CN115612642B - 一种广谱降解生物胺的清酒乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种广谱降解生物胺的清酒乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。为了提供一株具有广谱降生物胺能力的清酒乳杆菌，并应用于哈尔滨风干肠中，以控制哈尔滨发酵风干肠中的生物胺含量。本发明提供一种广谱降解生物胺的清酒乳杆菌，于2022年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.25287，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，命名为MDJ6。清酒乳杆菌MDJ6的胞内的单胺氧化酶活力、胞外的单胺氧化酶活力和胞外的二胺氧化酶活力很高，说明该菌株有较强的广谱降胺能力并在风干肠中有一定的降胺潜力。

Description

一种广谱降解生物胺的清酒乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种广谱降解生物胺的清酒乳杆菌及其应用。

背景技术

生物胺是一种含有一个或多个氨基(NH₂)化学结构的低分子量含氮化合物，广泛存在于发酵食品中。生物胺根据其结构可划分为脂肪族胺、芳香族胺或杂环胺。食品中广泛存在的生物胺包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺和亚精胺。这些生物胺通常是以食品中的游离氨基酸作为底物，经食品中的微生物脱羧作用，或醛和酮的胺化和转胺化而形成。食品中生物胺的产生受若干因素的影响，如食品的理化参数(如a_w、pH值)、储存条件(如温度、时间)、生产工艺和生产方式(如发酵、成熟或微生物污染)、脱羧酶阳性微生物的存在、食品原料质量和是否存在大量的可用的游离氨基酸等。食品中生物胺的存在关系到食品质量和安全，它也是是食品腐败的一个有用的指标。

胺氧化酶是一类能够催化胺类氧化脱氨的特殊蛋白质，可作用于单胺、二胺与多胺的伯胺基和仲胺基，将其氧化生成相应的醛、氨和过氧化氢。根据氧化酶含有的辅基不同，可分为含铜胺氧化酶和含黄素胺氧化酶，其中含铜胺氧化酶包括二胺氧化酶(DAO)和伯胺氧化酶(PrAO)，含黄素胺氧化酶包括单胺氧化酶(MAO)和多胺氧化酶(PAO)。少量的生物胺的摄入对人体有益，且会在人体中存在的胺氧化酶的催化下降解。而过度的胺摄入或人体的降解功能缺失则会导致机体急性中毒。因此，如何降低食品中的生物胺含量收到了消费者的广泛关注。

乳酸菌是发酵香肠中常用的发酵剂，它能通过代谢碳水化合物产生乳酸，在提高发酵肉制品风味、色泽和安全性能上表现突出，是功能性发酵剂的重要组成部分。它是最早作为发酵剂应用于发酵肉制品中的一类有益益生菌，能够通过发酵过程中pH值的降低显著抑制腐败菌的生长。有研究表明，部分乳酸菌因缺乏脱羧酶而不产生生物胺，同时能产生胺氧化酶进一步对已存在的生物胺进行降解。生物胺被降解后生成醛、氨和过氧化氢等低毒性产物，并转移至细胞代谢，从而完成生物胺的降解。因此，选择本身没有氨基酸脱羧酶活性且具有胺氧化酶活性的菌株作为发酵剂是风干肠中控制生物胺形成是目前发酵食品降低生物胺最有前景的途径之一。

发明内容

本发明的目的是为了提供一株具有广谱降生物胺能力的清酒乳杆菌，并应用于哈尔滨风干肠中，以控制哈尔滨发酵风干肠中的生物胺含量。

本发明提供一种降解生物胺的清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)，于2022年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCCNo.25287，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，命名为MDJ6。

本发明提供一种含有上述的清酒乳杆菌MDJ6的微生物制剂。

本发明提供一种上述的清酒乳杆菌MDJ6或权利要求2所述的微生物制剂在降解生物胺中的应用。

进一步地限定，所述生物胺包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺。

本发明提供一种上述的清酒乳杆菌MDJ6或上述的微生物制剂在制备发酵香肠制品中的应用。

进一步地限定，所述应用包括哈尔滨风干肠制造领域。

本发明提供一种降解生物胺的方法，将上述的清酒乳杆菌MDJ6接种在含有生物胺的反应液中，37℃条件下，反应4天。

进一步地限定，生物胺包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺。

进一步地限定，色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺的浓度为50mg/L。

有益效果：本发明的清酒乳杆菌MDJ6在培养基中的生物胺降解模拟试验中呈现良好的降生物胺能力，其对色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺和亚精胺分别为0.21％、7.63％、4.05％、2.74％、10.81％、5.15％、2.39％和27.65％；胞外单胺氧化酶活性、胞内单胺氧化酶活性、胞外二胺氧化酶活性和胞内二胺氧化酶活性分别为602.25、619.04、352.81和39.82U/g蛋白；经接种至风干肠中验证，其在风干肠中对色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺和亚精胺均有显著降解效果(P<0.05)，且总生物胺的降解率达60.97％。因此，清酒乳杆菌MDJ6可以作为有降生物胺的功能性发酵剂应用到发酵肉制品中，生产低生物胺发酵肉制品。

