CN1155905A

CN1155905A - 单体与交联剂之比高的交联聚丙烯酰胺凝胶

Info

Publication number: CN1155905A
Application number: CN 96190549
Authority: CN
Inventors: T·J·海曼; M·E·施默德尔; S·M·比姆
Original assignee: Amresco LLC
Current assignee: Amresco LLC
Priority date: 1995-04-04
Filing date: 1996-04-04
Publication date: 1997-07-30

Abstract

本发明公开了使用二烯丙酰叔酰胺型交联剂的改进的聚丙烯酰胺型凝胶，该凝胶与常规聚丙烯酰胺相比，具有相对高的单体∶交联剂比例。所得凝胶有着与常规聚丙烯酰胺凝胶不同的化学和物理孔隙结构，当以最优单体∶交联剂比例制备凝胶时，所得凝胶给出了超过常规聚丙烯酰胺凝胶的分辨率和结构特性。

Description

单体与交联剂之比高的交联聚丙烯酰胺凝胶

背景技术

长期以来，聚丙烯酰胺电泳一直被视为分辨核酸片段、DNA测序产物、蛋白质和多肽的有利工具(Stell wagen，生物化学，22(1983)：6186；Hames等人，eds.，蛋白质的凝胶电泳，牛津大学出版社，纽约，1981)。然而，常规的聚丙烯酰胺凝胶在下述各方面受到限制，这些方面包括：对于不同分子量范围内物质的分辨能力，足以分辨相近大小低分子量片段的能力，及DNA测序产物与凝胶强度的分辨率，特别是对于薄的DNA测序型凝胶而言更是如此。另一个限制是银染色的高背景染色水平，它干扰分辨率。

Hochstrasser等人(U.S.P.5,283,196和生物分析化学，173(1988)：412-423)曾发明了新的交联剂，其中包括二丙烯酰哌嗪，它们有助于消除N，N′-亚甲双丙烯酰胺遇到的某些背景问题，该常规交联剂过去常常用于制备聚丙烯酰胺凝胶。就新的交联剂而言，Hochstrasser等人在凝胶强度和电泳分离方面取得的进展很小，而且这种进展充其量而言也是不明确的。

Hochstrasser使用的单体∶交联剂比例的最高值是37.5∶1(或30∶0.8)，如第7栏第68行所述。Hochstrasser使用的比例与常规聚丙烯酰胺凝胶中使用的比例，即：约19∶1～37.5∶1一致。更大的比例几乎从未被采用过，因为由此而得的凝胶在实际使用时太易破损，并且提供的分辨率差。

被称为“丙烯酰胺凝胶浓度”的第二种测量方法是指在最终凝胶中单体与交联剂重量之和与凝胶全部组分总重量的百分比值。一般而言，使用的丙烯酰胺凝胶浓度为4-20％，更常使用的浓度是6-12％。较低的丙烯酰胺凝胶浓度通常使凝胶的机械性能很差，而较高的浓度会限制电泳迁移率。Hochstrasser使用的丙烯酰胺凝胶浓度仍在常规范围内。

应当指出Hochstrasser主要关心的是常规凝胶的银染色问题，他解决该问题的方法是使用二丙烯酰哌嗪。然而，在本发明之前，无法期望使用非常规高单体∶交联剂比例会获得二丙烯酰基叔酰胺型交联剂的出众的分辨率、凝胶强度和染色特性。本发明与现有技术指出的方向是相反的。

发明概述

本发明人出乎意料地发现，当使用高于聚丙烯酰胺凝胶常规使用的和高于Hochstrasser使用的单体∶交联剂比例时，二丙烯酰基叔酰胺，尤其是二丙烯酰哌嗪给出了超级聚丙烯酰胺凝胶(远远好于Hochstrasser所建议的)。由于其独特的含氮环结构，这些交联剂可取得与双丙烯酰胺可比的凝胶强度，而且浓度较低。此外，由于使用的交联剂浓度较低，获得的凝胶具有较大的孔径(与常规聚丙烯酰胺凝胶中使用的总凝胶浓度相比)，从而改进了对分子的分辨率，即使这些分子具有相近的大小和重量。

此外本发明人还发现，当使用本发明的高的单体∶交联剂比例时，二丙烯酰叔酰胺交联剂即使在丙烯酰胺凝胶浓度低于4％和高于20％时，也能得到令人满意的凝胶。已经发现，在3.0％～25.0％浓度范围内可得到令人满意的凝胶。这些优点Hochstrasser从未指出或建议过。

