CN115636879A - 一种基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法及其应用，要点是利用AP‑MS和NGS测序联合的方式生产重组纳米抗体，并借助BLAST+和V‑QUEST软件的双重比对筛选高置信度的纳米抗体序列，利用多酶酶切的手段提高质谱检测纳米抗体的CDR区域覆盖率。可以准确高通量地识别出纳米抗体的CDR区和保守区，在功能验证时针对性和目的性更强。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产及其应用方法。
背景技术
目前鉴定和生产纳米抗体一般通过噬菌体展示技术来实现，具体流程如下：按照一定的时间间隔给骆驼科动物注射特定抗原以刺激其体内免疫反应的发生。从外周血淋巴细胞分离mRNA后，用PCR扩增VHHs(抗原结合功能区)并连接到克隆载体中。连接成功后的DNA材料随后转化大肠杆菌构建VHH文库。经过2至3轮的生物筛选后，用噬菌体ELISA法检测抗体与抗原的特异性结合。对ELISA阳性克隆的核酸序列进行测序，进而推断纳米抗体的蛋白序列。图中空心的红色菱形表示抗原。
但是通过噬菌体展示鉴定和生产纳米抗体的技术方案存在筛选阳性克隆效率低、噬菌体文库容量小的缺点。因为在现有方案中，选择最适合的阳性克隆是至关重要的，这一步通常使用体外检测(即ELISA)，通常需要两到三轮筛选才能得到预期的阳性噬菌体。但是，如果选择纳米抗体的特异性标准较高，获得阳性噬菌体所需的轮数可能会增加。并且在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。常用的噬菌体展示文库中含有不同序列分子的数量一般限制在10以内。
为了研究血清中多克隆抗体的单克隆组成，我们采用了基于二代测序和蛋白质组学的方法。然而，这种方法很难实施，因为多克隆抗体具有高度的复杂性和缺乏在单个动物体内针对特定外来抗原产生的抗体序列参考数据库。为了应对这些挑战，我们利用亲和纯化来减少抗体样品的复杂性，并且利用二代测序来生成来自被免疫动物B细胞的参考数据库。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产及其应用方法。
本发明第一方面提供了基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法，在本发明创造的技术方案中，包括以下步骤：1)抗原制备和免疫动物；2)抗体的亲和纯化；3)免疫后骆驼B细胞总mRNA的提取以及纳米抗体参考蛋白库的制备；4)高亲和力纳米抗体的酶切以及蛋白质谱检测；5)纳米抗体参考蛋白库的搜库和高置信度纳米抗体cDNA的确定；6)高亲和力纳米抗体的基因工程表达。
在本发明一个优选的实施例中，验证后的纯化抗体用多种蛋白酶消化制备肽段，用LC-MS/MS进行高质量分析。
在本发明一个优选的实施例中，为了利用BLAST+和V-QUEST的方法鉴定抗体片段对应的肽段序列，我们通过对免疫动物B细胞总mRNA进行二代测序(NGS)，建立了抗原免疫产生的纳米抗体序列的参考数据库。
在本发明一个优选的实施例中，使用ProteinPlot软件识别与从血清中纯化的抗体相对应的高置信度的肽段序列。
在本发明一个优选的实施例中，经过BLAST+和V-QUEST软件的双重比对之后，得到高置信度的纳米抗体序列。
在本发明一个优选的实施例中，筛选出表达丰度较高和比对匹配率较高的纳米抗体序列，并对其进行基因工程表达和功能验证。
本发明的第二方面提供了基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法在抗体制备过程中的应用。
本发明的提供的技术方案与现有技术相比，具有以下的优点：
第一，在获得免疫动物的血清或血浆后，采用AP-MS(亲和纯化质谱)技术直接鉴定多克隆抗体的单克隆组成，而非对ELISA阳性克隆的核酸序列进行测序才能推断纳米抗体的蛋白序列。相比于现有技术，本发明创造的技术方案避免了对ELISA阳性克隆的筛选步骤，转而利用AP-MS对复杂的多克隆抗体进行高通量的直接鉴定，在通过亲和纯化富集纳米抗体之后借助四极杆飞行时间(QTOF)质谱仪，有效提高了对特定抗原特异性单克隆抗体的筛选和鉴定效率。
第二，对免疫动物B细胞总mRNA进行二代测序(NGS)，从而建立抗原免疫产生的纳米抗体序列的参考数据库，而非利用PCR扩增VHHs后转化大肠杆菌构建VHH文库。相比于现有技术，本发明创造的技术不依赖于噬菌体展示文库，从而突破了现有技术建库容量和分子多样性的限制，利用NGS技术进行的无参考基因组转录组测序可获得达15Gb CleanData，De novo组装后可获得达十万计的Unigene，极大提高了目标抗体库的库容量和分子多样性。
