CN115669947A - 一种具有结肠保健功能的高內相乳液凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有结肠保健功能的高內相乳液凝胶及其制备方法。所述方法以质量浓度为4~8%的酪蛋白胶束和2~4%的多糖溶液为基质，采用超声技术将原花青素负载于酪蛋白胶束上，进而利用超声技术构建酪蛋白胶束‑原花青素‑多糖三元复合物；以复合物溶液为水相，以负载了咖啡酸苯乙酯的植物油脂为油相，利用均质联合离心技术制备水包油（O/W）型高內相乳液凝胶。所述乳液凝胶既能显著促进人结肠上皮正常细胞NCM‑460生长，又能有效抑制结肠癌细胞Caco‑2，且贮藏24个月仍保持品质稳定。所述具有结肠保健功能的高內相乳液凝胶制备工艺简单，易于工业化生产；产品对结肠上皮细胞和结肠癌细胞具有双向调节作用，保健功能显著，可用于功能食品和医药领域，应用前景广泛。

Description

一种具有结肠保健功能的高內相乳液凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药和功能食品领域，具体涉及一种具有结肠保健功能的高內相乳液凝胶及其制备方法。

技术背景

功能食品是指具有特定保健功能或者以补充维生素、矿物质为目的的食品，即适用于特定人群食用，具有调节机体功能，不以治疗疾病为目的，并且对人体不产生任何急性、亚急性或慢性危害的食品。近年来，人们对健康、营养模式的认识已经发生重大改变，食品已不仅仅是满足饥饿和为人类提供必需的营养，而且是可以预防疾病以提高消费者的身心健康。其中，以天然材料为原料生产的功能食品深受消费者的喜爱，如从天然动植物提取的多糖、蛋白质、小分子活性成分等备受人们关注（成妮妮，2012）。

酪蛋白是乳中含量最多的一大类蛋白质的总称，由αs1-，αs2-，β-，κ-酪蛋白 4部分组成。酪蛋白价格低廉，易于获得，可生物降解，并且营养价值极高。在牛乳中，酪蛋白并非以单体分子存在，而是与磷酸钙相互结合形成直径约为50~600nm的复合物，即酪蛋白胶束。酪蛋白胶束具有疏水内核、亲水表面结构（Fox et al., 2008）。因结构特殊，酪蛋白胶束已被作为天然纳米载体用于负载和递送大黄素（Yang et al., 2020a）、姜黄素（Hudsonet al., 2019）、维生素D2（Moeller et al., 2018）等活性分子，以改善其溶解性、稳定性和生物利用度。

果胶和海藻酸钠是具有多种功能的天然高分子多糖，具有凝胶、增稠等性能，在食品和医药领域引起了广泛的关注。研究表明，果胶、海藻酸钠具有一系列的健康促进作用，如减肥、预防结肠癌、心血管疾病、代谢综合征等；另外，果胶、海藻酸钠用于负载药物可延缓药物释放时间（艾世杰，2021；李萍，2021）。

咖啡酸苯乙酯是一种天然酚类化合物，存在于多种植物中，也是从蜂房中提取的蜂胶等天然产物的主要药用成分之一。研究表明，咖啡酸苯乙酯可通过诱导白细胞凋亡以对抗炎症反应，也可通过抗炎和抗氧化作用促进烧伤愈合，表现出较好的抗炎活性（DosSantos et al., 2013）。虽然咖啡酸苯乙酯是一种很有前景的抗炎治疗候选药物，但口服后溶解度低、生物利用度低，降低了其在临床治疗中的应用潜力（Wei et al, 2021）。

原花青素是一类广泛存在于植物中的天然多酚类化合物，由单体儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素等聚合而成，具有抗炎、抑菌、抗病、驱虫等作用（王楠等，2022）。然而，原花青素稳定性较差，在加工过程中易受到光照、温度、pH、氧化剂、金属离子等因素影响，使其在食品及医药行业的应用受到极大限制。

乳液凝胶是一种以乳液为基础，并辅助一定的诱导方式，由连续相形成空间网状结构，分散相进行填充，即以连续相包埋分散相形成的凝胶状固体或半固体。高內相乳液凝胶是指内相体积分数在74%以上的乳液凝胶。高内相乳液具有内相比例大、稳定性极佳、模版材料空隙均匀等特性，目前已被应用于药品和食品加工、生物组织工程、化妆品等多种领域中（江连洲等，2020）。从营养与健康的角度，全天然成分的乳液凝胶日益得到研究人员和消费者关注。从制备工艺的角度，寻求简单可行的方法，实现高稳定性乳液凝胶制备是当前热点问题之一。

