CN115666547B - 用于广谱抗病毒疗法的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了配制剂、系统和方法，其中使用一种或多种抑制AP2M1与用于运输病毒蛋白的蛋白质基序的相互作用的化合物来治疗广泛的病毒感染。此类化合物的实例是N‑(对戊基肉桂酰基)邻氨基苯甲酸(ACA)。适合此类方法的病毒感染包括由RNA病毒引起的感染，其中用于将病毒RNA转运到细胞核中的病毒编码的蛋白质包括基序，其中
Description
本国际专利申请要求于2020年5月13日提交的美国临时专利申请号63/024,266的权益，其全部内容通过引用并入以用于所有目的。
发明领域
本发明的领域是用于病毒感染的广谱治疗的组合物和方法。
背景技术
背景描述包括可以用于理解本发明的信息。这并非承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者任何具体或隐含引用的出版物都是现有技术。
病毒-宿主相互作用驱动相互进化变化，从而导致感染病毒和宿主抗病毒应答两者的多样化(1)。新型病毒(许多是动物来源)如人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性和中东呼吸综合征(SARS和MERS)冠状病毒、寨卡病毒(ZIKV)、甲型禽流感(H5N1)、甲型禽流感(H7N9)和2009年大流行的甲型流感(pdmH1N1)病毒、肠道病毒(例如EV-A71和EV-D68)和SARS-CoV-2的最近出现表明需要开发具有广泛特异性的治疗病毒感染的方法。
正在寻求的方法之一是开发和/或鉴定广谱抗病毒药物。广谱抗病毒药物靶向并抑制广泛的病毒病原体的复制和发展。此类药物通常抑制病毒蛋白(如聚合酶、蛋白酶或逆转录酶)或通过靶向宿主细胞蛋白和病毒在感染期间利用的过程。许多广谱抗病毒药物是通过筛选已证实安全性的现有治疗性药物化合物的文库针对超出其原始适应症的特定病毒的功效，例如针对最初研究之外的其他病毒的抗病毒活性(例如瑞德西韦、利托那韦/洛匹那韦)或超出其原始治疗性适应症(例如阿奇霉素、氯硝柳胺)的功效来鉴定的。虽然有效地鉴定了对用于筛选的病毒具有抗病毒活性的化合物，但此类病毒特异性筛选方法并非旨在(并因此不太可能)鉴定具有跨不同病毒种类的广泛抗病毒作用的化合物。
因此，仍然需要广谱抗病毒药物。
发明概述
本发明提供了以下实施方案。
1.用于提供多种不同病毒感染的治疗的配制剂，其包含调节宿主AP2M1与包含基序的病毒蛋白的化合物，其中代表具有庞大疏水侧链的氨基酸并且x是任何氨基酸，并且其中化合物以对于多种不同病毒感染有效降低死亡率或减少病毒复制的量提供。
2.实施方案1的配制剂，其中化合物是N-(对戊基肉桂酰基)邻氨基苯甲酸(ACA)或其类似物。
3.实施方案1或2的配制剂，其中选自L、M、F、I和V。
4.实施方案1至3中一项的配制剂，其中配制剂包含用于注射或输注的药学上可接受的载剂。
5.实施方案1至3中一项的配制剂，其中配制剂包含用于局部施用于体表的药学上可接受的载剂。
6.实施方案5的配制剂，其中配制剂作为液体、凝胶、软膏或洗剂提供。
7.实施方案1至3中一项的配制剂，其中配制剂包含用于吸入的药学上可接受的载剂。
8.实施方案7的配制剂，其中配制剂作为喷雾或气雾提供。
9.实施方案1至8中一项的配制剂，其中导致多种不同病毒感染中的至少一种的病毒选自流感病毒、冠状病毒和寨卡病毒。
10.提供多种不同病毒感染的治疗的方法，其包括：
鉴定需要治疗导致多种病毒感染中的一种的病毒的个体；和
向需要治疗的个体施用调节宿主AP2M1与包含基序的病毒蛋白的化合物，其中代表具有庞大疏水侧链的氨基酸并且x是任何氨基酸。
11.实施方案10的方法，其中化合物是N-(对戊基肉桂酰基)邻氨基苯甲酸(ACA)或其类似物。
12.实施方案10或11的方法，其中选自L、M、F、I和V。
13.实施方案10至12中一项的方法，其中配制剂包含用于注射或输注的药学上可接受的载剂。
14.实施方案10至12中一项的方法，其中施用包括将配制剂应用至体表。
15.实施方案14的方法，其中配制剂作为液体、凝胶、软膏或洗剂提供。
16.实施方案10至12中一项的方法，其中施用包括配制剂的吸入。
17.实施方案16的方法，其中配制剂作为喷雾或气雾提供。
18.实施方案10至17中一项的方法，其中导致多种病毒感染中的一种的病毒选自流感病毒、冠状病毒和寨卡病毒。
19.实施方案10至18中一项的方法，其中治疗包括预防性治疗。
20.实施方案10至18中一项的方法，其中治疗包括活动性疾病的治疗。
21.实施方案20的方法，其中需要治疗的个体是无症状的。
22.调节宿主AP2M1与包含基序的病毒蛋白的相互作用的化合物在用于提供对多种不同病毒感染的治疗的配制剂中的用途，其中代表具有庞大疏水侧链的氨基酸并且x是任何氨基酸。
23.实施方案22的用途，其中化合物为N-(对戊基肉桂酰基)邻氨基苯甲酸(ACA)或其类似物。
24.实施方案22或23的用途，其中选自L、M、F、I和V。
25.实施方案22至24中一项的用途，其中配制剂包含用于注射或输注的药学上可接受的载剂。
26.实施方案22至24中一项的用途，其中施用包括配制剂至体表的应用。
27.实施方案26的用途，其中配制剂是液体、凝胶、软膏或洗剂的形式。
28.实施方案22至24中一项的用途，其中施用包括配制剂的吸入。
29.实施方案28的用途，其中配制剂是喷雾或气雾的形式。
30.实施方案22至29中一项的用途，其中导致多种病毒感染中的一种的病毒选自流感病毒、冠状病毒和寨卡病毒。
31.实施方案22至30中一项的用途，其中治疗包括预防性治疗。
32.实施方案22至30中一项的用途，其中治疗包括活动性疾病的治疗。
33.实施方案32的用途，其中需要治疗的个体是无症状的。
附图简述
图1.细胞内运输通路是易损的并且可用于抗病毒干预用药。(A)不同病毒感染后细胞命运决定通路的时程应答。对pdmH1N1感染的人原代支气管/气管上皮细胞(HBTEC)、ZIKV感染的人成纤维细胞和EV-A71感染的人神经祖细胞分别进行了反映Wnt、TGF-β、Notch和PI3K/Akt信号传导活性的萤光素酶报告基因测定。用10MOI病毒感染含有报告基因和内部对照质粒的细胞，然后在指定的时间点进行双亮度检测，并通过内部对照质粒归一化。结果显示为热图。(B)RNAi筛选鉴定了pdmH1N1病毒复制所必需的基因。左图：在具有0.1MOI病毒感染的人肺上皮A549细胞中进行的实验工作流程。右图：与加扰-siRNA对照相比时，在426个膜和细胞运输基因中，17个基因(黑点)的单独敲低可以抑制病毒复制>1-Log幅度。(C)小分子化合物文库筛选将ACA鉴定为体外广谱抗病毒药物。膜转运蛋白/细胞运输文库通过细胞保护测定(框1，蓝点表示>90％的细胞活力)在pdmH1N1感染的MDCK细胞(0.01MOI和48hpi)中进行初级筛选，随后利用病毒载量减少测定进行次级筛选(框2，品红点表示应用10μM药物浓度降低>3log病毒载量)和三级筛选(框3，黄点表示使用1μM药物浓度降低>2log病毒载量)。ACA因其广谱抗病毒功效而被优先考虑。最后一张图中显示了针对所示6种不同病毒的抗病毒作用。在EV-A71(RD细胞)、SARS-CoV-2(VeroE6细胞)、SFTSV(Vero细胞)和ZIKV(Vero细胞)中进行了噬斑减少测定。TCID50测定用于AdV5滴定(HEp-2细胞)，而p24ELISA用于HIV抗原测量(MOLT-4细胞)。显示的是相对于不存在化合物的对照，指定浓度的PFU或TCID50或OD450值(％)。
图2.ACA在体外和体内的抗流感活性。(A)ACA减少了甲型流感NP阳性细胞。MDCK细胞用0.01MOI pdmH1N1病毒感染并用ACA(10μM)或DMSO(0.1％)处理或模拟品感染24hpi。通过流式细胞术对病毒NP阳性细胞进行定量。(B)ACA表现出包括甲型流感H5N1、H7N7、H7N9和H9N2病毒的跨亚型抗流感活性。MDCK细胞用0.001MOI的每种病毒感染，并用指定浓度的ACA处理。在24hpi收集细胞培养上清液，通过RT-qPCR测定确定病毒载量。单因素ANOVA用于与DMSO处理组(0μM)进行比较。对于使用≥1.25μM ACA的所有组，**p<0.01。(C)ACA抑制了由0.01MOI病毒感染的HBTEC中的pdmH1N1复制。在24hpi收集上清液并通过噬斑测定确定病毒滴度。单因素ANOVA用于与DMSO处理组(0μM)进行比较。(D)ACA在分化的人气管类器官(AO)中显示出抗流感活性。用0.01MOI的pdmH1N1病毒接种3D AO(n＝3)。用ACA(10μM)或DMSO(0.1％)处理的受感染类器官在24hpi收获。显示了通过GAPDH归一化的细胞内病毒基因拷贝。通过学生t检验分析DMSO和ACA组之间的差异。上述实验一式三份并且以3次独立实验进行。结果显示为平均值±s.d。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。(E)在对病毒NP(绿色)、DAPI(蓝色，用于细胞核)和鬼笔环肽(品红色，用于细胞膜)进行免疫荧光染色后，使用共聚焦显微镜检查人AO的代表性2D图像。比例尺：20μm。(F-I)ACA针对甲型H1N1或H7N9流感病毒的致命攻击提供全面保护。BALB/c小鼠鼻内接种1000PFU的小鼠适应性甲型H1N1流感病毒(黑线)或200PFU的甲型H7N9流感病毒(红线)。然后从攻击后1小时开始，用鼻内ACA(空心三角形)、扎那米韦(空心圆)或0.5％DMSO(实心方形)处理小鼠1剂。(F)监测生存和临床疾病14天或直至死亡。使用对数秩(Mantel-Cox)检验比较组间生存率的差异。(G)生存小鼠的每日体重。(H)收集肺组织用于分别在2dpi和4dpi使用噬斑测定法检测病毒滴度。虚线表示噬斑测定的检测下限(***p<0.001；出于统计分析和清晰的目的，将任何低于检测限的滴度指定为10～15PFU/ml的值)。(I)用苏木精和伊红(H&E)染色的指定组的肺组织(4dpi)的代表性组织切片。DMSO组存在更大的肺泡损伤和间质炎症浸润。放大倍数：200×。