第三，采用生物信息学分析高通量筛选出潜在与抗原结合的特异性纳米抗体，而非采用耗时的生物筛选，再通过噬菌体ELISA法检测抗体与抗原的特异性结合。相比于现有技术，本发明创造的技术利用NCBI提供的BLAST+(2.90)软件和IMGT提供的V-QUEST软件对质谱原始数据搜库得到的蛋白序列进行双重比对，可以准确高通量地识别出纳米抗体的CDR区和保守区，再利用ELISA对候选的纳米抗体进行功能验证时针对性和目的性更强，解决了现有技术通过生物筛选难以提高阳性克隆特异性的缺点。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明的进行详细说明。
图1是二代测序和蛋白质组学生产重组纳米抗体的技术流程图。
图2是筛选得到的纳米抗体的功能验证。图2(A)为单克隆纳米抗体57493的Western blot实验结果，以还原和非还原状态下的Gn为抗原蛋白，实验组使用单克隆纳米抗体57493为一抗，对照组使用兔抗Gn血清为一抗(稀释比例1:1500)。图2(B)为单克隆纳米抗体57493的浓度梯度ELISA检测。横坐标为抗体浓度(nM)，纵坐标为450nm处的吸光度，实验组包被单克隆纳米抗体57493的抗原Gn，对照组包被CBS，图例分别用实心圆和实心方块表示。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1基于基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产
1.抗原制备和免疫骆驼
制备抗原Gn的方法：将SFTSV B亚型的Gn蛋白融合rabbit FC标签，构建于pVAX1载体中，并转染293F细胞进行无血清表达；以protein A树脂(20334，Thermo FisherScientific)纯化柱进行纯化，得到Gn-rFc作为免疫双峰骆驼的抗原；同时表达融合6-His标签的Gn蛋白，以Ni-NTA(R901100，Thermo Fisher Scientific)纯化柱进行纯化，所得蛋白命名为Gn-his，作为检测抗原。免疫双峰骆驼的方法：首先，将250μg Gn蛋白用250μL弗氏完全佐剂(F5881-10ML，Millipore Sigma)乳化后免疫双峰骆驼；在第一次免疫后的第14、28和42天，分别用250μg Gn蛋白和250μL弗氏不完全佐剂(F5506-10ML，Millipore Sigma)乳化后免疫骆驼，共加强免疫3次。第2、3次免疫后1周采血测定抗血清效价；第4次免疫后1周采集外周血100mL，用于抗体的亲和纯化和制备纳米抗体参考蛋白库。
2.抗体的亲和纯化
用偶联protein G和protein A的树脂从免疫骆驼最后一次采集的血清中分离IgG亚类。纯化柱平衡后，将1mL免疫骆驼的抗血清以PBS缓冲液10倍稀释后上柱，即加进1mLHiTrap Protein G HP柱(17-0404-03，GE Healthcare Life Sciences)上，之后用10mL磷酸盐缓冲液(20mM，pH 7.0)洗涤。用0.15M NaCl、0.58％乙酸(pH 3.5)洗脱得到lgG3(MW100kDa)，洗脱产物以1M Tris-HCI(pH 8.5)以1/10(v/v)的比例中和，pH调节至7.4。随后用0.1M甘氨酸-HCI(pH 2.7)洗脱得到IgG1(MW 170kDa)，并用1M Tris-HCI(pH 8.5)以1/5(v/v)的比例中和，pH调整到7.4。收集通过HiTrap Protein G HP柱的流穿液，装于1mL HiTrapProtein A HP柱上，用10mL磷酸盐缓冲液(20mM，pH 7.0)清洗。随后用0.15M NaCl、0.58％乙酸(pH 4.5)洗脱得到lgG2(MW 100kDa)，并用1M Tris-HCI(pH 8.5)以1/12(v/v)的比例中和，将pH调节到7.4。采用BCA法测定纯化后的IgG1、IgG2和IgG3亚类的浓度，并用还原和非还原SDS-PAGE检测各组的纯度。BCA法测定蛋白浓度的方法：首先配置蛋白浓度标准液，编号A、B、C、D、E、F、G、H、I，浓度分别为2000ng/μL、1500ng/μL、1000ng/μL、750ng/μL、500ng/μL、250ng/μL、125ng/μL、25ng/μL和0ng/μL；将蛋白样品冰上解冻，准备在96孔板上点样。蛋白浓度标准液A、B、C、D、E、F、G、H、I分别点样10μL，技术重复3次；待测蛋白样品用ddH2O稀释10倍，即添加待测蛋白样品1μL，dH2O 9μL，同样技术重复3次；配置BCA检测液，将BCA试剂盒Pierce BCA Protein Assay Kit(23225，Thermo Fisher Scientific)中的A液和B液按照50:1的比例混合，左右缓慢轻柔震荡均匀；点样孔中分别添加BCA检测液100μL；点样完成后，置于37℃烘箱中孵育30min，用多功能荧光酶标仪(Molecular Devices M3，MolecularDevices)检测蛋白浓度标准液和待测蛋白样品在562nm处的吸光度，并记录数据；利用蛋白浓度标准液的吸光度拟合吸光度-蛋白浓度的标准曲线，将待测蛋白样品的吸光度代入标准曲线，获得待测蛋白样品的浓度。
