CN115594655A - 色酮肟类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

色酮肟类衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一系列色酮肟类衍生物及其制备方法和应用。本发明所述的色酮肟类衍生物由色酮羧酸类衍生物和苯磺酸基哌嗪类衍生物在缩合剂存在的条件下进行缩合反应得到中间体，然后将该中间体与对甲苯磺酸在醇类溶剂中反应，再加入盐酸羟胺进行肟化反应，制得相应的目标化合物粗品。申请人的试验结果表明，本发明所述色酮肟类衍生物对IDO1酶具有显著的抑制活性，部分衍生物的抗癌活性高、靶向性强且毒性低，有望用于治疗肿瘤、阿尔茨海默病、抑郁症、白内障等多种疾病，具有很好的潜在药用价值。

Description

色酮肟类衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及色酮肟类衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
色酮是一类具有苯甲酰化γ-吡喃环的重要的含氧杂环化合物，属于酮类化合物。天然的色酮类衍生物在自然界中广泛存在，具有抗菌、抗溃疡、抗氧化、免疫调节、抗HIV、抗炎和抗癌(Keri R.S.,Budagumpi S.,Pai R.K.,et al.Chromones as a privilegedscaffold in drug discovery:A review.Eur.J.Med.Chem,2014,45(27):340–374.)等多种生物活性。近年来，色酮作为抗癌剂而大受关注，其被报道是TNF-α信号通路、NF-κB、CDK1、P13K抑制剂及微管稳定剂(Gaspar A.,Matos M.J.,Garrido J.,et al.Chromone:avalid scaffold in medicinal chemistry.Chem.Rev,2014,114(9):4960–4992.)。此外，色酮可抑制单胺氧化酶活性，后者参与恶性前列腺癌细胞转移和肿瘤的发展。
含有天然或合成物质的肟类化合物是一类重要的生物活性化合物，已有的研究表明，肟类衍生物具有杀虫、杀菌、抗菌、抗结核和抗癌等活性，但目前尚未有将肟功能团引入色酮结构母核，以IDO1为靶点，在色酮2-位上引入其他基团以获得抗癌活性高、靶向性强和毒性低的新型IDO1小分子色酮肟类抑制剂的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一系列结构新颖的色酮肟类衍生物，以及它们的制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
本发明所述的色酮肟类衍生物为具有下述式10所示结构的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003850072340000011
其中，R1为C1～4的烷基或C1～4的烷氧基；R2为卤原子、硝基、C1～4的烷基、C1～4的烷氧基或C1～4的全氟烷基，R2的取代位置为2位、3位和4位中的一种或两种以上。
上述化合物中，R1进一步优选为甲基或甲氧基；R2进一步优选为卤原子、硝基、甲基、甲氧基或三氟甲基，R2的取代位置为2位、3位和4位中的一种或两种以上。更为优选的，R1为OCH3或CH3；R2为4-CH3、4-NO2、4-OCH3、4-CF3、2-CH3、3-Br、4-F、4-Br、3-NO2、3-F、2-CF3、3,4-Cl、3,4-F、3,4-OCH3、4-Cl或2-Cl。在一些优选的实施例中，当R1为OCH3时，R2为4-CH3、4-NO2、4-OCH3、4-CF3、2-CH3、3-Br、4-F、4-Br、3-NO2、3-F、2-CF3、3,4-Cl、3,4-F、3,4-OCH3、4-Cl或2-Cl；当R1为CH3时，R2为4-OCH3、4-F、4-Br、3-NO2、3,4-F、3,4-OCH3或4-Cl。
上述式10所示结构化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)取下述式4所示化合物和式8所示化合物置于有机溶剂中，在缩合剂存在的条件下进行缩合反应，得到式9所示化合物；
Figure BDA0003850072340000021
其中，R1为C1～4的烷基或C1～4的烷氧基；R2为卤原子、硝基、C1～4的烷基、C1～4的烷氧基或C1～4的全氟烷基，R2的取代位置为2位、3位和4位中的一种或两种以上；
2)取对甲苯磺酸和式9所示化合物在醇类溶剂中反应，然后加入盐酸羟胺进行肟化反应，制得相应的目标化合物粗品。
上述制备方法中，涉及的原料式4所示化合物为色酮羧酸类衍生物，可参考现有文献(Cagide Fernando,Oliveira Catarina,Reis Joana et al.Optimizing theSynthetic Route of Chromone-2-carboxylic Acids:A Step forward to Speed-Up theDiscovery of Chromone-Based Multitarget-Directed Ligands.[J].Molecules,2019,24:undefined.)进行制备，也可自行设计合成路线进行制备，在此不再详述。涉及的原料式8所示化合物为苯磺酸基哌嗪类衍生物，可参考现有文献(梁贵宾.新型萘酰亚胺衍生物的设计、合成及抗肿瘤作用研究[D].广西师范大学,2019.DOI:10.27036/d.cnki.ggxsu.2019.000118.)进行制备，同样也可以自行设计合成路线进行制备。在步骤1)中，所述式4所示化合物和式8所示化合物的摩尔比通常为1：1.1～1.2；在步骤2)中，所述式9所示化合物、对甲苯磺酸和盐酸羟胺的摩尔比通常为1：1～1.2：4～10。
上述制备方法中，R1和R2的优先选择如前所述。
上述制备方法的步骤1)中，所述的有机溶剂具体可以是二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，也可以是N,N-二甲基甲酰胺与选自二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯中的一种或两种以上的组合。申请人的试验结果表明，当有机溶剂为DMF或者含有DMF时，能够更好的溶解反应原料，并获得更高的产率。当有机溶剂中含有DMF时，优选DMF在有机溶剂中的所占的比例≥10v/v％，更优选≥15v/v％。所述有机溶剂的用量以能够溶解参加反应的原料为宜，通常情况下，以1mmol的式4所示化合物为基准，所有参加反应的原料通常用6～20mL的有机溶剂来溶解。