蛋白质、多酚和多糖是食品中常见的物质。近年来，蛋白质-多酚-多糖三元复合物的研究受到了广泛的关注（李文婧，2022）。研究表明，蛋白质和多酚可以通过静电相互作用、疏水相互作用、氢键等非共价作用形成复合物；同时，再通过非共价作用与多糖结合（Tavernier et al., 2016）。多酚可以改善蛋白和多糖之间的相互作用并增强三元复合物在水中的稳定性，从而使非共价三元复合物具有许多二元复合物无可比拟的独特功能（Soares et al., 2012）。同时，多酚被负载于三元复合物中，稳定性提升（Wei et al.,2019）。另外，研究指出，蛋白-多酚-多糖非共价三元复合物具有稳定乳液的特殊功能，如乳铁蛋白-燕麦β葡聚糖-姜黄素三元复合物粒径较小且分子间结合紧密，形成的Pickering乳液具有较强的物理稳定性（Yang et al., 2020b）。白藜芦醇-玉米醇溶蛋白-果胶三元复合颗粒稳定的薄荷油乳液可以较好的递送白藜芦醇（Cheng et al.，2020）。姜黄素-豌豆分离蛋白-高甲氧基果胶三元复合物稳定的 Pickering 乳液负载可有效抑制β-胡萝卜素在紫外线照射下降解（Yi et al.，2020）。

超声波是一种频率超出人类听觉（20 kHz）的声波。低频超声技术是近年来兴起的一种非热加工技术。超声波可在液体基质中产生空化效应、热效应和微流效应，引起强烈的湍流，产生较高的剪切力，提高分子间的碰撞频率，从而增强分子间的结合作用。研究表明，超声波可有效促使酪蛋白胶束与活性小分子结合（Yang et al., 2020a）。

基于以上研究基础，本发明优选了酪蛋白胶束为载体，利用超声技术将具有抗炎活性的原花青素负载于酪蛋白胶束表面，进而通过其多元苯并吡喃结构在酪蛋白胶束与多糖间形成非共价交联，构建酪蛋白胶束-原花青素-多糖三元非共价复合物；以此复合物为乳化/稳定剂，以负载有抗炎成分咖啡酸苯乙酯的植物油为油相，利用均质技术制备乳液凝胶，进而通过离心技术获得高內相乳液凝胶，实现了原花青素、咖啡酸苯乙酯在乳液凝胶两相中的高效负载。所获得的乳液凝胶中，油滴由酪蛋白胶束-原花青素-多糖三元复合物稳定，在其表面形成三层膜结构，显著提升了乳液凝胶的稳定性，贮藏24个月仍保持结构完好，未见油相析出。双相负载后，乳液凝胶表现出结肠细胞双向调节性，即同时具有促进结肠上皮正常细胞NCM-460的生长和抑制结肠癌细胞Caco-2的作用，且原花青素和咖啡酸苯乙酯表现出协同促生长和抗癌作用。

由此可见，采用本发明技术制备的高內相乳液凝胶均以天然可食大分子为基质，无需添加人工合成乳化剂及其他稳定剂，具有天然、绿色的特性；乳液凝胶负载了两种功能因子，实现了二者的协同作用，保健功能显著。该乳液凝胶制备过程中无需其他凝胶化工艺，具有工艺简单、加工成本低的优势。该乳液凝胶既可作为药品基料，亦可作为功能食品，还可用于3D/4D打印功能食品基料，应用范围广泛，前景可观。

参考文献：

艾世杰. 海藻酸钠基酚酸共聚物的制备及其抗氧化活性研究[D]. 湘潭大学,2021.

成妮妮.国内外功能食品的需求现状及发展趋势[J]. 食品工业科技,2012, 33(08): 428-430.

江连洲,温家煜,王禹涵,罗小雪,姜思岐,隋晓楠. SPI凝胶颗粒制备及其Pickering高内相乳液特性研究[J]. 农业机械学报,2020,51(12):348-355.

李文婧. 醇溶蛋白/原花青素/果胶复合纳米颗粒稳定Pickering乳液的制备及其负载姜黄素的研究[D]. 山东农业大学,2022.

李萍. 花色苷和果胶基于肠道菌群对肥胖小鼠的协同干预研究[D]. 暨南大学,2021.

王楠,杨敏,郑杰,秦娟娟.酪蛋白胶束对原花青素稳定性的影响[J/OL]. 食品与发酵工业:1-14[2022-10-08]. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.029537.