3.免疫后骆驼B细胞总mRNA的提取以及纳米抗体参考蛋白库的制备
骆驼免疫后B细胞总RNA提取的方法：
用淋巴细胞分离液GE Ficoll-Paque Plus(17-1140-02，GE Healthcare LifeSciences)从免疫骆驼的100mL血液中分离出外周血单个核细胞(PBMC)，加入Trizol，1×107PBMC/mL，冰上放置5min，枪头吹打；将裂解液吸到1.5mL EP管中，加入氯仿0.2mL/管，用力振摇15s。15～30℃下孵育2～3min，离心(4℃，12,000g，15min)；离心后液体分为三层(上层－无色水样层为RNA，中层白色为DNA和底层红色为蛋白质)，小心吸取上层无色液体移入新的EP管中；加入等体积异丙醇，0.4～0.5mL，混匀，15～30℃下孵育10～30min，离心(4℃，12,000g，10min)；用封口膜密封后，放于4℃冰箱中，沉淀30min后去上清。沉淀加入75％乙醇1mL，漩涡振荡30s，离心(4℃，7,500g，5min)。小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3～5min。用枪头吸取、尽量除去上清后加入20μL DEPC水溶解，分装5μL/管，-70℃冰箱保存。
制备纳米抗体参考蛋白库的方法：
分别采用Nanodrop、Qubit 2.0、Aglient 2100方法检测RNA样品的纯度、浓度和完整性等，以保证使用合格的样品进行转录组测序。样品检测合格后，进行文库构建，主要流程如下：(1)用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；(2)加入Fragmentation Buffer将mRNA进行随机打断；(3)以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，利用AMPure XP beads纯化cDNA；(4)纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择；(5)最后通过PCR富集得到cDNA文库。文库构建完成后，分别使用Qubit2.0和Agilent 2100对文库的浓度和插入片段大小(Insert Size)进行检测，使用qRT-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。库检合格后，用HiSeq测序平台进行高通量测序，测序读长为PE150。对Raw Data进行数据过滤，去除其中的接头序列及低质量Reads获得高质量的Clean Data。获得高质量的测序数据之后，需要对其进行序列组装。Trinity是一款专门为高通量转录组测序设计的组装软件。利用Trinity将Clean Data进行序列组装，获得该物种的Unigene库。基于此，可以进行随机性检验、饱和度检验等测序文库质量评估。
4.高亲和力纳米抗体的多酶酶切以及蛋白质谱检测
利用蛋白变性剂将多克隆纳米抗体变性后，每管样品加入2μL还原试剂，振荡混匀后离心，在60℃水浴1h。水浴结束后离心，将样品离心至管底，并将还原后的纳米抗体样品冷却至室温，然后每管样品加入1μL烷基化试剂，振荡混匀后离心，室温孵育10min。
谷氨酸C端内切酶GluC、赖氨酸内切酶LysC、赖氨酸N端内切酶LysN、胰蛋白酶Trypsin在25mM NH4HCO3中，以酶与底物比为1:20的浓度分别将纳米抗体样品在37℃水浴中酶解过夜。胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin则在500mM Tris·HCl(pH8.0)/10mM CaCl2中，以酶与底物比为1:20的浓度将纳米抗体样品在37℃水浴中酶解过夜。酶解完成后将样品酶解后的肽段离心至管底。