上述制备方法的步骤1)中，所述的缩合剂为现有技术中的常规选择或常规组合，具体可以是选自HATU(2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)、Et3N(三乙胺)、DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)、HOBT(1-羟基苯并三唑)、EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸)中的一种或者它们的组合(如HATU+DIPEA、HATU+Et3N或HOBT+EDCI+Et3N等组合)。所述缩合剂的加入量通常为式4所示化合物摩尔量的2～5倍，优选为3～4.5倍。在本申请中，缩合剂优选采用HOBT+EDCI+Et3N的组合，此时，HOBT、EDCI和Et3N的用量均优选为式4所示化合物摩尔量的1～1.2倍。所述缩合剂可以直接加入，也可以先用有机溶剂溶解后再加入到反应体系中。
上述制备方法的步骤1)中，缩合反应优选是在不加热的条件下进行，通常选择在常温下进行。反应过程中采用TLC跟踪监测反应是否完全。根据申请人的经验，当反应在常温下进行时，反应时间控制在12～18h较为适宜。即得到式9所示化合物。此时得到的是式9所示化合物的粗产物，可对其进行纯化后再用于式10所示结构化合物的制备。具体可采用硅胶柱层析纯化的方式对式9所示化合物进行纯化操作以获得纯化后的化合物。在硅胶柱层析时，洗脱剂优选为由石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为3：1～1：1。进一步的，在上硅胶柱层析之前，可先对反应所得物料进行除杂以减少硅胶柱的负担，具体是对反应所得物料先用乙酸乙酯或二氯甲烷与水进行萃取，收集有机相经洗涤(碳酸钾溶液及饱和食盐水)后无水硫酸钠干燥，再浓缩除去溶剂，所得残余物再上硅胶柱层析。
上述制备方法的步骤2)中，所述的醇类溶剂优选为含1～4个碳原子的醇类溶剂，优选为选自甲醇、乙醇、正丙醇和正丁醇中的一种或两种以上的组合。所述醇类溶剂的浓度优选为70～100v/v％。醇类溶剂的用量以能够溶解参加反应的原料为宜，通常情况下，以1mmol的式9所示化合物为基准，所有参加反应的原料通常用10～15mL的有机溶剂来溶解。
上述制备方法的步骤2)中，对甲苯磺酸和式9所示化合物在醇类溶剂中的反应，以及后续加入盐酸羟胺后的肟化反应均优选是在加热条件下进行，具体可以是在50摄氏度至醇类溶剂的沸点之间进行回流反应，更优选是在60～80℃条件下进行回流反应。反应过程中均采用TLC跟踪监测反应是否完全。该步骤中，优选是将对甲苯磺酸和式9所示化合物分别先用醇类溶剂溶解后再混合在一起进行反应。
上述方法制备得到的是目标化合物的粗品，可采用现有常规的纯化方法对其进行纯化以提高目标化合物的纯度。在本申请中，具体是采用硅胶柱层析以获得纯化后的目标化合物，层析时以二氯甲烷和甲醇组成的混合溶剂为洗脱剂，其中二氯甲烷和甲醇的体积比优选30：1～5：1，更优选为20：1～10：1。
申请人采用酶法和细胞法检测色酮肟类衍生物对IDO1酶的抑制作用，结果表明，上述式10所示结构的化合物对IDO1酶具有显著的抑制活性，因此，本发明还提供上述式10所示结构的化合物或其药学上可接受的盐在制备IDO抑制剂中的应用，更具体是在制备IDO1抑制剂中的应用。
本发明进一步提供一种IDO抑制剂，其中含有上述式10所示结构的化合物或其药学上可接受的盐。
申请人还发现部分色酮肟类衍生物具有良好的抗癌活性，因此，本发明还提供上述式10所示结构的化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明提供了一系列结构新颖的色酮肟类衍生物及其制备方法以及它们的制备方法。申请人的试验结果表明，本发明所述色酮肟类衍生物对IDO1酶具有显著的抑制活性，部分衍生物的抗癌活性高、靶向性强且毒性低，有望用于治疗肿瘤、阿尔茨海默病、抑郁症、白内障等多种疾病，具有很好的潜在药用价值。
附图说明
图1为不含和含有2mM化合物10m碘化铁的紫外光谱。
图2为含有IDO1蛋白的化合物10m的SPR分析图，其中浓度从上到下依次为：25μM、12.5μM、6.25μM、3.12μM、1.56μM、0.78μM；平衡离解常数(KD)值为1.41μM。
具体实施方式
为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中涉及的式4所示化合物参照下述合成路线进行制备：
Figure BDA0003850072340000041
其中，R1为OCH3或CH3；(a)二氧六环，甲醇钠溶液，120℃，20min；(b)盐酸溶液，120℃，40min。
具体的制备方法为：将2'-羟基-4'-甲氧基苯乙酮或2'-羟基-4'-甲氧基苯乙酮(1.16mmol)溶解在2mL的1，4-二氧六环中，然后加入草酸二乙酯(474μL,3.49mmol)和甲醇钠溶液(甲醇钠溶液为甲醇钠溶解在甲醇中所得的溶液，531μL,2.32mmol,25％w/w)，在120℃油浴锅中回流搅拌20min；然后加入盐酸溶液(3mL,18mmol,6mol/L)，继续反应40min；待反应结束后，缓慢加入50mL蒸馏水，并搅拌直至固体析出完全，过滤，收集固体并干燥，之后用二氯甲烷洗涤，再次干燥，得到的固体即为式4所示化合物。下面以4a为例给出其表征数据：
4a：浅灰色固体，0.17g，收率66％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.94(d,J＝8.7Hz,1H),7.22(s,1H),7.09(d,J＝8.8Hz,1H),6.83(s,1H),3.92(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ177.22,164.91,161.97,157.89,154.24,126.75,118.06,115.93,113.77,101.42,56.71.HR-MS(m/z)(ESI)：计算为C11H8O5[M+K]+：259.1355；实测值：259.2824.
