CN115678998A - 一种检测肺腺癌EGFR突变的miRNA标志物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测肺腺癌EGFR突变的miRNA标志物、试剂盒及方法。所述的miRNA标志物由miR‑10a‑5p、miR‑10b‑5p、miR‑34a‑5p、miR‑181a‑5p、miR‑203a‑3p、miR‑30e‑3p、miR‑542‑3p和miR‑4772‑3p组成。本发明通过运用limma包筛选与肺腺癌EGFR突变密切相关的差异miRNA，通过Lasso回归和logistic回归构建上述miRNA组合物的评分Score，可用于肺腺癌EGFR突变的检测。本发明的检测方法具有灵敏度、特异度高的特点，同时性价比高，能够简便、快速地为临床上EGFR‑TKI治疗提供科学的指导。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测肺腺癌EGFR突变的miRNA标志物、试剂盒及方法，属于分子诊断技术领域。
背景技术
肺腺癌是当前最主要的肺癌病理亚型，已占据每年所有新发肺癌病例的近三分之二。近年来，随着miRNA及组织学等基础学科的进展，人们针对肺腺癌的分子机制有了更深入的理解。人们发现表皮生长因子受体(EGFR)突变是肺腺癌的主要驱动因素之一。肺腺癌患者EGFR突变率为50％左右，不吸烟肺腺癌患者可高达60％-70％。EGFR基因突变通常发生在外显子18-21，其中19外显子DEL缺失(约占45％)及21外显子L858R点突变(约占40％)最常见。
目前临床EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)例如吉非替尼、阿法替尼、奥希替尼等已成为进展期且具有EGFR突变的肺腺癌患者的标准治疗方式。通过检测患者是否具有EGFR突变，来判断患者是否适合用EGFR-TKI治疗，已经是目前临床的常规操作。
目前检测EGFR突变的方法存在成本高昂、流程繁琐等缺陷。例如EGFR突变的标准检测方法直接测序法，过程稍繁琐、耗时长，检测10％以下突变率的样本常常出现假阴性。NGS是边合成边测序技术(Sequencing by Synthesis，SBS)，高通量高深度，价格昂贵。
发明内容
本发明的目的是：提供一种检测肺腺癌EGFR突变的miRNA标志物、试剂盒及方法，通过检测多个miRNA标志物的表达量，作为生物标志物用于判断患者EGFR突变情况，为临床上EGFR-TKI治疗提供指导。
为了实现上述目的，本发明提供了一种检测试剂在制备检测肺腺癌EGFR突变的试剂盒中的应用，所述检测试剂由检测以下miRNA表达量的试剂组成：miR-10A-5P、miR-10B-5P、miR-34A-5P、miR-181A-5P、miR-203A-3P、miR-30E-3P、miR-542-3P和miR-4772-3P，所述检测试剂作为试剂盒实现检测肺腺癌EGFR突变的唯一关键成分。
优选地，所述试剂盒内还包括说明书，所述说明书记载如下评分模型：
Score＝0.558×miR-10a-5p+0.446×miR-10b-5p+0.635×miR-34a-5p+0.921×miR-181a-5p-0.346×miR-203a-3p+0.984×miR-30e-3p+0.503×miR-542-3p-0.74×miR-4772-3p－39.893；
上述评分模型中各基因代表的是miRNA表达量的Log2(TPM+1)转换值，即采用TPM计算度量指标，TPM公式＝(每条miRNA比对到的read数目)/(样本总比对read数目)×106，并转换成Log2(TPM+1)后代入评分模型中计算Score得分，当检测样本Score得分大于0时，则该检测样本存在EGFR突变；当检测样本得分等于或小于0时，则该检测样本不存在EGFR突变；所述检测样本为新鲜组织肿瘤样本。
本发明还提供了一种检测肺腺癌EGFR突变的试剂盒，至少包括特异性检测以下miRNA表达量的试剂：miR-10A-5P、miR-10B-5P、miR-34A-5P、miR-181A-5P、miR-203A-3P、miR-30E-3P、miR-542-3P和miR-4772-3P。
本发明还提供了一种用于非疾病诊断和治疗目的的检测肺腺癌EGFR突变的方法，包括如下步骤：
步骤1：使用miRcute miRNA提取分离试剂盒miRcute miRNA Isolation Kit提取肿瘤组织样本中的miRNA；
步骤2：miRNA文库构建：采用TruSeq miRNA Sample Prep Kitv2试剂盒完成；
步骤3：簇生成：采用TruSeq SR Cluster Kitv3-cBot–HS试剂盒完成；
步骤4：Illumina Hiseq2000测序：Hiseq2000上机，测序结果将原始数据转换成Fastq格式；
