CN115619633A - 基于加速互相关的7帧结构光照明超分辨图像重建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于加速互相关的7帧结构光照明超分辨图像重建方法，包括：首先搭建基于SLM的双光束干涉式SIM系统，并逐像素预标定荧光光强；其次采用调制分配的空间滤波器去除低信噪比的不可靠背景；然后通过特殊设计的相移条纹并结合荧光标定实现频谱分离；最后采用粗到精的加速相关算法进行参数估计修正高频信息，利用广义维纳滤波对频谱分量进行加权重组实现超分辨图像重建。本发明能够在保证对复杂实验环境的鲁棒性的同时，能够以4.5倍于传统的迭代相关方法的效率实现高精度参数估计和高质量的超分辨率重建。
Description
技术领域
本发明属于光学显微成像领域，具体为一种基于加速互相关的7帧结构光照明超分辨图像重建方法
背景技术
荧光超分辨显微成像技术是近几十年来发展最快，受关注度最高的光学成像技术之一，这种技术突破了阿贝衍射极限，将光学显微镜的空间分辨率提升到了纳米级，对生命科学、材料科学等具有重大意义。结构光照明显微镜(SIM)凭借其快速全场成像和低光损伤的优点，适用于活细胞的研究。传统的2D-SIM通过结构照明将处于光学传递函数之外的高频信息搬运到探测通带之内，然后通过相关算法进行解调、重组，获得超分辨图像。为了获取各向同性的超分辨效果，通需要在三个方向上应用三步相移的条纹，即每次重建需要九幅结构照明图像，尽管相比于其他需要曝光数千次的基于点扫描的超分辨技术(STED/STORM/PALM)具备更高的时间分辨率，但对于活细胞观测仍然充满挑战。另外，SIM的重建算法极度依赖于后验的照明参数，不准确的参数估计将造成严重的伪影。
为了减少原始图像数量提高时间分辨率，通常采用空域/频域迭代算法进行重建，然而，这些方法需要对超分辨图像的形成过程进行假设，最终结果受到成像环境和噪声的严重限制，并且在计算效率方面也很耗时，因此，基于相移频谱分离的传统算法仍是首选。为最小化重建伪影，许多参数估计算法被提出，其中基于迭代的互相关算法可能是目前最流行的参数估计算法，其通过实空间相位梯度的形式进行亚像素优化，具备较高的精度和抗噪性能，但迭代优化耗时较长，进一步限制了SIM的成像效率优势。
因此，针对结构光照明超分辨显微术而言，目前尚缺一种时间分辨率与计算效率兼备的高保真重建方法。
发明内容
本发明提出了一种基于加速互相关的7帧结构光照明超分辨图像重建方法，在减少SIM超分辨重建所需原始图像数量的同时，优化了传统互相关参数估计算法，实现了1.3倍的时间分辨率、4.5倍的计算效率的提升。
实现本发明目的的技术方案为：一种基于加速互相关的7帧结构光照明超分辨图像重建方法，具体步骤为：
步骤1：搭建基于SLM的双光束干涉式SIM系统并完成荧光光强标定；
步骤2：通过SLM载入7幅相移条纹图像，利用±1级衍射光在样品焦面上产生干涉，通过干涉条纹对样品信息进行调制，采集调制后的荧光图像；
步骤3：利用调制分配的空间滤波器去除离焦背景与无效信息；
步骤4：分别对三个照明方向分别进行频谱分离；
步骤5：采用从粗到精的加速相关算法进行参数估计修正高频信息，利用广义维纳滤波进行超分辨图像重建。
本发明与现有技术相比，其显著优点为：本发明利用调制度滤波可快速有效去除离焦背景与无效信息，可获得更好的图像视觉效果和重建质量；本发明通过特殊设计相移条纹实现7帧SIM重建，提高了SIM成像的时间分辨率；本发明优化传统互相关参数估计算法，在保证精度与抗噪性能的同时计算效率比传统方法快了4.5倍。
下面结合附图对本发明做进一步详细的描述。
附图说明
