CN115624616A - 接头蛋白pinch在诊断血管发育异常相关疾病中的应用 - Google Patents

接头蛋白pinch在诊断血管发育异常相关疾病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及接头蛋白PINCH在诊断血管发育异常相关疾病中的应用，本发明所述接头蛋白PINCH包括PINCH1和PINCH2两个异构体，在细胞质和细胞核中均有表达。本发明首次证实了PINCH的缺失会抑制VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ‑RⅡ和Pdgf‑Rβ基因的表达，影响Akt、ERK、FAK、Src等关键基因和通路的激活，且会促进PI3K‑Akt，受体酪氨酸激酶，MAPK和EGFR1等整合素相关信号通路，导致胚胎死亡，且伴有血管网发育异常、血管扩张并形成血管瘤为主要症状的各种血管发育异常相关疾病，增加接头蛋白PINCH的医药用途。

Description

接头蛋白PINCH在诊断血管发育异常相关疾病中的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及接头蛋白PINCH在诊断血管发育异常相关疾病中的应用。
背景技术
血管是最早形成的器官之一，对胚胎的发育至关重要。血管形成和其结构稳态维护的异常与肿瘤生长和转移、损伤修复和多种人类的血管相关病变如脑血管病变、动脉粥样硬化、血管瘤和糖尿病等密切相关。因此，阐明血管形成的分子机制将加深我们对人类相关疾病发生，发展及病理机制的理解，为探索更有效的预防和治疗提供基础。
胚胎期血管系统的发育包括血管发生（由成血管细胞和干细胞形成血管的过程）和血管生成（由已存在的血管通过出芽、桥接或套叠形成新血管的过程）两大阶段。具体包括血管内皮前体细胞的激活，募集，定位并形成初级毛细血管网。随后，初级毛细血管经过广泛的迁移，分叉，生长和重塑；同时内皮细胞募集并与平滑肌细胞和周细胞相互作用，从而形成稳定的血管结构和功能。血管壁由内皮细胞，平滑肌细胞，周细胞，成纤维细胞，以及基底膜和其他细胞外基质组成。干扰内皮细胞或它与基底膜和周边细胞的相关作用将导致周细胞和平滑肌细胞的募集障碍，形态，增殖，分化和存活异常。反之，干扰平滑肌细胞和周细胞将导致内皮细胞异常增殖，形态和细胞间连接改变，基底膜异常，血管渗漏甚至崩解。
由ILK、接头蛋白PINCH（particularly interesting new cysteine-histidine-rich protein）和Parvin组成的IPP复合体是整合素双向跨膜信号的核心枢纽，介导了细胞外基质和细胞质中的细胞骨架网络以及其它多种信号通路的整合。PINCH是含5个LIM结构域的接头蛋白，有PINCH1和PINCH2两个异构体，在细胞质和细胞核中均有表达。
细胞外基质蛋白对血管形态发生至关重要，缺失纤连蛋白或IV型胶原可导致胚胎心血管发育缺陷，进而死于妊娠中期。在血管内皮细胞双敲除α5/αv导致大血管的重塑异常和出血。内皮细胞特异性敲除整合素β1导致胚胎早期死亡，伴有内皮细胞凋亡增加，迁移障碍和血管分叉和网络减少，血管细胞外基质/基底膜的形成障碍。整合素β1是血管平滑肌细胞表达量最高的整合素亚基，整合素β1失活可导致血管平滑肌细胞增殖和迁移能力的增强。用Pdgfrb-Cre敲除小鼠整合素β1亚基导致小鼠出生后死亡，且血管平滑肌细胞的伸展、分化及其支持血管的能力受到损害。突变体周细胞无法伸展，且细胞数量增加。用Pdgfrb-Cre特异性敲除ILK导致小鼠胚胎局部出血并水肿，个体生长和器官形态发生迟缓，且突变体小鼠生后死亡。研究表明，ILK可响应PDGF信号来调控小鼠大动脉血管平滑肌细胞迁移和肌动蛋白的聚合。小干扰RNA介导的PINCH1敲低可破坏细胞骨架并导致血管平滑肌细胞凋亡。
已分化的血管平滑肌细胞可响应环境压力和血管损伤，迅速逆转其表型，成为具有合成分泌细胞外基质蛋白和迁移活性的血管平滑肌细胞，参与血管损伤修复。因此，血管平滑肌细胞在动脉粥样硬化、动脉整形术后再狭窄和冠状动脉旁路移植术中扮演着重要的角色。
目前已有通过下调内皮细胞特异性表达血管发育相关整合素或利用生长因子抑制子（如血管内皮生长因子（VEGF）抑制子）来抑制肿瘤内血管发生，进而抑制肿瘤生长与转移的治疗方案。利用外源性促进血管生成的生长因子（如VEGF）诱导局部组织缺血区域血管的生成。而针对整合素信号通路中接头蛋白PINCH血管疾病的相关诊疗方案在本领域中还未见相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供接头蛋白PINCH在诊断血管发育异常相关疾病中的应用，所述接头蛋白PINCH可用于包括脑血管病变、马方综合症和腹主动脉瘤等多种以胚胎期血管网发育异常及血管瘤为主要症状的血管发育异常疾病的治疗、诊断和产前筛查，增加接头蛋白PINCH的医药用途。
本发明提供了接头蛋白PINCH或PINCH基因的应用，包括下述Ⅰ~Ⅳ中的任意一项或多项：
Ⅰ：用于制备促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因的表达的药物组合物；