以下实施例中涉及的式8所示化合物参照下述合成路线进行制备：
Figure BDA0003850072340000051
其中，(c)二氯甲烷，三乙胺，25℃，30min；(d)二氯甲烷，三氟乙酸，0℃，4h；R2为4-CH3、4-NO2、4-OCH3、4-CF3、2-CH3、3-Br、4-F、4-Br、3-NO2、3-F、2-CF3、3,4-Cl、3,4-F、3,4-OCH3、4-Cl或2-Cl。
具体的制备方法为：
①称取N-Boc-哌嗪(5.0g,26.9mmol)溶于30mL的二氯甲烷中，在冰浴条件下滴加Et3N(2.8mL,30mmol)，然后缓慢滴加溶于二氯甲烷的对甲苯磺酰氯(5.0g,26.8mmol)溶液，常温下搅拌30min，TCL监测反应进程，反应结束后水洗有机层，收集有机层，得到化合物7的粗品溶液；
②在冰浴条件下将化合物7的粗品溶液，加入相当于化合物7摩尔量3倍的三氟乙酸搅拌4h，TLC监测反应进程；反应结束后，浓缩除去多余的三氟乙酸，用碳酸氢钠饱和溶液调pH至7～9，然后用100mL乙酸乙酯萃取，收集有机层，用饱和食盐水洗、干燥后上硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯20：1～5：1，体积比)，分别得到相应的化合物8。下面以8a为例给出其表征数据：
8a：白色固体，5.3g，产率为82％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.60(d,J＝8.2Hz,2H),7.46(d,J＝8.0Hz,2H),2.72(dd,J＝20.4,5.2Hz,8H),2.41(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ144.04,132.25,130.25,128.12,47.16,45.09.HR-MS(m/z)(ESI)：计算为C11H16N2O2S[M+H]+：241.1011；实测值：241.1003.
实施例1
按下述合成路线合成本发明所述的色酮肟类衍生物。
Figure BDA0003850072340000061
(e)有机溶剂，EDCI+HOBT+Et3N，25℃，18～24h；(f)醇类溶剂，盐酸羟胺，12～20h，75～80℃.
a：R1＝OCH3R2＝4-CH3 m：R1＝OCH3 R2＝3，4-F
b：R1＝OCH3 R2＝4-NO2 n：R1＝OCH3 R2＝3，4-OCH3
c：R1＝OCH3 R2＝4-OCH3 o：R1＝OCH3 R2＝4-Cl
d：R1＝OCH3 R2＝4-CF3 p：R1＝OCH3 R2＝2-Cl
e：R1＝OCH3R2＝2-CH3 q：R1＝CH3 R2＝4-OCH3
f：R1＝OCH3 R2＝3-Br r：R1＝CH3 R2＝4-F
g：R1＝OCH3 R2＝4-F s：R1＝CH3 R2＝4-Br
h：R1＝OCH3 R2＝4-Br t：R1＝CH3 R2＝3-NO2
i：R1＝OCH3 R2＝3-NO2 u：R1＝CH3 R2＝3，4-F
j：R1＝OCH3 R2＝3-F v：R1＝CH3 R2＝3，4-OCH3
k：R1＝OCH3 R2＝2-CF3 w：R1＝CH3 R2＝4-Cl
I：R1＝OCH3 R2＝3，4-Cl
具体的制备方法为：
1)取式4所示化合物(0.25mmol)和式8化合物(0.26mmol)溶于5mL有机溶剂(化合物9a～9r采用的有机溶剂均为DMF，化合物9s～9v采用的有机溶剂均为乙酸乙酯和DMF按4：1组成的混合溶剂，化合物9w采用的有机溶剂为二氯甲烷)中，然后向其中加入HOBT(36mg，0.26mmol)、Et3N(38μL，0.28mmol)和EDCI(53mg，0.28mmol)，在室温条件下搅拌反应，TCL监测反应进程(反应时间约为18～24h)。反应结束后，加入15mL乙酸乙酯(在制备9w时用二氯甲烷代替乙酸乙酯)和5mL蒸馏水萃取，收集有机相依次用1mol/L K2CO3溶液以及饱和食盐水洗涤并干燥，浓缩除去溶剂得到固体；所得固体通过硅胶柱层板(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇，3：1～1：1，体积比)，得到相应的式9所示化合物。下面以9a为例给出其表征数据：
9a：白色固体，0.42g，产率39％。1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ 7.93(d，J＝8.9Hz，1H)，7.64(d，J＝8.3Hz，2H)，7.48(d，J＝7.9Hz，2H)，7.16(d，J＝2.4Hz，1H)，7.09(dd，J＝8.8，2.4Hz，1H)，6.49(s，1H)，3.89(s，3H)，3.67(d，J＝31.0Hz，4H)，2.99(d，J＝26.6Hz，4H)，2.42(s，3H).13C NMR(151MHz，DMSO-d6)δ176.22，164.64，160.81，157.75，157.22，144.40，132.45，130.48，128.08，126.79，117.92，115.67，111.31，101.47，46.29，45.79，21.52.HR-MS(m/z)(ESI)：计算为C22H22N2O6S[M+H]+：443.1199；实测值：443.1270.
2)取对甲苯磺酸(3mmol)溶于50mL的甲醇(100v/v％)中，得到溶液A；取式9所示化合物(3mmol)溶于50mL的醇类溶剂(化合物9a～9i采用的有机溶剂均为100v/v％甲醇，化合物9m～9w采用的有机溶剂均为70v/v％乙醇)中，得到溶液B；向溶液A中加入溶液B，在回流条件下，先搅拌1h，然后加入盐酸羟胺(12.5mmol)继续回流反应，TCL监测反应进程(反应时间约为12～20h)。反应完成后，浓缩得到固体，所得固体通过硅胶柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇，30：1～5：1，体积比)，得到相应的式10所示目标化合物。各目标产物及其表征如下：
Figure BDA0003850072340000071
(Z)-(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)(4-甲苯磺酰哌嗪-1-基)甲酮(10a)：白色固体，产率：41％，熔点:219.5–221.3℃，纯度99.30％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.91(s,1H),7.74(d,J＝8.8Hz,1H),7.64(d,J＝8.3Hz,2H),7.47(d,J＝8.5Hz,2H),6.89(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),6.82(d,J＝2.5Hz,1H),6.70(s,1H),3.80(s,3H),3.64(t,J＝5.0Hz,4H),2.97(t,J＝5.1Hz,4H),2.42(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ161.78,161.61,152.04,149.04,144.39,141.15,132.42,130.46,128.06,123.79,114.02,47.04,45.20,56.16,21.52.HR-MS(m/z)(ESI)：计算为C22H23N3O6S[M+H]+:458.1380；实测值：458.1384.