步骤5：数据分析及计算：
对原始Fastq文件数据去除接头序列后，并检验测序片段碱基的质量和长度，筛选质量可靠的测序片段；将测序结果与miRbase数据库比对过滤，鉴定出检测样本中的miRNA数据；根据鉴定的miRNA进行表达量统计，miRNA表达量计算采用TPM计算度量指标，TPM公式＝(每条miRNA比对到的read数目)/(样本总比对read数目)×106，并转换成Log2(TPM+1)；将目的miRNA的表达量转换成Log2(TPM+1)后代入评分模型：Score＝0.558×miR-10a-5p+0.446×miR-10b-5p+0.635×miR-34a-5p+0.921×miR-181a-5p-0.346×miR-203a-3p+0.984×miR-30e-3p+0.503×miR-542-3p-0.74×miR-4772-3p－39.893计算Score得分。
步骤6：判断：当检测样本Score得分大于0时，则该检测样本存在EGFR突变；当检测样本得分等于或小于0时，则该检测样本不存在EGFR突变；所述检测样本为新鲜组织肿瘤样本。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明中通过检测患者多个miRNA的表达量，作为生物标志物用于判断患者EGFR突变情况，将会更具性价比地为EGFR突变检测提供保障，同时具有高敏感性、特异性和应用价值，有助于实现针对患者的精准医疗；
(2)本发明首次提出了该miRNA组合物可用于评估肺腺癌EGFR突变，较目前常用的方法，具有操作便捷，可定量分析、准确性高、灵敏度和特异性好、性价比高的优点。
附图说明
图1为EGFR突变型和野生型患者显著差异miRNA火山图；
图2为LASSO回归结果图；
图3为ROC曲线。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1miRNA集的筛选及效果验证
(一)肺腺癌预后评分模型构建
1、方法
首先从TCGA数据库中获得448例肺腺癌样本的miRNA表达数据和突变数据，根据患者的EGFR突变与否分为EGFR突变型(51例)和野生型(397例)，通过R语言limma包筛选出两组间的显著差异miRNA共38个，其中显著上调的miRNA共36个，显著下调的miRNA共2个(图1)。
进一步通过Lasso回归最终挑选出18个miRNA为：miR-101-3p、miR-10a-5p、miR-10b-5p、miR-34a-5p、miR-181a-5p、miR-203a-3p、miR-205-5p、miR-181a-3p、miR-224-5p、miR-30e-3p、miR-501-5p、miR-542-3p、miR-181a-2-3p、miR-339-3p、miR-146b-3p、miR-589-5p、miR-4772-3p、miR-664b-3p(图2)。
进一步对上述18个miRNA进行Logistic回归分析，最终挑选出8个miRNA(表1)，并构建得分模型：
Score＝0.558×miR-10a-5p+0.446×miR-10b-5p+0.635×miR-34a-5p+0.921×miR-181a-5p-0.346×miR-203a-3p+0.984×miR-30e-3p+0.503×miR-542-3p-0.74×miR-4772-3p－39.893；
表1：Logistic回归结果
最后我们基于该miRNA表达，计算每个样本的评分，通过ROC曲线(图3)分析其敏感性和特异性，将TCGA样本分为两组，评分大于0归于EGFR突变型，评分等于或小于0归于EGFR野生型。与实际检测结果相比较，计算灵敏度＝41/51＝80.4％，特异度＝371/444＝83.1％(表2)。
表2本方法在TCGA数据库肺腺癌中预测的灵敏度与特异度
(二)效果验证
我们将复旦大学附属中山医院胸外科收集的47例肺腺癌样本，进行miRNA测序。具体步骤如下：
①使用miRcute miRNA提取分离试剂盒(miRcute miRNA Isolation Kit)提取肿瘤组织样本中的miRNA；
②miRNA文库构建：采用TruSeq miRNA Sample Prep Kitv2试剂盒完成；
③簇生成：采用TruSeq SR Cluster Kitv3-cBot–HS试剂盒完成；
④Illumina Hiseq2000测序：Hiseq2000上机，测序结果将原始数据转换成Fastq格式；
⑤数据分析：
