CN115684436A - 一种液质联用定量检测桃红四物汤中芍药苷含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种液质联用定量检测桃红四物汤中芍药苷含量的方法。液相色谱采用SCIEX Exion LC‑20AC，色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18，流动相：A：水(含0.1％甲酸)、B：甲醇。质谱采用SCIEX TQ 4500三重四极杆质谱仪，电喷雾离子源，负离子方式电离，多反应监测分析模式(MRM)，检测离子对为525.1→449.3。该方法中芍药苷在0.1～50μg/mL范围内线性关系良好。该方法符合中国药典2020版《药品质量标准分析方法验证指导原则》的要求，方法中供试品溶液前处理方法较现有方法操作简单，操作时间短，检测方法专属性强、灵敏度高、稳定、可靠，可用于芍药苷的含量测定、桃红四物汤质量控制，给生产过程和用药安全提供有益的参考。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种液质联用定量检测桃红四物汤中芍药苷含量的方法。
背景技术
桃红四物汤又名加味四物汤，出自《医宗金鉴》，是由桃仁、红花、熟地、当归、芍药、川芎构成的的活血补气之要方。具有养血活血、调经止痛的功效，广泛应用于妇人瘀血阻滞所致的痛经、月经后期、月经过少、闭经等疾病。
芍药苷为该方主要成分赤芍的有效成分，也是桃红四物汤的有效成分。目前芍药苷含量的测定方法主要有薄层扫描法、高效液相色谱法。由于桃红四物汤成分复杂现有方法存在前处理步骤繁琐，耗时长，专属性差、灵敏度低等缺点，存在一定的局限性，对于药物研究开发进度有一定的限制。
发明内容
为了克服现有技术存在的缺陷和不足，本发明提供了一种重现性好、灵敏度高、分析速度快、样品前处理简单的检测桃红四物汤中芍药苷含量的方法，此法可用于芍药苷的含量测定、桃红四物汤质量控制，给生产过程和用药安全提供有益的参考。
一种液质联用定量检测桃红四物汤中芍药苷含量的方法，包括步骤(1)样品制备，(2)标准曲线制备，(3)采用液相色谱-质谱联用检测芍药苷含量。
所述(1)样品制备的步骤包括：取桃红四物汤方剂药材：熟地黄12克、当归9克、白芍药9克、川芎6克、桃仁9克、红花6克，加水100mL浸泡1h，置电磁炉上武火煮沸后，文火煎煮30min，过滤。滤渣加水100mL武火煮沸后，文火煎煮30min，过滤。合并滤液。将滤液定容至100mL即得供试品溶液。精密移取供试品溶液0.5mL，置EP管中，加入稀释剂(50％甲醇)9.5mL，涡旋2min，超声20min后，13000r/min离心5min，取上清液作为供试品进样溶液。
所述(2)标准曲线制备的步骤包括：取芍药苷浓度为0.1、0.5、2、10、50μg/mL的标准曲线工作溶液，采用(3)液相色谱-质谱联用检测的方法检测，记录每个浓度的芍药苷对应的峰面积；以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，制备芍药苷的线性回归方程。
所述步骤(3)采用液相色谱-质谱联用检测的步骤包括：
(a)液相色谱条件液相色谱采用SCIEX Exion LC-20AC，色谱柱：C18，流动相：A：水(含0.1％甲酸)、B：甲醇。
(b)质谱条件质谱采用SCIEX TQ4500三重四极杆质谱仪，电喷雾离子源，负离子方式电离，多反应监测分析模式(MRM)。
本发明首次建立了LC-MS/MS法用于桃红四物汤中芍药苷含量的测定，并对其进行方法学验证，结果表明，所建立的方法符合中国药典2020版《药品质量标准分析方法验证指导原则》的要求，方法中供试品溶液前处理方法较现有方法操作简单，操作时间短，检测方法专属性强、灵敏度高、稳定、可靠，可用于芍药苷的含量测定、桃红四物汤质量控制，给生产过程和用药安全提供有益的参考。
附图说明
图1稀释剂的MRM质谱图。
图2空白溶剂的MRM质谱图。
图3标准品溶液的MRM质谱图。