Figure BDA0003850072340000072
(Z)-(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)(4-((4-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲酮(10b)：黄色固体，产率：38.3％，熔点：202.3–203.3℃,纯度：99.39％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.93(s,1H),8.46(d,J＝8.8Hz,2H),8.03(d,J＝8.8Hz,2H),7.74(d,J＝8.8Hz,1H),6.89(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.81(d,J＝2.5Hz,1H),6.71(s,1H),3.80(s,3H),3.65(s,4H),3.09(s,4H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ161.77,161.62,151.63,151.25,141.23,141.14,129.61,125.30,123.82,114.00,111.74,101.88,99.97,56.15,46.29,45.74,42.45.HR-MS(m/z)(ESI)：计算为C21H20N4O8S[M+H]+：489.1075；实测值：489.1076.
Figure BDA0003850072340000081
(Z)-(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)(4-((4-甲氧基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲酮(10c)：白色固体，产率：50.8％，熔点：213.3–215.2℃,纯度：97.66％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.92(s,1H),7.74(d,J＝8.8Hz,1H),7.68(d,J＝8.9Hz,2H),7.17(d,J＝8.9Hz,2H),6.89(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.82(d,J＝2.5Hz,1H),6.71(s,1H),3.86(s,3H),3.80(s,3H),3.65(t,J＝5.0Hz,4H),2.96(t,J＝5.0Hz,4H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ162.31,160.71,160.53,150.97,147.97,140.09,129.21,125.66,122.72,114.07,112.94,110.66,100.79,98.16,55.13,55.08,45.54.HR-MS(m/z)(ESI)：计算为C22H23N3O7S[M+H]+：474.1329；实测值：474.1336.
Figure BDA0003850072340000082
(Z)-(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)(4-(((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲酮(10d)：白色固体，产率：48.3％，熔点：128.4–129.5℃,纯度：93.41％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.93(s,1H),8.09–7.95(m,4H),7.74(d,J＝8.9Hz,1H),6.94–6.69(m,3H),3.80(s,3H),3.66(s,4H),3.09(s,4H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ162.31,160.71,160.53,150.97,147.97,140.09,129.21,125.66,122.72,114.07,112.94,110.66,100.79,98.16,55.13,55.08,45.54.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C22H20F3N3O6S[M+H]+:512.1098；实测值：512.1108.
Figure BDA0003850072340000083
(Z)-(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)(4-(邻甲苯磺酰基)哌嗪-1-基)甲酮(10e)：白色固体，产率：48.3％，熔点：213.4–214.4℃,纯度：98.35％.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.92(s,1H),7.98–8.93(m,2H),7.77–7.70(m,2H),6.89(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),6.83(d,J＝2.5Hz,1H),6.74(d,J＝1.0Hz,1H),3.81(s,3H),3.72–3.62(m,4H),3.10(t,J＝5.0Hz,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ161.76,161.63,150.93,149.71,145.97,140.52,138.00,136.05,133.60,132.39,129.65,127.39,123.83,114.00,111.78,102.30,99.32,55.49,45.73,45.28.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C22H23N3O6S[M+H]+:458.1380；实测值：458.1387.
Figure BDA0003850072340000091
(Z)-(4-((3-溴苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)甲酮(10f)：白色固体，产率：37.8％，熔点：170.3–171.3℃,纯度：94.10％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.94(d,J＝8.0Hz,1H),7.82(d,J＝9.3Hz,1H),7.75(dd,J＝8.8,5.3Hz,1H),7.62(dd,J＝26.3,7.8Hz,1H),7.48–7.45(m,1H),6.90(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),6.84(dd,J＝21.1,2.6Hz,1H),6.73(d,J＝29.1Hz,1H),3.81(s,3H),3.65(s,4H),3.17(s,2H),2.58(s,2H),2.42(s,1H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ160.69,160.50,150.94,148.61,147.91,140.06,136.77,134.42,132.67,132.41,129.33,128.96,125.91,122.66,112.93,110.63,101.61,98.56,54.43,39.36,19.01.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C21H20BrN3O6S[M+Na]+:544.0418；实测值：544.0413.
Figure BDA0003850072340000092
(Z)-(4-((4-氟苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)甲酮(10g)：白色固体，产率：37.8％，熔点：210.6–212.3℃,纯度：99.41％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.93(s,1H),7.83(dd,J＝8.9,5.1Hz,2H),7.74(d,J＝8.8Hz,1H),7.51(d,J＝8.8Hz,2H),6.89(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.83(d,J＝2.5Hz,1H),6.72(s,1H),3.80(s,3H),3.66(s,4H),3.02(s,4H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ165.03,163.36,160.72,160.55,151.57,147.98,140.51,130.78,130.03,123.46,116.27,116.12,113.64,110.68,101.44,98.56,59.16,53.94,46.12,44.73,40.41.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C21H20FN3O6S[M+H]+:462.1130；实测值：462.1128.
Figure BDA0003850072340000101
(Z)-(4-((4-溴苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)甲酮(10h)：白色固体，产率：42.6％，熔点：241.6–242.6℃,纯度：99.38％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.93(s,1H),7.89(s,1H),7.75(d,J＝8.8Hz,1H),7.70–7.67(m,2H),6.89(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.83(d,J＝2.5Hz,1H),6.74(s,1H),3.89(s,1H),3.80(s,3H),3.66(t,J＝5.2Hz,4H),3.03(t,J＝5.1Hz,4H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ160.71,160.55,150.99,140.09,133.73,132.05,128.92,126.92,122.74,112.94,110.68,100.81,98.20,55.61,54.71,46.74,44.64,41.50.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C21H20BrN3O6S[M+Na]+:544.0418；实测值：544.0413.