【生物保藏】本发明的清酒乳杆菌MDJ6由东北农业大学食品学院自传统发酵风干肠中分离得到，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.25287，保藏日期为2022年7月13日。

附图说明

图1为3株有降解八种生物胺能力的乳酸菌的生物胺氧化酶活力测定结果；

图2为风干肠中接种清酒乳杆菌MDJ6后八种生物胺含量变化。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1.降解生物胺的清酒乳杆菌分离与鉴定

一.清酒乳杆菌的分离与鉴定

(1)MRS肉汤培养基的配制

蛋白胨10.0g，牛肉浸粉8.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，吐温80 1.0g，蒸馏水1000mL，pH5.7±0.2。

(2)清酒乳杆菌的分离

将切碎的风干肠(10g)与9倍体积的无菌生理盐水(90mL)充分混合，放置在4℃下30min，每10min用力摇晃一次，以充分提取细菌。提取液用0.85％(w/v)无菌生理盐水稀释至适当浓度后，接种于在MRS琼脂平板，并于37℃培养48h。随机挑取单菌落并重新在MRS琼脂培养基上划线，划线获得的单菌落即为纯菌株。纯菌株在MRS肉汤中37℃培养18小时后，保存于20％(v/v)甘油中，置于-80℃冰箱中待用。

(3)清酒乳杆菌的鉴定

使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)对所纯化菌株进行16S rRNA扩增。在BLAST程序(https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中将所得核苷酸序列与GenBank数据库中可用的序列进行比较，识别高序列同源性(99％-100％)，以获得菌株的鉴定结果。

二.培养基中清酒乳杆菌对生物胺降解能力的测定

将自风干肠中分离的20株乳酸菌接种至MRS培养基中活化3代后，分别以体积比为2％接种量接种至MRS-BA培养基(在MRS培养基中分别加入50mg/L的色胺、苯乙胺、组胺、酪胺、腐胺、尸胺、亚精胺和精胺)，以不接种菌株的培养基为对照，37℃培养4天。将20种菌液于4℃、6000r/min下离心10min，取0.1mL离心后的菌液于试管中，加入0.9mL 20％TCA溶液提取，遵循GB 5009.208—2016《食品中生物胺的测定》第一法液相色谱法中的酒类及调味品(醋和酱油)方法进行生物胺含量测定。

生物胺降解率的计算方法：

式中：C₀为对照组培养基中的生物胺浓度(mg/L)；C₁为20株试验菌株培养基中的生物胺浓度(mg/L)。

结果：从表1可知，20株乳酸菌中均能不同程度的降低生物胺含量，但大多数菌株在降胺的同时会产生其他生物胺；只有3株乳酸菌(清酒乳杆菌MDJ6、植物乳杆菌SH7和赫伦魏斯氏菌DQ9)对八种生物胺均有强降解能力(广谱降胺特性)且对部分生物胺有较强降解效果(>10％)，如MDJ6对组胺与精胺的降解、DQ9对色胺、苯乙胺、组胺与酪胺的降解、SH7对色胺、苯乙胺与组胺的降解。

表1

三.培养基中胺氧化酶活力测定

培养基中生物胺降解能力较强的3株乳酸菌(清酒乳杆菌MDJ6、植物乳杆菌SH7和赫伦魏斯氏菌DQ9)分别进行胞外与胞内单胺氧化酶(单胺氧化酶MAO试剂盒，南京建成生物工程研究所)和二胺氧化(二胺氧化酶DAO试剂盒，南京建成生物工程研究所)活性检测。3株测试菌株在MRS培养基中活化3代后，于4℃、6000r/min下离心10min，上清液以30％硫酸铵盐析提取蛋白，弃去上清液后将得到的蛋白于等体积PBS中溶解，测定蛋白浓度后于4℃待用，用于测定胞外氧化酶活力；离心后的菌泥用PBS清洗2次后重悬于等体积PBS，加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟0.02mmol/L，冰浴下在超声破碎仪上将细胞打碎，2s开，2s关，交替破碎循环共15min。将破碎的细胞在4℃、13000r/min下离心10min，收集上清液测定蛋白浓度后于4℃待用，用于测定胞内胺氧化酶活力。蛋白含量测定采用BCA蛋白含量测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

结果：对3株具有降结八种生物胺作用的乳酸菌进行胞内和胞外胺氧化酶活性检测，如图1所示。结果表明，三株乳酸菌胞内与胞外均有氧化酶活性，尤其是清酒乳杆菌MDJ6，其胞内的单胺氧化酶活力(619.04U/g蛋白)、胞外的单胺氧化酶活力(602.25U/g蛋白)和胞外的二胺氧化酶活力(352.81U/g蛋白)显著高于其他两株乳酸菌(P<0.05)，且胞内胺氧化酶活性也高于其他两株乳酸菌(39.82U/g蛋白；P>0.05)，说明该菌株有较强的降胺能力并在风干肠中有一定的降胺潜力。