图1为本发明的流程图。
图2为所搭建的SIM系统的原理示意图。
图3为本发明与传统方法的实验对比图，图3(a)为宽场图像与超分辨图像的对比，图3(b)是标定与未标定的对比，图3(c)是图3(a)中矩形框区域放大的细节对比。
具体实施方式
一种基于加速互相关的7帧结构光照明超分辨图像重建方法，首先搭建基于SLM的双光束干涉式SIM系统并完成荧光光强标定，采集7帧结构照明图像，通过调制度分配滤波去除离焦背景与无效信息，然后进行频谱分离，通过加速相关的参数估计算法对照明参数进行计算，并修正高频信息，最后通过维纳滤波进行超分辨重组，流程示意图如图1所示，实现步骤如下：
步骤1：搭建基于SLM的双光束干涉式SIM系统并完成荧光光强标定，其具体步骤为：
步骤1.1：SIM系统包含一台计算机，一台科研级sCMOS相机，一台倒置荧光显微镜，三台不同波长(561nm、488nm、405nm)的激光器、两个半波片(H1、H2)、铁电液晶空间光调制器(SLM)、偏振分束器(PBS)、空间滤波器、MASK板、两片二向色镜(DM1、DM2)、三片平面反射镜(M1、M2、M3)、四片透镜(L1-L4)。根据荧光样品特定特性选择适当波段的激光照明光，出射激光通过平面镜和二向色镜反射进入空间滤波器，并通过透镜L1完成准直扩束，为了最小化能量的损失，半波片H1改变激光的偏振态使其完全透过PBS，并入射到SLM上产生衍射，衍射光被H2改变偏振态并被PBS完全反射，由透镜L2聚焦到MASK上进行滤波，只保留±1级衍射光，通过透镜L3和L4组成的4F系统进入显微镜主体，被显微物镜收集在样品焦面上产生干涉，形成干涉条纹，最终发射荧光信号通过二向色镜被相机采集，其中相机和SLM由计算机控制同步触发，干涉条纹频率和方向可由SLM控制。
步骤1.2：对于整体荧光分布相对均匀的样品，在三个照明方向上分别采集传统三步相移图像，表示为
上式中，r表示空间坐标，n表示方向，j表示相移步数，S表示样品的荧光分布信息，mn表示方向n上的调制度，pn表示方向n上的条纹的空间频率，
表示方向n上的初相位，H(r)表示点扩散函数，
表示卷积。将三步相移图像组成线性方程组，求解各个方向的0级光谱和相应的空间宽场图像Cn,0(r)，并采用多帧平均的方法去除噪声。对于每个宽场图像，计算以每个像素为中心的大小为5x5的范围内的荧光强度之和，然后得到每个框内第一个照明方向的强度和与其他方向的强度和的比值作为标定参数：
其中n＝2和3。根据标定参数，可在后续进行7帧超分辨重建中直接从第1个方向获取第2和第3个方向的宽场图像：
Cn,0(r)＝Mn(r)C1,0(r)
另外，在每次标定完成之后，后续实验无需重复标定。
步骤2：对荧光样品进行超分辨成像需要采集7帧结构照明图像，其具体步骤为：
将通过Matlab生成的7幅分辨率为1536*2048的光栅条纹图像载入SLM：
I1,j(r)＝127+128cos(2πp·r+(j-1)·π/3)|j＝1,2,3
I2or3,j(r)＝127+128cos(2πp·r+(j-1)·π/4)|j＝1,2
当相机开始曝光时SLM显示条纹图像，经准直扩束后的照明光产生衍射，利用±1级衍射光在样品焦面上产生干涉，通过干涉条纹对样品信息进行调制。最后被调制的荧光信号被sCMOS相机采集，记为
当n＝1时，j＝1，2，3，
当n＝2或3时，j＝1，2，
步骤3：利用调制分配的空间滤波器去除离焦背景与无效信息，其具体步骤为：
根据步骤2中采集到的照明方向1的相移图像计算调制度图像，
利用调制度图像的直方图选取一个公共期望的阈值对原始图像进行修正，阈值被选定为调制直方图峰值的两倍。
步骤4：分别对三个照明方向分别进行频谱分离，其具体步骤为：