Ⅱ：用于制备促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种蛋白的表达的药物组合物；
Ⅲ：制备信号通路激活剂，所述信号通路激活剂剂激活的信号通路包括FAK、Src和ERK中一种或多种信号通路；
Ⅳ：制备信号通路抑制剂，所述信号通路抑制剂抑制的信号通路包括PI3K-Akt，受体酪氨酸激酶，MAPK和EGFR1通路中的一种或多种；
所述药物组合物、信号通路激活剂或信号通路抑制剂与血管发育异常相关疾病有关。
优选的，所述药物组合物、信号通路激活剂或信号通路抑制剂用于诊断血管发育异常相关疾病。
优选的，所述血管发育异常相关疾病包括先天性血管瘤、脑血管病变、马方综合症和腹主动脉瘤中的一种或多种。
优选的，用于所述诊断的试剂包括检测接头蛋白PINCH或PINCH基因表达量或活性的试剂。
优选的，所述接头蛋白PINCH包括PINCH1和/或PINCH2。
优选的，所述试剂包括芯片、探针、引物、抗体和质谱检测试剂中的至少一种。
优选的，所述芯片包括核酸芯片和/或蛋白芯片；所述抗体包括接头蛋白PINCH特异性抗体。
本发明还提供了一种筛选用于促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因或蛋白表达的试剂的方法，包括如下步骤：
1）在实验组中，向细胞培养体系中添加测试试剂，并测定所述细胞培养系中PINCH基因或的接头蛋白PINCH表达量和/或活性；
2）在对照组中，向相同的细胞培养系中不添加测试试剂，并测定所述细胞系中PINCH基因或接头蛋白PINCH的表达量和/或活性；
3）如果实验组中PINCH基因或接头蛋白PINCH的表达量大于对照组，则说明该测试试剂为用于促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因或蛋白表达的试剂。
优选的，测定所述步骤3）中获得的所述试剂对VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因的促进作用，如果实验组中VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因的表达量明显大于对照组，则证明所述试剂为用于促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因或蛋白表达的试剂。
有益效果：
本发明提供了接头蛋白PINCH或PINCH基因的应用，包括下述Ⅰ~Ⅳ中的任意一项或多项：Ⅰ：用于制备促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因的表达的药物组合物；Ⅱ：用于制备促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种蛋白的表达的药物组合物；Ⅲ：制备信号通路激活剂，所述信号通路激活剂剂激活的信号通路包括PI3K-Akt、FAK、Src和ERK中一种或多种信号通路；Ⅳ：制备信号通路抑制剂，所述信号通路抑制剂抑制的信号通路包括PI3K-Akt，受体酪氨酸激酶，MAPK和EGFR1通路中的一种或多种。
本发明所述接头蛋白PINCH包括PINCH1和PINCH2两个异构体，在细胞质和细胞核中均有表达；同时，本发明首次证实了PINCH的缺失会抑制VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ基因的表达，影响ERK、FAK、Src等关键基因和通路的激活，且会促进PI3K-Akt，受体酪氨酸激酶，MAPK和EGFR1等整合素相关信号通路，导致胚胎死亡，且伴有血管网发育异常、血管扩张并形成血管瘤为主要症状的各种血管发育异常相关疾病，增加接头蛋白PINCH的医药用途。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1中胚胎发育至8.5天和9.5天的接头蛋白PINCH的小鼠胚胎原位杂交表达结果；
图2为本发明实施例1中胚胎发育至10.5天和11.5天的接头蛋白PINCH的小鼠胚胎原位杂交表达结果；
图3为本发明实施例1中接头蛋白PINCH在内皮细胞中与PECAM共表达结果图；
图4为本发明实施例1中PINCH基因敲除小鼠模型交配方案；
图5为本发明实施例1中模型小鼠胚胎死亡统计结果，其中WT为对照组，SMUT为单敲除组，DMUT为双敲除组；
图6为本发明实施例2中内皮细胞中PINCH1和PINCH2双敲除小鼠胚胎血管网整体成像图；
图7为本发明实施例3中单敲除PINCH1基因小鼠X-gal染色结果图；
图8为本发明实施例4中体外培养的敲除组内皮细胞粘附、生长和迁移结果图；
图9为本发明实施例5中双敲除组小鼠胚胎内皮细胞增殖及凋亡情况分析；
图10为本发明实施例6中胚胎发育12.5天的对照组与单敲除小鼠肝和肺组织中内皮细胞的磷酸化位点差异表达分析；
图11为本发明实施例6中胚胎发育12.5天的对照组与单敲除小鼠肝和肺组织中内皮细胞的差异蛋白通路分析；
图12为本发明实施例6中胚胎发育12.5天的对照组与单敲除小鼠肝和肺组织中内皮细胞的差异蛋白磷酸化位点聚类热图；