Cheng H., Khan M. A., Xie Z., Tao S., Li Y. and Liang L. A peppermintoil emulsion stabilized by resveratrol-zein-pectin complex particles:Enhancing the chemical stability and antimicrobial activity in combinationwith the synergistic effect[J]. Food Hydrocolloids, 2020, 103: 105675.

Dos Santos J S, & Monte-Alto-Costa A. Caffeic Acid Phenethyl EsterImproves Burn Healing in Rats Through Anti-Inflammatory and AntioxidantEffects[J]. Journal of Burn Care & Research, 2013, 34(6):682-688.

Fox P F, & Brodkorb A. The casein micelle: Historical aspects,current concepts and significance[J]. International Dairy Journal, 2008, 18(7):677-684.

Hudson E A, de Paula H M C, da Silva R M, et al. Curcumin-micellarcasein multisite interactions elucidated by surface plasmon resonance[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 133:860-866.

Moeller H, Martin D, Schrader K, et al. Spray- or freeze-drying ofcasein micelles loaded with Vitamin D2: Studies on storage stability and invitro digestibility[J]. LWT-Food Science and Technology, 2018, 97:87-93.

Soares S., Mateus N. and de Freitas V. Carbohydrates inhibit salivaryproteins precipitation by condensed tannins[J]. Journal of Agricultural FoodChemistry, 2012, 60(15): 3966-3972.

Tavernier I., Wijaya W., Van der Meeren P., Dewettinck K. and PatelA. R. Food-grade particles for emulsion stabilization[J]. Trends in FoodScience & Technology, 2016, 50: 159-174.

Wei Z., Zhang H. and Huang Q. Curcumin-loaded Pickering emulsionstabilized by insoluble complexes involving ovotransferrin–gallic acidconjugates and carboxymethyldextran[J]. Food & Function, 2019, 10(8): 4911-4923.

Wei X, Dai J, Zhong Y, et al. Caffeic acid phenethyl ester loaded innano-targeted delivery system with casein: Physicochemical characterization,in vitro release, and binding mechanisms[J]. LWT-Food Science and Technology,2021, 150:111938.

Yang M, Wei Y, Ashokkumar M, et al. Effect of ultrasound on bindinginteraction between emodin and micellar casein and its microencapsulation atvarious temperatures[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2020a, 62:104861.

Yang W., Liang X., Xu L., Deng C., Jin W., Wang X., Kong Y., Duan M.,Nei Y., Zeng J. and Li B. Structures, fabrication mechanisms, and emulsifyingproperties of self-assembled and spray-dried ternary complexes based on，lactoferrin, oat beta-glucan and curcumin: A comparison study[J]. FoodResearch International, 2020b, 131: 109048.

Yi J., Huang H., Liu Y., Lu Y., Fan Y. and Zhang Y. Fabrication ofcurcumin-loaded pea protein-pectin ternary complex for the stabilization anddelivery of beta carotene emulsions[J]. Food Chemistry, 2020, 313: 126118.

发明内容

本发明所解决的技术问题一方面在于构建适宜的乳液乳化/稳定剂，简化乳液凝胶制备工艺，提高油滴稳定性，解决传统乳液凝胶制备工艺复杂、成本高、稳定性差的问题；另一方面在于通过优选两种活性因子，进行油相和水相双相负载，构建新型药剂和功能食品，发挥功能因子的协同作用，显著提高其功能性。本发明技术为相关技术人员提供了一种高稳定性高內相乳液凝胶的制备工艺，为医药行业提供了一种药物新剂型，为消费者提供了一种功能优异的半固体食品。

本发明所采用的技术方案为：

一种具有结肠保健功能的高內相乳液凝胶及其制备方法，具体步骤如下：

（1）原料制备：将酪蛋白胶束溶于水中，制成质量浓度为4~8%的水溶液，采用0.5~1mol/L盐酸或氢氧化钠调节溶液pH至6.5~7.5；将多糖溶于水中，制成质量浓度为2~4%的水溶液，采用0.5~1mol/L盐酸或氢氧化钠调节溶液pH至6.5~7.5，备用；

（2）二元复合物制备：将25~75mg原花青素与50mL步骤（1）的酪蛋白胶束溶液混合，置于带有25~35℃循环水浴的双层烧杯中，采用超声仪进行脉冲式超声处理，超声探头直径为12.7mm，浸入样品中心深度为2~4cm，超声波频率为20kHz，振幅为20~40%，超声时间为60~180s，脉冲模式为开启3~5s，停止2~4s，获得酪蛋白胶束-原花青素二元静态复合物；