图3.ACA在体内显示出广谱抗病毒活性。(A-D)ACA针对ZIKV的致命攻击提供保护。四至六周龄的A129小鼠在麻醉下皮下(s.c.)接种1×106PFU的ZIKV-PR。每只小鼠在1hpi接受1剂皮下施用的ACA(1mg/kg)或PBS中的0.5％ DMSO。每天监测小鼠的(A)生存率和(B)体重变化。(C)每组中的五只小鼠在6dpi安乐死，并收获脑组织用于通过噬斑测定进行小瓶滴度测定。虚线表示噬斑测定的检测下限(***p<0.001；出于统计分析和清晰的目的，将任何低于检测限的滴度指定为10～15PFU/ml的值)。(D)ACA处理后6dpi的脑样品的组织病理学和免疫组织化学分析表明较轻的脑膜炎(通过H&E，200×)和如ZIKV NS1抗原染色所示的较少的病毒感染细胞(红色箭头，通过IHC，200×放大倍数)。(E-H)ACA保护hDPP4转基因小鼠免受MERS-CoV感染。hDPP4小鼠鼻内(i.n.)接种500PFU的MERS-CoV，并且从1hpi开始，通过ACA或0.5％ DMSO i.n.处理1剂。显示了(E)生存率，(F)平均体重，(G)2dpi的肺病毒滴度，和(H)通过H&E和抗MERS-CoV-NP免疫荧光染色的代表性肺组织。染色表明在ACA处理的小鼠肺中检测到更少的炎症细胞过滤(通过H&E，200×放大)和较少的病毒感染细胞抗原(通过IF，绿色荧光)。结果表示为平均值±s.d。使用对数秩(Mantel-Cox)检验比较生存率的差异并且通过学生t检验比较病毒滴度。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。
图4.ACA靶向宿主AP2M1蛋白。(A)ACA阻断pdmH1N1病毒复制周期的启动。上图：描述ACA添加和用于病毒mRNA (蓝线)、vRNA (品红线)和cRNA(黑线)定量的细胞裂解物收集的时间点的实验工作流程。MDCK细胞与2MOI病毒在冰上孵育2小时，然后进行强力洗涤并添加ACA，然后转移至37℃。下图：在指定的时间点收集细胞裂解物并逆转录用于qPCR分析。使用学生t检验分析指定时间点每种病毒RNA类型的DMSO和ACA组之间的差异(在相应的彩色实线上**p<0.01或***p<0.001)。(B)ACA抑制IAV vRNA的核输入。与DMSO或ACA预孵育的MDCK细胞与H1N1病毒(50MOI)在冰上孵育1小时。在有或没有药物的情况下，在零时间加入温热的培养基。然后将细胞在指定的时间点固定，并与针对病毒NP vRNA的RNA探针杂交(红色)并对DNA染色(蓝色)，然后通过共聚焦显微镜检查。图像代表三次独立实验。比例尺：10μm。(C-D)点击化学/WaterLOGSY/蛋白质ID(CWID)平台用于鉴定药物结合靶标。(C)点击化学：叠氮基-ACA的化学结构，其显示叠氮基(绿色圆圈)在ACA上的位置。接下来，对pdmH1N1感染的MDCK细胞进行抗病毒测定，以证明叠氮基-ACA和ACA之间相似的抗病毒效力。右图：显示了叠氮基-ACA的细胞分布(绿色荧光)，而ACA由于缺乏膦反应性叠氮基团而被用作阴性对照。比例尺：50μm。(D)WaterLOGSY引导的细胞分级分离：左图显示了指示凝胶过滤色谱法通过大小分级分离感染性MDCK细胞裂解物的示意图；对每个级分进行WaterLOGSY分析，以获得ACA特征的NMR光谱(中图)。含有若干独特的芳香峰的单独的ACA用作参考对照。*表示温和结合信号；***表示强结合信号。蛋白质ID：右图显示由荧光图像分析仪检测到的天然PAGE凝胶照片。凝胶顶部指示了含有叠氮基-ACA或ACA、荧光染料和增加的细胞级分蛋白质负载的不同组合的上样样品。红色箭头指示特定的叠氮基-ACA结合片段。(E)AP2M1的诱变分析以针对ACA拯救pdmH1N1病毒复制。在pdmH1N1病毒感染(0.001MOI)和ACA(5μM)处理之前，将包括全长AP2M1(全)、N端Longin样结构域(LLD)、C端mu同源结构域(MHD)和具有包括M216A、N217A、K400A和K410A的位点突变的突变体AP2M1的功能结构域转染至MDCK 24小时。再过24小时后收集上清液中的病毒滴度，并使用单因素ANOVA进行比较。**p<0.01，n.s.表示不显著。实验一式三份进行。使用抗His标签抗体通过蛋白质印迹分析每种蛋白质的过表达。(F)上图：显示了人、小鼠和狗AP2M1 MHD的部分序列比对。N217和K410是ACA结合的关键残基，用方框突出显示，并且是完全保守的。下图：3D分子对接分析。显示了AP2M1(红色)上的潜在相互作用表面，而ACA(绿色)以棒状和网格表示形式展示。
图5.多种病毒通过病毒蛋白基序利用宿主AP2M1。(A)与宿主AP2M1相互作用的病毒蛋白基序在甲型流感病毒的NP中是完全保守的，并且通过生物信息学分析在冠状病毒NP、小核糖核酸病毒2C和黄病毒NS3蛋白中高度保守，并在免疫沉淀测定中得到证实(图13)。通过生物信息学分析，基序在布尼亚病毒NP、逆转录病毒Gag和腺病毒核心蛋白V中也是保守的。(B)竞争性ELISA显示ACA添加后AP2M1和生物素-肽的阻断。将His-AP2M1(WT)或其低结合亲和力突变体D176A固定在ELISA板上，然后进行1小时的药物预孵育并添加生物素-肽底物用于信号测量。游离标记的肽作为阳性对照抑制剂。使用单因素ANOVA将结合信号与WT-AP2M1组进行比较。(C)已知的阻滞剂酪氨酸磷酸化抑制剂(Tyrphostin)A23表现出广谱抗病毒活性。显示了对包括pdmH1N1(MDCK,0.01MOI,24hpi)、MERS-CoV(Huh7,0.001MOI,24hpi)、EV-A71(RD,0.01MOI,24hpi)和ZIKV(Huh7,0.01MOI,48hpi)的4种不同病毒的抗病毒作用。在有或没有酪氨酸磷酸化抑制剂A23处理的情况下，进行噬斑测定以确定细胞培养上清液中的病毒滴度。与0μM组(0.1％DMSO)相比时，使用单因素ANOVA分析数据。(D)AP2M1的CRISPR敲除减少了pdmH1N1和EV-A71的复制。敲除效率使用蛋白质印迹评估。WT和AP2M1-/-细胞由pdmH1N1(293T细胞，1MOI，24hpi)或EV-A71(RD细胞，0.01MOI，48hpi)或ZIKV(Huh7细胞，1MOI，24hpi)或MERS-CoV(Huh7细胞,0.1MOI,24hpi)感染。通过RT-qPCR评估细胞裂解物中的病毒载量。学生t检验用于组间比较。实验一式三份并以3次独立实验进行。**p<0.01并且***p<0.001。(E)用放线菌酮处理AP2M1-/-和WT 293T细胞以抑制蛋白质合成。处理后的细胞用10MOI的pdmH1N1感染，并在2hpi分离成核(Nuc)和细胞质(Cyto)级分，然后进行蛋白质印迹以量化NP的量。用抗NP或抗AP2M1对每个级分进行蛋白质印迹以进行蛋白质检测。人β-肌动蛋白和核纤层蛋白A分别用于Cyto和Nuc的归一化。(F)用GFP-流感-NP和mCherry-AP2M1转染的A549细胞与DMSO或ACA一起孵育24小时。药物存在于染色和成像培养基中。进行活细胞成像并追踪活动的AP2M1/NP斑点(参见代表性影片S1和影片S2)。显示的是在整个行进距离内可追踪斑点的平均速度。学生t检验，**p<0.01。(G)AP2M1促进了病毒蛋白的运输。上图：IAV-NP(绿色)和核(蓝色)的代表性共聚焦图像。在进行成像处理之前，用10MOI的IAV感染MDCK细胞3小时。中图：EV-A71-2C(绿色)和ER标志物(红色)的代表性共聚焦图像。在成像前，用5MOI的EV-A71感染VeroE6细胞6小时。下图：ZIKV-NS3(绿色)和ER(红色)的代表性共聚焦图像。在成像前，用5MOI的ZIKV感染VeroE6细胞6小时。使用ImageJ(JACoP)共定位软件和Manders的共定位系数(MCC)对共定位进行量化。在将像素作为共定位探针之前，阈值使用自动阈值(插件；ImageJ)确定。条形图表示以共定位百分比表示的平均MCC值(在IAV-NP/核的情况下，与蓝色强度一致的绿色强度分数，以及在EV-A71-2C/ER和ZIKV-NS3/ER的情况下，与红色强度一致的绿色强度分数)±标准偏差(误差线n＝10至15)。在整个实验过程中使用同步感染，感染的细胞在从4℃转移到37℃后在添加或不添加ACA的情况下孵育。比例尺：10μm。***经学生t检验p<0.001。
