的实施方式中，分子信标包含SEQ ID NO.:56的核苷酸7-25，更优选地包含SEQ ID NO.:56的完整序列。在优选的实施方式中，分子信标的多核苷酸序列由SEQ ID NO.:56组成。在实施方式中，其中多核苷酸组是组11或组13，分子信标包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:77的核苷酸5-29和SEQ ID NO.:79的核苷酸5-29。优选地，分子信标包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:77和SEQ ID NO.:79。在特别优选的实施方式中，分子信标的多核苷酸序列由SEQ ID NO.:77或SEQ ID NO.:79组成。在其中多核苷酸组为组12的实施方式中，分子信标包含SEQ ID NO.:78的核苷酸6-26，更优选地包含SEQ ID NO.:78的完整序列。在优选的实施方式中，分子信标的多核苷酸序列由SEQ ID NO.:78组成。在实施方式中，其中多核苷酸组是组14、组15、组16或组17，分子信标包含SEQ ID NO.:95的核苷酸2-24，更优选地包含SEQ ID NO.:95的完整序列。在优选的实施方式中，分子信标的多核苷酸序列由SEQ IDNO.:95组成。
本发明的一方面提供了分子信标，该分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸，其中多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:55的核苷酸5-27、SEQ ID NO.:56的核苷酸7-25、SEQ ID NO.:75的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:76的核苷酸5-22、SEQ IDNO.:77的核苷酸5-29、SEQ ID NO.:78的核苷酸6-26、SEQ ID NO.:79的核苷酸5-29、SEQ IDNO.:80的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:81的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:82的核苷酸4-22、SEQ IDNO.:83的核苷酸6-28、SEQ ID NO.:84的核苷酸6-25、SEQ ID NO.:85的核苷酸3-23和SEQID NO.:95的核苷酸2-24。在优选的实施方式中，分子信标的多核苷酸部分包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:55、SEQ ID NO.:56、SEQ ID NO.:75至85和SEQ ID NO.:95。更优选地，该序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO.:55、SEQ ID NO.:56、SEQ ID NO.:75至85和SEQ ID NO.:95。
本发明的又另一方面提供了检测测试样品中SARS-CoV-2的方法，该方法包括(a)从测试样品提取核酸，(b)通过使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和逆转录酶以及序列特异性引物组的反应混合物反应来扩增靶序列，其中所述序列特异性引物组选自由组1至组17组成的组；以及(c)检测步骤(b)的扩增产物的存在或不存在；其中所述扩增产物的存在指示测试样品中存在SARS-CoV-2。在一种实施方案中，靶序列在步骤(b)中的扩增在约60℃和约67℃之间进行少于30分钟。优选地，扩增步骤进行少于十五分钟。在一些实施方式中，链置换DNA聚合酶和逆转录酶活性由单个酶提供。
在某些实施方案中，检测扩增产物的存在或不存在包括将扩增产物与包含附接到标记的多核苷酸的探针杂交。在优选的实施方式中，标记是荧光团，其优选地附接到多核苷酸的末端。在特别优选的实施方案中，探针或多核苷酸是包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标。在一种实施方案中，荧光团是FAM，并且猝灭剂是BHQ1。在替代实施方式中，荧光团是ATTO 565或Alexa 594或Cy5，并且猝灭剂是BHQ1或BHQ2。在其它实施方式中，检测扩增产物的存在或不存在包括将扩增产物暴露于嵌入染料。
本发明的另一方面提供了检测测试样品中的SARS-CoV-2的方法，该方法包括(a)从测试样品提取核酸，(b)通过使在步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性LAMP引物组的反应混合物反应少于十分钟来扩增靶序列，以及(c)检测步骤(b)的扩增产物的存在或不存在；其中所述扩增产物的存在指示测试样品中存在SARS-CoV-2。在一些实施方式中，扩增步骤包括使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性引物组的反应混合物反应，其中所述序列特异性引物组选自由组1至组17组成的组。在这样的实施方式中，检测扩增产物的存在或不存在可包括将扩增产物与包含多核苷酸序列的分子信标杂交，该多核苷酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO.:55的核苷酸5-27、SEQID NO.:56的核苷酸7-25、SEQ ID NO.:75的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:76的核苷酸5-22、SEQID NO.:77的核苷酸5-29、SEQ ID NO.:78的核苷酸6-26、SEQ ID NO.:79的核苷酸5-29、SEQID NO.:80的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:81的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:82的核苷酸4-22、SEQID NO.:83的核苷酸6-28、SEQ ID NO.:84的核苷酸6-25、SEQ ID NO.:85的核苷酸3-23和SEQ ID NO.:95的核苷酸2-24。在这样的实施方式中，检测扩增产物的存在或不存在可以包括将扩增产物与分子信标杂交，分子信标由选自由以下组成的组的多核苷酸序列组成：SEQID NO.:55、SEQ ID NO.:56、SEQ ID NO.:75至85和SEQ ID NO.:95。
在检测测试样品中SARS-CoV-2的方法的某些实施方式中，多核苷酸组为组1或组4，并且标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:55的核苷酸5-27。更优选地，标记的多核苷酸的序列为SEQ ID NO.:55。在其中多核苷酸组为组3或组8的实施方式中，标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:56的核苷酸7-25。更优选地，标记的多核苷酸的序列为SEQ ID NO.:56。在实施方式中，其中多核苷酸组是组5或组9，标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:75的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:76的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:80的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:81的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:82的核苷酸4-22、SEQ ID NO.:83的核苷酸6-28、SEQ ID NO.:84的核苷酸6-25、SEQ ID NO.:85的核苷酸3-23。更优选地，标记的多核苷酸的序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO.:75、SEQ ID NO.:76、SEQ ID NO.:80、SEQ IDNO.:82、SEQ ID NO.:83、SEQ ID NO.:84和SEQ ID NO.:85。在其中多核苷酸组为组9的实施方式中，标记的多核苷酸的序列优选地为SEQ ID NO.:83。在其中多核苷酸组为组11或组13的实施方式中，标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:77的核苷酸5-29和SEQ ID NO.:79的核苷酸5-29。优选地，标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:77或SEQID NO.:79。在实施方式中，其中多核苷酸组为组12，标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:78的核苷酸6-26。优选地，标记的多核苷酸的序列为SEQ ID NO.:78。在其中多核苷酸组选自由以下组成的组：组14、组15、组16和组17的实施方式中，标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:95的核苷酸2-24。更优选地，标记的多核苷酸的序列为SEQ ID NO.:95。
本发明的又另一方面提供了试剂盒，该试剂盒包含含有选自由组1至组17组成的组的多核苷酸组的组合物。在一些实施方案中，试剂盒还包含链置换聚合酶和逆转录酶。在某些实施方案中，试剂盒包含含有荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标，其中多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:55的核苷酸5-27、SEQ ID NO.:56的核苷酸7-25、SEQ ID NO.:75的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:76的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:77的核苷酸5-29、SEQ ID NO.:78的核苷酸6-26、SEQ ID NO.:79的核苷酸5-29、SEQ ID NO.:80的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:81的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:82的核苷酸4-22、SEQ ID NO.:83的核苷酸6-28、SEQ ID NO.:84的核苷酸6-25、SEQ ID NO.:85的核苷酸3-23和SEQ ID NO.:95的核苷酸2-24。分子信标的多核苷酸序列可以包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:55、SEQ ID NO.:56、SEQ ID NO.:75至85和SEQ ID NO.:95。在一些实施方案中，分子信标的多核苷酸序列由选自由以下组成的组的序列组成：SEQ ID NO.:55、SEQ ID NO.:56、SEQ IDNO.:75至85和SEQ ID NO.:95。