步骤4.1：对于步骤2中采集到的原始图像在傅里叶空间可以表示为：
其中k表示频率坐标，～表示原始对象的傅里叶变换，
表示光学传递函数。
对方向1求解方程组
求解结果记为
和
步骤4.2：再将
与步骤1中的标定参数结合，得到
并构建新的方程组并求解得到所有的频谱分量：
步骤5：利用从粗到精的加速相关算法进行参数估计修正高频信息，并利用广义维纳滤波进行超分辨重建，其具体步骤为：
步骤5.1：将步骤4中获得的高频信息
整像素移动到中心位置，并对移动后的1级谱和0级谱进行反卷积，以消除光学传递函数的影响，得到
和
然后选取
和
之间的一个公共区域(半径为光学传递函数半径的85％的圆相交的区域)，并对其进行相关计算：
通过改变ps大小构建一个小范围内的相关分布(包含九个整像素位置ps,x or y＝0,±1和四个亚像素位置ps,x or y＝±0.5，其中x和y表示水平和数值分量)，并通过质心算法计算出该分布的质心坐标
将该坐标作为粗估计；
步骤5.2：用步骤5.1的质心坐标pc作为初始估计点，将1级谱小步水平平移，并计算其与0级谱的相关值，定位最大相关峰：
其中p's表示像素位移量，p's,y＝pc,y,p's,x∈[-0.5+pc,x,0.5+pc,x]，p's,y和p's,x分别表示y和x方向的平移量，pc,y和pc,x分别表示质心的y、x坐标；argmax表示寻找最大值。然后从
开始，沿着垂直方向进行相同的操作，即
直至定位出亚像素波矢。利用估计的亚像素波矢将1级谱移到正确的位置，通过复线性回归得到初始相位和调制度：
其中angle表示取幅值的操作。
步骤5.3：利用估计出的照明参数对原始频谱分量进行修正；
步骤5.4：利用广义维纳滤波对各个频谱分量进行加权平均重组，最后进行傅里叶逆变换得到超分辨图像
其中ifft表示傅里叶逆变换，u＝0,±1，pn表示方向n的条纹空间频率，
表示光学传递函数
的共轭，ω表示维纳常数，A(k)表示切趾函数，用来抑制高频伪影。
实验例
为验证本发明的有效性，搭建了一套基于SLM的双光束干涉式系统，如图1所示，该系统主要包含一台PCO edge5.5相机，一台奥林巴斯IX73倒置荧光显微镜，一台QXGA-3DM铁电液晶空间光调制器，三台Coherent激光器(405，488，561nm)及其他光学元件。使用Dell计算机(Intel(R)Core(TM)i7-9700 CPU)进行硬件控制，MATLAB完成超分辨算法重建。最终可实现成像速度达33HZ，成像空间分辨率为100nm。
实验结果如图3所示，通过60x/1.42NA的油浸物镜观察COS-7细胞，主要包括细胞核、线粒体、肌动蛋白等细胞器。从图a显示的宽场图像中可以看出，由于样品散射造成的离焦严重影响了成像质量。图b显示了未标定荧光光强将会给重建结果带来严重的伪影，这是由于不同照明方向的荧光不匹配导致的，而这些伪影通过标定可以很好的去除。此外，由于调制度分配滤波的预处理，我们的方法获得的重建结果质量优于传统方法，对于COS-7细胞中的肌动蛋白，我们的方法获得了最好的对比度。
Claims (7)
1.一种基于加速互相关的7帧结构光照明超分辨图像重建方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤1：搭建基于SLM的双光束干涉式SIM系统并完成荧光光强标定；
步骤2：通过SLM载入7幅相移条纹图像，利用±1级衍射光在样品焦面上产生干涉，通过干涉条纹对样品信息进行调制，采集调制后的荧光图像；
步骤3：利用调制分配的空间滤波器去除离焦背景与无效信息；
步骤4：分别对三个照明方向分别进行频谱分离；
