CN115590846A - α-倒捻子素在制备抑制大肠杆菌生物被膜形成制剂中的应用 - Google Patents
α-倒捻子素在制备抑制大肠杆菌生物被膜形成制剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了α‑倒捻子素在制备抑制大肠杆菌生物被膜形成制剂中的应用,涉及生物被膜抑制剂筛选技术领域,α‑倒捻子素在制备抑制大肠杆菌生物被膜形成制剂中的应用,所述抑制大肠杆菌生物被膜形成的制剂抑制胞外多糖的生成,α‑倒捻子素的浓度为≥2μg/mL。还提供了一种联合细菌抗菌剂,包括α‑倒捻子素和抗生素。α‑倒捻子素对于大肠杆菌生物被膜的产生具有良好的抑制作用,并且对于大肠杆菌产胞外多糖具有抑制作用,与抗生素联合作用可有效提高抗生素的活性,多肽类或氨基糖苷类抗生素与α‑倒捻子素联合使用后具有协同作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物被膜抑制剂筛选技术领域,尤其涉及α-倒捻子素在制备抑制大肠杆菌生物被膜形成制剂中的应用。
背景技术
随着抗生素的大量滥用,多重耐药细菌和真菌病原体的出现构成了全球关注的主要健康问题之一。根据美国国立卫生研究院(NIH)的估计,目前全球每年有超过1600万人死于细菌感染。α-倒捻子素是从山竹果皮里提取分离的一种四羟基占吨酮衍生物,根据现有技术的记载,可知α-倒捻子素通过引发金黄色葡萄球菌自溶的分子机理,调控金黄色葡萄球菌中胞壁质水解酶的活性和细菌自溶行为达到抗菌效果。在邹汉勋所著论文《基于α-倒捻子素的抗菌多肽模拟抗菌剂的设计合成及生物活性研究》(2012年)中记载了通过寻找新的作用机制来改进α-倒捻子素的抗菌作用,以消除细菌耐药性的途径,文中记载通过首次用模拟天然多肽的设计思路对α-倒捻子素进行修改和改性,在化学结构和生物功能上模拟天然抗菌多肽,改进α-倒捻子素的生物功能。使得所合成的α-倒捻子素衍生物降低了溶血活性,提高了其在哺乳动物细胞和细菌细胞中的选择性。
然而,并不能从根本上解决细菌耐药性问题,通过对α-倒捻子素的修饰和改性只能缓解细菌一时的耐药性的产生,并未从根本上突破抗生素的耐药性问题,因此,寻找新颖作用机制的抗生素对多药耐药细菌感染的治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供α-倒捻子素在制备抑制大肠杆菌生物被膜形成制剂中的应用,α-倒捻子素对大肠杆菌生物被膜形成具有良好的抑制作用,并且与多粘菌素B和多粘菌素E联用后,有效增强了多粘菌素B和多粘菌素E的活性。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了α-倒捻子素在制备抑制大肠杆菌生物被膜形成制剂中的应用,α-倒捻子素的浓度为≥2μg/mL。
优选的,所述抑制大肠杆菌生物被膜形成的制剂抑制胞外多糖的生成。
本发明还提供了一种联合细菌抗菌剂,包括α-倒捻子素和抗生素。
优选的,所述抗生素为多肽类抗生素或氨基糖苷类抗生素。
优选的,所述多肽类抗生素为多粘菌素B和/或多粘菌素E,所述氨基糖苷类抗生素为庆大霉素。
优选的,所述联合细菌抗菌剂中α-倒捻子素浓度为3~5μg/mL,抗生素浓度为1/8MIC~1/2MIC。
本发明提供了α-倒捻子素在制备抑制大肠杆菌生物被膜形成制剂中的应用,α-倒捻子素对于大肠杆菌生物被膜的产生具有良好的抑制作用,并且对于大肠杆菌产胞外多糖具有抑制作用,与抗生素联合作用可有效提高抗生素的活性,多肽类抗生素或氨基糖苷类抗生素与α-倒捻子素联合使用后具有协同作用。
附图说明
图1为不同浓度α-倒捻子素对E.coli O157:H7生物被膜形成的影响图;
图2为激光共聚焦显微镜观察不同浓度α-倒捻子素对E.coli生物被膜的影响;
图3为不同浓度α-倒捻子素对E.coli产胞外多糖(EPS)的影响图;
图4为不同浓度α-倒捻子素对E.coli生长能力和代谢能力的影响图;