利用C18脱盐Tip头分别对纳米抗体酶解后的肽段样品进行脱盐。首先将Tip头用100μL 100％ACN湿润两次，再用100μL 50％ACN/Water(0.1％FA)湿润两次。用100μL 1.0％FA平衡Tip头5～10次后，反复吸吹样品10～15次，保证样品和Tip头充分接触。利用100μL0.1％FA反复清洗吸附在Tip头上的肽段样品2～3次后，第一次用50μL 0.1％FA/50％ACN洗脱Tip头3～5次，收集洗脱液至新的离心管中；第二次用50μL 0.1％FA/75％ACN洗脱Tip头3～5次，将洗脱液收集至同一支离心管中，完成对一管纳米抗体酶解后的肽段样品的脱盐。重复数次，完成所有样品。
肽段用液相色谱流动相A相(0.1％(v/v)甲酸水溶液)溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0～40min，2％-22％B；40～52min，22％-35％B；52～56min，35％-80％B；56～60min，80％B，流速维持在350nL/min。
肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进QExactiveTM Plus质谱进行分析。将离子源电压设定为2.0kV，肽段母离子及其二级片段都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1800m/z，扫描分辨率设置为70000；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，Orbitrap扫描分辨率设置为17500。数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用30％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。
为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制(AGC)设置为5E4，信号阈值设置为5000ions/s，最大注入时间设置为200ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为15秒以避免母离子的重复扫描。
5.纳米抗体参考蛋白库的搜库和高置信度纳米抗体cDNA的确定
二级质谱数据使用ProteinPlot软件进行检索。检索参数设置：数据库为无参考基因组转录组测序得到的Unigene库(27700条序列)，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)，并且通过mRNA片段化随机性检验和插入片段长度检验确保测序文库的质量；酶切方式设置为多酶酶切，包括谷氨酸C端内切酶GluC、赖氨酸C端内切酶LysC、赖氨酸N端内切酶LysN、胰蛋白酶Trypsin和胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin；漏切位点数设为2；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02Da。将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化。定量方法设置为TMT-6plex，蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％。
质谱数据搜库完成后，将得到的不同酶切的数据文件进行合并，总共鉴定到66种不同的纳米抗体。按照95％置信度下的肽段总计数≥1的标准，总共定量到了56种不同的纳米抗体。利用NCBI提供的BLAST+(2.90)软件对定量到的纳米抗体序列与保守的纳米抗体框架序列进行比对，总共得到了32条比对成功的纳米抗体序列。将比对成功的抗体序列利用IMGT提供的V-QUEST软件重新映射(remap)到保守的纳米抗体框架序列中，成功映射到了19条纳米抗体序列。返回Unigene库中调取成功映射的纳米抗体的cDNA序列。
6.高亲和力纳米抗体的基因工程表达
将筛选得到的部分纳米抗体DNA序列合成后，将其克隆到真核表达载体pCDNA3.4中；并融合Human IgG1 Fc片段进行构建；将构建所得载体瞬转293F细胞进行无血清表达；所得产物以protein A纯化柱纯化后进行后续的检测。
7.高亲和力纳米抗体的功能验证
抗体的Western Blot反应性检测：在还原和非还原条件下将Gn-his蛋白经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，分离的蛋白转移到PVDF膜上(还原和非还原条件分别是指在载胶缓冲液中是否添加β-巯基乙醇)；先用5％牛奶封闭PVDF膜，然后用稀释的血浆或抗体在4℃过夜或37℃孵育1h，经PBST洗膜后，加入IRDye 800CW(926-32232，Rockland)标记的抗人IgG或兔IgG二抗；使用奥德赛CLx成像系统(LI-COR)观察蛋白条带。