图13为本发明实施例7中小鼠模型内皮细胞中整合素通路相关蛋白的表达和磷酸化水平分析结果；
图14为本发明实施例8中血管平滑肌细胞中PINCH1和PINCH2基因双敲除组和对照组小鼠中血管扩张和毛细血管网发育情况分析；
图15为本发明实施例9中Pdgfrb-Cre敲除PINCH1和PINCH2基因的小鼠P0.5天的主动脉表型分析；
图16为本发明实施例10中对照组小鼠和双敲除组小鼠腹主动脉组学结果分析；
图17为本发明实施例11中对照组小鼠和双敲除组小鼠中动脉组学结果分析；
图18为本发明实施例12中胚胎发育16.5-18.5天的对照组与双敲除小鼠平滑肌细胞的磷酸化位点差异表达分析结果；
图19为本发明实施例12中胚胎发育16.5-18.5天的对照组与双敲除小鼠平滑肌细胞的差异蛋白通路分析；
图20为本发明实施例12中胚胎发育16.5-18.5天的对照组与双敲除小鼠平滑肌细胞的差异蛋白磷酸化位点聚类热图。
具体实施方式
本发明提供了接头蛋白PINCH或PINCH基因的应用，包括下述Ⅰ~Ⅳ中的任意一项或多项：
Ⅰ：用于制备促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因的表达的药物组合物；
Ⅱ：用于制备促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种蛋白的表达的药物组合物；
Ⅲ：制备信号通路激活剂，所述信号通路激活剂剂激活的信号通路包括FAK、Src和ERK中一种或多种信号通路；
Ⅳ：制备信号通路抑制剂，所述信号通路抑制剂抑制的信号通路包括PI3K-Akt，受体酪氨酸激酶，MAPK和EGFR1通路中的一种或多种；
所述药物组合物、信号通路激活剂或信号通路抑制剂与血管发育异常相关疾病有关。
本发明所述药物组合物、信号通路激活剂或信号通路抑制剂优选用于诊断血管发育异常相关疾病。
在本发明中，接头蛋白PINCH的缺失或表达量下调，PINCH基因的敲除会导致胚胎死亡，且伴有血管网发育异常，血管扩张并形成血管瘤为主要症状的各种血管疾病，进而当生物样本中接头蛋白PINCH和PINCH基因缺失或表达量下调时，则确认其患有血管发育异常相关疾病。
本发明所述接头蛋白PINCH含5个LIM结构域，有PINCH1和PINCH2两个异构体，在细胞质和细胞核中均有表达，即本发明在将所述接头蛋白PINCH进行上述应用时优选包括PINCH1和/或PINCH2，更优选包括PINCH1和PINCH2。本发明所述血管发育异常相关疾病包括胚胎发育过程中的血管发育异常相关疾病，更优选包括先天性血管瘤、脑血管病变、马方综合症和腹主动脉瘤中的一种或多种。
本发明所述用于所述诊断的试剂优选包括检测接头蛋白PINCH或PINCH基因表达量或活性的试剂。本发明所述试剂优选包括核酸芯片、探针、引物、抗体和质谱检测试剂中的至少一种，更优选包括探针、引物或抗体。本发明所述探针优选包括原位杂交探针；所述原位杂交探针优选包括PINCH1原位杂交探针cRNA序列和PINCH2原位杂交探针cRNA序列；所述PINCH1原位杂交探针cRNA序列优选为PINCH1基因从1431到2156位碱基互补序列，长度为726bp，所述PINCH2原位杂交探针cRNA序列优选为PINCH2基因从1017到1682位碱基互补序列，长度为666bp。本发明所述PINCH1基因在NCBI中的登录号为NM_026148.4；所述述PINCH1基因在NCBI中的登录号为NM_144862.4。本发明所述抗体优选包括接头蛋白PINCH特异性抗体。本发明所述引物优选包括特异性扩增PINCH基因的引物，更优选包括PINCH1基因特异性扩增引物和PINCH2特异性扩增引物，所述PINCH1特异性扩增引物的上游引物长度为22bp，下游引物长度为22bp，具体可参见参考文献[1]中的forward primer，P4和reverseprimer，P5；所述PINCH2特异性扩增引物优选包括野生型PINCH2引物和突变体PINCH2引物，所述野生型PINCH2引物序列参考参考文献[1]中材料与方法中序列1和序列2；所述突变体PINCH2引物参考参考文献[1]材料与方法处第二段中序列1和序列3。本发明所述引物优选用于野生型小鼠、单敲除突变体和双敲除突变体基因型的鉴定。本发明对所述基因型的鉴定步骤没有具体限定，采用对应引物按照本领域中常规步骤进行鉴定即可。本发明所述抗体优选包括接头蛋白PINCH特异性抗体，更优选包括接头蛋白PINCH单克隆抗体或多克隆抗体。本发明通过测定接头蛋白PINCH的活性或PINCH基因的表达量或活性来检测或预测血管发育异常相关疾病，尤其是胚胎期的血管发育异常相关疾病。
本发明还提供了一种筛选用于促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因或蛋白表达的试剂的方法，包括如下步骤：
1）在实验组中，向细胞培养体系中添加测试试剂，并测定所述细胞培养系中PINCH基因或的接头蛋白PINCH表达量和/或活性；
2）在对照组中，向相同的细胞培养系中不添加测试试剂，并测定所述细胞系中PINCH基因或接头蛋白PINCH的表达量和/或活性；