图4供试品溶液的MRM质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的详细说明。下述内容仅用于说明本发明，但本发明不局限于此。
1仪器与试剂
液相色谱-质谱联用系统，型号为SCIEX Exion LC-TQ4500，AB SCIEX。Analyst数据采集软件。AUW-120D型电子分析天平，岛津公司。ME-204E型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。LED加热磁力搅拌器，BIOLOGIX。KQ3200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。Z216MK型高速冷冻离心机，HERMLE Labortechnik GmbH。
熟地黄、当归、白芍药、川芎、桃仁、红花(来源于建联中药店)。芍药苷对照品(批号：110736-202145，中国食品药品检定研究院)。甲醇(色谱纯，Merck)。甲酸(色谱纯，Fisher scientific)。水为Advantage A10 Milli-Q超纯水机制备的超纯水。
2溶液制备
2.1标准曲线溶液配制
稀释剂：50％甲醇即水-甲醇(体积比为50:50)。
标准曲线溶液：取芍药苷对照品10.0mg精密称定，置于100mL容量瓶中，加50％甲醇溶解并定容至刻度，得浓度为100μg/mL的标准品储备液。精密量取10、50、200、1000、5000μL该溶液分别置于10mL容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，制成芍药苷浓度为0.1、0.5、2、10、50μg/ml的标准曲线工作溶液，命名为标1、标2、标3、标4、标5。
2.2供试品溶液配制
取桃红四物汤方剂药材：熟地黄12克、当归9克、白芍药9克、川芎6克、桃仁9克、红花6克，加水100mL浸泡1h，置电磁炉上武火煮沸后，文火煎煮30min，过滤。滤渣加水100mL武火煮沸后，文火煎煮30min，过滤。合并滤液。将滤液定容至100mL即得供试品溶液。
精密移取供试品溶液0.5mL，置EP管中，加入稀释剂(50％甲醇)9.5mL，涡旋2min，超声20min后，13000r/min离心5min，取上清液作为供试品进样溶液。
3方法学验证
3.1液相色谱条件液相色谱采用SCIEX Exion LC-20AC，包括Degasser，AC pump，AD Multiplate Autosamper，AC Column Oven。色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(5μm，2.1*50mm)。流动相：A：水(含0.1％甲酸)；B：甲醇。洗脱梯度程序如下：0～0.3min，5％(v/v)B；0.3～1.0min，5％～95％(v/v)B；1.0～3.0min，95％(v/v)B；3.0～5.0min，5％(v/v)B。样品检测时间：5min；流速：0.5mL/min；进样量：2.0μL；柱温：40℃。
质谱条件质谱采用SCIEX TQ 4500三重四极杆质谱仪，电喷雾离子源，负离子方式电离，多反应监测分析模式(MRM)。检测离子对为525.1→449.3；去簇电压：-120V；碰撞电压：-30V；气帘气(CUR)：35psi；碰撞气(CAD)：8psi；喷雾电压(IS)：-4500V；离子源温度(TEM)：500℃；雾化气(GS1)：50psi；辅助加热气(GS2)：55psi。
3.2专属性
取稀释剂、空白溶剂、标准曲线溶液的标3、供试品溶液按3.1方法检测，得质谱图。结果表明，供试品与芍药苷对照品出峰位置一致，对照品出峰位置无干扰，且在出峰位置，空白溶剂不出峰。
3.3线性和范围
取2.1项下制备的标准曲线溶液，按3.1方法检测。以芍药苷的浓度为横坐标X，芍药苷的峰面积为纵坐标Y，用加权最小二乘法(权重为1/X2)进行回归运算，求得的直线方程即为标准曲线。回归方程为Y＝1730X+14389；r＝0.9996。芍药苷在0.1～50μg/mL范围内线性关系良好。
3.4精密度