Figure BDA0003850072340000102
(Z)-(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)(4-((3-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲酮(10i)：白色固体，产率：36.6％，熔点：234.9–236.6℃,纯度：95.93％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.92(s,1H),8.63(d,J＝8.3Hz,1H),8.44(s,1H),8.25(d,J＝7.7Hz,1H),8.02(t,J＝8.0Hz,1H),7.79(d,J＝8.8Hz,1H),6.94(d,J＝6.3Hz,1H),6.86(s,1H),6.76(s,1H),3.85(s,3H),3.72(s,4H),3.16(s,4H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ160.60,160.47,150.88,147.88,147.55,136.05,132.15,130.98,127.35,120.93,112.88,111.25,100.73,96.73,55.00,45.14,44.60,44.34,39.36.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C21H20N4O8S[M+H]+:489.1075；实测值：489.1073.
Figure BDA0003850072340000111
(Z)-(4-((3-氟苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)甲酮(10j)：白色固体，产率：36.6％，熔点：100.7–101.8℃,纯度：99.74％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.94(s,1H),7.74(dd,J＝12.6,8.4Hz,2H),7.66–7.58(m,3H),6.90(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),6.83(d,J＝2.5Hz,1H),6.74(s,1H),3.81(s,3H),3.67(s,4H),3.07(s,4H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ163.23,161.80,161.62,151.28,149.05,142.29,138.73,132.45,125.27,123.81,121.59,115.15,114.00,111.76,101.87,99.95,56.14,46.30,44.76.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C21H20FN3O6S[M+H]+:462.1130；实测值：462.1128.
Figure BDA0003850072340000112
(Z)-(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)(4-(((2-(三氟甲基)苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲酮(10k)：白色固体，产率：40.3％，熔点：119.7–120.9℃,纯度：99.23％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.95(s,1H),8.07(dd,J＝13.8,7.5Hz,2H),7.92(t,J＝6.7Hz,2H),7.75(d,J＝8.8Hz,1H),6.90(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),6.86(d,J＝2.5Hz,1H),6.78(s,1H),3.81(s,3H),3.67(s,4H),3.32(s,4H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ160.78,160.57,151.01,149.03,140.14,136.13,133.04,130.53,128.14,125.83,122.17,112.97,111.47,101.18,98.28,55.09,45.03,41.06.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C22H20F3N3O6S[M+H]+:512.1098；实测值：512.1108.
Figure BDA0003850072340000113
(Z)-(4-((3,4-二氯苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)甲酮(10l)：白色固体，产率：46.7％，熔点：199.7–200.7℃,纯度：95.47％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.93(s,1H),7.97–7.93(m,2H),7.76–7.71(m,2H),6.89(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),6.83(d,J＝2.5Hz,1H),6.74(s,1H),3.80(s,3H),3.66(s,4H),3.09(s,4H).13CNMR(151MHz,DMSO-d6)δ160.67,160.54,150.98,147.98,140.80,136.05,132.02,131.32,128.59,127.05,122.75,112.51,110.69,100.80,98.92,55.08,45.20,43.95,40.38,39.43.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C21H19Cl2N3O6S[M+H]+:512.0444；实测值：512.0443.
Figure BDA0003850072340000121
(Z)-(4-((3,4-二氟苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)甲酮(10m)：白色固体，产率：38.3％，熔点：149.1–150.1℃,纯度：98.61％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.94(s,1H),7.89(t,J＝9.6Hz,1H),7.75(t,J＝8.2Hz,2H),7.65(s,1H),6.90(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),6.83(d,J＝2.5Hz,1H),6.73(s,1H),3.80(s,3H),3.66(s,4H),3.07(s,4H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ160.69,160.55,150.97,149.83,147.98,140.08,131.68,125.43,123.29,118.90,117.00,113.56,110.30,100.81,98.21,54.36,45.68,44.01,40.39,39.43.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C21H19F2N3O6S[M+Na]+:502.0855；实测值：502.0858.
Figure BDA0003850072340000122
(Z)-(4-((3,4-二甲氧基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)甲酮(10n)：白色固体，产率：40.3％，熔点：200.1–201.3℃,纯度：98.27％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.93(s,1H),7.74(d,J＝8.8Hz,1H),7.33(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),7.20(d,J＝8.5Hz,1H),7.16(d,J＝2.2Hz,1H),6.89(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),6.83(d,J＝2.5Hz,1H),6.72(s,1H),3.85(d,J＝9.0Hz,6H),3.80(s,3H),3.65(s,4H),2.99(s,4H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ161.45,160.55,153.61,150.99,149.05,147.99,140.10,126.55,122.23,121.67,114.33,110.84,110.68,109.39,100.79,98.19,55.26,55.22,55.07,45.18,40.43,39.43.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C23H25N3O8S[M+Na]+:526.1255；实测值：526.1261.
Figure BDA0003850072340000131
(Z)-(4-((4-氯苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)甲酮(10o)：白色固体，产率：42.4％，熔点：168.4–169.6℃,纯度：99.31％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.93(s,1H),7.78–7.72(m,5H),6.89(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),6.83(d,J＝2.5Hz,1H),6.73(s,1H),3.80(s,3H),3.65(s,4H),3.03(s,4H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ160.70,160.54,150.98,147.97,140.08,137.84,133.32,129.12,128.87,122.73,112.14,110.68,100.81,98.61,55.08,45.21,44.66,40.40,39.42.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C21H20ClN3O6S[M+Na]+:500.0654；实测值：500.0657.
Figure BDA0003850072340000132
(Z)-(4-((2-氯苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)(4-(羟基亚氨基)-7-甲氧基-4H-色烯-2-基)甲酮(10p)：白色固体，产率：41.6％，熔点：208.1–209.3℃,纯度：99.34％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.05(s,1H),7.78–7.71(m,5H),7.14–7.07(m,2H),6.73(s,1H),3.65(s,4H),3.07(s,4H),2.34(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ161.28,160.56,151.47,148.09,140.13,134.64,134.14,131.82,130.96,130.39,127.34,122.36,112.99,110.10,102.14,98.25,55.09,53.83,44.95,40.56,39.42.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C21H20ClN3O6S[M+H]+:478.0834；实测值：478.0840.