在试剂盒的某些实施方式中，多核苷酸组为组1或组4。在这样的实施方式中，试剂盒还可以包含含有荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标，其中多核苷酸包含SEQ ID NO.:55的核苷酸5-27。优选地，分子信标的多核苷酸序列由SEQ ID NO.:55组成。在试剂盒的其他实施方式中，多核苷酸组选自由组3和组8组成的组。在这样的实施方式中，试剂盒还可以包含含有荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标，其中多核苷酸包含SEQ ID NO.:56的核苷酸7-25。优选地，分子信标的多核苷酸由SEQ ID NO.:56组成。在试剂盒的又另一实施方式中，多核苷酸组选自由组5和组9组成的组。在这样的实施方式中，试剂盒还可以包含含有荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标，其中多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQID NO.:75的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:76的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:80的核苷酸5-22、SEQID NO.:81的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:82的核苷酸4-22、SEQ ID NO.:83的核苷酸6-28、SEQID NO.:84的核苷酸6-25和SEQ ID NO.:85的核苷酸3-23。优选地，分子信标的多核苷酸由选自由以下组成的组的序列组成：SEQ ID NO.:75、SEQ ID NO.:76、SEQ ID NO.:80、SEQ IDNO.:81、SEQ ID NO.:82、SEQ ID NO.:83、SEQ ID NO.:84和SEQ ID NO.:85。在试剂盒的其他实施方式中，多核苷酸组选自由组11和组13组成的组。在这样的实施方式中，试剂盒还可以包含含有荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标，其中多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:77的核苷酸5-29和SEQ ID NO.:79的核苷酸5-29。优选地，分子信标的多核苷酸由选自由以下组成的组的序列组成：SEQ ID NO.:77和SEQ ID NO.:79。在试剂盒的又另一种实施方式中，多核苷酸组为组12。在这样的实施方式中，试剂盒还可以包含含有荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标，其中多核苷酸包含SEQ ID NO.:78的核苷酸6-26。优选地，分子信标的多核苷酸由SEQ ID NO.:78组成。在试剂盒的某些实施方式中，多核苷酸组选自由以下组成的组：组14、组15、组16和组17。在这样的实施方式中，试剂盒还可以包含含有荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标，并且该多核苷酸包含SEQ ID NO.:95的核苷酸2-24。优选地，分子信标的多核苷酸由SEQ ID NO.:95组成。
本发明的另一方面提供了一种试剂盒，该试剂盒包含含有SEQ ID NO.:49、SEQ IDNO.:50、SEQ ID NO.:51、SEQ ID NO.:52、SEQ ID NO.:53和SEQ ID NO.:54的多核苷酸组。试剂盒优选地还包含链置换聚合酶和逆转录酶。在一些实施方式中，试剂盒还包含含有荧光团、猝灭剂和SEQ ID NO.:83的分子信标。在另一种实施方式中，试剂盒还包含含有SEQID NO.:63、SEQ ID NO.:64、SEQ ID NO.:65、SEQ ID NO.:66、SEQ ID NO.:67和SEQ IDNO.:68的多核苷酸组。试剂盒优选地还包含含有荧光团、猝灭剂和SEQ ID NO.:77的分子信标。
详述
在一些实施方案中，本发明包括一种包含用于引发核酸扩增反应的多核苷酸组的组合物及其使用方法。在一些实施方案中，组合物还包含探针。
如本文使用的，“核酸”包括DNA和RNA两者，包括包含非标准核苷酸的DNA和RNA。“核酸”包含至少一个多核苷酸(“核酸链”)。核酸可以是单链或双链的。术语“核酸”是指核苷酸和核苷，它们构成例如脱氧核糖核酸(DNA)大分子和核糖核酸(RNA)大分子。最常见的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。还应理解，本发明可用于包含人工核苷酸诸如肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)等的生物序列。优选地，人工核苷酸是锁核酸分子，包括[α]-L-LNA。LNA包括其中核糖环被2’-氧和4’-碳之间的亚甲基桥“锁定”的核糖核酸类似物，即包含至少一个LNA单体(即一个2’-O,4’-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核苷酸)的寡核苷酸。LNA碱基形成标准的Watson-Crick碱基对，但锁定配置增加了碱基配对反应的速率和稳定性(Jepsen等人，Oligonucleotides,14,130-146(2004))。
如本文使用的，“多核苷酸”是指包含两个或更多个核苷酸的聚合链，其包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物，诸如包含修饰的主链(例如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或修饰的碱基的那些。“多核苷酸”包括引物、寡核苷酸、核酸链等。多核苷酸可以包含标准或非标准核苷酸。因此，该术语包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重组核酸、分支核酸、质粒、载体、探针、引物等。通常，多核苷酸在链的一个末端(“5’末端”)包含5’磷酸，并在链的另一末端(“3’末端”)包含3’羟基基团。多核苷酸的最5’侧的核苷酸在本文中可称为多核苷酸的“5’末端核苷酸”。多核苷酸的最3’侧的核苷酸在本文中可称为多核苷酸的“3’末端核苷酸”。当本发明的核酸采取RNA形式时，它可以具有或不具有5’帽。
LAMP是一种核酸扩增方法，它依赖于由Bst DNA聚合酶或其他链置换聚合酶进行的自动循环链置换DNA合成。扩增产物为具有若干个重复靶序列的茎环结构，并具有多于一个环。该方法的主要优点是不需要DNA模板的变性，并且因此LAMP反应可以在等温条件(60℃至67℃的范围)下进行。LAMP只需要一种酶和识别靶序列中六个不同的杂交位点的四种类型的引物。通过添加两种另外的引物可以加速反应。该方法产生大量的扩增产物，导致更容易的检测，诸如通过视觉判断反应混合物的浊度或荧光来检测。
简而言之，该反应由一对“成环”引物(分别为正向内部引物FIP和反向内部引物BIP)的退火和延伸起始，然后是一对侧翼引物(F3和B3)的退火和延伸。这些引物的延伸导致成环元件的链置换，这些元件折叠形成末端发夹环结构。一旦这些关键结构出现，扩增过程就会自我维持，并在恒温下以连续和指数的方式(而不是像PCR那样的循环方式)进行，直到反应混合物中的所有核苷酸(dATP、dTTP、dCTP和dGTP)都掺入到扩增的DNA中。任选地，可以包括另外的引物对以加速反应。这些引物称为环引物，与内部引物哑铃形产物的非内部引物结合的末端环杂交。
如本文使用的术语“引物”是指这样的寡核苷酸，当将其放置在诱导与核酸链(模板)互补的引物延伸产物的合成的条件下，即在存在核苷酸和聚合剂诸如DNA聚合酶的情况下，并在合适的温度和pH时，其能够充当合成的起始点。
LAMP的应用还已经扩展到包括通过逆转录酶(RT)的添加来检测RNA分子。通过包括RNA检测，LAMP可应用的靶的类型也被扩展，并增加了另外的靶向基于RNA的病毒、重要的调节性非编码RNA(sRNA、miRNA)、以及已经与特定疾病或生理状态相关联的RNA分子的能力。检测RNA的能力还具有提高测定灵敏度的潜力，例如在选择高表达、稳定和/或丰富的信使RNA(mRNA)或核糖体RNA(rRNA)靶方面。这个扩增的初步阶段包括RNA分子向互补DNA(cDNA)的逆转录。cDNA然后用作链置换DNA聚合酶的模板。使用热稳定RT酶(即NEB RTx)使反应能够在单一温度和在一步、单一混合物反应中完成。
如本文使用的“靶序列”意指使用一种或更多种本文提供的多核苷酸进行扩增、检测，或扩增和检测两者的淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)的核酸序列或其互补物。此外，虽然术语靶序列有时指双链核酸序列，但本领域技术人员将认识到靶序列也可以是单链的，例如RNA。可以选择对特定生物体而言或多或少具有特异性的靶序列。例如，靶序列可以是整个属、多于一个属、物种或亚种、血清群、营养型、血清型、株系(strain)、分离株或其他生物体亚组特异性的。
本文所描述的引物/探针组合物和方法的速度、特异性和灵敏度来自若干个方面。用于根据本发明的组合物和方法的示例性引物包括表1中提供的那些。
表1：引物序列
可以通过多种方法来实现对LAMP扩增产物的检测。在一些实施方式中，使用嵌入染料检测LAMP扩增产物。嵌入染料一般是具有平面结构的芳香阳离子，其插入DNA双链体中堆叠的碱基对之间，这种排列为染料分子提供环境依赖的荧光增强，并相对于溶液中的游离染料产生荧光信号的大幅增加。信号增强提供了成比例的响应，允许直接定量DNA测量结果。本公开内容中优选的嵌入染料包括荧光染料。染料可以是花青或非花青嵌入染料。在一些情况下，嵌入染料是花青染料。在一些情况下，花青染料可以是噻唑橙、SYBR.RTM.(例如Sybr Green I、Sybr Green II、Sybr Gold、SYBR DX)、Oil Green、CyQuant GR、SYTOXGreen、SYTO9、SYT010、SYTO17、SYBR14、噁唑黄、噻酮橙、SYTO、TOTO、YOYO、BOBO和POPO。在一些情况下，染料是非花青染料。在一些情况下，非花青染料是并五苯、蒽、萘、二茂铁、甲基紫精、三吗啉代铵、丙啶(例如碘化丙啶)或另一种芳族或杂芳族衍生物。
在优选的实施方案中，通过向引物混合物中添加荧光标记探针来进行产物检测。本文使用的术语“探针”是指包含与靶序列互补或基本互补的一个或更多个部分的单链核酸分子。在某些实施方式中，荧光标记的探针是分子信标。
