CN115595306A - 一种完整视网膜铺片制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种完整视网膜铺片制作方法，可以极大地提高视网膜铺片的制作效率，同时减少了视网膜铺片制作过程中组织的破坏方便定位视网膜各组织(如黄斑等)以及减少制作过程中出现的卷曲，折叠等现象，便利各种后续实验技术的开展。

Description

一种完整视网膜铺片制作方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种视网膜铺片的制作方法。

背景技术

视网膜铺片可应用于多种科学研究，包括视神经节细胞的定量染色，视网膜定位注射，以及各种视网膜组织的电生理研究和免疫组化研究，是眼科体内研究中不可或缺的一环。传统的视网膜铺片方法为：小鼠眼球取出后，沿角膜缘后0.5mm剪开,去掉角膜和晶状体,剥离出视网膜组织，此时的视网膜自然卷曲呈纺锤状，将卷曲的视网膜放置在载玻片上,沿四个方向剪开视网膜并逐渐展平。

传统视网膜铺片制作方法存在诸多不足：视网膜做四叶草切瓣后，翻转至神经纤维层朝上的步骤可能会导致四瓣扇形视网膜组织不同程度的卷边或堆叠；视网膜切开后，破坏了视网膜组织上的血管，使得定位视网膜各部位的难度较大，研究者需要付出大量时间和精力去分辨视网膜铺片中组织的位置，这将极大地降低了后续观察研究的效率；视网膜切开后，在组织病理学和分子生物学实验中将不利开展。比如载玻片上滴抗体混合液及清洗液时常因液面张力等因素四瓣视网膜发生卷曲或者翻转，免疫染色实验常常因此而失败。

因此，为保证后续研究的顺利开展，本领域需要一种能够保持视网膜完整的高效率视网膜铺片制作方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种完整视网膜铺片的制作方法，可以极大地提高视网膜铺片的制作效率，同时减少了视网膜铺片制作过程中组织的破坏方便定位视网膜各组织(如黄斑等)以及减少制作过程中出现的卷曲，折叠等现象，便利各种后续实验技术的开展。

具体地，本发明提供了一种完整视网膜铺片制作方法，包括如下步骤：(1)解剖眼球，将视网膜组织调整至神经纤维层朝上浸泡在培养基中；(2)将载玻片直接沿远离视网膜组织的培养皿边缘放入，调整位置；(3)吸除培养基；(4)展平的视网膜植片贴在载玻片上，维持该状态一段时间。

在某些实施方式中，所述步骤(1)中培养基量液面要深于载玻片厚度。

在某些实施方式中，所述培养基含有胰岛素，孕酮溶液(progesterone)，亚硒酸钠(sodium selenite)，甲状腺素T3，毛喉素(Forskolin)，乙酰半胱氨酸，BDNF，CNTF，FGF，GNTF等，成分也可根据实验需求进行调整。

在某些实施方式中，所述步骤(2)中将载玻片直接移动至视网膜组织正下方.

在某些实施方式中，所述步骤(3)中吸除培养基采用多次少量的方式。进一步地，每次吸除后用虹膜恢复器缓慢调整视网膜组织的位置和展开卷边的视网膜边缘，保证每下调一次液面，视网膜组织卷起的周边都被展平。

在某些实施方式中，所述步骤(4)中维持该状态的时间30s以上。进一步地，维持该状态的时间可以为2min左右。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1)视网膜铺片的制作效率更高：传统视网膜铺片为了防止视网膜瓣组织卷曲，需要将视网膜铺片视神经纤维层向下贴合培养皿底部，在做剪开操作后为了观察RGC通常需要将视网膜铺片翻转为视神经纤维层向上再做处理，在这个过程中，经常会发生视网膜铺片的向上卷曲和堆叠。而本发明制作视网膜铺片采用“少量多次”的方式吸除培养基，每次吸除后逐步调整视网膜组织的位置和视网膜边缘的方式，免去了剪开和翻转等工序。同时，由于本发明制作的视网膜铺片操作者更易于把控而操作速度更快，因此本发明制作的视网膜铺片将极大地提高制作效率。

2)更易定位：传统视网膜铺片在切割后，四瓣状的视网膜组织破坏了视网膜原有的血管组织，使得定位黄斑等部位变得困难，而本发明在解剖眼球后不采取切开视网膜组织的方式，而是采用利用培养基液体张力逐步达到展平视网膜的效果，保留了完整的视网膜结构，根据血管走行，极大地降低了定位黄斑等部位的时间和难度，缩短了视网膜铺片后续研究的时间。

3)更利于其他实验的开展：在组织病理学和分子生物学实验中，传统的视网膜铺片由于4片视网膜组织瓣的结构，各种液体试剂更易使其发生卷曲和变形，对上述实验的开展造成一定的影响。而本发明的铺片中完整的视网膜结构，在定型后，较难发生卷曲和变形，这为后续实验的顺利开展奠定了基础。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著：