附图简述附图1是本发明凝胶(A)和常规双丙烯酰胺凝胶(B)对大小相近的片段的分辨对比。附图2是使用本发明凝胶(A)和常规双丙烯酰胺凝胶(B)，从DNA测序得到的电泳带图谱的对比。附图3是使用本发明凝胶，从蛋白质分子量标准得到的电泳带图谱。附图4是单体∶交联剂比例(X轴)-凝胶使用性能(Y轴)曲线，该曲线说明了本发明所制备凝胶的改进的使用性能。

优选实施方案的详述

本发明涉及用于检测和分离分子的组合物，该组合物含有由交联剂制得的改进的聚丙烯酰胺凝胶，所述交联剂是具有构成叔酰氨基团的至少一种仲胺化合物的可聚合丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺衍生物，其中单体∶交联剂比例范围为约1∶40～约1∶480。该组合物中丙烯酰胺凝胶的浓度为组合物重量的3.0％～25.0％。

本发明的另一个实施方案是分子的检测方法，该方法包括将含有分子的样品放在含一种凝胶的组合物上面，该凝胶含有一种丙烯酰胺单体，该丙烯酰胺单体与含有至少一个仲氨基团的氨基化合物的丙烯酰胺衍生物交联，该衍生物还含有至少一个叔酰氨基，其中丙烯酰胺单体∶丙烯酰衍生物的比例为约40∶1～约480∶1，组合物中凝胶的浓度为组合物重量的3.0％～25.0％；使该组合物与一种溶剂接触足够长的时间，让分子经该组合物差异迁移一段预定的距离；再使该组合物与一种银溶液接触，使该组合物显象并检测样品中各分子的相对位置。

这些交联剂可以含有不止一个丙烯酰基或不止一个叔酰氨基。具体而言，二丙烯酰叔酰胺，特别是二丙烯酰哌嗪是优选的交联剂。这些交联剂的制备示于U.S.P.5,283,196中(Hochstrasser)，该文献被引作本发明的参考文献。本发明的二丙烯酰叔酰胺型交联剂具有下述结构式：

其中每个R基团可以是H、甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基。

交联的聚丙烯酰胺凝胶的制备可按照制备这类凝胶的标准技术，使用本发明所述的交联剂来进行。例如可从下式(II)的丙烯酰胺型单体的水溶液制得电泳基质：

R₄-CH₂-CH₂-C(＝R₁)NR₃R₂ (II)其中R₁是O或S，R₂，R₃和R₄各自独立地代表氢或可被至少一个-OH基团或被至少一个＝O基团选择性取代的C₁-C₅烷基。这些基质可按照本领域公知的标准凝胶制备技术，在缓冲或无缓冲溶液中制备。这些溶液中可含有任何变性剂的组合，其中包括离子、非离子和两性离子洗涤剂，以及其它通常用于制备交联聚丙烯酰胺凝胶的螯变剂和改性剂。

术语“单体∶交联剂比例”指凝胶中单体重量与凝胶中交联剂重量的比值。本发明中的单体∶交联剂比例为约40∶1～约480∶1，优选约50∶1～约150∶1，约101∶1～约480∶1也是优选的。

本发明人经过大量的实验发现，当单体∶交联剂比例在50∶1～150∶1的范围内时，二丙烯酰叔酰胺型交联剂具有优秀的分辨率和凝胶强度。当然，当该比例小至40∶1，大至480∶1时也可得到令人满意的结果。

从相近的意义上讲，可将观测到的结果比作一个“钟形”响应曲线，其中在一个特定的比例范围内可观测到一个宽的最大作用值，从该宽的最佳值算起，当单体∶交联剂比例曾大或减少时响应值均降低。精确的最佳比例范围随被分析分子的特性最终的丙烯酰胺浓度、选择的缓冲液、电压、时间和变性剂的不同而改变。

回顾起来就很容易看出，为什么在某些情况下Hochstrasser可以看到性能的改进，而在另一些情况下看不到。就二丙烯酰哌嗪交联剂而言，Hochstrasser使用的最高单体∶交联剂比例为37.5∶1(或30∶0.8)。由此可知Hochstrasser(所使用的上述比例)处于钟形响应曲线的末端，此处的效果与本发明相对高的比例处所看到的极佳效果相比是极差的，参见附图4。当该比例在常规比例范围内进一步降低时(首先是在29∶1这一比例处，然后是在19∶1这一比例处)，在37.5∶1这一比例附近所看到的低于最佳值的效果实际上会变得更差，参见附图4。