实施例2.清酒乳杆菌微生物制剂的制备

一、将清酒乳杆菌MDJ6的活化：

从保存于-80℃的甘油管内吸取100-300μL清酒乳杆菌CGMCC No.25287菌液，接种至800-1200mL MRS肉汤培养基中，于37℃恒温孵育24-48h；吸取200-500μL孵育后菌液接种至800-1200mL MRS肉汤培养基中，重复这一步骤2-4次得到活化的清酒乳杆菌CGMCCNo.25287菌液。将活化后的菌液高速离心使菌体沉淀，弃去上清后用无菌生理盐水对菌体沉淀进行洗涤并重悬，重复这一步骤2-3次并弃去上清，得到菌体浓度在10⁹-10¹⁰CFU/g的活性菌泥。

二、菌粉生物制剂的制备：

选择脱脂乳液作为冻干保护剂，将上一步得到的菌泥和脱脂乳液按质量比1:10-1:20充分混匀，得到菌体浓度在10⁸-10⁹CFU/mL的清酒乳杆菌MDJ6脱脂乳悬浮液。接着，让该悬浮液在温度37℃的条件下预培养60min，之后将悬浮液置于-80℃冰箱中预冻2-3h，预冻完成后置于真空冻干机中冻干。即得到活菌浓度在10⁸-10¹⁰CFU/g的冻干清酒乳杆菌CGMCCNo.25287菌粉生物制剂。

实施例3.清酒乳杆菌MDJ6菌粉生物制剂用于发酵香肠制品

原料肉经切丁、腌制后，将清酒乳杆菌MDJ6生物制剂菌粉直接按2％添加量添加至原料肉馅料中，斩拌混匀、灌馅，在室温下发酵至成熟，即得含清酒乳杆菌MDJ6生物制剂发酵香肠制品。

实施例4.清酒乳杆菌MDJ6的应用

一、风干肠的制作

(1)原料

瘦肉(猪里脊)4.5kg，肥肉(猪背脂)0.5kg，大麯酒0.15kg，盐0.125kg，亚硝酸钠0.0045kg，绵白糖0.25kg，味素0.075kg，混合调料(世一堂干肠料)0.025kg。

(2)发酵剂制备

将三株生物胺降解能力较强的乳酸菌(清酒乳杆菌MDJ6、植物乳杆菌SH7和赫伦魏斯氏菌DQ9)在MRS培养基中进行两次传代后，于37℃培养18h。4℃、10,000g离心5min后，备用。添加发酵剂时，乳酸菌的添加量为10⁷CFU/g肉馅。

(3)工艺流程

原料肉(剔除淋巴，筋腱，血管等结缔组织)→切丁(1cm³的肉丁)→腌制(加盐和调味料等)→加发酵剂(对照组不添加)→拌馅→灌制(长度20cm，直径3cm)→发酵风干(温度25±2℃，湿度65±5％)。

二、风干肠中生物胺含量的测定

遵循GB 5009.208—2016《食品中生物胺的测定》第一法液相色谱法中水产品和肉类的测定方法进行风干肠中生物胺含量的测定。

结果：图2是接种清酒乳杆菌MDJ6与未接种的风干肠(对照组)在发酵第9天时，风干肠中八种生物胺含量的比较，试验结果表明，该清酒乳杆菌MDJ6具有显著降生物胺的能力(P<0.05),对八种生物胺均有不同程度的降解效果，对色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺的降解率分别为9.97％、20.22％、66.06％、73.55％、100％、56.23％、62.64％和58.60％，且总生物胺降解率达62.91％，具备广谱降胺特性，能够作为降低生物胺含量的发酵剂应用于发酵肉制品的生产。

降解率的公式：

式中：C₂为对照组风干肠中的生物胺浓度(mg/kg)；C₃为试验菌株风干肠中的生物胺浓度(mg/kg)。

Claims (10)

1.一种广谱降解生物胺的清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）MDJ6，其特征在于，于2022年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 25287，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，命名为MDJ6。

2.含有权利要求1所述的清酒乳杆菌MDJ6的微生物制剂。

3.权利要求1所述的清酒乳杆菌MDJ6或权利要求2所述的微生物制剂在降解生物胺中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生物胺包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺。

5.权利要求1所述的清酒乳杆菌MDJ6或权利要求2所述的微生物制剂在制备发酵香肠制品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述的清酒乳杆菌MDJ6接种在发酵香肠制品中，接种量达10⁷ CFU/g发酵香肠制品。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述微生物制剂直接添加至发酵香肠制品中，添加量为2%。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括哈尔滨风干肠制造领域。

9.一种降解生物胺的方法，其特征在于，将权利要求1所述的清酒乳杆菌MDJ6在含有生物胺的反应液中，37℃条件下，反应4天。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，生物胺包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺。

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