3）如果实验组中PINCH基因或接头蛋白PINCH的表达量大于对照组，则说明该测试试剂为用于促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因或蛋白表达的试剂。
本发明优选还包括测定所述步骤3）中获得的所述试剂对VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因的促进作用，如果实验组中VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因的表达量明显大于对照组，则证明所述试剂为用于促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因或蛋白表达的试剂。
本发明对测定所述PINCH基因或的接头蛋白PINCH表达量和/或活性的方法没有特殊限定，采用本领域中常规测定方法即可。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
在下述实施例中，如无特殊限定，所述试验方法均为本领域中常规的试验方法，所使用的试剂和抗体均可通过本领域常规市售渠道购买得到；同时，本发明所获结论均以同等背景野生型小鼠为参照进行实验。
准备例：
实施例中，除包括基因型为PINCH1f/f的小鼠模型为自行构建外，其他基因型小鼠均购买于南京模式动物公司，包括基因型为PINCH1f/f的小鼠模型的构建方法参见文献[3]；野生型小鼠和对照小鼠均指的是c57品系小鼠。
实施例中所涉及的试验方法如下：
（1）构建小鼠品系：将基因型为PINCH1f/f，PINCH2-/-的小鼠与Rosa-LacZ或-tdTomato报导小鼠杂交，参照参考文献[2]和[3]。在报导小鼠中，报导基因前有一个两侧带有loxP的终止密码子。只有在Cre表达细胞中，Cre介导删除停止密码子使报导基因得以表达。并且一旦表达，报导基因将永久表达在这一细胞以及所有来源于这一细胞的细胞群中，所以可以追踪Cre表达的细胞谱系。
将基因型为Tie2-Cre+，PINCH1f/+的小鼠与基因型为Tie2-Cre-，PINCH1f/f的小鼠交配获得单敲除PINCH1基因的小鼠模型（下称单敲除突变体）；将基因型为Tie2-Cre+，PINCH1f/+，PINCH2-/-的小鼠与基因型为Tie2-Cre-，PINCH1f/f，PINCH2-/-的小鼠交配获得双敲除PINCH1和PINCH2基因的小鼠模型（下称双敲除突变体）。
同样，本发明利用Pdgfrb-Cre小鼠，建立了血管平滑肌细胞特异性单敲除PINCH1基因和双敲除PINCH1和PINCH2基因的小鼠模型，分别记为PINCH1Pdgfrb-Cre和PINCHsPdgfrb-Cre。在不同的发育阶段收集小鼠胚胎或成体器官组织进行研究。
（2）内皮细胞和血管平滑肌细胞谱系和组织学分析：将小鼠按步骤（1）的方法进行杂交，在预定的发育阶段收获胚胎并用4% PFA固定，进行X-gal染色或直接用荧光显微镜分析。将组织用石蜡包埋，进行切片组织学和抗体染色分析。
（3）免疫组化染色和RNA原位杂交：（A）抗体染色，将步骤（2）中得到的10μm厚的切片在一抗溶液中于4℃孵育过夜，洗涤后用荧光标记的二抗孵育。一抗包括PINCH1抗体，PINCH2抗体，PECAM，Vinculin，Fibronectin，Sma，Laminin抗体，所述PINCH1抗体和PINCH2抗体制备方法参考文献[4]；二抗包括488和594荧光二抗，抗体主要购于Abcam公司和BD公司。染色后用正置荧光显微镜成像拍照。（B）RNA原位杂交，使用原位杂交DNA序列合成cRNA探针并用地高辛标记，之后用AP标记地高辛抗体，用BCIP和NBT试剂盒显色；所述PINCH1原位杂交探针cRNA序列优选为PINCH1基因从1431到2156位碱基互补序列，长度为726bp，所述PINCH2原位杂交探针cRNA序列优选为PINCH2基因从1017到1682位碱基互补序列，长度为666bp。本发明所述PINCH1基因在NCBI中的登录号为NM_026148.4；所述述PINCH1基因在NCBI中的登录号为NM_144862.4。
（4）胚胎整体染色：用X-gal对胚胎进行整体染色，用共聚焦显微成像。
（5）内皮组织培养：收集E9.5-12.5天（胚胎发育9.5~12.5天，下同）的肝和肺的胚芽，在基底胶中，10%胎牛血清（FBS）的DMEM:F12培养基（1:1）中，37oC（5%二氧化碳）培养，观察内皮细胞的迁移和血管网形成情况。
（6）内皮细胞和血管平滑肌细胞培养：收集E9.5-12.5天的肝和肺的胚芽。用蛋白酶-胶原酶试剂（罗氏公司，货号10269638001）和胰酶（康宁公司，货号25053CI）处理，在纤连蛋白包被培养瓶或基底胶包被的培养皿中，在含10% FBS的DMEM/F12（1:1）培养液中，37℃（5%二氧化碳）中培养，观察细胞的形态，粘附，生长，存活和分化。
取出生一周内的双敲除组小鼠和野生型小鼠的脑动脉（椎动脉，基地动脉，大脑前/中/后动脉和及其交通支）。用购于罗氏公司的蛋白酶-胶原酶试剂（罗氏公司，货号10269638001）和木瓜酶（Worthington生化公司，货号LS003119）消化5分钟，并用玻璃吸管轻轻吹打机械分离，得到单细胞悬液。在含10%FBS的DMEM培养液中培养和研究。