重复性：取同一份供试品溶液，按照3.1方法，连续进样6次，计算色谱图中芍药苷峰面积的RSD为1.9％，<5％。
中间精密度：按照2.2操作，于第2天制备另一份供试品溶液，按3.1方法，连续进样6次，计算色谱图中芍药苷峰面积的RSD为2.6％，<5％。
表明方法精密度符合要求。
3.5回收率
取已知芍药苷含量为0.4531mg的供试品溶液6份，分别加入芍药苷对照品0.5mg、0.4mg、0.3mg各两份，按2.2项下方法处理后，按3.1方法处理测定，计算芍药苷的回收率，结果平均回收率和RSD分别为98.1％和3.7％(n＝6)。表明方法回收率符合要求。
3.6均一性考察
取精密度项下用于重复性实验的供试品混悬液，在上、中、下层各取3份样品，按2.2项下方法处理后，按3.1方法处理测定，计算芍药苷峰面积的RSD，结果RSD为2.1％，表明供试品均一性良好。
3.7稳定性考察
取精密度项下用于重复性实验的供试品混悬液，在室温下，放置24h，分别在0、12、24h于溶液上、中、下部平行取样，按2.2项下方法处理为相对应供试品溶液，按3.1方法检测，计算芍药苷峰面积的RSD，结果RSD为4.2％，表明供试品混悬液在24h内室温放置稳定性良好。
Claims (4)
1.一种液质联用定量检测桃红四物汤中芍药苷含量的方法，其特征在于，包括步骤(1)样品制备，(2)标准曲线制备，(3)采用液相色谱-质谱联用检测芍药苷含量；
所述(1)样品制备的步骤包括：取桃红四物汤方剂药材：熟地黄12克、当归9克、白芍药9克、川芎6克、桃仁9克、红花6克，加水100mL浸泡1h，置电磁炉上武火煮沸后，文火煎煮30min，过滤；滤渣加水100mL武火煮沸后，文火煎煮30min，过滤；合并滤液；将滤液定容至100mL即得供试品溶液；精密移取供试品溶液0.5mL，置EP管中，加入稀释剂(50％甲醇)9.5mL，涡旋2min，超声20min后，13000r/min离心5min，取上清液作为供试品进样溶液；
所述(2)标准曲线制备的步骤包括：取芍药苷浓度为0.1、0.5、2、10、50μg/mL的标准曲线工作溶液，采用(3)液相色谱-质谱联用检测的方法检测，记录每个浓度的芍药苷对应的峰面积；以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，制备芍药苷的线性回归方程；
所述步骤(3)采用液相色谱-质谱联用检测的步骤包括：
(a)液相色谱条件液相色谱采用SCIEX Exion LC-20AC，色谱柱：C18，流动相：A：水(含0.1％甲酸)，B：甲醇；
(b)质谱条件质谱采用SCIEX TQ4500三重四极杆质谱仪，电喷雾离子源，负离子方式电离，多反应监测分析模式(MRM)。
2.如权利要求1所述的一种液质联用定量检测桃红四物汤中芍药苷含量的方法，其特征在于，标准曲线溶液配制：取芍药苷对照品10.0mg精密称定，置于100mL容量瓶中，加50％甲醇溶解并定容至刻度，得浓度为100μg/mL的标准品储备液；精密量取10、50、200、1000、5000μL该溶液分别置于10mL容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，制成芍药苷浓度为0.1、0.5、2、10、50μg/ml的标准曲线工作溶液。
3.如权利要求1所述的一种液质联用定量检测桃红四物汤中芍药苷含量的方法，其特征在于，所述稀释剂：50％甲醇即水-甲醇(体积比为50:50)。
4.如权利要求1所述的一种液质联用定量检测桃红四物汤中芍药苷含量的方法，其特征在于，液相色谱条件液相色谱采用SCIEX Exion LC-20AC，色谱柱：Agilent EclipsePlus C18(5μm，2.1*50mm)，流动相：A：水(含0.1％甲酸)，B：甲醇；
质谱条件质谱采用SCIEX TQ 4500三重四极杆质谱仪，电喷雾离子源，负离子方式电离，多反应监测分析模式(MRM)，检测离子对为525.1→449.3，去簇电压：-120V，碰撞电压：-30V。
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