步骤5：采用从粗到精的加速相关算法进行参数估计修正高频信息，利用广义维纳滤波进行超分辨图像重建。
2.根据权利要求1所述的基于加速互相关的7帧结构光照明超分辨图像重建方法，其特征在于，所述基于SLM的双光束干涉式SIM系统包括计算机、sCMOS相机、倒置荧光显微镜、三台不同波长的激光器、两个半波片(H1、H2)、铁电液晶空间光调制器(SLM)、偏振分束器(PBS)、空间滤波器、MASK板、两片二向色镜(DM1、DM2)、三片平面反射镜(M1、M2、M3)、四片透镜(L1-L4)，根据荧光样品特定特性选择对应波段的激光照明光，出射激光通过平面镜和二向色镜反射进入空间滤波器，并通过透镜L1完成准直扩束，准直扩束后的激光通过半波片H1改变激光的偏振态使其完全透过偏振分束器(PBS)，并入射到SLM上产生衍射，衍射光被半波片H2改变偏振态并被偏振分束器(PBS)完全反射，由透镜L2聚焦到MASK板上进行滤波，只保留±1级衍射光，±1级衍射光通过透镜L3和透镜L4组成的4F系统进入显微镜主体，被显微物镜收集在样品焦面上产生干涉，形成干涉条纹，发射荧光信号通过二向色镜被相机采集，其中相机和SLM由计算机控制同步触发，干涉条纹频率和方向可由SLM控制。
3.根据权利要求1所述的基于加速互相关的7帧结构光照明超分辨图像重建方法，其特征在于，荧光光强标定的具体方法为：
对于整体荧光分布相对均匀的样品，为获取各向同性的超分辨效果，在三个相隔60°的照明方向上分别采集三步相移图像，具体为：
式中，r表示空间坐标，n表示方向，n＝1,2,3，j表示相移步数，S表示样品的荧光分布信息，mn表示方向n上的调制度，pn表示方向n上的条纹的空间频率，
表示方向n上的初相位，
表示相移量，H(r)表示点扩散函数，
表示卷积；
通过求解三步相移图像组成的线性方程组得到各个方向的0级光谱和相应的空间宽场图像Cn,0(r)，并采用多帧平均的方法去除噪声；
对于每个宽场图像，计算以每个像素为中心的大小为5x5的范围内的荧光强度之和，得到每个框内第一个照明方向的强度和与其他方向的强度和的比值作为标定参数：
4.根据权利要求1所述的基于加速互相关的7帧结构光照明超分辨图像重建方法，其特征在于，通过SLM载入7幅相移条纹图像，利用±1级衍射光在样品焦面上产生干涉，通过干涉条纹对样品信息进行调制，采集调制后的荧光图像的具体步骤为：
将Matlab生成的7幅分辨率为1536*2048的光栅条纹图像载入SLM，具体表示为：
I1,j(r)＝127+128cos(2πp·r+(j-1)·π/3)|j＝1,2,3
I2 or 3,j(r)＝127+128cos(2πp·r+(j-1)·π/4)|j＝1,2
当相机开始曝光时SLM显示条纹图像，经准直扩束后的照明光产生衍射，利用±1级衍射光在样品焦面上产生干涉，通过干涉条纹对样品信息进行调制；
sCMOS相机采集被调制的荧光信号，记为：
当n＝1时，j＝1，2，3，
当n＝2或3时，j＝1，2，
5.根据权利要求1所述的基于加速互相关的7帧结构光照明超分辨图像重建方法，其特征在于，步骤3利用调制分配的空间滤波器去除离焦背景与无效信息的具体步骤为：
对采集到的照明方向1的三步相移图像计算调制度图像，具体计算公式为：
D1,j(r)为相机采集到的方向1的三步相移图像；
利用调制度图像的直方图选取一个公共期望的阈值对原始图像进行修正，其中，阈值被选定为调制直方图峰值的两倍。
6.根据权利要求1所述的基于加速互相关的7帧结构光照明超分辨图像重建方法，其特征在于，步骤4对三个照明方向分别进行频谱分离的其具体步骤为：
步骤4.1：对于步骤2中采集到的原始图像，在傅里叶空间表示为：