（3）三元复合物制备：将步骤（2）的酪蛋白胶束-原花青素二元复合物溶液与步骤（1）的多糖溶液按照体积比为9:1~7:3的比例混合，总体积为50mL，置于带有25~35℃循环水浴的双层烧杯中，采用超声仪进行脉冲式超声处理，超声探头直径为12.7mm，浸入样品中心深度为2~4cm，超声波频率为20kHz，振幅为20~40%，超声时间为60~180s，脉冲模式为开启3~5s，停止2~4s，获得酪蛋白胶束-原花青素-多糖三元复合物；

（4）乳液凝胶制备：将25~75mg咖啡酸苯乙酯溶于50mL食用植物油，作为油相备用；取32.5~37.5mL油相与17.5~12.5mL步骤（3）的三元复合物溶液混合，形成总体积为50mL的混合液，采用高速剪切机进行均质处理，将剪切头置于溶液中心处，转速8000~15000r/min，均质时间为2~6min，获得油相体积分数为65~75%的初级乳液凝胶；

（5）高內相乳液凝胶制备：采用离心机对步骤（4）的初级乳液凝胶进行离心处理，离心力为4000~10000g，离心时间为30~60min，离心后弃去下层水相，获得高內相乳液凝胶。

本发明的有益效果或优点

1. 本发明利用酪蛋白胶束特殊的结构和其对原花青素的高亲和性，先构建酪蛋白胶束-原花青素二元非共价复合物，将原花青素负载于酪蛋白胶束表面；其次，利用原花青素的多元苯并吡喃环结构，在其另一侧通过非共价作用连接多糖，克服了多糖和蛋白的静电斥力和位阻效应，形成稳定的静态三元复合物；该复合物将原花青素负载在蛋白质和多糖之间，有利于提高其稳定性，还可实现缓释，显著提升了原花青素的生物利用度。

2. 本发明利用原花青素多聚体结构特征，其一侧以非共价键与酪蛋白胶束连接，另一侧非共价连接多糖，形成交联网络。酪蛋白胶束粒径较多糖小，分布于多糖链两侧不同位置，形成三层结构。在乳化过程中，酪蛋白胶束乳化油相，在油滴表面形成一层吸附层，而利用原花青素连接的多糖及多糖链另一侧的酪蛋白胶束包覆在油滴的外层，从而形成三层膜结构，显著提升了油滴的稳定性，延长了乳液凝胶的贮藏期。

3. 本发明利用原花青素和咖啡酸苯乙酯的抗氧化、抗炎、抑制结肠癌等生理活性，依据其溶解性，将原花青素负载于水相的酪蛋白胶束上，将咖啡酸苯乙酯负载于油相，进而利用酪蛋白和多糖的营养、乳化、凝胶及负载特性，构建了具有结肠保健功能的乳液凝胶，有效实现了原花青素和咖啡酸苯乙酯的缓释，提高了二者的生物利用度；通过双相负载，促使原花青素和咖啡酸苯乙酯的生理活性出现协同作用，构建的乳液凝胶具有促进正常结肠上皮细胞生长、抑制结肠癌细胞的双向功效，其双向调节作用显著优于同浓度单一游离分子或二者的游离组合物。

总之，本发明优选营养价值较高、结构性能特殊的酪蛋白胶束、多糖为基料，以具有抗炎、抗癌活性的原花青素、咖啡酸苯乙酯为功能因子，通过超声技术构建三元复合物，进而通过均质和离心技术构建高內相乳液凝胶。其中，油滴由蛋白质和多糖三层膜稳定；又因油滴密集，相互拥堵，因此乳液凝胶稳定性极高。其次，通过双相负载，提高了功能因子的稳定性，实现了缓释，二者生理活性具有协同效应。本发明所述技术可用于乳液凝胶构建，所制备的乳液凝胶可用作功能食品，用于结肠保健，在食品及医药行业具有广泛的用途和广阔的市场前景。

附图说明

图1为本发明中构建的二元复合物和三元复合物，及乳化后油滴表面的三层膜结构示意图。

图2为本发明实施例中乳液凝胶初始水相及油相体积、离心后乳液凝胶油相体积分数图。

图3为本发明实施例中获得的乳液凝胶贮藏24个月后的外观及显微镜照片。

图4为本发明实施例中获得的乳液凝胶流变性。

图5为本发明实施例中获得的乳液凝胶中原花青素和咖啡酸苯乙酯的胃肠模拟消化释放曲线，其中PC为原花青素，CAPE为咖啡酸苯乙酯，下同。

图6为本发明实施例中获得的乳液凝胶对结肠上皮正常细胞NCM-460和结肠癌细胞Caco-2的抑制性。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不仅仅局限于实施例表述的范围。实施例中有关测试方法说明如下。