（7）统计分析：数据结果以平均值±均方差表示，统计分析运用t检验或ANOVA。P ≤ 0.05被认为具有显著统计学意义。
（8）流式细胞仪分离纯化内皮细胞和血管平滑肌细胞：根据表型出现的时间，本发明将取E9.5天双敲除组小鼠和对照小鼠的肝胚芽，以及E12.5天单敲除组小鼠的肝和肺胚芽，用罗氏公司生产的Collagenase IV/Dispase酶对组织进行消化，然后Trypsin酶解处理和机械分离得到单细胞悬液；为分离血管平滑肌细胞，取PINCHsPdgfrb-Cre新生小鼠（血管平滑肌细胞特异性PINCH1和PINCH2基因双敲除小鼠）颅底中小动脉，包括椎动脉，基地动脉，大脑前/中/后动脉和及其交通支，先后用Protease XIV/Collagenase IV，以及Collagenase IV/Papain消化，并用玻璃吸管轻轻吹打机械分离，得到单细胞悬液。进行FACS分选得到纯化的内皮细胞和血管平滑肌细胞，或用PECAM磁珠纯化内皮细胞。将细胞保存在RNAlater中4℃过夜，次日离心去除RNAlater，并在-80℃保存。
（9）磷酸化蛋白芯片研究：收集细胞或血管标本如上述方法，送往上海华盈生物公司进行Fullmoon PEX100 explorer磷酸化蛋白芯片检测蛋白磷酸化情况，并对结果进行生信分析。
实施例1
通过Cre loxP重组酶系统构建小鼠模型，具体构建方法详见参考文献[2]中的第2~3、6和8页，小鼠模型基因型的鉴定过程可参见文献[5]中的第5-8页。由于接头蛋白PINCH在胚胎发育过程中广泛表达，内皮细胞分散分布，不适合对其在内皮细胞中的表达进行定量分析。为了研究其表达，本发明对准备例步骤（5）中培养的肝胚芽内皮细胞进行免疫荧光染色，结果如图3所示，其中a表示PINCH1与PECAM共表达，b表示PINCH2与PECAM共表达，由图3可以得出PINCH在内皮细胞中与PECAM共表达，说明PINCH在血管内皮细胞中高表达，提示PINCH可能在内皮细胞中起重要作用。
按照准备例步骤（3）和（4）中的方法对野生型小鼠胚胎进行原位杂交，具体应用过程可参见文献[6]。结果如图1和2所示，其中图1为胚胎发育至8.5天和9.5天的接头蛋白PINCH的小鼠胚胎原位杂交表达结果，图2为胚胎发育至10.5天和11.5天的接头蛋白PINCH的小鼠胚胎原位杂交表达结果。由图1和2可以得出PINCH在胚胎发育早期（E8.5天）的血管内皮细胞中高表达。
为了研究接头蛋白PINCH在内皮细胞中的作用，本发明从南京模式动物中心购买了内皮细胞特异性的 Tie2-Cre+小鼠。将基因型为Tie2-Cre+，PINCH1f/+的小鼠与基因型为Tie2-Cre-，PINCH1f/f的小鼠交配获得单敲除PINCH1基因的小鼠模型（单基因突变体），基因型为Tie2-Cre+，PINCH1f/+的小鼠与基因型为Tie2-Cre-，PINCH1f/f的小鼠交配导致特异性基因敲除原理详见参考文献[2]；将基因型为Tie2-Cre+，PINCH1f/+，PINCH2-/-的小鼠与基因型为Tie2-Cre-，PINCH1f/f，PINCH2-/-的小鼠交配获得双敲除PINCH1和PINCH2基因的小鼠模型（双基因突变体），具体交配方案如图4图所示。野生型、单敲除突变体和双敲除突变体的成活率和表型组织学变化统计结果如图5所示：随着PINCH表达量的降低，突变小鼠的存活率也急剧下降，单敲除突变体死于胚胎发育的16.5天，双敲除突变体死于胚胎发育的12.5天，即PINCH1和PINCH2基因双敲除小鼠在胚胎发育早期死亡。以上表明PINCH在血管发育中起重要作用，并且与PINCH1和PINCH2基因的总表达量呈剂量依赖性。
实施例2
内皮细胞中PINCH1和PINCH2基因双敲除导致严重的胚胎血管生成异常和内皮细胞的严重丢失
对对照小鼠（WT）和双敲除突变体（DMUT）进行胚胎整体染色，胚胎整体染色染色结果显示正常对照小鼠中，原始毛细血管网络的表达正常，可以分支、重塑和成熟，形成大血管（图6中C），但双敲除突变体原有的毛细血管网络数量明显减少，且不能进一步分支、重塑、成熟和形成大血管（图6中D）。整体荧光成像结果显示基因双敲除突变体在E9.5天具有严重的胚胎和血管发育障碍。内皮细胞严重缺失，不能形成原始血管网络，如图6中A和B所示。
实施例3
单敲除PINCH1基因小鼠胚胎血管重塑和成熟障碍：
单敲除突变体小鼠在E12.5天颈动脉显着扩张或中断；颈静脉增加或合并成明显扩张的静脉，如图7所示，在图7中ctrl表示对照组小鼠，PINCH1Tie2-Cre表示单敲除PINCH1基因小鼠；同时C’、D’和E’图分别对应C、D和E中画框部分的放大结果；F和G分别对应对照组和单敲除组，右侧1展示的小鼠颈侧切片，2展示的小鼠上肢下侧切片，对比发现PINCH1Tie2-Cre小鼠血管密度较对照组小鼠血管密度明显降低。图中下方带有黑色箭头指颈总动脉和上肢静脉，白色箭头指内皮细胞聚集形成的血岛。