图5-A为α-倒捻子素与多粘菌素B协同抗菌作用图;
图5-B为α-倒捻子素与多粘菌素E协同抗菌作用图;
图5-C为α-倒捻子素与庆大霉素协同抗菌作用图;
图5-D为α-倒捻子素与四环素协同抗菌作用图;
图5-E为α-倒捻子素与环丙沙星协同抗菌作用图;
图5-F为α-倒捻子素与头孢噻肟酸协同抗菌作用图;
图5-G为α-倒捻子素与氨苄西林协同抗菌作用图;
图6-A为α-倒捻子素与多粘菌素B联合对BNCC358271大肠杆菌的抗菌作用图;
图6-B为α-倒捻子素与多粘菌素B联合对BNCC332831大肠杆菌的抗菌作用图;
图6-C为α-倒捻子素与多粘菌素B联合对BNCC358310大肠杆菌的抗菌作用图;
图6-D为α-倒捻子素与多粘菌素B联合对BNCC358309大肠杆菌的抗菌作用图;
图6-E为α-倒捻子素与多粘菌素E联合对BNCC358271大肠杆菌的抗菌作用图;
图6-F为α-倒捻子素与多粘菌素E联合对BNCC332831大肠杆菌的抗菌作用图;
图6-G为α-倒捻子素与多粘菌素E联合对BNCC358310大肠杆菌的抗菌作用图;
图6-H为α-倒捻子素与多粘菌素E联合对BNCC358309大肠杆菌的抗菌作用图;
图6-I为α-倒捻子素与庆大霉素联合对BNCC358271大肠杆菌的抗菌作用图;
图6-J为α-倒捻子素与庆大霉素联合对BNCC332831大肠杆菌的抗菌作用图;
图6-K为α-倒捻子素与庆大霉素联合对BNCC358310大肠杆菌的抗菌作用图;
图6-L为α-倒捻子素与庆大霉素联合对BNCC358309大肠杆菌的抗菌作用图;
图7为α-倒捻子素对建模小鼠体重的影响;
图8为α-倒捻子素对建模小鼠DAI值的影响;
图9为EHEC感染导致空肠上皮损伤和肠道炎症及治疗情况图(A:肠上皮损伤显微观察图;B:绒毛高度/隐窝深度比(V/C)统计图;C:DAI值变化统计图)。
具体实施方式
本发明提供了α-倒捻子素在制备抑制大肠杆菌生物被膜形成制剂中的应用,α-倒捻子素的浓度为≥2μg/mL。
在本发明中,所述抑制大肠杆菌生物被膜形成的制剂抑制胞外多糖的生成。
本发明还提供了一种联合细菌抗菌剂,包括α-倒捻子素和抗生素。
在本发明所述联合细菌抗菌剂中,所述抗生素优选为多肽类抗生素或氨基糖苷类抗生素。
在本发明所述联合细菌抗菌剂中,所述多肽类抗生素优选为多粘菌素B和/或多粘菌素E,所述氨基糖苷类抗生素优选为庆大霉素。
在本发明所述联合细菌抗菌剂中,所述联合细菌抗菌剂中α-倒捻子素浓度优选为3~5μg/mL,进一步优选为3.5~4.5μg/mL,再进一步优选为4μg/mL,抗生素浓度优选为1/8MIC~1/2MIC,进一步优选为1/4MIC。
在本发明中,所述E.coli O157:H7(ATCC 43895)购买自ATCC,BNCC332831、BNCC358271、BNCC358310、BNCC358309购自北纳生物。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
挑取大肠杆菌单菌落于37℃静置培养于LB肉汤培养基中24h,涡旋,调整OD600=1.0,并将菌液采用培养基稀释100倍,和不同浓度的α-倒捻子素加入到96孔板至终浓度为2、4、8、16、32、64μg/mL,37℃静置培养24h,弃去培养基,用PBS清洗3遍,55℃烘干,加入甲醇固定30min,弃去甲醇后,烘干,再加入质量分数为0.1%的结晶紫溶液,室温下孵育30min,流水冲洗掉残留的结晶紫,烘干,加入体积浓度为95%的乙醇重溶结晶紫,静置30min以上,用多功能酶标仪测定在570nm处的吸光度。采用激光共聚焦显微镜观察α-倒捻子素对生物被膜的抑制作用,具体方法如下:在12孔板中加入细胞爬片,将稀释后的大肠杆菌菌液分别与浓度为4μg/mL,8μg/mL,16μg/mL的α-倒捻子素混合后加入到12孔板中,37℃静置培养24h,弃去培养基,用PBS清洗3遍,然后根据程序使用BacLight Live/Dead活力试剂盒(购自Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,货号:L7012)对生物膜进行染色,在激光共聚焦显微镜下进行观察。