（1）油相体积分数的计算

测定离心浓缩后乳液凝胶的下层水相体积，记录并弃去水相，通过下式计算油相体积分数：

油相体积分数=[油相体积/(凝胶总体积-离心后弃去的水相体积)]×100

（2）流变学性质的测定

乳液凝胶的粘弹性采用混合流变仪进行测量，将乳液凝胶平铺在锥板之间，锥板直径为40mm，间隙为1mm；在25℃条件下平衡3min后，进行动态振荡测量，记录弹性模量G'和粘性模量G"，频率范围为0.628~126.28 rad/s。

（3）活性分子体外模拟释放测定

将1g凝胶样品置于3mL pH 1.2 模拟胃液中，装于截留分子量为2kDa的透析袋中；将透析袋置于含有150mL释放介质的烧杯中，在37℃、100r/min下振荡2h。模拟胃液由2g/LNaCl、7 mL HCl、3.2g/L胃蛋白酶和5g/L脂肪酶组成，释放介质由75mL乙醇和75mL无酶模拟胃液组成。之后，将溶液的pH调至7.5，加入3mL模拟肠液；然后将透析袋置于含有150mL释放介质的烧杯中，并在37℃、100r/min下震荡24h。模拟肠液由6.8g/L磷酸二氢钾、10g/L胰蛋白酶、5g/L脂肪酶和12g/L猪胆盐组成，pH为7.5；释放介质由75mL乙醇和75mL无酶模拟肠液组成。在特定时间点收集3mL透析液，并添加等体积新鲜介质。由分光光度法测定透析液吸光度，其中原花青素为280nm，咖啡酸苯乙酯为330nm。原花青素和咖啡酸苯乙酯释放量依据同介质下的标准曲线进行计算。

（4）细胞活力测定

利用培养基将原花青素和咖啡酸苯乙酯标品及乳液凝胶样品稀释成活性分子含量为100μg/mL溶液，备用。在96孔板中配置100μL的NCM-460细胞或Caco-2细胞悬液，在37℃培养箱、5%CO₂的条件下预培养24h。向培养板加入10μL样品，在培养箱培育6h。向每孔加入10μL CCK-8 溶液，将培养板在培养箱内培育4h后用酶标仪测定450nm处的吸光度，计算细胞活力。在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去除药物影响。

实施例1，一种具有结肠保健功能的高內相乳液凝胶及其制备方法，具体步骤如下：

（1）原料制备：将酪蛋白胶束溶于水中，制成质量浓度为8%的水溶液，采用1mol/L氢氧化钠调节溶液pH至7.5；将高甲氧基果胶溶于水中，制成质量浓度为2%的溶液，采用1mol/L氢氧化钠调节溶液pH至7.5，备用；

（2）二元复合物制备：将75mg原花青素与50mL步骤（1）的酪蛋白胶束溶液混合，置于带有35℃循环水浴的双层烧杯中，采用超声仪进行脉冲式超声处理，超声探头直径为12.7mm，浸入样品中心深度为4cm，超声波频率为20kHz，振幅为20%，超声时间为180s，脉冲模式为开启5s，停止4s，获得酪蛋白胶束-原花青素二元静态复合物；

（3）三元复合物制备：将步骤（2）的酪蛋白胶束-原花青素二元复合物溶液与步骤（1）的果胶溶液按照体积比为9:1的比例混合，总体积为50mL，置于带有35℃循环水浴的双层烧杯中，采用超声仪进行脉冲式超声处理，超声探头直径为12.7mm，浸入样品中心深度为4cm，超声波频率为20kHz，振幅为20%，超声时间为180s，脉冲模式为开启5s，停止4s，获得酪蛋白胶束-原花青素-多糖三元复合物；

（4）乳液凝胶制备：将25mg咖啡酸苯乙酯溶于50mL食用葵花籽油，作为油相备用；取37.5mL油相与12.5mL步骤（3）的三元复合物溶液混合，形成总体积为50mL的混合液，采用高速剪切机进行均质处理，将剪切头置于溶液中心处，转速8000r/min，均质时间为6min，获得油相体积分数为75%的初级乳液凝胶；