如本文使用的，“分子信标”是指单链发夹状寡核苷酸探针，其设计用于报告溶液中特定核酸的存在。分子信标由四个组分组成：茎、发夹环、末端标记的荧光团和相对末端标记的猝灭剂(Tyagi等人，(1998)Nature Biotechnology 16:49-53)。当发夹样信标未与靶结合时，荧光团和猝灭剂紧密地靠在一起，并且荧光被抑制。在存在互补的靶核苷酸序列的情况下，信标的茎打开以与靶杂交。这将荧光团和猝灭剂分开，允许荧光团发出荧光。可选地，分子信标还包含在末端标记的供体附近发射的荧光团。“波长位移分子信标(Wavelength-shifting Molecular Beacons)”包含另外的收集荧光团，使荧光团能够发射得更加强烈。目前对分子信标的综述包括：Wang等人,2009,Angew Chem Int Ed Engl,48(5):856-870；Cissell等人,2009,Anal Bioanal Chem 393(1):125-35；Li等人,2008,Biochem Biophys Res Comm 373(4):457-61；和Cady,2009,Methods Mol Biol 554:367-79。用于根据本发明的组合物和方法的示例性探针包括表2中提供的那些。在某些实施方式中，探针可以包含一个或更多个锁核酸(LNA)，如“[+X]”所示，其中X指示核碱基的身份。粗体指示与靶冠状病毒基因组中发现的序列杂交的分子信标的部分。
表2：探针序列
在一种实施方式中，分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸，其中多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:55的核苷酸5-27、SEQ ID NO.:56的核苷酸7-25、SEQ ID NO.:75的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:76的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:77的核苷酸5-29、SEQ ID NO.:78的核苷酸6-26、SEQ ID NO.:79的核苷酸5-29、SEQ ID NO.:80的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:81的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:82的核苷酸4-22、SEQ ID NO.:83的核苷酸6-28、SEQ ID NO.:84的核苷酸6-25、SEQ ID NO.:85的核苷酸3-23。在一种实施方案中，多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:55、SEQ ID NO.:56和SEQ ID NO.:75-85。在另一种实施方案中，多核苷酸由选自由以下组成的组的序列组成：SEQ ID NO.:55、SEQ ID NO.:56和SEQ ID NO.:75-85。
分子信标优选地用于还包含序列特异性LAMP引物组的组合物中。在一种实施方式中，分子信标包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:55的核苷酸5-27和SEQ IDNO.:56的核苷酸7-25。在这样的实施方式中，分子信标可以包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:55、SEQ ID NO.:56和SEQ ID NO.:75-85。更优选地，分子信标的多核苷酸序列由选自由以下组成的组的序列组成：SEQ ID NO.:55、SEQ ID NO.:56和SEQ ID NO.:75-85。
如本文使用的术语“标记”意指具有能够检测和任选地定量的特性或特征的分子或部分。标记可以是直接可检测的，如用例如(且不限于)放射性同位素、荧光团、化学发光团、酶、胶体颗粒、荧光微粒等可检测的；或者标记可以是间接可检测的，如用例如特异性结合成员可检测的。应当理解，直接可检测的标记可能需要另外的组分，诸如例如底物、触发试剂、猝灭部分、光等，以实现标记的检测和/或定量。当使用间接可检测的标记时，它们通常与“缀合物”联合使用。缀合物通常是已经附接或偶联到直接可检测的标记的特异性结合成员。用于合成缀合物的偶联化学是本领域熟知的，并且可以包括例如不破坏特异性结合成员的特异性结合特性或标记的可检测特性的任何化学手段和/或物理手段。如本文使用的，“特异性结合成员”意指结合对的成员，结合对即两个不同的分子，其中一个分子通过例如化学或物理手段与另一个分子特异性结合。除抗原和抗体特异性结合对外，其他特异性结合对包括但不意图限于抗生物素蛋白和生物素；半抗原和半抗原特异性抗体；互补核苷酸序列；酶辅因子或底物和酶；等等。
分子信标可以仅包含核酸诸如DNA或RNA，或者它可以包含肽核酸(PNA)缀合物。荧光团可以是任何荧光有机染料或单个量子点。猝灭部分理想地猝灭荧光团的发光。可以使用任何合适的猝灭荧光团发光的猝灭部分。荧光团可以是本领域已知的任何荧光标志物/染料。合适的荧光标志物的实例包括但不限于Fam、Hex、Tet、Joe、Rox、Tamra、Max、Edans、Cy染料诸如Cy5、荧光素、香豆素、曙红、罗丹明、Bodipy、Alexa、Cascade Blue、YakimaYellow、Lucifer Yellow、得克萨斯红和ATTO染料家族。猝灭剂可以是本领域中已知的任何猝灭剂。猝灭剂的实例包括但不限于DABCYL(4-(二甲基氨基偶氮)苯-4-羧酸)、暗猝灭剂诸如ECLIPSE Dark Quencher、ElleQuencher、Tamra(四甲基罗丹明)、Black Hole猝灭剂和QSY染料。技术人员在设计探针时会知道染料/猝灭剂的哪些组合是合适的。在示例性实施方案中，荧光素(FAM)与Blackhole QuencherTM(BHQTM)联合使用。然后，分子信标与扩增产物的结合可以直接可视化地评估。可选地，荧光水平可以通过光谱学来测量，以提高灵敏度。
多个商业供应商生产标准和定制的分子信标，包括Abingdon Health(UK；www.abingdonhealth.com)、Attostar(US,MN；www.attostar.com)、Biolegio(NLD；www.biolegio.com)、Biomers.net(DEU；www.biomers.net)、Biosearch Technologies(US,CA；www.biosearchtech.com)、Eurogentec(BEL；www.eurogentec.com)、Gene Link(US,NY；www.genelink.com)、Integrated DNA Technologies(US,IA；www.idtdna.com)、IsogenLife Science(NLD；www.isogen-lifescience.com)、Midland Certified Reagent(US,TX；www.oligos.com)、Eurofins(DEU；www.eurofinsgenomics.eu)、Sigma-Aldrich(US,TX；www.sigmaaldrich.com)、Thermo Scientific(US,MA；www.thermoscientific.com)、TIBMOLBIOL(DEU；www.tib-molbiol.de)、TriLink Bio Technologies(US,CA；www.trilinkbiotech.com)。利用分子信标的多种试剂盒也是商购可得的，诸如来自Stratagene(La Jolla,Calif.)的SentinelTM Molecular Beacon AllelicDiscrimination试剂盒以及来自Eurogentec SA(Belgium，eurogentec.com)和IsogenBioscience BV(The Netherlands,isogen.com)的各种试剂盒。
本发明的寡核苷酸探针和引物任选地基本上使用本领域已知的任何技术制备。在某些实施方案中，例如，本文描述的寡核苷酸探针和引物基本上使用任何核酸合成方法化学合成，包括例如根据Beaucage和Caruthers(1981)，Tetrahedron Letts，22(20):1859-1862(其通过引用并入)描述的固相亚磷酰胺三酯方法，或本领域已知的另一合成技术，例如，使用自动合成仪，如在Needham-VanDevanter等人(1984)Nucleic Acids Res.12:6159-6168(其通过引用并入)中描述的。用于自动化寡核苷酸合成的各种各样的设备是商购可得的。还任选地利用多-核苷酸(multi-nucleotide)合成方法(例如，三核苷酸合成等)。此外，本文描述的引物核酸任选地包含各种修饰。为了进一步说明，引物还任选地被修饰以改进扩增反应的特异性，如例如在1999年12月14日授权的美国专利第6,001,611号(其通过引用并入)中描述的。引物和探针也可以合成为带有本文中描述的或其他本领域中已知的各种其他修饰。
此外，基本上任何核酸(和几乎任何标记的核酸，无论是标准的或非标准的)都可以从多种商业来源(诸如Integrated DNA Technologies、the Midland CertifiedReagent Company、Eurofins、Biosearch Technologies、Sigma Aldrich和许多其他来源)中的任何一个定制或标准订购。
如本文使用的术语“测试样品”意指取自怀疑包含或可能包含靶序列的生物体或生物流体的样品。测试样品可以取自任何生物来源，诸如例如组织、血液、唾液、痰、黏液、汗液、尿液、尿道拭子、宫颈拭子、阴道拭子、泌尿生殖或肛门拭子、结膜拭子、眼晶状体液(ocular lens fluid)、脑脊液、乳汁、腹水液、滑液、腹膜液、羊水、发酵液、细胞培养物、化学反应混合物等。测试样品可以(i)按从来源获得的那样直接使用或(ii)在预处理以修改样品的特征后使用。因此，可以通过例如从血液制备血浆或血清、破坏细胞或病毒颗粒、从固体材料制备液体、稀释黏性流体、过滤液体、蒸馏液体、浓缩液体、灭活干扰组分、添加试剂、纯化核酸等在使用前对测试样品进行预处理。
有利的是，本发明能够可靠地快速检测临床样品(诸如痰或鼻拭子或咽拭子)中的SARS-CoV-2。
为了进一步说明，在分析本文描述的靶核酸之前，可以从典型地包含不同组分的复杂混合物的样品纯化或分离这些核酸。收集的样品中的细胞通常被裂解以释放细胞内容物，包括靶核酸。例如，怀疑含有病毒的测试样品可以通过将病毒颗粒与各种酶、化学物质接触来裂解，和/或通过本领域已知的其它方法来裂解，这些方法降解例如病毒颗粒壁。在一些实施方案中，直接在细胞裂解物中分析核酸。在其他实施方案中，核酸在检测之前从裂解物进一步纯化或提取。基本上，任何核酸提取方法都可以用于纯化本发明方法中使用的样品中的核酸。可用于纯化核酸的示例性技术包括，例如，亲和层析、与固定在固体支持物上的探针杂交、液-液萃取(例如，苯酚-氯仿萃取等)、沉淀(例如，使用乙醇等)、用滤纸提取、用胶束形成试剂(例如，十六烷基-三甲基-溴化铵等)提取、与固定的嵌入染料(例如，溴化乙锭、吖啶等)结合、吸附到硅胶或硅藻土、在离液条件下吸附到磁性玻璃颗粒或有机硅烷颗粒等。样品处理也在例如美国专利第5,155,018号、第6,383,393号和第5,234,809号中描述，其各自通过引用并入。
测试样品可以任选地根据本领域技术人员已知的任何技术处理和/或纯化，以改进扩增效率和/或定性准确性和/或定量准确性。因此，样品可以完全或基本上由核酸组成，无论是通过纯化、分离还是通过化学合成获得。对于希望从测试样品分离或纯化核酸(诸如DNA)，例如从咽部刮片分离或纯化DNA(例如，QIAamp-DNA Mini-Kit；Qiagen,Hilden,Germany)的技术人员，手段是可得的。