Figure BDA0003850072340000141
(Z)-(4-(羟基亚氨基)-7-甲基-4H-色烯-2-基)(4-((4-甲氧基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲酮(10q)：白色固体，产率：44.2％，熔点：209.5–210.7℃,纯度：98.72％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.05(s,1H),7.72(d,J＝8.1Hz,1H),7.69(d,J＝8.8Hz,2H),7.18(d,J＝8.9Hz,2H),7.11(d,J＝6.5Hz,1H),7.08(s,1H),6.72(s,1H),3.87(s,3H),3.65(s,4H),2.95(s,4H),2.34(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ161.59,161.43,149.70,148.48,140.78,140.22,129.21,126.93,125.69,121.40,116.98,115.31,114.09,99.17,55.14,45.43,45.12,40.45,39.43,20.21.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C22H23N3O6S[M+H]+:458.1380；实测值：458.1384.
Figure BDA0003850072340000142
(Z)-(4-((4-氟苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)(4-(羟基亚氨基)-7-甲基-4H-色烯-2-基)甲酮(10r)：白色固体，产率：40.6％，熔点：173.6–174.6℃,纯度：99.32％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.05(s,1H),7.83(dd,J＝8.9,5.1Hz,2H),7.73(d,J＝8.0Hz,1H),7.52(t,J＝8.8Hz,2H),7.14–7.06(m,2H),6.73(s,1H),3.65(s,4H),3.05(s,4H),2.51(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ163.36,160.76,149.70,148.52,140.42,140.21,130.80,130.09,130.03,125.33,122.03,116.98,116.27,116.12,115.31,96.83,45.76,44.73,40.45,39.43,20.20.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C21H20FN3O5S[M+Na]+:468.1000；实测值：468.1008.
Figure BDA0003850072340000143
(Z)-(4-((4-溴苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)(4-(羟基亚氨基)-7-甲基-4H-色烯-2-基)甲酮(10s)：白色固体，产率：41.7％，熔点：211.1–212.7℃,纯度：97.27％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.05(s,1H),7.89(d,J＝8.6Hz,2H),7.73(d,J＝8.1Hz,1H),7.68(d,J＝8.6Hz,2H),7.12–7.06(m,2H),6.73(s,1H),3.65(s,4H),3.04(s,4H),2.34(s,3H).13CNMR(151MHz,DMSO-d6)δ160.68,149.25,148.00,140.35,140.15,133.67,131.99,128.85,126.85,125.92,122.22,116.91,115.80,99.57,45.11,44.60,40.37,39.36.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C21H20BrN3O5S[M+H]+:506.0380；实测值：506.0396.
Figure BDA0003850072340000151
(Z)-(4-(羟基亚氨基)-7-甲基-4H-色烯-2-基)(4-((3-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)甲酮(10t)：白色固体，产率：38.6％，熔点：222.2–223.2℃,纯度：96.91％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.05(s,1H),8.58(d,J＝9.6Hz,1H),8.38(t,J＝2.0Hz,1H),8.20(d,J＝9.4Hz,1H),7.98(d,J＝8.0Hz,1H),7.72(d,J＝8.1Hz,1H),7.11(d,J＝9.9Hz,1H),6.71(s,1H),3.66(s,4H),3.11(s,4H),2.34(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ160.03,150.04,148.39,147.61,140.93,140.18,136.12,132.88,130.11,127.90,125.99,122.34,121.40,116.95,115.29,98.26,45.13,44.66,40.43,39.42,20.20.HR-MS(m/z)(ESI):calcd for C21H20N4O7S[M+Na]+:495.0945；实测值：495.0809.
Figure BDA0003850072340000152
(Z)-(4-((3,4-二氟苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)(4-(羟基亚氨基)-7-甲基-4H-色烯-2-基)甲酮(10u)：白色固体，产率：42.7％，熔点：162.6–163.6℃,纯度：97.91％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.05(s,1H),7.89(t,J＝7.5Hz,1H),7.74(dd,J＝18.4,9.2Hz,2H),7.65(s,1H),7.13–7.07(m,2H),6.73(s,1H),3.65(s,4H),3.07(s,4H),2.34(s,3H).13CNMR(151MHz,DMSO-d6)δ160.74,152.83,149.82,149.70,148.06,140.43,140.21,131.69,125.99,124.97,122.01,118.42,116.97,116.87,115.31,98.25,59.16,45.26,44.69,40.42,20.21.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C21H19F2N3O5S[M+K]+:502.0645；实测值：502.0642.
Figure BDA0003850072340000161
(Z)-(4-((3,4-二甲氧基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)(4-(羟基亚氨基)-7-甲基-4H-色烯-2-基)甲酮(10v)：白色固体，产率：37.8％，熔点：184.3–185.3℃,纯度：95.99％.1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.05(s,1H),7.72(d,J＝8.0Hz,1H),7.33(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),7.20(d,J＝8.6Hz,1H),7.16(d,J＝2.2Hz,1H),7.11(d,J＝8.3Hz,1H),7.07(s,1H),6.72(s,1H),3.86(d,J＝8.5Hz,6H),3.65(s,4H),2.98(s,4H),2.34(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ160.25,152.06,150.26,148.16,148.07,141.39,140.22,125.98,125.57,121.40,120.28,116.58,115.31,110.85,109.40,97.58,64.43,55.26,45.49,44.86,40.90,39.43,20.20.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C23H25N3O7S[M+H]+:504.1435；实测值：504.1442.
Figure BDA0003850072340000162
(Z)-(4-((4-氯苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)(4-(羟基亚氨基)-7-甲基-4H-色烯-2-基)甲酮(10w)：白色固体，产率：44.3％，熔点：222.8–223.9℃,纯度：96.55％.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.05(s,1H),7.78–7.71(m,5H),7.14–7.07(m,2H),6.73(s,1H),3.65(s,4H),3.07(s,4H),2.34(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ160.75,150.08,148.07,140.42,140.21,138.67,133.33,129.13,128.87,125.98,121.41,115.31,97.87,45.19,44.67,41.48,39.43,20.25.HR-MS(m/z)(ESI):计算为C21H20ClN3O5S[M+H]+:462.0885；实测值：462.0899.