图1传统视网膜铺片和本发明视网膜铺片的示意图。

图2本发明铺片制作流程

图3本发明视网膜铺片示意图(X10，共聚焦显微镜)

图4传统视网膜铺片(X4)

图5小鼠视神经钳夹伤后7天视网膜铺片单位面积内的RGC数。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另作定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

改良小鼠全视网膜铺片制作方法

本发明提供的改良小鼠全视网膜铺片制作方法主要分为4个步骤：

(1)解剖眼球后将视网膜组织调整至神经纤维层朝上浸泡在培养基中，培养基量液面要深于载玻片厚度(图2A)。

(2)随后将载玻片直接沿远离视网膜组织的培养皿边缘放入，调整位置，将载玻片直接移动至视网膜组织正下方(图2B)。

(3)多次少量的吸除培养基，每次吸除液体后用虹膜恢复器调整视网膜组织的位置和展开卷边的视网膜边缘；这一步一定要缓慢并且保证每下调一次液面，视网膜组织卷起的周边都被展平(图2C)。

(4)吸出培养皿内所有培养基，展平的视网膜植片贴在载玻片上，维持该状态2min(图2D)。

实验鼠为C57BL/6小鼠。实验鼠的年龄可为任意年龄段。

步骤(1)中，培养基含有胰岛素，孕酮溶液(progesterone)，亚硒酸钠(sodiumselenite)，甲状腺素T3，毛喉素(Forskolin)，乙酰半胱氨酸，BDNF，CNTF，FGF，GNTF等，成分也可根据实验需求进行调整。在用培养基浸泡视网膜组织之后，应当用镊子轻轻调整位置，将切开分离好的视网膜组织视神经纤维层朝上放置。

步骤(2)中，在放置载玻片时，培养皿一定要深度超过载玻片的厚度，目的是调整载玻片位置的同时不破坏视网膜组织。同时放置载玻片需从远离视网膜组织的一段缓慢放入，避免视网膜组织翻转。每张视网膜的取材一般为小鼠角膜缘后1mm剪开的杯型视网膜组织。但也可以根据实验需要稍作调整。

步骤(3)中，需要多次吸除少量培养基，并在每次吸除培养基后都用虹膜恢复器轻柔的展开视网膜并调整位置。目的是为了保证液面和杯型视网膜组织底部的距离差距逐步缩小，液面的张力会逐步压平视网膜组织使视网膜组织底部与载玻片表面贴合地更紧密。注意需要每次吸除培养基后都需用虹膜恢复器轻柔调整视网膜，因为每次吸除培养基后由于培养基的流动均可能导致视网膜移位，而且每次液面的下降均有可能导致视网膜组织卷边和翻转折叠。

步骤(4)中，必须吸除所有的培养基促使其视网膜铺片与载玻片表面紧密贴合，这可以防止视网膜铺片向上卷曲。最好吸除培养基后静置2min定型视网膜铺片后，再进行固定处理，这是为了防止视网膜铺片在固定液中翻转折叠。

以下结合具体实施例对本发明的铺片制作方法及其效果进行阐述。

实施例1完整视网膜铺片制作

1.1完整视网膜铺片的制作及观察

实验动物选用C57/BL6小鼠，体重20至40g，眼部检查无异常采用腹腔注射过量6％水合氯醛处死动物,利用显微剪及显微镊,取出眼球。

(1)沿角膜缘后0.5mm剪开眼球，去掉角膜和晶状体，暴露出眼杯。左手用显微镊夹巩膜,右手用显微剪在对侧分离视网膜。直至在视盘处将视网膜与其下面紧贴的组织剪开，分离出纺锤状视网膜。准备灭菌的载玻片和10cm直径的培养皿，培养皿中加入15ml的培养基，将卷曲的视网膜放置在培养皿中，先将卷曲的视网膜组织在培养基液体中轻柔的展开至杯型，并用无齿镊轻柔的调整杯型视网膜组织至杯尖正下方朝向(图2A)。

(2)将载玻片沿远离视网膜组织的培养皿边缘轻轻放入，并用镊子轻柔的调整位置，将载玻片直接移动至视网膜组织正下方(图2B)。

(3)每次用移液器吸除1ml培养基，每次吸除培养基后用虹膜恢复器调整视网膜组织的位置和保持杯尖正下方朝向，直至再一次吸除1ml培养基时，视网膜组织的杯尖开始贴合载玻片表面展平，整个视网膜组织开始呈碗装，接下来每一次吸除1ml培养基时，均利用虹膜恢复器展开卷边的视网膜边缘；这一步一定要缓慢且轻柔。直至吸出培养皿内所有培养基，全部展平的视网膜植片贴在载玻片上(图2C)，维持该状态2min定型，在视网膜铺片周围在显微镜下用棉签擦干，并用免疫组化笔划圈以隔绝水渍及方便各类染色处理，在免疫组化圈中滴入100ul 4％多聚甲醛固定24小时以上即可染色后进行下一步观察(图2D)。可用于拍片,视网膜平整,满足拍摄照片的需要。完整视网膜铺片观察示例可见图4。