其中，
表示原始图像的傅里叶变换，k表示频率坐标，n表示方向，n＝1,2,3，j表示相移步数，
表示样品的低频信息，
和
分别表示样品的高频信息，mn表示方向n上的调制度，pn表示方向n上的条纹的空间频率，
表示方向n上的初相位，
表示相移量，
表示光学传递函数；
对方向1求解方程组
式中，k表示频率坐标，～表示原始对象的傅里叶变换，
表示低频信息，
和
分别表示高频信息，m1表示方向1的调制度，
表示方向1的初相位，
表示光学传递函数，求解结果为
上式中
是方向1的宽场图像，而
包含了方向1上的高频细节信息，且受到调制度m1和初相位
的影响。
步骤4.2：将
与步骤1中的标定参数结合，得到
其中n＝2，3，并构建新的方程组求解得到所有的频谱分量：
其中mn表示方向n的调制度，
表示方向n的初相位，pn表示方向n的条纹空间频率。
7.根据权利要求6所述的基于加速互相关的7帧结构光照明超分辨图像重建方法，其特征在于，步骤5利用从粗到精的加速相关算法进行参数估计修正高频信息，并利用广义维纳滤波进行超分辨重建的具体步骤为：
步骤5.1：将获得的高频信息
整像素移动到中心位置，并对移动后的1级谱和0级谱进行反卷积去除光学传递函数的影响，得到
和
其中
和
分别表示低频信息和高频信息，mn和
分别表示方向n的调制度和初相位；
选取
和
之间的一个公共区域，并对公共区域进行相关计算：
其中，ps表示位移量，mn表示方向n的调制度，
表示方向n的初相位，
表示低频信息
的共轭，
表示高频信息；
通过改变ps构建一个小范围内的相关分布，利用质心算法计算出相关分布的质心坐标
将质心坐标作为粗估计；
步骤5.2：用质心坐标pc作为初始估计点，将1级谱小步水平平移，并计算1级谱小步水平平移与0级谱的相关值，定位最大相关峰：
上式中argmax表示寻找最大值，p's表示像素位移量，且满足：
p's,y＝pc,y,p's,x∈[-0.5+pc,x,0.5+pc,x]
其中p's,y表示y方向的平移量，p's,x表示x方向的平移量，pc,y表示质心的y坐标，pc,x表示质心的x坐标；
从
开始，沿着垂直方向进行相同的操作定位出亚像素波矢，即
其中
和
分别表示x和y方向上的亚像素波矢；
利用估计的亚像素波矢将1级谱移到正确的位置，通过复线性回归得到初相位和调制度：
其中，angle表示取幅值的操作；
步骤5.3：利用估计出的照明参数对原始频谱分量进行修正；
步骤5.4：利用广义维纳滤波对各个频谱分量进行加权平均重组，进行傅里叶逆变换得到超分辨图像
其中ifft表示傅里叶逆变换，u＝0,±1，pn表示方向n的条纹空间频率，
表示光学传递函数
的共轭，ω表示维纳常数，A(k)表示切趾函数。
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| CN202210992210.8A CN115619633A (zh) | 2022-08-18 | 2022-08-18 | 基于加速互相关的7帧结构光照明超分辨图像重建方法 |
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| CN202210992210.8A CN115619633A (zh) | 2022-08-18 | 2022-08-18 | 基于加速互相关的7帧结构光照明超分辨图像重建方法 |
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2022
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