（5）高內相乳液凝胶制备：采用离心机对步骤（4）的乳液凝胶进行离心处理，离心力4000g，离心时间为60min，离心后弃去下层水相，获得高內相乳液凝胶。

附图1为本发明技术构建的二元复合物和三元复合物，及其乳化油滴形成的三层膜结构。原花青素体积较大，为多聚体，其一侧与酪蛋白胶束结合，另一侧与多糖结合，克服了多糖与酪蛋白胶束间的静电斥力，形成了三层复合结构；在乳化过程中，酪蛋白胶束在油水界面形成吸附层，进而使三元复合物覆盖于油滴表面，即形成了三层膜结构，显著提升了油滴的稳定性，又将原花青素负载在多糖和酪蛋白胶束之间，提升了原花青素的稳定性，并可对其进行缓释。另外，将咖啡酸苯乙酯负载于油相，亦可提升其溶解性，实现缓释。

实施例1的乳液凝胶油相体积分数87.6%，见附图2，说明其为高內相乳液凝胶。实施例1中乳液凝胶贮藏24个月后的外观及显微镜照片见附图3，可以看出，乳液凝胶贮藏24个月后，油滴依然分布均匀且密集，未见油相析出，说明乳液凝胶具有极高的贮藏稳定性。

实施例1中乳液凝胶的流变性数据见附图4，可以看出，G’大于G’’，乳液凝胶表现为典型的半固体凝胶状；且G’和G’’值较大，说明乳液凝胶具有一定的粘弹性和自支撑性，可作为3D/4D打印材料。

实施例1中乳液凝胶对原花青素和咖啡酸苯乙酯的释放特性见附图5。由图可以看出，游离咖啡酸苯乙酯在模拟胃肠条件下释放较快，24h累积释放率达到100%；而其经过负载后消化10h内释放速率显著减缓，24h累积释放率为80.99±4.15%。由于游离原花青素水溶性较好，其在胃液中释放较快；在肠液的pH7.5环境中，部分原花青素降解，因此释放率降低，其24h累积释放率仅为53.14±0.98%。负载后，原花青素在胃液中释放率显著降低，而在肠液中的释放率显著升高，24h累积释放率达到98.00±2.25%。由此可见，经乳液凝胶负载，显著提升了原花青素的稳定性，实现了原花青素和咖啡酸苯乙酯的缓释。

实施例1中乳液凝胶对人结肠上皮正常细胞NCM-460和结肠癌细胞Caco-2的抑制率见附图6。由图可以看出，与凝胶负载同剂量的游离原花青素、咖啡酸苯乙酯及其组合物对正常结肠上皮细胞具有一定的毒性，且对结肠癌细胞也具有一定的抑制作用；空载体无细胞毒性，也无结肠癌细胞抑制性。负载原花青素和咖啡酸苯乙酯后，乳液凝胶的促正常细胞生长作用和结肠癌细胞抑制作用均显著增加，其中NCM-460细胞存活率为253.81±6.64%，Caco-2细胞存活率为30.39±3.47%。一方面，乳液凝胶负载提升了原花青素的稳定性，改善了咖啡酸苯乙酯的溶解性，并对二者有缓释作用，因此降低了细胞毒性，提升了生物利用度。另一方面，负载后原花青素和咖啡酸苯乙酯与蛋白质、多糖形成非共价复合物，其细胞代谢途径可能会与游离状态存在差异，有待进一步研究。综上所述，本发明所述的乳液凝胶具有极高的贮藏稳定性，且表现出对结肠细胞的双向调节作用，是一种具有结肠保健功能的高稳定性高內相乳液凝胶。

实施例2，一种具有结肠保健功能的高內相乳液凝胶及其制备方法，具体步骤如下：

（1）原料制备：将酪蛋白胶束溶于水中，制成质量浓度为4%的水溶液，采用0.5mol/L盐酸或氢氧化钠调节溶液pH至6.5；将海藻酸钠溶于水中，制成质量浓度为4%的溶液，采用0.5mol/L盐酸或氢氧化钠调节溶液pH至6.5，备用；

（2）二元复合物制备：将25mg原花青素与50mL步骤（1）的酪蛋白胶束溶液混合，置于带有25℃循环水浴的双层烧杯中，采用超声仪进行脉冲式超声处理，超声探头直径为12.7mm，浸入样品中心深度为2cm，超声波频率为20kHz，振幅为40%，超声时间为60s，脉冲模式为开启3s，停止2s，获得酪蛋白胶束-原花青素二元静态复合物；