等同物和范围
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定根据本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。本发明的范围不意图限于以上描述，而是如所附权利要求中阐述。
在权利要求中，诸如“一种(a)”、“一种(an)”和“该(the)”之类的冠词可以意指一种或多于一种，除非相反地指示或从上下文中以其他方式明显。如果一个、多于一个或所有的组成员在给定的产品或过程中存在、采用或以其他方式与之相关，则认为在一个或更多个组成员之间包含“或”的权利要求或描述被满足，除非相反地指示或从上下文中以其他方式明显。本发明包括其中该组中的一个成员恰好存在于给定产品或过程中、在其中采用或以其他方式与给定产品或过程相关的实施方案。本发明包括其中多于一个或所有组成员存在于给定产品或过程中、在其中采用或以其他方式与给定产品或过程相关的实施方案。
还应注意，术语“包括”意在是开放的并且允许但不要求包括另外的要素或步骤。当本文使用术语“包括”时，术语“由……组成”因此也被涵盖和公开。
在给出范围的地方，包括端点。此外，应理解，除非根据上下文和本领域普通技术人员的理解另有指示或以其他方式明显，否则表示为范围的值可以假定在本发明的不同实施方案中所述范围内的任何特定值或子范围，直至范围下限的单位的十分之一，除非上下文另外明确指示。
所有引用的来源，例如，本文引用的参考文献、出版物、数据库、数据库条目和技术，都通过引用并入本申请，即使在引用中没有明确陈述。在引用的来源和本申请的陈述相冲突的情况下，以本申请中的陈述为准。
章节和表的标题不意图限制。
实施例
提出以下实施例，以便为本领域技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开内容和描述，且以下实施例并不意在限制发明人视作其发明的范围，它们也不意在代表下文的实验是进行的所有实验或仅有的实验。尽管做出了努力以确保所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另外指示，份数为重量份数，分子量为加权平均分子量，温度以摄氏度计，且压力处于大气压或临近大气压。
实施例1：靶选择与引物探针设计
从NCBI数据库中检索了SARS-CoV-2的多于一个分离株、密切相关的物种(诸如常见的人类冠状病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)相关冠状病毒和中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV))以及从患有上呼吸道症状的患者得到的鼻或咽样品中常见的其他物种的基因序列。使用Clustal omega(Sievers等人，2011.Molecular Systems Biology 7:539)比对序列并且鉴定出具有SARS-CoV-2物种独特特异性碱基的区域。环介导扩增引物使用LAMP设计器(Premier Biosoft)或内部设计算法设计。为了增加特异性，人工设计或使用信标设计器(Premier Biosoft)设计靶向扩增产物的分子信标或探针。使用BLAST对NCBI核苷酸数据库(包括人类转录组、流感病毒和非人类冠状病毒)进一步分析设计的引物组和信标的特异性。设计了各种引物组和探针，并对反应速度进行了筛选。
本发明的引物组总结在表3中，其至少包括正向内部引物(FIP)和反向内部引物(BIP)。此外，引物组通常还包括至少两种另外的选自正向外部引物(F3)、反向外部引物(B3)、正向环引物(LF)和反向环引物(LB)的引物。
表3：LAMP引物组
通常，3μL至5μL的RNA标准品或基因组RNA或从阴性鼻拭子基质或阴性对照(NTC＝无核酸酶水或Tris缓冲液，无模板对照)提取的基因组RNA用作RTLAMP反应的模板。在冰上将10-25μl的总体积反应制备为包含制剂的混合物，该制剂包含1x扩增缓冲液，该缓冲液包含10-40mM Tris-HCl、0-0.5％吐温20、0-300mM海藻糖、5-70mM KCl、4-41mM MgSO4、10-20mM(NH4)2SO4、0-2mM TCEP以及各1.6-2mM的dCTP、dGTP、dATP和dTTP。NEB Bst2聚合酶(NEBCN#M0537L)和RTx Warmstart逆转录酶(NEB CN#M0380S)。根据实验设计的要求，将引物(2μM内部引物、0.2μM外部引物和0.8μM环引物)添加到个体反应中或直接添加到主混合物中。将分子信标(0.2μM)或200nM To-Pro染料也添加到主混合物中，如下面的实施例指示的。用标准6-引物组合物制备扩增反应物。将主混合物分配到个体样品模板中，涡旋并短暂离心，并将每个反应加载到96孔或384孔板(Roche CN#4729692001或BioRad CNhsI9605)的个体孔中。反应在60-67℃范围的温度进行，并且荧光在Roche LightCycler 96实时PCR仪或BioRad CFX96实时循环仪上监测。通过嵌入染料或分子信标探针与靶结合导致分子信标荧光分子内猝灭的释放来监测靶扩增。
实施例2：扩增反应动力学
输入样品为从900-1500bp基因片段(包括SARS-CoV-2和常见人类冠状病毒的基因片段)体外转录产生的RNA分子标准品。
将RNA分子标准品或基因组RNA稀释到50-5000拷贝/反应范围内的各种浓度，以评估指定引物组(表3)的灵敏度。标准品用PBS(Sigma)中0.1mg/mL Poly A载体RNA连续稀释，并用作在RTLAMP反应中扩增的模板。ToProTM或SytoTM染料或相同染料组家族中的相容波长形式(Life Technologies；绿色或红色荧光羰花青核酸染色剂)用于扩增产物的检测。如实施例1描述地制备主混合物。
本实施例示出，使用这组引物和环介导的扩增方法，实现了快速的扩增动力学。结果总结在表4中，其中通过使用内部开发的算法计算到阳性的时间(Tp)。NT指示未测试的浓度。结果按到阳性的时间分类(NT意指“未测试”，并且“无判定”指示未检测到扩增)。
表4：到阳性的时间染料检测
用来自常见人类冠状病毒株229E、NL63和OC43的基因组材料对阴性鼻拭子基质中进行加标。在包含LAMP引物的RT-LAMP反应中，使用相应提取的核酸或DNA作为模板，并与500-5000拷贝/反应的SARS-CoV-2RNA标准品进行特异性比较。
表5：交叉反应性染料检测
| 引物 | 5000 | 500 | 229E | NL63 | OC43 |
| 组1 | 7 | 8.5 | 无判定 | 无判定 | 无判定 |
| 组4 | 7 | 7.9 | 无判定 | 无判定 | 无判定 |
| 组8 | 6.3 | 7.2 | 无判定 | 无判定 | 无判定 |
| 组11 | 4.8 | 5.3 | 无判定 | 无判定 | 无判定 |
实施例3：分子信标检测
为了提供另外水平的基于直接序列的扩增产物的检测(相对于间接染料检测)，设计和利用了靶向引物组中SARS-CoV-2扩增子内的独特核苷酸、具有良好的到阳性的时间和灵敏度的结合的分子信标(MB1-MB14；参见表2)，并将该分子信标用于检测从RNA标准品的扩增(表4)。分子信标探针被设计为包括5’荧光团/3’猝灭剂修饰(6-羧基荧光素(FAM)))和Black Hole Quencher 1(BHQ1)以及锁核酸(+)，以提供靶特异性荧光检测。
根据实施例1和2中描述的方法，利用25至500拷贝/反应的SARS-CoV-2RNA标准品或基因组RNA作为模板输入，评价了10-25μL总体积的反应。虽然使用分子信标检测导致反应Tp略有增加，但基于序列直接检测扩增产物的能力，以及从而区分密切相关的物种，提供了合理的权衡。
表6：到阳性的时间探针检测
另外，通过比较用500至5000拷贝/反应的SARS-CoV-2 RNA标准品的反应和用大约5x105拷贝/反应的RNA标准品或从阴性鼻拭子基质提取的核酸(用密切相关的常见人类冠状病毒株229E、NL63、OC43或SARS相关冠状病毒进行加标)的反应，测试选择的引物组和分子信标对的特异性。当如实施例1和2中的描述进行扩增反应时，所测试的引物和分子信标对不具有针对常见人类冠状病毒的交叉反应性(表7)。
表7：交叉反应性探针检测
| 引物 | 信标 | 5000 | 500 | 229E | NL63 | OC43 | SARS |
| 组8 | MB2 | 8.4 | 9.1 | 无判定 | 无判定 | 无判定 | NT |
| 组10 | MB3 | 6.3 | 7.1 | NT | NT | NT | 无判定 |
| 组12 | MB6 | 10.1 | 11.3 | NT | NT | NT | 无判定 |
实施例4：多靶扩增
像所有病毒一样，SARS-CoV-2的基因组序列会经历突变和自然选择。鉴于SARS-CoV-2的潜在致死性和相对的高传播性，检测多于一个基因组靶的存在的测定将是有益处的。因此，如果病毒的一部分已经突变，病毒仍然可以通过第二位置被检测到。这可以通过进行两个独立的扩增测定来实现。然而，时间、人员和资源是有限的。因此，如果可以在同一反应孔中同时评估两个或更多个基因组靶，则将是有利的。这常常是用标准PCR测定进行的，标准PCR测定通常利用每扩增基因座两个引物。然而，LAMP通常包含含有八个独立的杂交位点的六个引物。这为引物:引物相互作用创造了显著更高的潜力，这些相互作用可能干扰靶向扩增或导致可能与在靶扩增混淆的脱靶扩增(导致对COVID-19的错误阳性诊断)。组9和组11被计算机模拟证实为几乎不存在来自引物-引物相互作用的脱靶扩增的可能性。
首先，将组9和组11组合以扩增RNA分子标准品，稀释到每个反应25、50或500拷贝(范围为5-500拷贝/反应的不同浓度)，以评估组合引物组的灵敏度。标准品用PBS(Sigma)中0.1mg/mL Poly A载体RNA连续稀释，并用作在RTLAMP反应中扩增的模板。ToProTM染料或SytoTM染料用于检测扩增产物。如实施例1中所述地制备主混合物。对于500拷贝/反应，在5.3分钟(到阳性的时间)检测到扩增；50拷贝/反应在6.2分钟检测到扩增，并且25拷贝/反应在6.5分钟检测到扩增。如预期的那样，阴性对照未检测到扩增。
用来自常见人类冠状病毒株229E、NL63和OC43的基因组材料对阴性鼻拭子基质进行加标。在包含组合LAMP引物组的RT-LAMP反应中，使用相应提取的核酸或DNA作为模板，并与50-5000拷贝/反应的SARS-COV-2 RNA标准品或从阴性鼻拭子基质提取的基因组RNA进行特异性比较。没有检测到关于任何可能发生交叉反应的物种的扩增。
为了提供另外水平的基于直接序列的扩增产物的检测(相对于间接染料检测)，包括了分别靶向SARS-CoV-2 ORF1b和N基因扩增子内的独特核苷酸的分子信标(MB5和MB11；参见表2)，以提供靶特异性荧光检测。根据实施例1和2中描述的方法，利用25、50或500拷贝/反应的SARS-CoV-2 RNA标准品作为模板输入，评价了10-25μL总体积的反应。组合的引物组(组9和组11)加两个信标(MB5和MB11)在500拷贝/反应在6.5分钟(到阳性的时间)检测到施加；在50拷贝/反应在7.7分钟检测到，以及在25拷贝/反应在7.8分钟检测到。无模板(阴性)对照未检测到扩增。