图6.宿主AP2M1介导的病毒运输对于启动其复制周期至关重要。(A)病毒取代对病毒生长和复制的影响。使用8质粒反向遗传系统来拯救具有WT和突变体病毒NP的重组GFP报告病毒。N.D表示在三次独立实验中失败的拯救。重组病毒在A549细胞中使用相同的0.01MOI进行多周期复制测定。通过对MDCK细胞的噬斑测定，将每种突变体病毒的上清病毒滴度与重组WT进行比较。(B)病毒取代对IAV NP核输入的影响。用放线菌酮处理A549细胞以抑制蛋白质合成。处理后的细胞用10MOI的WT和突变体病毒(即Y296A、Y385A、)感染，并在2hpi分离成核(Nuc)和细胞质(Cyto)级分，然后进行蛋白质印迹以量化NP的量。人β-肌动蛋白和核纤层蛋白A分别用于Cyto和Nuc的归一化。(C)宿主AP2M1/病毒NP结合的破坏消除了甲型流感聚合酶的复制和转录活性。显示的是AP2M1敲除(品红色条)或位点上的NP突变体(蓝色条)的相对聚合酶活性。在AP2M1-/-组中，AP2M1特异性抗体用于确定KD效率。在NP组中，通过抗His抗体检测WT和每个突变体的过表达。分别将学生t检验用于比较WT和KD组，而单因素ANOVA用于ACA和NP组。(D-F)WT和突变体(Y296A)GFP病毒在小鼠模型中的生长。BALB/c小鼠(每组n＝8)i.n.感染105或104PFU的指定病毒。显示的是(D)生存率和(E)体重变化。(F)在1、3和5dpi对每个105PFU感染组的三只小鼠实施安乐死，以分析GFP病毒感染后的体内动力学。使用IVIS Spectrum体内成像系统对来自受感染肺部和脑的GFP荧光进行成像。(G)宿主AP2M1介导的不同病毒的细胞内运输的拟议模型。包膜病毒(如甲型流感、MERS-CoV、ZIKV)和非包膜病毒(例如EV-A71)进入后，它们的病毒蛋白通常由宿主膜运输AP2接合物复合物的mu亚基(即AP2M1或μ2)通过分别识别甲型流感NP、MERS-CoV NP、ZIKV NS3和EV-A71 2C上的病毒基序募集。对于流感病毒，宿主AP2M1/病毒NP相互作用促进vRNP通过核孔复合体(NPC)的核输入，从而启动病毒基因组转录和复制。对于EV-A71，宿主AP2M1/病毒2C结合促进ER上的2C定位和用于vRNA合成的膜囊泡的形成。ACA通过与宿主AP2M1上的病毒基序结合位点竞争来破坏病毒生命周期的这些时间上不同的步骤，并充当广谱抗病毒药物。
图7.所选宿主基因的前病毒活性的验证(对应于图1B)。将靶向17个选定基因中的每一个的三个独特的、非重叠的siRNA转染到A549细胞中48小时，然后再感染H1N1(0.1MOI)48小时。在细胞内和通过RT-qPCR测定法测定siRNA敲低后宿主基因的转录水平和相应的病毒载量。使用单因素ANOVA将组间的差异与加扰对照组进行比较。显示的是一式三份样品的平均值±s.d.。*p<0.05，n.s.表示p>0.05。
图8.ACA的抗病毒活性和细胞毒性(对应于图1C和图2G)。(A)ACA针对不同病毒家族的EC50通过噬斑减少测定(pdmH1N1、ZIKV、SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV、EV-A71、HRV-B14)或TCID50(SFTSV、AdV5)或p24抗原ELISA(HIV-1)绘制，而不同细胞系中ACA的CC50通过测量细胞NAD(P)H依赖性细胞氧化还原酶(MTT测定)确定。选择性指数(SI)通过CC50与EC50的比率计算。(B)Caco2细胞用SARS-CoV-2(0.1MOI)感染并用所示不同浓度的ACA处理。在48hpi收集细胞培养上清液中的感染性病毒滴度并通过标准噬斑测定法确定。细胞内病毒载量通过靶向SARS-CoV-2RdRp/解旋酶区域的qRT-PCR进行量化，并通过人β-肌动蛋白进行归一化。单因素ANOVA用于比较处理组与0μM(阴性对照)组。*P表示<0.05，**表示P<0.01(单因素ANOVA)。实验一式三份进行并重复两次。结果显示为平均值±标准偏差。(C)通过腹膜内(i.p.)注射ACA或DMSO(1％)10天检查ACA对BALB/c小鼠(n＝5,8-10周)的体内毒性。显示的是记录14天的每组的体重变化。结果显示为每天的平均体重±s.d。
图9.ACA的抗病毒活性不依赖于TRP通道的阻断和磷脂酶A2的抑制(对应于图4A)。(A和B)A549细胞用TRPM2靶向siRNA(A)或TRPM8靶向siRNA(B)转染48小时，然后用H1N1(0.1MOI)感染另外48小时。在病毒感染前通过RT-qPCR检测siRNA敲低的效率。通过检测病毒M基因拷贝来量化细胞培养上清液中的病毒载量。通过学生t检验比较组间的差异。*p<0.05，n.s.表示p>0.05。(C)为了确定ACA是否由于其离子通道阻断活性而改变了内体/溶酶体区室的酸度，在4℃下用10MOI pdmH1N1病毒感染MDCK细胞75分钟，然后是37℃下ACA (20μM)或DMSO(0.1％)或巴弗洛霉素A1(100nM)1小时。之后，细胞用50nM LysoTracker red(LTR)染色，然后通过流式细胞术测量其荧光强度。显示的是具有相似结果的三次独立测定之一。(D)使用(A)和(B)中描述的相同方案确定宿主PLA2G2A基因敲低后的病毒复制。**p<0.01。实验一式三份并以3次独立实验进行。条形图中的数据表示为平均值±标准偏差。
图10.ACA不灭活病毒颗粒，也不抑制病毒附着(对应于图4A)。为了探索ACA干扰的病毒生命周期的阶段，(A)病毒灭活测定：pdmH1N1病毒(106PFU)与ACA (20μM)一起孵育2小时，然后将混合物稀释10,000倍(即ACA的剩余浓度低于其EC50，因此不影响噬斑的形成)进行标准噬斑测定。显示的是与DMSO对照(0.1％)相比时的相对PFU。(B)病毒附着测定：MDCK细胞用ACA(20μM)预处理2小时，然后进行强力洗涤并转移到4℃与病毒(MOI＝5)一起孵育。2小时后，去除病毒接种物，在裂解前洗涤细胞两次，并通过qRT-PCR测定附着的病毒RNA载量。实验一式三份进行。数据表示为平均值±标准偏差，并通过学生t检验进行分析，n.s.表明p>0.05。
图11.蛋白质ID分析揭示的ORF克隆的功能验证测定。(对应于图4D)。在pdmH1N1病毒感染(0.001MOI)和ACA(5μM)处理之前，将单个质粒(500ng)转染至MDCK 24小时。在24hpi收集上清液中的病毒滴度并通过噬斑测定确定。进行学生t检验以评估每个基因针对ACA拯救pdmH1N1病毒复制的能力。*p<0.05，n.s.表示与非ACA处理组相比时p>0.05。实验一式三份并以3次独立实验进行。
图12.ACA不抑制AP2M1磷酸化(对应于图5A)。通过对10MOI pdmH1N1感染和在花萼海绵诱癌素(Calyculin)A(Cal-A)存在下用化合物处理后收获的HBTEC细胞裂解物进行蛋白质印迹分析的抑制剂对AP2M1磷酸化的影响。用抗phopho-AP2M1(p-AP2M1)和抗β-肌动蛋白抗体印迹的代表性膜。
图13.AP2M1与不同的病毒蛋白相互作用(对应于图5A和图5G)。AP2M1和单个病毒蛋白的免疫沉淀(IP)将甲型流感病毒NP(A)、ZIKV NS3(B)、MERS-CoV NP(C)和EV-A71 2C(D)鉴定为它们各自的特异性结合配偶体。如图所示，在存在或不存在ACA(10μM)的情况下，将每个病毒组中的候选病毒蛋白与带HA标签的AP2M1在HEK293T细胞中共转染。使用抗HA磁珠进行IP。所有输入的AP2M1均由AP2M1特异性抗体检测，而单个病毒蛋白则由所示的抗Flag或抗V5或抗His检测。
图14.本研究中使用的所有工程化NP突变体的序列(对应于图6A和图6C)。在甲型流感病毒NP蛋白中鉴定了两个基序，Y是酪氨酸，x是任何氨基酸，且是具有庞大疏水侧链的氨基酸，指L/M/F/I/V。每个突变体中的取代以红色突出显示。
发明详述
以下描述包括可以用于理解本发明的信息。这并非承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者任何具体或隐含引用的出版物都是现有技术。
本发明的主题提供装置、系统和方法，其中使用一种或多种抑制AP2M1与用于运输病毒蛋白的蛋白基序相互作用的化合物来治疗广泛的病毒感染。此类化合物的实例是N-(对戊基肉桂酰基)邻氨基苯甲酸(ACA)。适合此类方法的病毒感染包括由RNA病毒引起的感染，其中用于将病毒RNA转运到细胞核中的病毒编码蛋白质包括基序，其中代表具有庞大疏水侧链的氨基酸，且x可以是任何氨基酸。合适病毒的实例包括流感病毒和冠状病毒(例如SARS-CoV-2)的各种毒株。
应当理解，所公开的技术提供了许多有利的技术效果，包括对广泛的病毒感染疾病的安全和有效治疗。
所有出版物均通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物或专利申请具体且单独地指示通过引用并入的程度相同。如果并入的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反，则本文提供的该术语的定义适用，并且该参考文献中的该术语的定义不适用。
在一些实施方案中，用于描述和要求保护本发明的某些实施方案的表示成分的量、性质如浓度、反应条件等的数字应理解为在某些情况下由术语“约”修饰。因此，在一些实施方案中，书面描述和所附权利要求中所示的数值参数是可以根据特定实施方案寻求获得的期望特性而变化的近似值。在一些实施方案中，数值参数应该根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本发明一些实施方案的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中阐述的数值得到尽可能准确地报告。在本发明的一些实施方案中呈现的数值可以含有必然由于在它们各自的测试测量中发现的标准偏差而导致的某些误差。
如在本文的描述和随后的权利要求中使用的，“一”、“一个”和“该”的含义包括复数指代，除非上下文另有明确规定。此外，如在本文的描述中使用的，“之内”的含义包括“之内”和“之上”，除非上下文另有明确规定。
本文中数值范围的叙述仅意在用作单独引用落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非在本文中另有说明，否则每个单独的值都包含在说明书中，如同其在本文中被单独引用。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行。关于本文中的某些实施方案提供的任何和所有示例或示例性语言(例如“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明并且不对另外要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指示对本发明的实践必不可少的任何未要求保护的元素。