实验例1：色酮肟类衍生物对IDO1抑制活性研究：
1.对IDO1抑制活性研究
1.1实验原理
IDO1是L-Trp沿犬尿氨酸途径(KP)分解代谢的关键酶，作用于KP的第一步，催化L-Trp氧化裂解为N-甲酰犬尿氨酸(NFK)，NFK在甲酰化酶或者酸碱条件下进一步代谢为犬尿氨酸(KYN)，其转化过程如下所示：
IDO1酶活性包括细胞水平的酶活性和非细胞水平的酶活性。两者之间最大的区别是酶的来源不同，一个是IFN-γ刺激细胞产生IDO1酶，一个是直接加入人重组的IDO1酶。但是两者酶活性的表征是一样的，都是通过测L-Trp及其代谢物水平来进行评估。因此，IDO1酶活性可以通过吸光度法测定KYN含量水平来进行评估。NFK在三氯乙酸(TCA)的作用下转化成KYN，KYN可被对二甲氨基苯甲醛(P-DMAB)显色，二者结合生成亮黄色复合物，然后再用酶标仪在480nm下测其吸光度，从而确定酶活性。
几乎所有文献中阳性对照物类似物INCB024360在细胞水平上IDO1酶活性的测定用的都是HeLa细胞，所以本申请中也采用HeLa细胞来进行细胞水平IDO1抑制剂抑制活性的测定。
细胞测定法检测IDO1的实验步骤：将HeLa细胞以每孔1×104的密度接种于96孔培养板中，第二天，将总体积为200μL的培养基(其中包括15μg/mL的L-色氨酸、40ng/mL的人IFN-γ和不同浓度的化合物)添加到细胞中，继续孵育48h后，将140μL上清液与10μL,6.1N三氯乙酸混合，并将混合物在50℃下孵育30min。然后将反应混合物以2500rpm离心10min以除去沉淀物。将100μL上清液与100μL 2％(w/v)对二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，并在480nm处测量。最后用SPSS19.0软件处理数据，计算IC50值。
酶法测定IDO1的实验步骤：根据试剂商提供的说明进行人IDO1酶活性测试。IDO抑制剂IDO5L作为阳性对照。包含50μL反应预混液、10μL纯化的人IDO1、10μL待检测化合物、IDO1检测缓冲液的混合液(90μL)在室温条件下孵育10min，然后加入10μL含1mM的L-色氨酸的基底溶液，使其终体积为100μL，37℃避光孵育45min。加入50μL荧光显影试剂，45℃避光孵育3h。室温冷却1小时后检测荧光强度(Ex/Em＝402/488nm)。根据公式[100-(A/B)100]/100计算抑制百分数，其中A为添加测试化合物的荧光强度，B为不添加测试化合物的荧光强度。化合物对IDO的抑制活性测试与该方法相同。
2.MTT法筛选目标化合物的细胞毒性
2.1实验原理
MTT又名噻唑蓝，是一种可穿过细胞膜进入细胞内的黄色染料。MTT法又称为MTT比色法，该方法是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，而死细胞却无法沉积，而二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪检测其在490nm波长处的吸收值，即可间接反映活细胞数量。
2.2实验步骤
(1)接种细胞：选择对数生长期且细胞状态较好的细胞进行细胞毒性实验。用完全培养基将细胞制成细胞悬液，然后用细胞计数板计数，并且将细胞浓度调整为1×105/mL。将Hela、A549、HCT-116和SW-480这四种细胞悬液用接种到96孔板中，保证每个孔体积为180μL，然后在96孔板的外围一周加入相同体积的PBS，轻晃96孔板，使细胞分布均匀，然后放在细胞培养箱中培养。待细胞长至60～70％，加入待测药物。药物浓度设置五个浓度梯度，各为3个复孔，分别加入20μL用DMEM稀释的药液，保证加入后的最终浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM，阳性对照药物选择IDO1抑制剂1-MT和epacadostat，阴性对照孔中加入与药液相同浓度梯度的含1％DMSO的DMEM培养基。
(2)培养细胞：同一般细胞培养条件，培养48h后，在避光条件下，将提前配制好的MTT(5mg/mL)加入待测的96孔板中，每孔加入20μL，放入培养箱中3.5～4.5h后，用移液枪吸去孔内上清液，然后在避光条件下，每孔加入150μL DMSO，待完全溶解后，继续下一步实验。
(3)比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测量每个孔的吸光度(OD)值，记录结果并根据公式计算细胞生长抑制率：生长抑制率(％)＝(对照OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％。所有实验均重复3次后取平均值。用SPSS19.0软件计算IC50。
3.结果
酶法和细胞法检测IDO1的抑制结果如下述表1所示，化合物10a～10w对Hela、A549、HCT-116和SW-480的抑制结果如下述表2所示。
表1.酶法和细胞法检测10a～10w对IDO1的抑制作用
Figure BDA0003850072340000181
Figure BDA0003850072340000191
表2.化合物10a～10w对细胞的抗肿瘤活性
Figure BDA0003850072340000192
实验例2：化合物10m与IDO1的结合力研究
1.UV-visible spectra检测先导化合物与亚铁血红素的结合
1.1实验原理：
UV-visible spectra研究了化合物10m的结合力。IDO1是一种含有血红素的蛋白质，其特有的结构卟啉具有独特的紫外吸收特性。由于血红素基团的吸收光谱与配体/底物结合时，会对血红素环境极性的变化高度敏感，从而改变了血红素的光谱性质。因此，由IDO1-配体相互作用引起的UV-可见光谱的变化可以用来评估化合物与IDO1的结合情况。
1.2UV-visible spectra实验步骤
紫外可见吸收光谱在Cary 1E UV-Visible的分光光度计上测量，扫描范围为200-700nm。为了保持各样品的温度在25℃下测定，将Haake F3水浴加热装置与分光光度计联用。测量使用1mL的样品磷酸盐缓冲溶液(PBS)水溶液，其中含有10μM纯化的IDO1和25μM的化合物10m。
2.SPR检测目标化合物对IDO1结合亲和力
2.1实验原理
SPR技术利用生物大分子之间的特异性结合进行分子识别，在进行分子间相互作用研究时，其中一种反应物与传感器芯片结合，含有分析物的样品通过蠕动泵以恒定流速通过传感器芯片表面，导致分子浓度发生变化。传感器芯片表面上SPR信号的变化随时间连续绘制，并记录反应过程，将SPR信号的改变以时间对RU连续作图，记录反应过程。因此，SPR技术可以实时动态地反映蛋白质相互作用的缔合和解离速率，获得缔合常数(Kb)和解离常数(Kd)等动力学信息。
2.2实验步骤