（3）三元复合物制备：将步骤（2）的酪蛋白胶束-原花青素二元复合物溶液与步骤（1）的海藻酸钠溶液按照体积比为7:3的比例混合，总体积为50mL，置于带有25℃循环水浴的双层烧杯中，采用超声仪进行脉冲式超声处理，超声探头直径为12.7mm，浸入样品中心深度为2cm，超声波频率为20kHz，振幅为40%，超声时间为60s，脉冲模式为开启3s，停止2s，获得酪蛋白胶束-原花青素-多糖三元复合物；

（4）乳液凝胶制备：将75mg咖啡酸苯乙酯溶于50mL食用大豆油，作为油相备用；取32.5mL油相与17.5mL步骤（3）的三元复合物溶液混合，形成总体积为50mL的混合液，采用高速剪切机进行均质处理，将剪切头置于溶液中心处，转速15000r/min，均质时间为2min，获得油相体积分数为65%的初级乳液凝胶；

（5）高內相乳液凝胶制备：采用离心机对步骤（4）的乳液凝胶进行离心处理，离心力10000g，离心时间为30min，离心后弃去下层水相，获得高內相乳液凝胶。

实施例2的乳液凝胶油相体积分数79.5%，见附图2，说明其为高內相乳液凝胶。实施例2中乳液凝胶贮藏24个月后的外观及显微镜照片见附图3，可以看出，乳液凝胶贮藏24个月后，油滴依然分布均匀且密集，未见油相析出，说明乳液凝胶具有极高的贮藏稳定性。

实施例2中乳液凝胶的流变性数据见附图4，可以看出，G’大于G’’，乳液凝胶表现为典型的半固体凝胶状；且G’和G’’值较大，说明乳液凝胶具有一定的粘弹性和自支撑性，可作为3D/4D打印材料。

实施例2中乳液凝胶对原花青素和咖啡酸苯乙酯的释放特性见附图5。由图可以看出，游离咖啡酸苯乙酯在模拟胃肠条件下释放较快，24h累积释放率为100%；而其经过负载后24h累积释放率为81.46±0.22%。乳液凝胶中原花青素24h累积释放率为97.91±2.04%。乳液凝胶负载显著提升了原花青素的稳定性，实现了原花青素和咖啡酸苯乙酯的缓释。

实施例2中乳液凝胶对人结肠上皮正常细胞NCM-460和结肠癌细胞Caco-2的抑制率见附图6。由图可以看出，与游离原花青素、咖啡酸苯乙酯相比，乳液凝胶的促正常细胞生长作用和结肠癌细胞抑制作用均显著增加；其中NCM-460细胞存活率为192.97±7.18%，Caco-2细胞存活率为47.21±5.47%。

实施例3，一种具有结肠保健功能的高內相乳液凝胶及其制备方法，具体步骤如下：

（1）原料制备：将酪蛋白胶束溶于水中，制成质量浓度为6%的水溶液，采用0.8mol/L氢氧化钠调节溶液pH至7.0；将低甲氧基果胶溶于水中，制成质量浓度为3%的溶液，采用0.8mol/L氢氧化钠调节溶液pH至7.0，备用；

（2）二元复合物制备：将50mg原花青素与50mL步骤（1）的酪蛋白胶束溶液混合，置于带有30℃循环水浴的双层烧杯中，采用超声仪进行脉冲式超声处理，超声探头直径为12.7mm，浸入样品中心深度为3cm，超声波频率为20kHz，振幅为30%，超声时间为120s，脉冲模式为开启4s，停止3s，获得酪蛋白胶束-原花青素二元静态复合物；

（3）三元复合物制备：将步骤（2）的酪蛋白胶束-原花青素二元复合物溶液与步骤（1）的果胶溶液按照体积比为8:2的比例混合，总体积为50mL，置于带有30℃循环水浴的双层烧杯中，采用超声仪进行脉冲式超声处理，超声探头直径为12.7mm，浸入样品中心深度为4cm，超声波频率为20kHz，振幅为30%，超声时间为120s，脉冲模式为开启4s，停止3s，获得酪蛋白胶束-原花青素-多糖三元复合物；

（4）乳液凝胶制备：将50mg咖啡酸苯乙酯溶于50mL食用橄榄油，作为油相备用；取35.0mL油相与15.0mL步骤（3）的三元复合物溶液混合，形成总体积为50mL的混合液，采用高速剪切机进行均质处理，将剪切头置于溶液中心处，转速12000r/min，均质时间为4min，获得油相体积分数为70%的初级乳液凝胶；