以下讨论提供了本发明主题的许多示例实施方案。尽管每个实施方案代表发明元素的单一组合，但认为发明主题包括所公开元素的所有可能组合。因此，如果一个实施方案包含元素A、B和C，并且第二实施方案包含元素B和D，那么即使没有明确公开，也认为本发明主题包括A、B、C或D的其他剩余组合。
此处公开的本发明的替代元素或实施方案的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独或与该组的其他成员或本文中发现的其他元素以任何组合的方式提及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，可以将组的一个或多个成员包括在组中或从组中删除。当任何此类包括或删除发生时，本说明书在本文中认为含有修改的组，从而满足在所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
病毒进入细胞并利用宿主机制进行复制和传播，在致病性病毒的情况下会引起疾病。发明人已经通过鉴定具有针对涉及病毒繁殖和加工的宿主细胞机制的活性的化合物来开发广谱抗病毒药物，该药物可能由广泛的致病性病毒种类所选择。合适的宿主细胞机制包括信号转导。响应病毒入侵的宿主信号转导激活决定基因表达特征和细胞命运信号传导机制的转录因子，这些转录因子在胚胎发育和癌症生物学中已被彻底研究，但在病毒感染中研究较少。
发明人已经注意到，在病毒-宿主相互作用期间，相对较小的一组进化上保守的信号传导通路与细胞凋亡、分化和/或病毒消除的细胞命运相关。这些包括涉及转化生长因子-β(TGF-β)/SMAD、Wnt/β-连环蛋白、Notch和磷脂酰肌醇3-激酶/胸腺瘤病毒原癌基因(PI3K/AKT)信号传导的通路。
发明人已将宿主细胞中的TGF-β信号传导确定为通常由多种截然不同的病毒改变或调节的通路。这种对TGF-β通路的调节主要由TGF-β细胞因子、其受体TGF-βR和SMAD转录因子的错误定位介导。这种定位主要通过膜和细胞内运输通路进行。基于这些发现，发明人认为，开发安全有效的广谱抗病毒药物的一种方法是靶向感染期间受调节的宿主细胞通路，以支持病毒通过病毒操纵的膜和细胞内运输进行复制。
为此，发明人进行了综合的化学和遗传筛选研究，将宿主细胞的AP2M1蛋白鉴定为影响TGF-β信号传导的宿主通路中的关键成分，并促进了多种不同病毒种类的细胞内运输。AP2M1是AP2接合物复合物(包含α、β2、μ2和σ2亚基)的mu(μ2)亚基，其作为协调网格蛋白介导的内吞作用(CME)主要异四聚体发挥作用。TGF-βR和AP2与一系列货物蛋白的胞质“尾部”之间的直接结合已在体外和体内得到证实。在功能上，AP2M1识别存在于其中x指任何氨基酸，表示疏水残基(例如L、M、F、I、V)的排序基序。
发明人已经确定了AP2M1作为细胞内货物分子先前未被认识的作用，其与不同的内部病毒蛋白共同运输以进行适当的亚细胞定位。这种共同运输可以通过宿主细胞AP2M1和包括基序的特定病毒蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用来介导。
发明人设计并实施了针对这种新发现的机制的筛选研究。初步药理学筛选确定了模型化合物N-(对戊基肉桂酰基)邻氨基苯甲酸(ACA)，其破坏相互作用而不影响AP2M1磷酸化。ACA在细胞培养和病毒感染疾病的小鼠模型中均表现出广谱抗病毒功效。发现在甲型流感病毒核蛋白基序中进行的取代会影响病毒在体外和体内的适应性，表明相互作用在病毒生命周期中的关键作用。发明人还发现，介导了多种病毒家族的细胞内运输，表明它代表了用于光谱新兴病毒性疾病的新干预靶标。
本发明构思的一个实施方案是一种组合物，其通过破坏宿主细胞中的相互作用而表现出针对广泛的病毒病原体的抗病毒活性。合适的化合物包括显示在宿主细胞中破坏相互作用的ACA及其类似物。在本申请的上下文中，此宽范围被认为是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的病毒种类。病毒种类的实例包括但不限于流感(例如H1N1流感)、冠状病毒(例如SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2)、人免疫缺陷病毒(HIV)和寨卡病毒。
在本发明构思的一些实施方案中，ACA或其类似物可以以可用于注射(例如皮内、肌肉内、血管内、腹膜内)或输注的药学载体(如水性缓冲液)的形式提供。在其他实施方案中，本发明构思的配制剂可以提供适合于通过胃肠道摄取和随后吸收的形式(例如作为液体、片剂、丸剂或胶囊)的ACA或其类似物。此类配制剂可以是液体形式，如乳液、混悬液、胶束混悬液或溶液。替代性地，此类配制剂可以作为待摄取的固体提供，如丸剂、片剂或胶囊。此类固体配制剂可以包括包衣、可降解聚合物赋形剂和其他将活性成分靶向释放到消化道期望部分的成分。
在其他实施方案中，ACA或其类似物在适合局部应用至体表如皮肤、眼表或黏膜(例如口腔黏膜、上和/或下呼吸道黏膜、消化道黏膜、泌尿生殖道黏膜)的药物载体中提供。此类配制剂可以作为液体(例如溶液、乳液、混悬液、胶束混悬液)、凝胶、乳膏、软膏、滴眼剂或栓剂提供。在一些实施方案中(例如，应用至上呼吸道和/或下呼吸道)，液体制剂可以作为液滴混悬液，例如气雾、气溶胶或喷雾应用。此类气雾、气溶胶或喷雾可以在环境空气中或在包括氦气或另一种低密度气体的呼吸混合物中提供。可以选择此类气雾、喷雾或气溶胶的液滴尺寸以靶向和/或促进递送至呼吸道的期望部分。例如，可以使用相对较大的液滴尺寸来靶向上呼吸道，而可以选择相对较小的液滴尺寸以促进递送至下呼吸道。
发明人相信，以喷雾、气雾或其他微滴空气混悬液或适合吸入的细粉形式提供的本发明构思的配制剂可以特别有效地预防和/或治疗活动性病毒感染，例如流感和/或冠状病毒的感染。此类配制剂可以通过常规喷雾装置应用。此类喷雾装置可以包括与雾化喷嘴和压力源流体连通的储存本发明构思的液体配制剂(例如溶液、乳液、混悬液、胶束混悬液等)的流体储存器。在一些此类实施方案中，流体储存器可以结合柔韧材料，使得储存器的压缩可以提供压力以通过雾化喷嘴排出液体配制剂以产生治疗性喷雾。此类喷雾剂可以通过鼻子吸入(例如，应用于上呼吸道和/或下呼吸道)、口服或应用于皮肤表面。
在此类实施方案中，本发明构思的液体配制剂(例如溶液、乳液、混悬液、胶束混悬液)提供在与雾化装置流体连通的流体储存器中。此类雾化装置被配置以产生细雾或液滴混悬液，并且可以包括加压喷嘴、超声换能器和/或移动筛或过滤装置。在一些实施方案中，喷雾器产生尺寸适合分散到肺泡中的液滴。此类气雾或液滴分散体可以通过外部面罩或套管应用，或者可以使用压力辅助或加压呼吸机应用。
在本申请的上下文中，这种治疗可以是防治性的或预防性的，或者可以针对活动性感染。这种活动性感染可以是无症状的、进展为轻度症状的或呈现急性症状的。应用本发明构思的配制剂的剂量和形式可以根据治疗的性质而变化。每剂提供的ACA或其类似物的量可以在1mg至200mg(或更多)的范围内。类似地，本发明构思的配制剂中ACA或其类似物的浓度可以根据期望药物的量和递送的配制剂的体积而变化。例如，通过吸入施用可以递送相对少量的ACA或其类似物(例如1至100mg)，但由于喷雾或气雾提供的液滴体积相对较小，可能需要使用高浓度。类似地，通过胃肠道施用可能需要使用相对大量但浓度相对较低的ACA或其类似物。
本发明构思的方法包括预防病毒感染。在一些实施方案中，这可以通过将ACA或其类似物递送给需要预防性治疗的个体来提供。这可以通过任何合适的途径递送，包括注射/输注、摄取、局部应用和/或吸入。在一些实施方案中，在预期暴露于致病性病毒(如流感或冠状病毒)之前提供配制剂，例如在预期暴露前一个月、两周、一周、三天、一天、12小时、8小时、4小时、2小时、1小时、30分钟或立即(例如少于15分钟)。在其他实施方案中，在暴露于或疑似暴露于致病性病毒之后提供配制剂。例如，可以通过在预期暴露之后一周、三天、一天、12小时、8小时、4小时、2小时、1小时、30分钟或立即(例如少于15分钟)治疗来提供预防。
本发明构思的方法包括活动性感染的治疗。当需要治疗的个体无症状、仅表现出轻微且不危及生命的症状、或表现出急性和/或危及生命的症状时，可以应用此类治疗。在此类实施方案中，可以如上所述连续地或周期性地提供配制剂。可以每小时、每两小时、每四小时、每六小时、每八小时、每十二小时、每天一次、每两天、每三天、每周一次或更不频繁地提供定期治疗。在一些实施方案中，两种或更多种此类施用途径可以相互结合提供。
实施例
材料和方法
实验设计：主要目标是鉴定具有阐明机制的新一代广谱抗病毒药物。发明人评估了模型药物ACA在细胞培养、离体和体内模型中的抗病毒效力。发明人还建立了名为CWID的综合平台，以无偏方式将宿主相互作用鉴定为ACA药物靶标。应当理解，此类工具可用于鉴定合适的活性ACA类似物和其他合适的化合物。发明人还使用三种代表性病毒研究了病毒复制周期中相互作用的生物学重要性。最后，发明人表征了甲型流感基序中的取代的毒力效应。