由图7可以得出在PINCH1Tie2-Cre单敲除PINCH1基因突变体小鼠在E12.5天颈动脉显着扩张或中断，颈静脉增加或合并成明显扩张的静脉；在单敲除突变体小鼠上可以看到大量内皮细胞团块，即血岛。E13.5天，对照组小鼠可见颈动脉及其分支及颈静脉形成，而PINCH1Tie2-Cre小鼠颈动脉明显扩张或中断，颈静脉增加或合并为明显扩张的静脉。对照组躯干处大血管形态及分支结构正常，PINCH1Tie2-Cre小鼠组躯干部大血管缺失，且血管分支异常。E15.5天PINCH1Tie2-Cre内皮细胞在颈部大量聚集，无功能性血管网络的形成，且胚胎皮肤出现水肿。
实施例4
体外培养的单敲除突变体和双敲除突变体内皮细胞表现出粘附、生长和迁移障碍：
通过分离小鼠胚胎肝胚芽组织，并对其进行酶解消化得到细胞悬液，对其进行流式细胞分选或Pecam磁珠分选得到内皮细胞悬液，体外培养内皮细胞，并对细胞迁移距离进行统计，发现突变体内皮细胞迁移距离显著降低，如图8中A所示，说明突变体内皮细胞迁移存在障碍。在A中，WT表示对照组小鼠，SMUT表示单敲除突变体，DMUT表示双敲除突变体：A中从左至右第一个柱状图表示突变体（单敲除突变体或双敲除突变体）细胞迁移细胞数相对于对照组细胞迁移细胞数的比值；第二个柱状图表示突变体（单敲除突变体或双敲除突变体）细胞迁移距离相对于对照组细胞迁移距离的比值。
将对照组内皮细胞和突变体组内皮细胞分别培养于不同细胞外基质蛋白上，PECAM染色后统计发现单敲除突变体和双敲除突变体组内皮细胞在纤连蛋白，层粘连蛋白，胶原蛋白和玻连蛋白上的粘附率均显著下降，如图8中B所示；B中柱状图表示细胞在不同蛋白包被的培养板上黏附细胞数的比值。
在matrix胶中培养内皮细胞，并对其进行免疫荧光染色发现突变体内皮细胞形态异常，如图8中C和D所示，C中柱状图表示铺展细胞占总细胞的比值和伸长细胞占总细胞的比值。突变体细胞形态偏圆形，长分支减少且分支较短，无法与其它细胞相连接，构成内皮细胞网络，且接头蛋白PINCH表达水平越低，敲除组细胞形态异常越严重，而对照组内皮细胞可互相连接形成网状结构。可见PINCH在内皮细胞的迁移，粘附和连接等基本生命活动中起着至关重要的作用。
在图8中，WT表示对照组小鼠，SMUT或SM表示单敲除突变体，DMUT或DM表示双敲除突变体。
实施例5
对照组和双敲除突变体组细胞增殖和凋亡的变化：
为了进一步探讨血管生成障碍的原因，本发明对E9.5天对照组和双敲除突变体组小鼠胚胎肝胚芽中的内皮细胞进行了增殖和凋亡染色，所用增殖检测试剂盒为锐博公司EdU细胞增殖（流式检测）试剂盒和BD公司Fitc偶联Annexin-V凋亡检测试剂盒1，对染色后细胞进行流式检测分析，结果如图9所示，其中A为对照组细胞凋亡染色流式图，B为双敲除突变体组细胞凋亡染色流式图，C为对照组增殖染色流式图，D为双敲除突变体组增殖染色流式图。双敲除突变体组内皮细胞增殖率从15.6%降低至8.7%，凋亡率从28.6%增高至35.2%，由此可见血管网密度减低是由于细胞增殖减少且细胞凋亡增加导致。在图9中wt表示对照组，dmut表示双敲除突变体组。
实施例6
磷酸化蛋白芯片检测结果：
本发明通过对小鼠胚胎内皮细胞进行多次流式分选和纯化后，从E12.5对照组（WT）和单敲除突变体组（SMUT）小鼠胚胎的肝和肺组织中分别获得了2×106个内皮细胞，将样本送往上海华盈生物公司进行Fullmoon PEX100 explorer磷酸化蛋白芯片检测。由图10可以得出：设置差异倍数为1.5时，在E12.5对照组和单敲除突变体组中筛选得到24个上调和43个下调蛋白磷酸化位点。由图11可以得出，这些差异蛋白富含多种生长因子（如MAPK、VEGF）、整合点、细胞周期、肿瘤信号通路等。差异蛋白磷酸化位点聚类热图如图12所示，可见与对照组相比，单敲除突变体小鼠组中这些关键差异蛋白磷酸化位点的磷酸化水平大部分呈下调趋势。
实施例7
单敲除突变体组内皮细胞中整合素通路相关蛋白的表达和磷酸化水平降低：
Akt是PI3K介导的细胞存活的关键调节剂。现有研究表明，Akt信号通路的持续激活可以防止一系列促凋亡刺激诱导的细胞死亡。ERK是一种在细胞增殖中起关键作用的信号通路。在细胞外刺激后，ERK可以被磷酸化和激活。激活的ERK可以通过激活下游分子来促进细胞增殖。因此，Akt和ERK通路磷酸化水平的降低可以反映细胞增殖受到抑制，如图13中A和I。
本发明采用蛋白质印迹法检测了Akt、ERK、FAK和Src信号通路的磷酸化。PI3K/Akt信号通路中关键蛋白Akt的整体表达无明显变化，但磷酸化水平明显降低（如图13中A所示），说明PINCH敲除后Akt活化受到抑制，从而影响PI3K/Akt信号通路。此外，在ERK-MAPK信号通路中，Erk蛋白的磷酸化水平也降低，说明Erk信号通路的功能受到抑制。
总的来说，与对照组相比，突变体组的p-Src/Src、p-Akt/Akt、p-FAK/FAK、p-ERK/ERK的值明显降低，如图13中A、F、G和I所示。与正常对照组相比，突变体组的VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ，Pdgf-Rβ蛋白的表达量明显降低，如图B、C、D和E。进一步的，与单敲除突变体组相比，双敲除突变体组的p-Src/Src、p-Akt/Akt、p-FAK/FAK、p-ERK/ERK的比值进一步降低。因此，综上所述，本发明的结果表明敲除PINCH基因可以显着降低Src、FAK、Akt和ERK的磷酸化和活化，从而影响内皮细胞的增殖和凋亡。