另外，通过比较用50至5000拷贝/反应的SARS-CoV-2 RNA标准品或从阴性鼻拭子基质提取的基因组RNA的反应和用大约5x105拷贝/反应的RNA标准品或从阴性鼻拭子基质提取的核酸(用密切相关的常见人类冠状病毒株229E、NL63、OC43或SARS相关冠状病毒进行加标)的反应，测试组合的引物组和分子信标对的特异性。当如实施例1和2中所述地进行扩增反应时，引物(组9和组11一起)和分子信标对(MB5和MB11一起)没有检测到针对常见人类冠状病毒229E、人类冠状病毒NL83、人类冠状病毒OC43和SARS-CoV(2003)的交叉反应性。
虽然为了清楚理解的目的通过说明和实例的方式相当详细地描述了以上发明，但对本领域普通技术人员将容易地明显的是，根据本发明的教导，可以对其进行一些改变和修改，而不偏离所附权利要求书的精神或范围。还要理解本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，且并非旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
因此，前述仅仅阐释了本发明的原理。将理解的是，本领域技术人员将能够设计出各种布置，尽管本文未明确描述或显示，这些布置体现本发明的原理并且被包括在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的全部实例和条件性语言主要意在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域发展而贡献的概念，并且应被解释为不限于这样的具体列举的实例和条件。此外，本文中列举本发明的原理、方面和实施方案及其具体实例的全部陈述意在包括其结构等同物和功能等同物两者。此外，意在这样的等同物既包括当前已知的等同物又包括未来开发的等同物，即开发的执行相同的功能而不论结构如何的任何元件。因此，本发明的范围并不意图被限制为本文示出和描述的示例性实施方案。而是，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。
序列表
<110> 达丽斯生物医学公司
<120> 用于扩增和检测SARS-CoV-2的多核苷酸
<130> TSM-055WO
<140>
<141>
<150> 16/912,462
<151> 2020-06-25
<150> 16/912,446
<151> 2020-06-25
<150> 63/009,803
<151> 2020-04-14
<150> 62/993,523
<151> 2020-03-23
<160> 103
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 1
ggaccaggaa ctaatcagac a 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 2
tctgcggtaa ggcttgag 18
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 3
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<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 4
tgacctacac aggtgccatc aaggctctgt tggtgggaat 40
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 5
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<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 6
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 7
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 8
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<211> 32
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 9
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<211> 36
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 10
cgtcggcccc aaggtttatc cttgccatgt tgagtg 36
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 12
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 15
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 16
ctgctagaat ggctggcaat gtggttcaat ctgtcaagca 40
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<211> 16
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<211> 36
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 21
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<210> 22
<211> 44
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 22
gggaacgtgg ttgacctaca gacttgatct ttgaaatttg gatc 44
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<211> 16
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 23
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 24
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<211> 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 25
tcaaagatca agtcattttg ct 22
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<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 26
gcctgagttg agtcagc 17
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 27
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 34
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 37
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 39
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<211> 38
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 41
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 42
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 45
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 47
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 49
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<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 50
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 51
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<210> 52
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 52
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<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 53
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<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 54
ctcttcttcc tgctgcagat ttgg 24
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成探针
<400> 55
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<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成探针
<400> 56
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<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 57
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<210> 58
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 58
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<210> 59
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 59
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 60
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<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 61
tgttcaccaa tattccaggc a 21
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 62