结果如图1、2,由图1可知,在2~64μg/mL浓度范围内,α-倒捻子素对大肠杆菌产生的生物被膜有良好的抑制作用;由图2中可知,随着α-倒捻子素浓度的增加,生物被膜中的活细胞(SYTO-9染色)和死细胞(PI染色)数量均呈现明显的减少趋势,证明该化合物能够有效抑制生物被膜的产生。
实验例1
α-倒捻子素对E.coli产胞外多糖的影响实验
采用钌红法测定α-倒捻子素对E.coli产胞外多糖的影响,将稀释后的大肠杆菌菌液,菌液浓度为1×106CFU/mL,分别与浓度为2μg/mL,4μg/mL,8μg/mL,16μg/mL,32μg/mL,64μg/mL的α-倒捻子素混合后加入到12孔板中,37℃静置采用LB肉汤培养基培养24h,弃去培养基,用PBS清洗3遍,每孔加入质量分数为0.01%的钌红溶液,以添加有钌红溶液的空白孔作为空白对照,37℃,静置60min,在450nm下读取吸光度。
结果见图3,从图3中可知,α-倒捻子素对大肠杆菌生物被膜中EPS的抑制作用呈现出剂量依赖性,在2~64μg/mL浓度范围内对均对EPS具有良好的抑制作用。
实验例2
α-倒捻子素对E.coli生长能力和代谢活力的影响实验
采用微量肉汤稀释法研究α-倒捻子素对大肠杆菌生长的影响:将大肠杆菌在LB肉汤培养基中过夜培养后,采用LB肉汤培养基稀释浓度至OD600=0.01,分别将浓度为2μg/mL,4μg/mL,8μg/mL,16μg/mL,32μg/mL,64μg/mL的α-倒捻子素与稀释后的菌液混合后加入到96孔板中,在37℃培养24h后,使用酶标仪在600nm处测量吸光度。
采用alamarBlue(AB)测定法评估未处理和α-倒捻子素处理细胞的代谢活性变化,将来自每个孔的细胞(浮游生物+生物膜)分别收集在无菌的2ml试管中,10000rpm,离心5min,使用无菌PBS(pH=7.4)洗涤两次并重新悬浮在1ml PBS中,取90μL添加到96孔板,每孔加入10μLAB染料。并在37℃的黑暗条件下孵育1小时,以仅包含AB染料的PBS作为空白对照,测定OD570nm和OD600nm。使用以下公式计算由于细胞代谢减少导致的alamarBlue(蓝色,氧化形式)还原为试卤灵(荧光粉红色,还原形式)的百分比:
Eoxi(OD570)=80586:AB的氧化形式在570nm处的摩尔消光系数;
Eoxi(OD600)=117216:AB的氧化形式在600nm处的摩尔消光系数;
Ered(OD570)=155677:AB的还原形式在570nm处的摩尔消光系数;
Ered(OD600)=14652:AB的还原形式在600nm处的摩尔消光系数;
T:试验样品;
B:空白对照;
OD570:570nm;
OD600:600nm。
如图4所示,α-倒捻子素在2~64μg/mL范围内,对E.coli生长能力以及代谢能力均无明显抑制作用,表明在该浓度下,α-倒捻子素不会对细菌生长产生不利影响。
实验例3
α-倒捻子素和抗生素联合抗菌作用评价实验
挑取大肠杆菌单菌落,于LB肉汤培养基中过夜培养,稀释调整浓度至OD600=0.01。以稀释后的菌液为媒介,将4μg/mLα-倒捻子素分别与浓度为相应最小抑菌浓度(minimuminhibitory concentration)的1/2MIC,1/4MIC,1/8MIC的抗生素混合,添加至96孔板中,每孔200μL,37℃孵育16h,按照alamarBlue代谢活力测定方法,测定细菌生长活力。
表1抗生素对应不同菌株的最小抑菌浓度
结果见图5A~G,如图所示,与抗生素单独使用相比,多粘菌素B或多粘菌素E或庆大霉素与α-倒捻子素联合使用后,能够有效增强抗生素的活性。
实验例4
α-倒捻子素与抗生素联用对四种耐药大肠杆菌的协同作用实验