整合素相关信号通路在血管发育中发挥重要作用：
在血管发育过程中，AKT对血管的正常发育起着重要作用；ERK是一种在细胞增殖中起关键作用的信号通路；Src是一种膜结合开关分子，可连接细胞内外的许多重要信号通路；Src激酶在受体介导的信号传递和细胞间通讯中起重要作用；此外，它在血管内皮生长因子介导的血管生成中起重要作用。
FAK在细胞信号转导中占有非常重要的地位。FAK蛋白通过与Src结合并磷酸化Src，参与 FAK 特异性激酶活性的调节。 FAK可以整合多种细胞外信号，激活下游通路，参与多种信号转导通路，从而调控细胞迁移、生长和细胞周期进程。敲除内皮细胞中的PINCH会导致Akt、ERK、FAK和Src基因磷酸化水平的变化，以及它们下游信号通路的变化。因此，本发明认为PINCH的缺失会影响Akt、ERK、FAK、Src等关键基因的激活，进而影响内皮细胞的增殖进而影响血管的发育。
在图13中，WT表示对照组，SMUT表示单敲除突变体，DMUT表示双敲除突变体；GAPDH为内参蛋白。
实施例8
在血管平滑肌细胞中双敲除PINCH1和PINCH2基因导致血管扩张和毛细血管网减少和出血，如图14所示。在血管平滑肌细胞中双敲除PINCH1和PINCH2基因导致小鼠生后发育迟缓，在出生后3天左右死亡，全身多处血管扩张。双敲除组小鼠脑和肾皮质有多发性出血点，如图14中B和C所示，颅底中小动脉显著扩张，毛细血管网稍扩张，密度下降。相对于对照组（ctrl），双敲除组（PINCHsPdgfrb-Cre）左侧大脑前动脉（aca）和中动脉（mca）及其交通支，基底动脉（ba）和小脑上动脉（sca）显著扩张，如图14中D所示，提示PINCH在血管平滑肌细胞中的表达对调控血管大小和结构的完整性至关重要，可通过调节血管平滑肌细胞和周细胞的增殖分化，以及与内皮细胞的相互作用。其中，在图14中D1和D2分别表示图14中D中1和2框部分的放大图；E1和E2分别表示图14中E中1和2框部分的放大图。
实施例9
平滑肌细胞特异性双敲除PINCH1和PINCH2基因的小鼠（PINCH1Tie2-Cre）生后0.5天的主动脉表型分析，如图15所示。生后0.5天对照组小鼠的主动脉整体表型可见血管发育正常。生后0.5天双敲除组小鼠的主动脉可以看到血管扩张，腹主动脉处有膨出，如图15中A-C所示。对照组（WT）小鼠主动脉发育正常，血管结构完整且致密，血管平滑肌细胞正常呈梭形且环形有序排列。PINCH1Tie2-Cre组（在图15中以DMUT表示PINCH1Tie2-Cre组，下同）小鼠主动脉局部显著扩张，管壁增厚且管壁粗细不一，血管结构疏松，血管平滑肌细胞分化障碍，呈圆形，排列无明显极性，细胞数显著增多，如图15中A1-D2所示。其中，A1表示A图箭头标注部分的放大图，A2表示A1中黑框部分的放大图；B1表示B图箭头标注部分的放大图，B2表示B1中黑框部分的放大图；C1表示C中颈动脉部分的放大图，C2表示C1中黑框部分的放大图；D1表示D中颈动脉部分的放大图，D2表示D1中黑框部分的放大图。图15中A、B和C中的标尺分别为2毫米、2毫米和0.5毫米。
实施例10
腹主动脉组学分析显示血管平滑肌细胞外间质蛋白排列异常，如图16所示。对出生后0.5天的血管进行石蜡切片和弹性蛋白化学染色结果显示，与对照组（WT）相比，PINCH1Tie2-Cre组（DMUT）胸主动脉弹性纤维丝较细，排列松散不规则。PINCH1Tie2-Cre组小鼠腹主动脉弹性纤维含量显著降低，且无法相互连接，排列散乱，如图16中A-B所示。主动脉SMA与纤连蛋白共染，图16中C-E图可见对照组纤连蛋白位于平滑肌细胞间和血管内外两侧，呈均一线型排列，双敲除组图16中F-H图显示纤连蛋白呈杂乱的网状排列，且分布不均匀，出现纤连蛋白大量聚集区。血管内侧纤连蛋白分布不连续。主动脉SMA与层粘连蛋白共染，由图16中I-K图可见对照组主动脉发育正常，血管结构完整且致密，平滑肌细胞正常呈梭形且环形有序排列，层粘连蛋白位于平滑肌细胞间，呈均环形排列，图16中L-N图PINCH1Tie2-Cre组血管结构疏松，平滑肌细胞间连接不紧密，且平滑肌细胞分化障碍，呈圆形，排列无明显极性，层粘连蛋白大量分布于内侧血管壁中，呈无序的网状排列。由此可以得出：异常的层黏连蛋白排列可导致平滑肌细胞收缩障碍，进而导致PINCH1Tie2-Cre组小鼠血管弹性下降。
实施例11
中动脉组学分析显示血管壁构成异常。如图17中A~B显示：对照组（WT）中动脉血管呈环形，内皮细胞与外侧一层均匀覆盖的平滑肌细胞紧密连接，平滑肌细胞呈梭形且环形有序排列；图17中E~F显示，双敲除突变体组（DMUT）中血管结构疏松，平滑肌细胞呈圆形，排列紊乱，细胞数显著增多，且未均匀覆盖于内皮细胞表面。双敲除组内皮细胞数也较对照组内皮细胞数有所增多。中动脉SMA与层粘连蛋白Laminin共染，由图17中C~D图可见，对照组中动脉发育正常，图17中G~H图可见，双敲除突变体组血管层粘连蛋白大量分布于外侧血管壁中，呈无序的网状排列。