用SPR研究了化合物10m与IDO1蛋白的相互作用，用纯化的人IDO1蛋白固定在传感器芯片CM5(GE Healthcare)上，在Biacore T200仪器上于25℃下进行；HBS-EP缓冲液用作运行缓冲液；将缔合速率常数与解离速率常数之比确定为亲和力(KD)。
3.Molecular docking检测抑制剂化合物10m与IDO1的相互作用位点
3.1实验原理
将已知三维结构数据库中的分子一一放置在目标蛋白的活性位点，不断优化蛋白内抑制剂化合物的位置、构象、可旋转键的二面体和氨基酸残基侧链和骨架，发现并预测与目标蛋白相互作用的受体小分子化合物的最佳构象，可以计算其亲和力、结合模式和还可以通过打分函数挑选出接近天然构象的配体，为配体寻找最佳亲和力受体的虚拟的、具有理论意义的分子间作用方法。
3.2实验步骤
所有的对接研究都是在Windows工作站上使用Sybyl-X 2.1.1进行的。从RCSB蛋白质数据库中检索IDO1蛋白质的晶体结构。
(1)将要对接的化合物建立三维结构，然后对其进行能量最小化。
(2)对接前的准备工作，先提取天然配体，将晶体结构中的水分子除去，然后制备蛋白质并加入极性氢原子。
(3)将数据库中的分子与目标蛋白——对接，并通过不断优化柔性键的二面角和抑制剂化合物在靶蛋白中的位置，找到目标化合物与靶蛋白相互作用的最佳形式。
4.结果与讨论
4.1UV-visible spectra结果与讨论
用UV-visible spectra研究了化合物10m与血红素的结合力。血红素特有的结构卟啉环具有独特的紫外吸收特性，由于血红素基团的吸收光谱与配体/底物结合时，根据其铁的氧化和配位状态，测量碘化铁的UV-visible spectra(如图1所示)。由图1可以观察到在化合物10m不存在的情况下，紫外可见光谱的最大吸收光波长大约为404nm；而在化合物10m存在的情况下，诱导效应使得吸收峰发生了红移，Soret峰由404nm移动到421nm，说明抑制剂与血红素的铁结合改变了其最大吸收光波长，同时也改变了血红素的光谱特性，由此可以推测化合物10m与IDO1结合并与血红素基团中的铁形成了相互作用。
4.2SPR结果与讨论：
为了进一步验证化合物10m与IDO1之间的直接相互作用，使用Biacore T200进行了SPR分析。结果如图2所示，响应单位(RU)值与选定范围内的化合物浓度成正比；化合物10m与IDO1的平衡解离常数(KD)为1.41μM，表明化合物10m与IDO1蛋白具有较强的结合亲和力。
4.3Molecular docking结果与讨论
为了阐明化合物10m与IDO1可能的结合方式，用SYBYL-X2.1.1软件包进行了对接研究。选择IDO1(PDB：6E40)的晶体结构作为受体。结果显示，化合物10m主要通过疏水性作用和氢键稳定地嵌入IDO1的活性口袋并与血红素的铁结合。化合物10m肟基上的氧原子直接结合到血红素铁上，而且氢原子与氨基酸残基ALA264形成一个氢键相互作用；色酮母核苯环及其取代基嵌入由氨基酸残基TYR126、VAL130、PHE163、PHE164和SER167形成的疏水性口袋中，并与富电子的氨基酸残基PHE163通过π-π堆积相互作用，这也使化合物10m与血红素铁的结合更加紧密。因此，改变色酮母核7位上的取代基对酶的抑制活性产生了较明显的影响。此外，苯磺酰胺基团嵌入由氨基酸残基PHE226、PHE227、ARG231、ASN240、ILE354和SER235形成的口袋中，而且末端苯环间位上的F原子与氨基酸残基ARG231和SER235形成卤素氢键相互作用，这可能是改变或替换苯环上的取代基导致活性降低的原因；而这也类似于Epacadostat通过侧链磺胺与ARG231和SER235形成的氢键相互作用，由此可见化合物10m能够与IDO1蛋白紧密结合。

Claims (10)

1.具有下述式10所示结构的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003850072330000011
其中，R1为C1～4的烷基或C1～4的烷氧基；R2为卤原子、硝基、C1～4的烷基、C1～4的烷氧基或C1～4的全氟烷基，R2的取代位置为2位、3位和4位中的一种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征是，R1为甲基或甲氧基；R2为卤原子、硝基、甲基、甲氧基或三氟甲基，R2的取代位置为2位、3位和4位中的一种或两种以上。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征是，R1为OCH3或CH3；R2为4-CH3、4-NO2、4-OCH3、4-CF3、2-CH3、3-Br、4-F、4-Br、3-NO2、3-F、2-CF3、3,4-Cl、3,4-F、3,4-OCH3、4-Cl或2-Cl。
4.权利要求1所述化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)取下述式4所示化合物和式8所示化合物置于有机溶剂中，在缩合剂存在的条件下进行缩合反应，得到式9所示化合物；
Figure FDA0003850072330000012
其中，R1为C1～4的烷基或C1～4的烷氧基；R2为卤原子、硝基、C1～4的烷基、C1～4的烷氧基或C1～4的全氟烷基，R2的取代位置为2位、3位和4位中的一种或两种以上；
2)取对甲苯磺酸和式9所示化合物在醇类溶剂中反应，然后加入盐酸羟胺进行肟化反应，制得相应的目标化合物粗品。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，
步骤1)中，所述的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或N,N-二甲基甲酰胺，或者是N,N-二甲基甲酰胺与选自二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯中的一种或两种以上的组合；
步骤2)中，所述的醇类溶剂为含1～4个碳原子的醇类溶剂。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，步骤1)中，所述的缩合剂为EDCI、HOBT和Et3N的组合。
7.根据权利要求4～6中任一项所述的制备方法，其特征是，还包括对制得的目标化合物粗品进行纯化的步骤。
8.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备IDO抑制剂中的应用。
9.一种IDO抑制剂，其中含有权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐。
10.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
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