cgatcaattt tctcccgcac 20
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 63
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<210> 64
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 64
tgtctcacca ctacgacc 18
<210> 65
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 65
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<210> 66
<211> 37
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 66
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<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 67
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<210> 68
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 69
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 70
gctttaacaa aatcgcccg 19
<210> 71
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 71
gcaactggat agacagatcg aattctatcc ataatcaaga ctattcaacc a 51
<210> 72
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 72
caccaaatga atgcaaccaa atgtgtctgc catgaagttt cacc 44
<210> 73
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 73
catcaagctt tttcttttca accc 24
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 74
cctttcaact ctcatgaagt gtg 23
<210> 75
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成探针
<400> 75
cacggtgact cttcttcctg ctcaccgtg 29
<210> 76
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成探针
<400> 76
cgagtcctgc tgcagatttg gactcg 26
<210> 77
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成探针
<400> 77
cagctcatgg tcatgttatg gttgagctg 29
<210> 78
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成探针
<400> 78
cacactttca actctcatga agtgtg 26
<210> 79
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成探针
<400> 79
cagctcatgg tcatgttatg gttgagctg 29
<210> 80
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成探针
<400> 80
cgagtcctgc tgcagatttg gactcg 26
<210> 81
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成探针
<400> 81
catgtcctgc tgcagatttg gacatg 26
<210> 82
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成探针
<400> 82
cacttcctgc tgcagatttg gaagtg 26
<210> 83
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成探针
<400> 83
cacgcgtgac tcttcttcct gctgcagacg cgtg 34
<210> 84
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成探针
<400> 84
cacgcttctt cctgctgcag atttgaagcg tg 32
<210> 85
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成探针
<400> 85
cagactcttc ttcctgctgc agagtctg 28
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 86
gagggacaag gacaccaag 19
<210> 87
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 87
tcggatgctc gaactgcact gtctcaccac tacgacc 37
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 88
ggtagcagaa ctcgaaggca t 21
<210> 89
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 89
aagagacagg tacgttaata gt 22
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 90
ttagaccaga agatcaggaa c 21
<210> 91
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 91
aagcgcagta aggatggcta tagcgtactt ctttttcttg c 41
<210> 92
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 92
tgcgtactgc tgcaatattg ttttaacacg agagtaaacg taaa 44
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 93
tgtaactagc aagaatacca cg 22
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 94
cgtgagtctt gtaaaacctt ct 22
<210> 95
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成探针
<400> 95
cacgtgagtc ttgtaaaacc ttctcacgtg 30
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 96
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 97
acacaatcga agcgcagtaa gttttcttgc tttcgtggta t 41
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 98
gcgtactgct gcaatattgt tttaacacga gagtaaacgt aaa 43
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
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<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 99
tggctagtgt aactagcaag a 21
<210> 100
<211> 24
<212> DNA
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<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 100
acgttaatag ttaatagcgt actt 24
<210> 101
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 101
tcaggaactc tagaagaatt ca 22
<210> 102
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 102
acaatcgaag cgcagtaagg ttttcttgct ttcgtggtat 40
<210> 103
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 103
tgcgtactgc tgcaatattg tttttaacac gagagtaaac gtaaa 45
Claims (100)
1.一种组合物，包含选自由组1至组17组成的组的多核苷酸组。
2.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含探针。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述探针包含标记。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述探针是标记的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述多核苷酸组是组11或组13，并且所述标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ IDNO.:77的核苷酸5-29和SEQ ID NO.:79的核苷酸5-29。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:77或SEQID NO.:79。
7.根据权利要求4所述的组合物，其中所述多核苷酸组是组11。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO.:78。
9.根据权利要求4所述的组合物，其中所述多核苷酸组为组12，并且所述标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:78的核苷酸6-26。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:78。