细胞和病毒：人原发性支气管/气管上皮细胞(HBTEC)根据制造商的方案，用气管上皮细胞基础培养基培养。人诱导多能干细胞(iPSC)衍生的神经祖细胞(NPC)通过常规方法培养和分化。人肺成纤维细胞HFL1在F-12K培养基中培养。人T淋巴母细胞MOLT-4CCR5+细胞在补充有10％热灭活FBS和1mg/mL G418的RPMI 1640培养基中培养。人胚胎肾(HEK293T)细胞、人肺癌(A549)细胞、人肝癌(Huh7)细胞、人横纹肌肉瘤(RD)细胞、人2型上皮(HEp-2)细胞、Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞、非洲绿猴肾(Vero)细胞维持在DMEM培养基中。所有培养基均添加10％热灭活FBS、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素。通过Plasmo Test(InvivoGen)确认所有细胞均无支原体污染。甲型流感病毒株A/415742/2009(H1N1)pdm09、A/1/2013(H7N9)、A/越南/1194/2004(H5N1)、A/荷兰/219/2003(H7N7)和A/1073/1999(H9N2)在含胚鸡蛋中培养。SARS-CoV-2HKU-001a分离自香港实验室确诊的COVID-19患者的鼻咽抽吸物样本(28)。MERS-CoV(HCoV-EMC/2012,Ron Fouchier博士赠送)和SARS-CoV(GZ50)在Vero-E6细胞中增殖。HIV-1JR-FL病毒(#4984，NIH AIDS)如发明人先前所述，在1ng/ml IL-2存在下在MOLT-4CCR5+细胞中增殖14天(29)。肠道病毒A-71(SZ/HK08-5)在RD细胞中培养。ZIKV(波多黎各毒株PRVABC59，由美国CDC的Brandy Russell博士和BarbaraJohnson博士赠送)在Vero细胞中扩增。人腺病毒5型(AdV5)的临床分离株在A549细胞中增殖。SFTSV HB29毒株(由中国CDC的Mifang Liang博士赠送)在Vero细胞中增殖。所有培养的病毒通过所示噬斑形成单位(PFU)测定和/或50％组织培养感染剂量(TCID50)测定和/或RT-qPCR测定和/或p24 ELISA滴定。所有病毒原液均在-80℃等分保存。所有活病毒实验均使用2级或3级生物安全设施进行。
质粒、引物和生物试剂：含有T细胞因子/淋巴增强子结合因子(TCF/LEF)的Wnt信号传导报告基因由Randall Moon博士赠送(Addgene质粒#12456)。含有Smad结合位点的四个拷贝的TGF-β信号传导报告基因由Bert Vogelstein博士分享(Addgene质粒#16495)。含有CBF1响应元件的Notch信号传导报告基因从Nicholas Gaiano博士获得(Addgene质粒#26897)。含有叉头响应元件的PI3K/Akt信号传导报告基因由Michael Greenberg博士赠送(Addgene质粒#1789)。使用的所有引物序列提供于表1中。ACA购自Cayman Chemical(密歇根州，美国)。除非另有说明，其他化学抑制剂购自Sigma-Aldrich(密苏里州，美国)。所有肽均由Cellmano Biotech(合肥，中国)合成，纯度>95％。膦激活荧光染料DyLightTM488-膦(invitrogen)用于特异性标记和检测带叠氮基标签的分子，即叠氮基-ACA。4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,Sigma)、钙连接蛋白多克隆Ab(Abbkine,ABP0065)和鬼笔环肽-Atto647N(Sigma)分别用于核、ER和细胞膜染色。针对人AP2M1(Abcam,ab75995)的一抗、抗β-肌动蛋白(Abcam,ab8227)、抗流感NP(Abcam,ab104870)、抗ZIKV NS3(GeneTex,GTX133309)、抗EV-A71 2C(GeneTex,GTX132354)、抗-His-标签(Invitrogen,MA1-21315)、抗-HA-标签(Abbkine,A02040)、抗-Flag-标签(Sigma,F3165)、抗核纤层蛋白A(abcam,ab26300)、抗GAPDH(Abcam，ab8245)、抗MERS-CoV NP小鼠血清(内部)用于相关实验。Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(Invitrogen,A28175,1:500)和Alexa Fluor 594山羊-兔(Invitrogen,A27016,1:500)用作免疫荧光染色的二抗。靶向AP2M1、TRPM2、TRPM8或PLA2G2A的单个SMARTpool siRNA购自Dharmacon(Lafayette，美国)。NE-PERTM核和细胞质提取试剂(Thermo Scientific)根据制造商的方案使用。AP2M1人基因敲除试剂盒(Origene，KN401377)用于根据制造商的方案建立CRISPR敲除细胞系。使用ViewRNA细胞加测定试剂盒(Invitrogen,88-19000)可视化免疫荧光RNA，该试剂盒含有针对甲型流感H1N1PR8病毒(Invitrogen,VF1-10583)的负链RNA NP基因组(vRNA)设计的viewRNA 1型探针组。
表1本研究使用的引物
功能丧失筛选：为了鉴定H1N1pdm复制所必需的宿主基因，使用靶向142个细胞膜运输基因的可商购文库(AmbionA30138)进行基于RNAi的筛选。简而言之，将1.5×104/孔的A549细胞接种在96孔板中过夜，然后使用Lipofectamine RNAiMAX试剂连续两天每天进行一次siRNA转染。在初级siRNA转染后48小时，用0.1MOI病毒感染A549细胞。一小时后，将感染性接种物吸出并更换为含有2％ BSA和2μg/ml胰蛋白酶TPCK的新鲜DMEM培养基。再过48小时后收集单个孔的细胞培养上清液，用于通过RT-qPCR方法滴定病毒载量。在病毒感染之前，在排除基因沉默后孔表现出较差的细胞活力(<80％)。
化学文库筛选：具有420个候选物、靶向膜转运蛋白和离子通道的小分子化合物文库(MedChemExpress)用于具有抗病毒活性的药理学筛选。pdmH1N1抑制剂的初级筛选是基于发明人先前建立的CPE抑制。使用CellTiter-Glo发光细胞活力试剂盒(Promega)在48hpi测定0.01MOI病毒感染和复合物处理(10μM)后MDCK细胞的活力。用病毒载量降低测定进行次级筛选。简而言之，收集24hpi和复合物处理(分别为10μM和1μM)的细胞培养上清液，并通过RT-qPCR方法应用于病毒拷贝定量。Favipiravir(50μg/ml)在整个筛选过程中用作阳性对照。
点击化学/Waterlosy/蛋白质ID(CWID)：建立CWID平台用于鉴定ACA结合靶标。首先，化学合成了带叠氮基标签的ACA，即(E)-4-叠氮-2-(3-(4-戊基苯基)-丙烯酰胺)苯甲酸，用于经由点击化学的细胞内可视化的目的。叠氮基对荧光染料Dylight488-膦具有反应性，使其在荧光显微镜下可见。
WaterLOGSY是配体观察NMR技术，用于筛选ACA相互作用的细胞组分。为了分离pdmH1N1感染的细胞裂解物，将1ml MDCK细胞(107个细胞，1MOI，6hpi)在冰上超声处理10秒3次，然后离心。使用320mL HiLoad26/600Superdex 200制备型尺寸排阻色谱柱将澄清的上清液用于快速蛋白质液相色谱(GE Healthcare)，以收获具有UV 260nm信号的每个蛋白质级分。ACA WaterLOGSY实验在Bruker Avance-600MHz光谱仪上使用5mmPASEI探针进行。用于WaterLOGSY实验的脉冲方案是“ephogsygpno.2”，其中使用梯度激发雕刻进行水抑制。所有实验均使用5mm直径NMR管在298K下进行，其中样品体积为500μl并添加17μM ACA，并使用4K扫描记录。所有样品均溶解在95％ H2O和5％ D2O中，其中最终浓度为70μM的三甲基甲硅烷基丙酸(TMSP)作为内标。在没有细胞级分的相同条件下记录对照光谱，以确认不存在自聚集的ACA大分子。
为了鉴定ACA结合蛋白靶标(蛋白质ID)，将细胞级分冻干，然后用10μl H2O重悬，并与70μM叠氮基-ACA一起孵育1小时。将混合物与100μMDyLight 488-膦进一步孵育3小时，以使荧光染料与叠氮基连接，然后加载到10％非变性天然凝胶上进行电泳。随后，使用AlexaFluor 488滤光片的Typhoon FLA 9500激光扫描仪用于可视化与ACA以外的叠氮基ACA相关的荧光带。光电倍增管(PMT)电压设置为300-350V，分辨率为50μm。切下靶条带并通过Q Exactive(Shanghai Applied Protein Technology Co.,Ltd.)进行液相色谱(LC)-电喷雾电离(ESI)串联质谱(MS/MS)分析。含有ACA和不含ACA的样品也与DyLight 488-膦一起孵育作为对照。
功能增益验证：为了验证ACA依赖性作用模式所必需的靶蛋白，将CWID平台揭示的8种蛋白质ID分别过表达，并筛选了它们拮抗ACA抗病毒活性的能力。每种蛋白质的ORF克隆均获自TRC3人ORF集合(Merck)。在24孔板中，用500ng的每种质粒转染MDCK细胞，并在pdmH1N1感染前孵育48小时。收集感染细胞的细胞培养上清液(含有或不含有ACA(5μM))，通过标准噬斑测定法测定病毒滴度。
人气管类器官中的病毒感染：根据香港大学/医院管理局香港西群机构监督委员会(UW 13-364)批准的方案，通过手术获得患者的正常人肺组织。获得人参与者的知情同意，并按照批准的标准操作程序进行实验。ACA的抗流感活性也在3D人气管类器官(AO)中进行了评估。简而言之，机械剪切3D AO以将顶端表面暴露于病毒接种物。然后将剪切的类器官与0.01MOI的病毒在37℃下孵育2小时。洗涤后，将接种的类器官重新嵌入基质胶(Matrigel)中，并在含有ACA (10μM)或DMSO(0.1％)的培养基中培养。在指定时间，收集气管类器官用于定量细胞内病毒载量或固定用于免疫荧光染色。