抗菌实验中α-倒捻子素与多粘菌素B、多粘菌素E和大庆霉素联合使用对大肠杆菌有良好的协同抗菌作用,进一步评价α-倒捻子素与多粘菌素B、多粘菌素E和大庆霉素联合使用对4种不同耐药菌株的联合抗菌作用。
结果如图6A~L,由图6A~L可知,多粘菌素B、多粘菌素E或大庆霉素与α-倒捻子素联合使用后,均有效增强了多粘菌素B、多粘菌素E和大庆霉素的活性,证明α-倒捻子素对抗生素具有协同作用。
实验例5
动物实验
72只C57BL/6小鼠,分为对照组(Control)、模型组(肠出血性大肠杆菌感染EHEC)、阳性对照组(EHEC+Enro)、高剂量组(EHEC+Man-H)、中剂量组(EHEC+Man-M)、低剂量组(EHEC+Man-L),每组12只。
对照组腹腔注射100μL无菌磷酸盐缓冲盐水;EHEC组腹腔注射含1×108个菌落形成单位的100μL无菌PBS(EHEC O157:H7);EHEC+恩诺沙星组腹腔注射22.75mg/kg恩诺沙星,每天一次,连续3天,然后腹腔注射100μL含1×108菌落单位EHEC O157:H7的无菌PBS;EHEC+Man-L)、EHEC+Man-M和EHEC+Man-H组分别注射25、50和100mg/kg.bw(每公斤体重给药量为100mg)α-倒捻子素,每天一次,连续3天然后分别给予100μL含1×108菌落形成单位EHECO157:H7的无菌PBS。3天后,对小鼠实施安乐死,并收集组织用于分析。研究前后,确认并记录小鼠的体重。
根据图7和图8所示体重和DAI数据,可知小鼠肠道炎症模型已成功建立。EHEC治疗组的小鼠比对照组的小鼠体重减轻明显更多,而其他组的小鼠比EHEC治疗组的小鼠体重减轻更少。除了体重减轻,EHEC感染还引发其他几个严重的临床变化(体重减轻、肛周出血和腹泻),对所有这些临床症状进行评分,并将这些评分合并到DAI中,以全面评估α-倒捻子素治疗对EHEC诱发疾病的影响。与EHEC治疗组(其显示出显著高于对照组的DAI值)相比各给药组的小鼠明显恢复,这反映在减少的DAI值上。
EHEC感染导致空肠上皮损伤和肠道炎症如图9中A所示,空肠组织的H&E染色显示EHEC感染导致大量绒毛损伤、浆膜增厚和水肿。相比之下,观察到用α-倒捻子素或恩诺沙星处理的小鼠组织切片的上皮损伤迹象减少。
如图9中B所示,与对照组相比,EHEC感染组的绒毛高度/隐窝深度比(V/C)显著降低。相比之下,EHEC+Enro组、EHEC+Man-L组、EHEC+Man-M组、EHEC+Man-H组的小鼠比EHEC组的小鼠具有明显更高的V/C值。EHEC+Man-M组的Chiu的分数也明显低于EHEC+Enro组。总的来说,我们的数据表明α-倒捻子素的处理显著减轻了EHEC引起的肠损伤(图9中的C)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.α-倒捻子素在制备抑制大肠杆菌生物被膜形成制剂中的应用,其特征在于,α-倒捻子素的浓度为≥2μg/mL。
2.如权利要求1所述α-倒捻子素在制备抑制大肠杆菌生物被膜形成制剂中的应用,其特征在于,所述抑制大肠杆菌生物被膜形成的制剂抑制胞外多糖的生成。
3.一种联合细菌抗菌剂,其特征在于,包括α-倒捻子素和抗生素。
4.如权利要求3所述的联合细菌抗菌剂,其特征在于,所述抗生素为多肽类抗生素或氨基糖苷类抗生素。
5.如权利要求4所述的联合细菌抗菌剂,其特征在于,所述多肽类抗生素为多粘菌素B和/或多粘菌素E,所述氨基糖苷类抗生素为庆大霉素。
6.如权利要求3所述的联合细菌抗菌剂,其特征在于,所述联合细菌抗菌剂中α-倒捻子素浓度为3~5μg/mL,抗生素浓度为1/8MIC~1/2MIC。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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