用ELISA法评估抗血清滴度和抗体特性：简单地说，将蛋白包被在高蛋白吸附结合酶联免疫吸附板(9018，Corning)上，浓度为0.5μg/mL，100μL/孔，37℃下孵育2h或4℃过夜；洗净后，在PBST缓冲液中加入5％脱脂牛奶进行封闭，37℃孵育1h；加入梯度稀释的抗血清或纯化抗体100μL，洗涤2～4次后，37℃孵育1.5h；洗净后，加入HRP标记的山羊抗人IgG(H+L)二抗(1:10000稀释，NB7242，Novus)，37℃孵育1h；随后，在37℃下添加3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)(CFAD-T2885-5G，Millipore Sigma)底物10min；加入10μL 0.2M硫酸中止反应；使用Infinite 200(Tecan)在450nm处测量OD值。
为了证实我们生产出的单克隆纳米抗体57493可以正常发挥生物学功能，我们以兔抗Gn血清为对照，分别作为一抗进行Western blot实验。实验结果表明，无论抗原Gn在还原或非还原状态下，单克隆纳米抗体57493作为一抗得到的Western blot条带，与对照组的条带一致(图2A)。这证明了我们筛选得到的单克隆纳米抗体57493能够正常行使生物学功能，同时也证明了本研究技术路线筛选、生产抗Gn单克隆纳米抗体的可行性和有效性。最后，我们通过浓度梯度ELISA，证实了单克隆纳米抗体57493与抗原Gn结合的特异性(图2B)。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (10)
1.一种基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法，包含以下步骤：
1)抗原制备和免疫动物；
2)抗体的亲和纯化；
3)免疫后骆驼B细胞总mRNA的提取以及纳米抗体参考蛋白库的制备；
4)高亲和力纳米抗体的酶切以及蛋白质谱检测；
5)纳米抗体参考蛋白库的搜库和高置信度纳米抗体cDNA的确定；
6)高亲和力纳米抗体的基因工程表达。
2.如权利要求1所述的基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法，其特征在于，步骤3)中的动物为骆驼。
3.如权利要求1所述的基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法，其特征在于，步骤3)中使用NGS测序制备纳米抗体参考蛋白库。
4.如权利要求1所述的基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法，其特征在于，步骤4)中使用多酶切的方法进行高亲和力纳米抗体的酶切。
5.如权利要求1所述的基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法，其特征在于，步骤4)中使用LC-MS/MS进行蛋白质谱的检测。
6.如权利要求1所述的基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法，其特征在于，步骤5)中使用使用ProteinPlot软件进行纳米抗体参考蛋白库的搜库。
7.如权利要求1所述的基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法，其特征在于，步骤5)中利用NCBI提供的BLAST+(2.90)软件对搜库得到的纳米抗体序列与保守的纳米抗体框架序列进行比对，将比对成功的抗体序列利用IMGT提供的V-QUEST软件重新映射(Remap)到保守的纳米抗体框架序列中，根据成功映射到了的纳米抗体序列返回Unigene库中调取纳米抗体的cDNA序列。
8.如权利要求1所述的基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法，其特征在于，还包括步骤7)高亲和力纳米抗体的结合活性检测。
9.一种如权利要求1所述的基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法在抗体制备中应用。
10.一种如权利要求2-8任一项所述的基于二代测序和蛋白质组学的纳米抗体生产方法在抗体制备中应用。
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