小鼠研究：将BALB/c小鼠、人二肽基肽酶4(hDPP4)转基因C57BL/6小鼠和干扰素受体α/β敲除(IFNAR-/-)A129小鼠分别饲养在生物安全2级或3级的饲养室中，并可自由获得标准颗粒饲料和随意饮水。所有实验方案均经香港大学动物伦理委员会(CULATAR 4057-16、4371-17、4511-17)批准，并按照生物安全2级或3级动物设施的标准操作程序进行。为了评估ACA在体内的跨亚型抗流感病毒功效，在BALB/c小鼠(每组20只小鼠)鼻内(i.n.)接种在20μl PBS中的200PFU的甲型H7N9流感病毒或1000PFU的小鼠适应性甲型H1N1流感病毒。在攻击后1小时通过i.n.施用进行处理。一组小鼠接种20μl ACA(0.2mg/kg)。第二组用20μl的扎那米韦(2mg/kg)i.n.处理。第三组i.n.给予PBS中的0.5％ DMSO作为未处理的对照。监测动物生存和临床疾病14天或直至死亡。分别在攻击后第2天和第4天收集肺组织(5只小鼠/组)用于病毒载量检测和H&E组织病理学分析。
为了评估ACA在体内的抗ZIKV功效，将4-6周龄的A129小鼠随机分为两组，通过皮下途径接受ACA处理或假处理(每组n＝13)。小鼠在麻醉下皮下接种1×106PFU(在100μlPBS中)的ZIKV-PR。然后每只小鼠在1hpi接受1剂s.c.施用的PBS中的ACA(1mg/kg)或0.5％DMSO。每天监测小鼠的体重变化和疾病的临床症状。每组中的五只小鼠在6dpi安乐死，并收获脑组织用于小瓶滴度、组织病理学和免疫组织化学分析。监测其他小鼠的生存直至14dpi。
为了检查ACA的抗MERS-CoV活性，共评估了26只小鼠(每组n＝13)。麻醉后，小鼠i.n.接种20μl含有500PFU MERS-CoV的病毒混悬液。在1hpi开始鼻内治疗性处理。一组小鼠接种20μl ACA(0.2mg/kg)。另一组i.n.给予PBS中的0.5％ DMSO作为未处理的对照。监测动物生存和临床疾病14天或直至死亡。每组的五只小鼠分别在2dpi随机安乐死。收集小鼠肺用于病毒滴定、H&E组织病理学和免疫荧光染色。
离体成像：在攻击后的指定时间切除感染GFP病毒的小鼠的全器官肺和脑。在4％多聚甲醛中固定过夜后，图像在装有GFP激发/发射滤光片的PE IVIS Spectrum体内成像系统中获取。
活细胞成像：根据先前的报道稍作修改，将实时成像用于可视化AP2M1和甲型流感NP的共同运输(37)。使用Nikon Ti2-E宽场显微镜在加热(37℃)室中使用×100 1.46油物镜拍摄延时图像。GFP标记的NP蛋白和mCheery融合的AP2M1蛋白每2秒通过顺序成像进行追踪，其中每个通道分别曝光50ms和200ms。使用MetaMorph分析软件的Track Points计算单个共定位斑点的运行长度和传输速度，测量每个相应斑点的帧之间的行进距离(在任何方向上)。通过按顺序累积相关帧，使用MetaMorph分析软件的Stack功能制作影片。
反向遗传学：使用标准反向遗传学技术拯救在NS区段中携带GFP报告基因的重组流感病毒(NS1-GFP病毒)。具有A/鸭/湖北/WH18/2015(H5N6)背景的8质粒系统由JinMeilin博士(华中农业大学，中国)赠送。含有突变的NP构建体，即pHWNP-Y296A、pHWNP-V299A、pHWNP-V299L、pHWNP-Y385A、pHWNP-I388A和pHWNP-I388L，是通过基于WTpHWNP质粒的定点诱变(Stratagene)完成的。通过对MDCK细胞的噬斑测定确定病毒原液的滴度。
报告基因测定：使用反映细胞命运决定通路的上调或下调的萤光素酶报告质粒。实验上，将单个报告质粒(100ng)与转染效率对照质粒(pNL1.1.TK，Promega)构建体(5ng)共转染到指定的细胞中24小时。随后，使用10MOI的每种病毒感染转染细胞，然后根据制造商的方案(双萤光素酶报告分析系统，Promega)在0、1、3、6或12hpi进行亮度检测。将具有模拟品感染的转染细胞作为归一化的基线对照。通过常规方法进行甲型流感病毒小基因组报告基因测定。由PA、PB1、PB2和NP或其突变体组成的RNP复合物与萤光素酶报告质粒(每种50ng)和pNL 1.1.TK构建体(5ng)混合，然后共转染到HEK293T细胞中。转染后24小时测定发光。
基序结合测定：该测定旨在检测AP2M1和结合或复合物形成。合成具有DYQRLN肽序列的游离或生物素标记的基序。为了暴露AP2M1结合位点，添加了可“锁定”AP2M1的结合活性构象的AP2M1去磷酸化抑制剂花萼海绵诱癌素A。用His-AP2M1或其低结合亲和力突变体D176A转染6孔板中的HEK293T细胞48小时。接下来，用Ni-NTAHisSorb 96孔板(Qiagen)在4℃下孵育10μg/孔的含有过表达蛋白质的转染细胞裂解物过夜。洗涤后，加入药物预孵育1小时，然后加入10μg/ml生物素-探针并使用HRP缀合链霉亲和素(Thermo Scientific，N100)和TMB底物(Thermo Scientific，N301)检测结合信号。在该实验中，未标记的肽DYQRLN用作阳性对照结合抑制剂，而模拟品转染的细胞裂解物用作背景对照。在整个测定过程中使用由100nM花萼海绵诱癌素A、PBS和0.1％Tween-20组成的洗涤和稀释缓冲液。
分子对接分析：从PubChem数据库下载N-(对戊基肉桂酰基)邻氨基苯甲酸(ACA)(PubChem CID:5353376)的3D结构。Leadfinder版本1804用于进行配体-受体对接。应用超精密模式(-xp)更彻底地搜索配体构象空间。根据复杂结构(PDB代码：2XA7)中基序的结合位姿生成能量网格图(7)。设置默认网格图间距0.375A用于在精度和性能之间取得良好的平衡。分配键序，添加氢，并在Maestro中实施的蛋白质制备向导模块中包括cap末端。使用PROPKA3.1服务器预测侧链的质子化状态。在AmberTools中实施的AMBER99力场方案中分配所有原子的部分电荷。通过使用Pymol可视化排名靠前的位姿，而用Ligplot+可视化2D分子间相互作用。
统计分析：使用GraphPad Prism 7(GraphPad Software,San Diego,CA,美国)分析数据。图中显示的值表示为至少三次独立实验的平均值±SD。使用单因素方差分析(ANOVA)统计检验和Dunnett多重比较检验或双尾非配对t检验分析组间的统计差异。如前所述(23)，使用ImageJ(JACoP)共定位软件和Manders的共定位系数(MCC)量化共定位率。P<0.05被认为具有统计学意义。
结果
TGF-β信号传导通常在病毒感染时发生改变：为了确定与细胞命运通路相关的病毒诱导的信号传导，发明人检查了病毒感染是否可以通过TGF-β、Wnt、Notch和PI3K/Akt通路增强宿主细胞信号传导。在基因转染的人原代细胞(包括感染甲型流感pdmH1N1的人原发性支气管/气管上皮细胞(HBTEC)、感染ZIKV的人原代成纤维细胞HFL1和肠道病毒A71(EV-A71)感染的人神经祖细胞(hNPC))中进行具有高MOI感染和萤光素酶活性时程监测的报告基因测定。有趣的是，与变化不大的Wnt、Notch和PI3K/Akt通路相比时，TGF-β信号表现出明显变化的独特模式(图1A)。pdmH1N1或ZIKV感染引发了TGF-β激活，而EV-A71感染抑制了其信号传导，表明TGF-β信号传导是不同的RNA病毒在细胞命运决定通路中所普遍利用的。
TGF-β调节的膜和细胞内运输易受抗病毒干预：已记载通过膜和细胞内运输对TGF-βR的适当控制可介导TGF-β信号传导。为了探索病毒适应性对这些宿主运输基因的依赖性，进行了功能丧失筛选以确定单个基因沉默后pdmH1N1复制的程度。在142个细胞运输基因中，有17个基因的敲低将病毒滴度降低超过1个log10单位(图1B和图7)。在17个IAV筛选命中中，三个与HIV-1组装、释放和出芽密切相关：AP1M1、CAV、RAB5A和RCOK1(11)；COPA或COPB2的耗尽严重限制了人巨细胞病毒的复制(12)；在全基因组siRNA筛选中，COPG和AP2M1被证明对IAV产生很重要。结果表明，选定的膜运输基因可以作为与许多病毒感染具有广泛相关性的前病毒因子。因此，发明人筛选了运输抑制剂的小分子化合物文库，以寻找具有有希望的抗病毒效力的药物命中，其也可以作为模型化合物使得能够鉴定和表征细胞内运输通路中的推定靶标。该文库由420种靶向膜转运蛋白的抑制剂(如P-糖蛋白、输出蛋白1)和离子通道(包括囊性纤维化跨膜电导调节剂、质子泵和钙泵等)组成。使用细胞保护和病毒载量减少测定进行多轮选择，鉴定了20个在10μM时抑制病毒复制>3-log的命中和另外5个在1μM时实现>2-log抑制的候选物(表2)。为了优先考虑这5种化合物，发明人评估了它们针对其他新兴病毒的抗病毒功效，并确定ACA是唯一对HIV-1、ZIKV、SARS-CoV-2、EV-A71、人腺病毒5(AdV5)和严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)具有广谱抗病毒作用的抑制剂(图1C和图8A)。
表2从文库筛选中鉴定的抗流感有效化合物
a通过靶向甲型流感病毒M基因的RT-qPCR检测。
模型化合物ACA在体外、离体和体内是广谱抗病毒的：ACA的50％细胞毒浓度(CC50)在不同细胞系中为20～120μM，而其半数最大有效浓度(EC50)处于或低于μM水平(图8A)。重要的是，ACA (10μM)在Caco2细胞的上清液和细胞裂解物中均能有效抑制SARS-CoV-2复制>2-log(EC50＝0.59μM)，表明对当前COVID-19大流行具有良好的治疗潜力(图8B)。由于ACA针对pdmH1N1感染显示出219的最高选择性指数，因此在随后的抗病毒评估中针对不同IAV流感亚型对ACA进行了测试。流式细胞术显示，10μM ACA处理后pdmH1N1感染的MDCK细胞的百分比在24hpi下降了83.2％(图2A)。ACA以剂量依赖性方式表现出对H5N1、H7N7、H7N9和H9N2的交叉保护(图2B)。引人注目的是，ACA处理在人肺原代细胞HBTEC中将上清液病毒滴度降低了>4-log(图2C)。使用发明人先前建立的近端分化3D人气管类器官来预测人中流感病毒的传染性，发明人证实ACA将病毒复制减少了>4-log(图2D)，其中显著降低了病毒NP抗原的表达(图2E)。总体而言，ACA在体外和离体都强烈抑制了IAV的复制。