1.2传统视网膜铺片的制作及观察

传统视网膜铺片示例：实验动物选用C57/BL6小鼠，体重20至40g，眼部检查无异常采用腹腔注射过量6％水合氯醛处死动物,利用显微剪及显微镊,取出眼球。

(1)沿角膜缘后0.5mm剪开眼球，去掉角膜和晶状体，暴露出眼杯。左手用显微镊夹巩膜,右手用显微剪在对侧分离视网膜。直至在视盘处将视网膜与其下面紧贴的组织剪开，分离出纺锤状视网膜。

(2)将卷曲的视网膜组织放在载玻片上，沿鼻上，鼻下，颞上，颞下四个方向剪开视网膜并用镊子轻柔的调整位置，逐渐展平。

(3)全部展平的视网膜植片贴在载玻片上，维持该状态2min定型，在视网膜铺片周围在显微镜下用棉签擦干，并用免疫组化笔划圈以隔绝水渍及方便各类染色处理，在免疫组化圈中滴入100ul 4％多聚甲醛固定24小时以上即可染色后进行下一步观察，传统视网膜铺片观察示例可见图3。

由图3和图4的对比可以看出，本发明的视网膜铺片制作方法相对于传统方法保留了完整的视网膜结构，能够极大降低了定位黄斑等部位的时间和难度，缩短视网膜铺片后续研究的时间。

实施例2完整视网膜铺片中视网膜神经节细胞观察

本发明较之传统视网膜铺片的更为完整，能轻易的通过血管形态定位，且不易卷曲，目前该发明已经应用于本课题组中观察视网膜神经节细胞(RGC)的实验研究(图5)。

2.1分组

为观察SCGF-β(重组人干细胞生长因子-β)在小鼠视神经钳夹模型下，在体内对小鼠RGC的保护效果，将15只20g左右的C57BL/6小鼠随机分为3组，每组5只均用于制作视网膜铺片(所有小鼠均为右眼进行手术操作)：假损伤组为对照组；视神经钳夹伤组标为损伤组；视神经钳夹伤小鼠玻璃体腔注射2μL SCGF-β为SCGF-β处理组；三组均在处理7天后摘取眼球制作全视网膜铺片进行RBPMS和Hochest免疫荧光染色，共聚焦显微镜下计算各组RBPMS阳性细胞的单位面积数量。小鼠用麻醉处死，取出右侧眼球，解剖眼球后调整视网膜位置，将视网膜组织神经纤维层朝上展开浸泡在培养基中，随后将载玻片直接沿培养皿边缘放入，调整位置，将载玻片直接移动至视网膜组织正下方。吸除培养基，并用虹膜恢复器调整视网膜组织的位置和展开卷边的视网膜边缘(分多次进行)。吸除培养液，使视网膜铺片下沉，促使展平的视网膜植片贴在载玻片上，等待2min使之定型。

2.2免疫染色和RGC计数观察

视网膜用RBPMS兔抗小鼠一抗(1:100)对铺片中的RGC进行免疫荧光染色，荧光显微镜下观察以每400μm2内RBPMS阳性细胞的数量为指标评价药物的作用效果，计算细胞的数量并进行统计。

2.3结果

在共聚焦显微镜下计算各组RBPMS阳性细胞的单位面积数量。RBPMS免疫荧光染色结果示：玻璃体腔给药后第7天，结果显示，SCGF-β处理后神经钳夹损伤7天的RBPMS阳性细胞覆盖率上升。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这中叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.一种完整视网膜铺片制作方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)解剖眼球，将视网膜组织调整至神经纤维层朝上浸泡在培养基中；(2)将载玻片直接沿远离视网膜组织的培养皿边缘放入，调整位置；(3)吸除培养基；(4)展平的视网膜植片贴在载玻片上，维持该状态一段时间。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养基量液面要深于载玻片厚度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中将载玻片直接移动至视网膜组织正下方。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中吸除培养基采用多次少量的方式。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，每次吸除后用虹膜恢复器缓慢调整视网膜组织的位置和展开卷边的视网膜边缘，保证每下调一次液面，视网膜组织卷起的周边都被展平。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中维持该状态的时间30s以上。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，维持该状态的时间为2min左右。

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