（5）高內相乳液凝胶制备：采用离心机对上述乳液凝胶进行离心处理，离心力7000g，离心时间为45min，离心后弃去下层水相，获得高內相乳液凝胶。

实施例3的乳液凝胶油相体积分数84.7%，见附图2，说明其为高內相乳液凝胶。实施例3中乳液凝胶贮藏24个月后的外观及显微镜照片见附图3，可以看出，乳液凝胶贮藏24个月后，油滴依然分布均匀且密集，未见油相析出，说明乳液凝胶具有极高的贮藏稳定性。

实施例3中乳液凝胶的流变性数据见附图4，可以看出，G’大于G’’，乳液凝胶表现为典型的半固体凝胶状；且G’和G’’值较大，说明乳液凝胶具有一定的粘弹性和自支撑性，可作为3D/4D打印材料。

实施例3中乳液凝胶对原花青素和咖啡酸苯乙酯的释放特性见附图5。由图可以看出，游离咖啡酸苯乙酯在模拟胃肠条件下释放较快，24h累积释放率为100%；而其经过负载后24h累积释放率为79.96±0.22%。乳液凝胶中原花青素24h累积释放率为98.96±2.66%。乳液凝胶负载显著提升了原花青素的稳定性，实现了原花青素和咖啡酸苯乙酯的缓释。

实施例3中乳液凝胶对人结肠上皮正常细胞NCM-460和结肠癌细胞Caco-2的抑制率见附图6。由图可以看出，与游离原花青素、咖啡酸苯乙酯相比，乳液凝胶的促正常细胞生长作用和结肠癌细胞抑制作用均显著增加；其中NCM-460细胞存活率为231.10±5.49%，Caco-2细胞存活率为43.96±4.08%。

Claims (5)

1.一种具有结肠保健功能的高內相乳液凝胶及其制备方法，其特征在于包括如下步骤和工艺条件：

（1）原料制备：将酪蛋白胶束溶于水中，采用盐酸或氢氧化钠调节溶液pH接近中性；将水溶性多糖溶于水中，采用盐酸或氢氧化钠调节溶液pH接近中性，备用；

（2）二元复合物制备：将适量原花青素与50mL步骤（1）的酪蛋白胶束溶液混合，置于带有25~35℃循环水浴的双层烧杯中，采用超声仪进行脉冲式超声处理，获得酪蛋白胶束-原花青素二元静态复合物；

（3）三元复合物制备：将步骤（2）的酪蛋白胶束-原花青素二元复合物溶液与步骤（1）的多糖溶液按照一定比例混合，形成50mL不同油相体积分数的混合液，置于带有25~35℃循环水浴的双层烧杯中，采用超声仪进行脉冲式超声处理，获得酪蛋白胶束-原花青素-多糖三元复合物；

（4）乳液凝胶制备：将适量咖啡酸苯乙酯溶于50mL食用植物油，作为油相备用；取一定体积的油相与步骤（3）的三元复合物溶液混合，形成总体积为50mL的混合液，采用高速剪切机进行均质处理，获得初级乳液凝胶；

（5）高內相乳液凝胶制备：采用离心机对步骤（4）的初级乳液凝胶进行离心处理，离心后弃去下层水相，即得高內相乳液凝胶。

2.根据权利要求1所述的具有结肠保健功能的高內相乳液凝胶及其制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的多糖为不同来源、不同酯化度的果胶，不同甘露糖醛酸/古洛糖醛酸比例的海藻酸钠，以及果胶和海藻酸钠的混合物；步骤（1）中所述的酪蛋白胶束浓度为4~8%，多糖浓度为2~4%，溶液pH为6.5~7.5。

3.根据权利要求1所述的具有结肠保健功能的高內相乳液凝胶及其制备方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（4）中所述的原花青素、咖啡酸苯乙酯质量为25~75mg；步骤（3）中所述的二元复合物溶液与多糖溶液混合的体积比为9:1~7:3；步骤（2）和步骤（3）中所述的超声处理条件为超声探头直径为12.7mm，浸入样品中心深度为2~4cm，超声波频率为20kHz，振幅为20~40%，超声时间为60~180s，脉冲模式为开启3~5s，停止2~4s。

4.根据权利要求1所述的具有结肠保健功能的高內相乳液凝胶及其制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述的油相体积分数为65~75%，均质条件为将剪切头置于溶液中心处，转速为8000~15000r/min，均质时间为2~6min。

5.根据权利要求1所述的具有结肠保健功能的高內相乳液凝胶及其制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述的离心条件为离心力4000~10000g，离心时间30~60min。

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