11.根据权利要求4所述的组合物，其中所述多核苷酸组是组5或组9，并且所述标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:75的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:76的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:80的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:81的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:82的核苷酸4-22、SEQ ID NO.:83的核苷酸6-28、SEQ ID NO.:84的核苷酸6-25、SEQ IDNO.:85的核苷酸3-23。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:75、SEQ ID NO.:76、SEQ ID NO.:80、SEQ ID NO.:81、SEQ ID NO.:82、SEQ ID NO.:83、SEQ ID NO.:84和SEQ ID NO.:85。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述多核苷酸组是组9。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO.:83。
15.根据权利要求4所述的组合物，其中所述多核苷酸组是组1或组4，并且所述标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:55的核苷酸5-27。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:55。
17.根据权利要求4所述的组合物，其中所述多核苷酸组是组3或组8，并且所述标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:56的核苷酸7-25。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:56。
19.根据权利要求4所述的组合物，其中所述多核苷酸组选自由以下组成的组：组14、组15、组16和组17，并且所述标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:95的核苷酸2-24。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:95。
21.根据权利要求4所述的组合物，其中所述标记是荧光团。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述荧光团共价附接到所述多核苷酸的末端。
23.根据权利要求2所述的组合物，其中所述探针是包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述多核苷酸组是组5或组9，并且其中所述分子信标包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:75的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:76的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:80的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:81的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:82的核苷酸4-22、SEQ ID NO.:83的核苷酸6-28、SEQ ID NO.:84的核苷酸6-25和SEQ IDNO.:85的核苷酸3-23。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述分子信标包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:75、SEQ ID NO.:76、SEQ ID NO.:80、SEQ ID NO.:81、SEQ ID NO.:82、SEQID NO.:83、SEQ ID NO.:84和SEQ ID NO.:85。
26.根据权利要求23所述的组合物，其中所述多核苷酸组是组1或组4，并且其中所述分子信标包含SEQ ID NO.:55的核苷酸5-27。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述分子信标包含SEQ IDNO.:55。
28.根据权利要求23所述的组合物，其中所述多核苷酸组是组3或组8，并且其中所述分子信标包含SEQ ID NO.:56的核苷酸7-25。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述分子信标包含SEQ IDNO.:56。
30.根据权利要求23所述的组合物，其中所述多核苷酸组是组11或组13，并且其中所述分子信标包含选自由以下组成的组的序列：SEQ IDNO.:77的核苷酸5-29和SEQ ID NO.:79的核苷酸5-29。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述分子信标包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:77和SEQ ID NO.:79。
32.根据权利要求23所述的组合物，其中所述多核苷酸组为组12，并且其中所述分子信标包含SEQ ID NO.:78的核苷酸6-26。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述分子信标包含SEQ IDNO.:78。
34.根据权利要求23所述的组合物，其中所述多核苷酸组选自由以下组成的组：组14、组15、组16和组17，并且其中所述分子信标包含SEQ ID NO.:95的核苷酸2-24。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述分子信标包含SEQ IDNO.:95。
36.一种组合物，包含SEQ ID NO.:49、SEQ ID NO.:50、SEQ ID NO.:51、SEQ ID NO.:52、SEQ ID NO.:53和SEQ ID NO.:54。
37.根据权利要求36所述的组合物，所述组合物还包含分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和SEQ ID NO.:83。
38.根据权利要求36所述的组合物，所述组合物还包含SEQ ID NO.:63、SEQ ID NO.:64、SEQ ID NO.:65、SEQ ID NO.:66、SEQ ID NO.:67和SEQ ID NO.:68。
39.一种组合物，包含SEQ ID NO.:63、SEQ ID NO.:64、SEQ ID NO.:65、SEQ ID NO.:66、SEQ ID NO.:67和SEQ ID NO.:68。
40.根据权利要求39所述的组合物，所述组合物还包含分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和SEQ ID NO.:77。
41.一种组合物，包含：
第一多核苷酸组，包括SEQ ID NO.:49、SEQ ID NO.:50、SEQ ID NO.:51、SEQ ID NO.:52、SEQ ID NO.:53和SEQ ID NO.:54；和
第二多核苷酸组，包括SEQ ID NO.:63、SEQ ID NO.:64、SEQ ID NO.:65、SEQ ID NO.:66、SEQ ID NO.:67和SEQ ID NO.:68。
42.根据权利要求41所述的组合物，所述组合物还包含：
包含SEQ ID NO.:83的核苷酸6-28的第一标记的多核苷酸；和
包含SEQ ID NO.:77的核苷酸5-29的第二标记的多核苷酸。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述第一多核苷酸包含SEQ ID NO.:83，并且所述第二标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:77。
44.根据权利要求41所述的组合物，所述组合物还包含含有SEQ IDNO.:83的第一分子信标和含有SEQ ID NO.:77的第二分子信标。
45.一种分子信标，包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:55的核苷酸5-27、SEQ ID NO.:56的核苷酸7-25、SEQ IDNO.:75的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:76的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:77的核苷酸5-29、SEQ IDNO.:78的核苷酸6-26、SEQ ID NO.:79的核苷酸5-29、SEQ ID NO.:80的核苷酸5-22、SEQ IDNO.:81的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:82的核苷酸4-22、SEQ ID NO.:83的核苷酸6-28、SEQ IDNO.:84的核苷酸6-25、SEQ ID NO.:85的核苷酸3-23和SEQ ID NO.:95的核苷酸2-24。
46.根据权利要求45所述的分子信标，其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:55、SEQ ID NO.:56、SEQ ID NO.:75-85和SEQ ID NO.:95。
47.根据权利要求46所述的分子信标，其中所述多核苷酸是选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:55、SEQ ID NO.:56、SEQ ID NO.:75-85和SEQ ID NO.:95。
48.根据权利要求45所述的分子信标，其中所述荧光团是FAM，并且所述猝灭剂是BHQ1。
49.根据权利要求45所述的分子信标，其中所述荧光团是ATTO 565或Alexa 594，并且所述猝灭剂是BHQ1或BHQ2。
50.一种检测测试样品中的SARS-CoV-2的方法，所述方法包括：
(a)从测试样品提取核酸；
(b)通过使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和逆转录酶以及序列特异性引物组的反应混合物反应来扩增靶序列，其中所述序列特异性引物组选自由组1至组17组成的组；以及