为了确定ACA的毒性，发明人将最大PBS可溶性ACA(6.75mg/kg)腹膜内接种到BALB/c小鼠中10天。分别在14天和28天的连续监测中未观察到体重减轻或活动减少(图8C)。为了评估ACA的体内抗病毒保护，发明人用1000PFU的小鼠适应性H1N1病毒攻击小鼠。ACA(0.2mg/kg)的单次鼻内(i.n.)给药后所有小鼠存活(n＝8)，而所有DMSO处理和扎那米韦处理(2mg/kg)的小鼠都死亡(图2F)。使用相同的实验方案，ACA赋予针对禽IAV H7N9的显著更好的生存(100％对0％，图2F)，显著减少的体重减轻(图2G)，并且在攻击后第2天和第4天检测不到肺组织病毒滴度(图2H)。在4dpi，组织病理学检查显示ACA处理小鼠的肺泡损伤和间质炎症浸润明显减少(图2I)。总之，ACA通过减少病毒复制和肺炎有效地保护了受到两种IAV亚型攻击的小鼠。
ACA在细胞培养物中的广谱抗病毒活性表明该化合物及其类似物可有效用于其他病毒性疾病的治疗(图3)。用ZIKV-PR毒株感染I型干扰素受体缺陷型A129小鼠，并通过皮下施用用ACA(1mg/kg)或DMSO处理。接受一剂ACA疗法的小鼠显示出明显更好的生存率(100％对0％)和平均体重(图3A和3B)。此外，在ACA处理组的脑中检测不到ZIKV滴度，而在DMSO组中通常4-log更高(图3C)。观察到脑膜脑炎和ZIKV-NS1抗原表达的组织病理学变化较少(图3D)。此外，在人DPP4(hDPP4)转基因小鼠中，鼻内ACA(0.2mg/kg，i.n.)对500PFU MERS-CoV的致命攻击提供了良好的保护，而所有DMSO处理的小鼠在攻击后第8天或之前死亡(100％对0％，图3E)。DMSO处理的小鼠从5dpi开始体重减轻，而ACA处理组的体重继续增加(图3F)。在ACA组中检测到约2-log更低的肺组织病毒滴度(图3G)。ACA处理后，肺组织中的炎症浸润和MERS-CoV-NP抗原表达显著降低(图3H)。因此ACA在体内也表现出广谱抗病毒功效。
ACA靶向宿主AP2M1蛋白：ACA被称为磷脂酶A2(PLA2)抑制剂和瞬时受体电位(TRP)通道阻滞剂，但这种抑制病毒复制的机制被排除在外(图9)。为了探索其抗病毒作用的实际机制，发明人进行了添加时间测定，以研究ACA如何干扰病毒复制周期的不同阶段。ACA不灭活病毒颗粒，也不影响病毒对宿主细胞表面的附着(图10)。为了剖析病毒附着后的步骤，发明人在病毒内化后的不同时间点量化了三种类型的流感病毒RNA(vRNA、cRNA和mRNA)。在对照组中观察到vRNA、cRNA和mRNA合成的不同动态，而ACA组中的所有病毒RNA类型在ACA添加的0-5hpi内保持在基线水平(图4A)。结果表明ACA在cRNA合成前内化后1.5小时内发挥作用，因此可以抑制病毒内吞作用和核输入，或直接阻断vRNP活性。由于LysoTracker red(LTR)测定表明内体区室的酸化不受影响，因此ACA不太可能阻断病毒融合后vRNA至细胞质的脱壳(图9C)。
因此，发明人直接追踪了vRNA在进入的vRNP中的位置(图4B)。在指定的时间点，使用特定的RNA探针组对细胞进行处理并染色PR8的负链NP vRNA (红色)。在DMSO处理的细胞中，1hpi检测到vRNA的主要核输入，其次是1.5～2hpi之间的主要胞质易位。相比之下，在整个时间过程中添加ACA后很少观察到核vRNA信号。因此，ACA可以通过阻断vRNA核输入来抑制IAV复制。
为了确定ACA的靶标，发明人开发了无偏的药物靶标阐明平台，该平台集成了点击化学、WaterLOGSY和使用LC-MS/MS的蛋白质ID技术，名为CWID(图4C和4D)。首先，应用点击化学将叠氮基引入ACA(叠氮基-ACA)，而不影响其抗病毒功效(中图，图4C)。使用叠氮基反应性荧光染料(Dylight-488)，在胞质溶胶和核中都可见叠氮基-ACA而不可见ACA (右图，图4C)。接下来，将通过观察核奥弗豪泽效应(nuclear overhauser effect)的配体结合测定方法WaterLOGSY应用于对ACA表现出高结合亲和力的细胞片段的初级核磁共振(NMR)筛选。通过凝胶过滤层析分级病毒感染的MDCK细胞，然后通过WaterLOGSY分别捕获ACA相互作用信号(中图，图4D)。进行迭代轮次的亚分级和WaterLOGSY以获得具有可检测ACA信号的最大分离级分。随后，结合形式的级分-叠氮基-ACA混合物由Dylight-488染色，并在天然PAGE中进行电泳。在叠氮基-ACA组中可见指示蛋白质-化合物复合物的特定条带，而在ACA或仅细胞裂解物组中不可见(右图，图4D)。收集靶条带的凝胶塞用于LC-MS/MS，其鉴定了8种与叠氮基-ACA物理相关的候选蛋白质。为了验证它们除结合之外的生物学功能，过表达单个ORF克隆以克服ACA对病毒复制的抑制。显然，尽管存在ACA，但只有AP2M1的异位表达显著拯救了pdmH1N1的生长，这表明AP2M1是解释ACA作用方式的最可能的靶标之一(图11)。
AP2M1由N端(～150aa)长蛋白样结构域(LLD)和C端(170aa-434aa)mu同源结构域(MHD)组成。在功能上，发明人证明，尽管添加了ACA，但全长AP2M1或MHD的过表达将pdmH1N1复制增强了约1.5-log，而过表达的LLD并没有拮抗ACA的抗病毒活性(左条形图，图4E)。因此，MHD包含ACA相互作用的位点。MHD的氨基酸残基在人、狗和小鼠AP2M1中是保守的，这与ACA在不同种类细胞和小鼠模型中的广谱抗病毒覆盖一致。分子对接预测ACA主要通过四个氨基酸M216、N217、K400和K410与AP2M1相互作用(图4F)。发明人的突变实验表明，与M216A、K400A或野生型(WT)AP2M1相比，N217A或K410A中的取代不能拮抗ACA的抗病毒活性(右条形图，图4E)。总的来说，ACA通过与其N217和K410残基相互作用来靶向宿主AP2M1。
宿主AP2M1由多个病毒家族通过其含有结合基序的蛋白质利用：ACA的抗病毒谱跨越包膜(ZIKV)和非包膜(EV-A71)、逆转录(HIV-1)和非逆转录(IAV)，以及DNA (AdV-5)和RNA (MERS-CoV)病毒(图8A)。因此AP2M1必须在许多病毒的生命周期中得到广泛利用。首先，发明人排除了ACA影响已被证实抗病毒有效的AP2M1的磷酸化的可能性(图12)。随后，为了找到与宿主AP2M1相互作用的特定病毒蛋白，发明人对病毒ORF克隆进行了免疫沉淀(IP)筛选。先前的宿主-IAV相互作用组表明M1、HA、PB2和NP作为潜在的AP2M1结合蛋白，无需单独验证。在293T细胞中共表达每个病毒基因和带HA标签的AP2M1后，在IP复合物中只能检测到NP，但添加ACA显著减少了靶标NP条带(图13A)。使用相同的方法，发明人将ZIKV-NS3、MERS-CoV-NP和EV-A71-2C鉴定为AP2M1的相互作用配偶体(图13B至图13D)。
已知AP2M1介导含有或二亮氨酸基序的货物蛋白的分选(18)。利用生物信息学方法，发明人发现而不是二亮氨酸基序始终存在于牵连的AP2M1结合病毒蛋白中。重要的是，通过生物信息学，基序在许多病毒科的特定蛋白质中高度保守，包括正粘病毒科的NP、逆转录病毒科的Gag、布尼亚病毒科的NP、黄病毒科的NS3、冠状病毒科的NP、小核糖核酸病毒科的2C和腺病毒科的核心蛋白V(图5A)。为了确定ACA是否阻断了AP2M1结合位点，发明人开发了竞争性ELISA。作为阳性对照，添加未标记的基序肽DYQRLN或低亲和力突变体D176A AP2M1导致生物素-底物与固定化His-AP2M1结合期间的结合信号减弱。ACA预处理显著降低了AP2M1/生物素-相互作用(图5B)。为了探索结合口袋是否是抗病毒疗法的用药靶标，发明人还测试了阻断AP2M1的酪氨酸结合口袋的酪氨酸磷酸化抑制剂A23。在无毒浓度下，酪氨酸磷酸化抑制剂A23抑制了包括pdmH1N1、MERS-CoV、EV-A71和ZIKV的一组病毒(图5C)。最后，研究了AP2M1基因耗尽对病毒复制的影响。AP2M1敲除导致pdmH1N1感染的293T细胞、EV-A71感染的RD细胞、ZIKV感染和MERS-CoV感染的Huh7细胞的病毒载量显著降低(图5D)。总之，相互作用是病毒复制周期中的关键步骤，可用于抗病毒干预用药。
相互作用促进了内吞作用以外的病毒运输，从而促进病毒复制：发明人利用IAV、EV-A71和ZIKV-NS3作为三种代表性病毒，在病毒复制周期中表征了相互作用的功能作用。IAV NP通过核孔复合体(NPC)的核输入是有效vRNP易位和随后的基因组复制的先决条件，而发明人的数据清楚地表明ACA损害了vRNA核输入和AP2M1/NP结合(图4B和图13A)。因此，发明人假设AP2M1通过募集基序促进NP从细胞质导入细胞核。为了量化AP2M1-/-293T细胞中NP导入的延迟，用10MOI IAV感染细胞并添加放线菌酮(CHX)以抑制蛋白质合成。粗细胞裂解物在2hpi分离成核(Nuc)和细胞质(Cyto)级分(图5E)。在WT细胞中，AP2M1蛋白主要在细胞质中检测到，而在核中发现了相当多的病毒NP。然而，在AP2M1-/-细胞中，病毒NP主要在细胞质级分中发现。由于NP蛋白的唯一来源是CHX处理后进入的vRNP，因此该发现表明AP2M1促进了进入的vRNP的核输入。为了提供直接证据表明AP2M1在介导内吞作用以外的细胞内NP运输中的作用，发明人使用活细胞成像监测了NP-GFP与AP2M1-mCherry的共同运输。GFP/mCherry信号主要在宿主核中发现(影片S1)。在ACA处理后，NP主要存在于胞质溶胶中，AP2M1相关的NP斑点(黄色)的流动性显著降低，这表明通过AP2M1的NP运输减少(图5F)。然而，大多数正链RNA病毒在细胞质内质网(ER)膜上复制其基因组而不进入核。例如，EV-A71-2C和ZIKV-NS3蛋白主要通过运输至ER膜来诱导病毒RNA复制复合物的形成。在同步病毒感染的情况下，发明人通过共聚焦成像证明，AP2M1/IAV-NP的广泛共定位在核中可见，AP2M1/EV-A71-2C和AP2M1/ZIKV-NS3分别在ER中可见。然而，在ACA处理后，所有三种代表性病毒的共定位率均显示降低(IAV-NP/核为89％对12％；EV-A71-2C/ER为63％对21％；ZIKV-NS3/ER为95％对56％，图5G)。总之，这些结果证实了AP2M1在内吞作用以外的运输病毒蛋白中的重要作用。