实施例12
磷酸化蛋白芯片检测结果，如图18、19和20所示。对胚胎发育16.5-18.5天的对照组与PINCH1Tie2-Cre组小鼠平滑肌细胞样本送往上海华盈生物公司进行Fullmoon PEX100explorer磷酸化蛋白芯片检测。设置差异倍数为1.5时筛选得到166个差异蛋白，其中，94个蛋白位点的磷酸化水平升高，72个蛋白位点的磷酸化水平降低，如图18所示。KEGG mapper分析结果显示这些差异蛋白主要集中在PI3K-Akt，受体酪氨酸激酶，MAPK，EGFR1等整合素相关信号通路中，如图19所示。差异蛋白磷酸化位点聚类热图如图20所示。由图18、图19和图20可见这些关键差异蛋白磷酸化位点的磷酸化水平大部分呈上调趋势。
由以上结果可以得出：在胚胎发育过程中，PINCH基因或接头蛋白PINCH对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞整个发育周期中的形成及功能调节起到重要作用，尤其是对于血管发生阶段及血管生成早期阶段的形成和功能而言，PINCH基因或蛋白的缺失会导致胚胎死亡，且伴有血管网发育异常，血管扩张并形成血管瘤为主要症状的各种血管疾病，进而，可以以接头蛋白PINCH或PINCH基因作为检测靶点进行血管发育异常相关疾病的诊断或检测。
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尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.接头蛋白PINCH或PINCH基因的应用，其特征在于，包括下述Ⅰ~Ⅳ中的任意一项或多项：
Ⅰ：用于制备促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因的表达的药物组合物；
Ⅱ：用于制备促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种蛋白的表达的药物组合物；
Ⅲ：制备信号通路激活剂，所述信号通路激活剂剂激活的信号通路包括FAK、Src和ERK中一种或多种信号通路；
Ⅳ：制备信号通路抑制剂，所述信号通路抑制剂抑制的信号通路包括PI3K-Akt，受体酪氨酸激酶，MAPK和EGFR1通路中的一种或多种；
所述药物组合物、信号通路激活剂或信号通路抑制剂与血管发育异常相关疾病有关。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物、信号通路激活剂或信号通路抑制剂用于诊断血管发育异常相关疾病。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血管发育异常相关疾病包括先天性血管瘤、脑血管病变、马方综合症和腹主动脉瘤中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用于所述诊断的试剂包括检测接头蛋白PINCH或PINCH基因表达量或活性的试剂。
5.根据权利要求1~4任一项所述的应用，其特征在于，所述接头蛋白PINCH包括PINCH1和/或PINCH2。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂包括芯片、探针、引物和抗体中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述芯片包括核酸芯片和/或蛋白芯片；所述抗体包括接头蛋白PINCH的特异性抗体。
8.一种筛选用于促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因或蛋白表达的试剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）在实验组中，向细胞培养体系中添加测试试剂，并测定所述细胞培养系中PINCH基因或的接头蛋白PINCH表达量和/或活性；
2）在对照组中，向相同的细胞培养系中不添加测试试剂，并测定所述细胞系中PINCH基因或接头蛋白PINCH的表达量和/或活性；
3）如果实验组中PINCH基因或接头蛋白PINCH的表达量大于对照组，则说明该测试试剂为用于促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因或蛋白表达的试剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，测定所述步骤3）中获得的所述试剂对VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因的促进作用，如果实验组中VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因的表达量明显大于对照组，则证明所述试剂为用于促进VEGFR1，VEGFR2，Tgfβ-RⅡ和Pdgf-Rβ中一种或多种基因或蛋白表达的试剂。
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