(c)检测步骤(b)的扩增产物的存在或不存在；其中所述扩增产物的存在指示所述测试样品中存在SARS-CoV-2。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述靶序列在步骤(b)中的扩增在约60℃和约67℃之间进行少于30分钟。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述扩增步骤进行少于十五分钟。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述扩增步骤进行少于十二分钟。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述扩增步骤进行少于九分钟。
55.根据权利要求50所述的方法，其中检测所述扩增产物的存在或不存在包括将所述扩增产物与探针杂交，所述探针包含附接到标记的多核苷酸。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述标记是荧光团。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述荧光团共价附接到所述多核苷酸的末端。
58.根据权利要求55所述的方法，其中所述标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:55的核苷酸5-27、SEQ ID NO.:56的核苷酸7-25、SEQ ID NO.:75的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:76的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:77的核苷酸5-29、SEQ ID NO.:78的核苷酸6-26、SEQ ID NO.:79的核苷酸5-29、SEQ ID NO.:80的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:81的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:82的核苷酸4-22、SEQ ID NO.:83的核苷酸6-28、SEQ ID NO.:84的核苷酸6-25、SEQ ID NO.:85的核苷酸3-23和SEQ ID NO.:95的核苷酸2-24。
59.根据权利要求55所述的方法，其中所述标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:55、SEQ ID NO.:56、SEQ ID NO.:75、SEQ ID NO.:76，SEQ ID NO.:77、SEQ ID NO.:78、SEQ ID NO.:79、SEQ ID NO.:80、SEQ ID NO.:81、SEQ ID NO.:82、SEQ IDNO.:83、SEQ ID NO.:84、SEQ ID NO.:85和SEQ ID NO.:95。
60.根据权利要求55所述的方法，其中所述序列特异性引物组为组1或组4，并且所述标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:55的核苷酸5-27。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO.:55。
62.根据权利要求55所述的方法，其中所述序列特异性引物组为组3或组8，并且所述标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:56的核苷酸7-25。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO.:56。
64.根据权利要求55所述的方法，其中所述序列特异性引物组是组5或组9，并且所述标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ IDNO.:75的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:76的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:80的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:81的核苷酸5-22、SEQ IDNO.:82的核苷酸4-22、SEQ ID NO.:83的核苷酸6-28、SEQ ID NO.:84的核苷酸6-25、SEQ IDNO.:85的核苷酸3-23。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述标记的多核苷酸的序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO.:75、SEQ ID NO.:76、SEQ ID NO.:80、SEQ ID NO.:81、SEQ ID NO.:82、SEQID NO.:83、SEQ ID NO.:84和SEQ ID NO.:85。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述序列特异性引物组为组9，并且所述标记的多核苷酸的序列为SEQ ID NO.:83。
67.根据权利要求55所述的方法，其中所述序列特异性引物组是组11或组13，并且所述标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO.:77的核苷酸5-29和SEQ IDNO.:79的核苷酸5-29。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述标记的多核苷酸的序列包括SEQ ID NO.:77或SEQ ID NO.:79。
69.根据权利要求55所述的方法，其中所述多核苷酸组是组12，并且所述标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:78的核苷酸6-26。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO.:78。
71.根据权利要求55所述的方法，其中所述序列特异性引物组选自由以下组成的组：组14、组15、组16和组17，并且所述标记的多核苷酸包含SEQ ID NO.:95的核苷酸2-24。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO.:95。
73.一种试剂盒，包含根据权利要求1所述的组合物。
74.根据权利要求73所述的试剂盒，所述试剂盒还包含链置换聚合酶和逆转录酶。
75.根据权利要求74所述的试剂盒，其中所述多核苷酸组选自由组1和组4组成的组。
76.根据权利要求75所述的试剂盒，所述试剂盒还包含分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO.:55的核苷酸5-27。
77.根据权利要求76所述的试剂盒，其中所述分子信标的多核苷酸由SEQ ID NO.:55组成。
78.根据权利要求74所述的试剂盒，其中所述多核苷酸组选自由组3和组8组成的组。
79.根据权利要求78所述的试剂盒，所述试剂盒还包含分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO.:56的核苷酸7-25。
80.根据权利要求79所述的试剂盒，其中所述分子信标的多核苷酸由SEQ ID NO.:56组成。
81.根据权利要求74所述的试剂盒，其中所述多核苷酸组选自由组5和组9组成的组。
82.根据权利要求81所述的试剂盒，所述试剂盒还包含分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ IDNO.:75的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:76的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:80的核苷酸5-22、SEQ IDNO.:81的核苷酸5-22、SEQ ID NO.:82的核苷酸4-22、SEQ ID NO.:83的核苷酸6-28、SEQ IDNO.:84的核苷酸6-25和SEQ ID NO.:85的核苷酸3-23。
83.根据权利要求82所述的试剂盒，其中所述分子信标的多核苷酸由选自由以下组成的组的序列组成：SEQ ID NO.:75、SEQ ID NO.:76、SEQ ID NO.:80、SEQ ID NO.:81、SEQ IDNO.:82、SEQ ID NO.:83、SEQ ID NO.:84和SEQ ID NO.:85。
84.根据权利要求74所述的试剂盒，其中所述多核苷酸组选自由组11和组13组成的组。
85.根据权利要求84所述的试剂盒，所述试剂盒还包含分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ IDNO.:77的核苷酸5-29和SEQ ID NO.:79的核苷酸5-29。
86.根据权利要求85所述的试剂盒，其中所述分子信标的多核苷酸由选自由以下组成的组的序列组成：SEQ ID NO.:77和SEQ ID NO.:79。
87.根据权利要求74所述的试剂盒，其中所述多核苷酸组是组12。
88.根据权利要求87所述的试剂盒，所述试剂盒还包含分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO.:78的核苷酸6-26。
89.根据权利要求88所述的试剂盒，其中所述分子信标的多核苷酸由SEQ ID NO.:78组成。
90.根据权利要求74所述的试剂盒，其中所述多核苷酸组选自由以下组成的组：组14、组15、组16和组17。
91.根据权利要求90所述的试剂盒，所述试剂盒还包含分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO.:95的核苷酸2-24。
92.根据权利要求91所述的试剂盒，其中所述分子信标的多核苷酸由SEQ ID NO.:95组成。
93.一种试剂盒，包含根据权利要求36所述的组合物。
94.根据权利要求93所述的试剂盒，所述试剂盒还包含链置换聚合酶和逆转录酶。
95.根据权利要求94所述的试剂盒，所述试剂盒还包含分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和SEQ ID NO.:83。
96.根据权利要求94所述的试剂盒，所述试剂盒还包含SEQ ID NO.:63、SEQ ID NO.:64、SEQ ID NO.:65、SEQ ID NO.:66、SEQ ID NO.:67和SEQ ID NO.:68。
97.根据权利要求96所述的试剂盒，所述试剂盒还包含分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和SEQ ID NO.:77。
98.一种试剂盒，包含根据权利要求39所述的组合物。
99.根据权利要求98所述的试剂盒，所述试剂盒还包含链置换聚合酶和逆转录酶。
100.根据权利要求99所述的试剂盒，所述试剂盒还包含分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和SEQ ID NO.:77。
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