为了桥接AP2M1介导的运输和病毒复制，发明人拯救了在两个 位置，即Y296-V299(YSLV)和Y385-I388(YWAI)上具有一系列点突变的重组IAV(图14)。诱变包括两个Y/A取代(Y296A和Y385A)、两个取代(V299A和I388A)和两个取代(V299L和I388L)。值得注意的是，Y296A、Y385A和突变体病毒的生长速率在每个时间点减弱>1-log，而突变体病毒表现出与WT相似的复制动力学(图6A)。结果不仅表明在确定病毒适应度方面的关键作用，而且在同源信号(即I388L取代)中在功能上是可互换的。然而，发明人无法在三个独立的实验中拯救含有或突变的重组病毒。为了验证IAV复制的减少是否是由于减少的NP核进入(AP2M1介导的内吞作用以外的步骤)所致，使用发明人成功拯救了的WT和突变IAV感染A549细胞，然后在2hpi测量胞质溶胶和核中的NP。显然，在携带Y296A、Y385A和NP取代的IAV感染后，宿主核中未检测到NP，而突变体病毒表现出与WT相似量的NP(图6B)。如所预期的，两种突变体(和)的流感聚合酶萤光素酶报告基因活性与WT相似，而所有Y/A(Y296A和Y385A)和(和)突变体均显示出降低的聚合酶活性。此外，AP2M1基因耗尽使聚合酶活性降低>75％(图6C)。结果表明，基序的氨基酸残基通过调节NP核输入确定了IAV聚合酶的活性。
发明人扩展了体内分析，并选择了最减毒的Y296A取代与WT进行全面比较。分别用两剂WT-H5N6-GFP(WT)和Y296A-H5N6-GFP(Y296A)病毒攻击BALB/c小鼠。Y296A攻击(105PFU)组的生存率(100％对0％对40％)明显优于WT攻击(105PFU)组和WT感染(104PFU)组(图6D)。105PFU Y296A组的小鼠显示出与104PFU WT感染组相似的体重减轻，但在7dpi后反弹，而104PFU Y296A组在整个感染过程中显示出轻度体重减轻(<5％)(图6E)。利用拯救的IAV的GFP报告功能进行体内动态分析，发明人在不同的dpi检查了感染小鼠的肺和脑样品。显然，自3dpi以来，检测到WT病毒向细支气管和可能的肺泡的更深处扩散，而来自Y296A突变体病毒的GFP信号仅限于初始感染部位周围的区域，表明病毒扩散有限(左图，图6F)。与报道的在高致病性H5感染的动物中出现的神经系统症状一致，早在3dpi时就可以在WT病毒感染的小鼠脑中观察到广泛的GFP信号。相比之下，Y296A组显示整个时间点的GFP强度降低(右图，图6F)。这些数据提供的证据表明，基序中的单个Y296A取代显著限制了IAV在体内的复制。总而言之，宿主AP2M1/病毒相互作用对于内吞作用步骤以外的细胞内病毒运输到复制/转录位点至关重要，从而促进病毒复制(图6G)。
病毒利用不同的受体来促进细胞进入并逃避原本会消除感染的敌对细胞外环境。在细胞内环境中，发明人展示了保守的宿主AP2M1/病毒相互作用，这种相互作用通常在细胞内运输过程中由不同的病毒所利用，但超出了明确定义的CME过程(图6G)。使用ACA作为模型化合物，发明人开发了CWID平台，并将宿主AP2M1的结合口袋鉴定为广谱抗病毒开发的新靶标，这与之前阻断AP2M1磷酸化的抗病毒策略不同(图12)。虽然AP2M1-/-小鼠是致死的，但AP2M1-/-细胞系对IAV、EV-A71、MERS-CoV和ZIKV的感染不敏感(图5D)。在病毒方面，基序决定了NP核易位的能力，从而影响IAV适应度(图6A-6F)。
关于细胞命运的病毒感染结果是病毒生物学的基本方面。在发明人表征TGF-β信号传导(与多种病毒具有广泛相关性的细胞命运决定通路)的努力中，发现这些病毒使用AP2M1作为细胞内运输但超出内吞作用的常见中间体：首先，通过使用活IAV感染，亲本vRNA在核周区域但在胞质溶胶内可见，表明IAV进入过程不受ACA的影响(图4B)；此外，通过绕过内吞作用步骤的IAV-NP的外源过表达，AP2M1-/-细胞的核中不存在NP，这表明AP2M1对于IAV-NP核定位是必不可少的(图5G)。AP2M1与丙型肝炎病毒(HCV)进入和组装相关的作用已被确定(23,24)。有趣的是，发明人的研究进一步证明了AP2M1的多功能性和广泛性，可与其他几种内部病毒蛋白共同运输完成其复制周期。以IAV(包膜和负链)、EV-A71(非包膜)和ZIKV(包膜和正链)为代表，发明人证明AP2M1对含有的IAV-NP、EV-A71-2C和ZIKV-NS3蛋白的募集与病毒基因组复制周期的完成功能相关。从策略上讲，病毒NP利用AP2M1进行有效的核进入，从而促进聚合酶活性。在病毒基序中引入的Y到A或到A的取代大大减少了病毒在体外和体内的生长。由于NP Y296A突变体病毒的毒力显著减弱，将来可以评估含有这种或其他突变体的甲型流感病毒株作为疫苗的战略性用途。在EV-A71和ZIKV的情况下，2C和NS3蛋白有效运输到ER膜分别需要AP2M1，以便它们的基因组复制可以发生。此外，AP2M1在病毒复制过程中的重要性在包括pdmH1N1、EV-A71、ZIKV和MERS-CoV的多种病毒感染的背景下得到验证(图5D)。总之，AP2M1可以由不同的病毒普遍利用，以在细胞进入后完成它们的复制周期。
AP2的结构必须经历从“关闭”、货物无法进入状态到“开放”结构以暴露结合位点的巨大构象变化，其由AP2相关蛋白激酶1和细胞周期蛋白G相关激酶调节。尽管据报道此类激酶抑制剂(例如舒尼替尼和厄洛替尼)抑制包括登革热、埃博拉病毒和HCV在内的RNA病毒，但ACA的体内抗病毒效力(在IAV、ZIKV和MERS-CoV小鼠模型中100％生存)比舒尼替尼(在DENV中37％保护，在EBOV小鼠模型中30％)或厄洛替尼(在DENV和EBOV小鼠模型中均无保护)好得多。发明人的研究直接靶向T156 AP2M1磷酸化位点以外的结合口袋，不仅将治疗窗口扩展到了AP2M1的构象变化(其是瞬时的且由激酶活性介导)，而且还通过将ACA与其他抑制剂(包括舒尼替尼或厄洛替尼)组合提供了协同抗病毒方法。事实上，将蛋白激酶抑制剂转化为临床开发的主要障碍是对其差选择性的怀疑，这在很大程度上是所有蛋白激酶共有的高度保守的ATP结合位点的结果。然而，正如发明人研究中所举例说明的那样，蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的破坏通常对结合界面具有高度特异性，而较少涉及细胞毒性。事实上，通过使用酪氨酸磷酸化抑制剂A23占用AP2M1结合口袋阻断了多种病毒的复制(图5C)。因为ACA与位于由残基F174、D176、K203和R423形成的结合腔之外的N217和K410相互作用，可以存在AP2的变构激活机制(图4E)。除了AP亚基基因(AP1M1、AP2A1、AP2M1、AP3S2)外，还鉴定出多种突触融合蛋白相关基因(STX5、STX10、STXBP2)发挥前病毒作用(图1B和图7)。包括欧前胡素、Pyr6、ZD7288和乙琥胺的四种药理抑制剂，表现出有效的抗流感活性，其中EC99在nM范围内(图1C)。
CWID平台的建立能够以无偏的方式鉴定药物结合靶标，从而解决了挑战所有表型正向化学筛选的常见困难(图4C和4D)。应当理解，此平台可用于针对宿主靶向策略的研究，以加速药物靶标发现的进展。总体而言，发明人证明相互作用是广谱抗病毒疗法的合适用药靶标，病毒突变体可用作减毒疫苗。此类方法可以与其他抗病毒药剂联合使用，以提供附加的和可能的协同作用，以应对新出现的病毒感染。
对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不背离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外，还可以进行更多的修改。因此，本发明的主题不受限制，除非在所附权利要求的精神内。此外，在解释说明书和权利要求时，应以与上下文一致的最广泛的可能方式解释所有术语。特别地，术语“包括”和“包含”应解释为以非排他性的方式提及元素、组件或步骤，表明所提及的元素、组件或步骤可以存在、或利用或与未明确提及的其他元素、组件或步骤组合。当说明书权利要求涉及选自由A、B、C……和N组成的组中的至少一种时，文本应解释为只需要组中的一个元素，而不是A加N或B加N等。
Claims (6)
1.N-(对戊基肉桂酰基)邻氨基苯甲酸(ACA)在制备用于治疗流感病毒和/或冠状病毒感染的配制剂中的用途，其中所述流感病毒为甲型流感病毒，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV和/或MERS-CoV。
2.权利要求1的用途，其中所述配制剂包含用于注射或输注的药学上可接受的载剂。
3.权利要求1的用途，其中所述配制剂通过吸入施用。
4.权利要求3的用途，其中所述配制剂是喷雾或气雾的形式。
5.权利要求1至4中任一项的用途，其中所述治疗包括预防性治疗。
6.权利要求5的用途，其中需要治疗的个体是无症状的。
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