对原始Fastq文件数据去除接头序列后，并检验测序片段碱基的质量和长度，筛选质量可靠的测序片段；将测序结果与miRbase数据库比对过滤，鉴定出结果中的已知人的miRNA数据；根据鉴定的miRNA进行表达量统计，miRNA表达量计算采用TPM(transcript permillion)计算度量指标，TPM公式＝(每条miRNA比对到的read数目)/(样本总比对read数目)×106，并转换成Log2(TPM+1)。将目的miRNA的表达量Log2(TPM+1)进行相关计算，根据评分模型Score＝0.558×miR-10a-5p+0.446×miR-10b-5p+0.635×miR-34a-5p+0.921×miR-181a-5p-0.346×miR-203a-3p+0.984×miR-30e-3p+0.503×miR-542-3p-0.74×miR-4772-3p－39.893计算Score得分。
⑥根据计算结果分为两组，得到大于0的为EGFR突变型，等于或小于0的为EGFR野生型，与实际检测结果相比较，计算灵敏度＝20/26＝76.9％，特异度＝16/21＝71.4％。
表3本方法在中山医院肺腺癌患者中预测的灵敏度与特异度
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种检测试剂在制备检测肺腺癌EGFR突变的试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测试剂由检测以下miRNA表达量的试剂组成：miR-10A-5P、miR-10B-5P、miR-34A-5P、miR-181A-5P、miR-203A-3P、miR-30E-3P、miR-542-3P和miR-4772-3P，所述检测试剂作为试剂盒实现检测肺腺癌EGFR突变的唯一关键成分。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒内还包括说明书，所述说明书记载如下评分模型：
Score＝0.558×miR-10a-5p+0.446×miR-10b-5p+0.635×miR-34a-5p+0.921×miR-181a-5p-0.346×miR-203a-3p+0.984×miR-30e-3p+0.503×miR-542-3p-0.74×miR-4772-3p－39.893；
上述评分模型中各基因代表的是miRNA表达量的Log2(TPM+1)转换值，即采用TPM计算度量指标，TPM公式＝(每条miRNA比对到的read数目)/(样本总比对read数目)×106，并转换成Log2(TPM+1)后代入评分模型中计算Score得分，当检测样本Score得分大于0时，则该检测样本存在EGFR突变；当检测样本得分等于或小于0时，则该检测样本不存在EGFR突变；所述检测样本为新鲜组织肿瘤样本。
3.一种检测肺腺癌EGFR突变的试剂盒，其特征在于，至少包括特异性检测以下miRNA表达量的试剂：miR-10A-5P、miR-10B-5P、miR-34A-5P、miR-181A-5P、miR-203A-3P、miR-30E-3P、miR-542-3P和miR-4772-3P。
4.一种用于非疾病诊断和治疗目的的检测肺腺癌EGFR突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：使用miRcute miRNA提取分离试剂盒miRcute miRNA Isolation Kit提取肿瘤组织样本中的miRNA；
步骤2：miRNA文库构建：采用TruSeq miRNA Sample Prep Kitv2试剂盒完成；
步骤3：簇生成：采用TruSeq SR Cluster Kitv3-cBot–HS试剂盒完成；
步骤4：Illumina Hiseq2000测序：Hiseq2000上机，测序结果将原始数据转换成Fastq格式；
步骤5：数据分析及计算：
对原始Fastq文件数据去除接头序列后，并检验测序片段碱基的质量和长度，筛选质量可靠的测序片段；将测序结果与miRbase数据库比对过滤，鉴定出检测样本中的miRNA数据；根据鉴定的miRNA进行表达量统计，miRNA表达量计算采用TPM计算度量指标，TPM公式＝(每条miRNA比对到的read数目)/(样本总比对read数目)×106，并转换成Log2(TPM+1)；将目的miRNA的表达量转换成Log2(TPM+1)后代入评分模型：Score＝0.558×miR-10a-5p+0.446×miR-10b-5p+0.635×miR-34a-5p+0.921×miR-181a-5p-0.346×miR-203a-3p+0.984×miR-30e-3p+0.503×miR-542-3p-0.74×miR-4772-3p－39.893计算Score得分。
步骤6：判断：当检测样本Score得分大于0时，则该检测样本存在EGFR突变；当检测样本得分等于或小于0时，则该检测样本不存在EGFR突变；所述检测样本为新鲜组织肿瘤样本。
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