本发明通过下述实施例得以进一步详细说明，但这并不限于这些实施例。实施例1

在1000ml去离子水中制备含39.5g超纯丙烯酰胺和0.5g二丙烯酰哌嗪的40％料液。将该40％的料液稀释至20％，并用1X Tris/硼酸盐/EDTA(0.089M Tris，0.089M硼酸盐和0.002M EDTA)缓冲。所得溶液在真空下(100-500托)5分钟除去可能抑制聚合的溶解气体。为引发聚合，将1ml 10％过硫酸铵和100μl N，N，N′，N′-四甲基亚乙基二酰胺(TEMED)加至100ml稀释的凝胶溶液中，并使该凝胶在被0.8mm间隔隔开的两个玻璃平板之间流延，聚合于室温下进行1小时。

在一标准载荷缓冲液中，通过稀释至100μg/ml的最终浓度制得电泳用的核酸分子量标准。该分子量标准由具有下述大小碱基对：587，458，434，298，267，257和174的双/链DNA片段组成。将10μl(1μg DNA)加至组成不同的两种凝胶上。为了说明上述基质和常规聚丙烯酰胺凝胶之间的不同，使样品分别在与二丙烯酰叔二酰胺型交联剂交联的凝胶中和在常规双丙烯酰胺型交联凝胶中电泳。两种凝胶系统均用1X TBE缓冲。

电泳后卸下凝胶平板，并使该凝胶在1mg/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓去离子蒸馏水溶液中染色30分钟。然后再使凝胶在去离子蒸馏水中脱色30分钟，再用FCR-10相机照像。结果示于附图1。从该附图中可以清楚地看出：A栏中的凝胶，即二丙烯酰叔酰胺交联的凝胶；对于相似大小的片段(267bp和257bp)有着出众的分辨率，而B栏中的凝胶，即：双丙烯酰胺交联的凝胶，却没能充分地分辨出这些片段。这里所说的分辨率是指将各种组分分至单独指定区域，使其与相近分子清楚分开和可识别的能力。此外A栏中的凝胶与B栏中的凝胶相比还显示出出众的回弹性和抗破裂性。实施例2

在1000ml去离子水中制备含39.5g超纯丙烯酰胺和0.5g二丙烯酰哌嗪的40％料液。将该料液在1X Tris/硼酸盐/EDTA(0.089M Tris、0.089M硼酸盐和0.002M EDTA)中稀释至6％，加入尿素使最终浓度为7.0M。使该溶液于真空下保持5分钟，然后加入1ml 10％过硫酸铵和100μl TEMED引发聚合。

所得溶液在被间隔为0.4mm的两个玻璃平板之间流延，并使其于室温下聚合1小时。DNA测序反应物可按照Sanger双脱氧测序法，使用改性的T7聚合酶和α-³²P-dATP制得。为说明上述基质与常规聚丙烯酰胺凝胶的不同，使样品分别在与二丙烯酰叔二酰胺型交联剂交联的凝胶中和在双丙烯酰胺交联的凝胶中电泳。两个凝胶系统中均用1X TBE缓冲。

DNA测序产物用射线自显影术显象。在附图2中可以清晰地看出，A栏中的凝胶，即：二丙烯酰叔二酰胺交联的凝胶与B栏中的凝胶相比，所给出的可读碱基数目有所增加。与二丙烯酰叔二酰胺交联剂交联的凝胶显示的谱图在给定迁移区域内，给出了更多的被分辨开的条谱。这里所说的分辨率是指将各种组分分至单独指定区域，使其与相近分子清楚分开和可识别的能力。此外A栏中的凝胶与B栏中的凝胶相比还显示出出众的加弹性和抗破裂性。实施例3

在1000ml去离子水中制备含39.5g超纯丙烯酰胺和0.5g二丙烯酰哌嗪的40％料液。将该料液于1X Tris/甘氨酸/SDS(TG-SDS：0.25MTris碱，0.192M甘氨酸，0.1％十二烷基硫酸钠)中稀释至12％。使该溶液于真空下停留5分钟，然后加入1ml 10％过硫酸铵和100μl TEMED来引发聚合。

所得溶液在带有1.0mm间隔的两块玻璃板之间流延，并使其于室温下聚合1小时。使蛋白质分子量标准(14KD-66KD)在用1X TG-SDS缓冲的前述基质中电泳。电泳后用乙酸将该凝胶固定，然后用硝酸银染色并用碳酸氢钠/硫代硫酸钠溶液显象。所得结果于附图3。

当用银盐染色时，用二丙烯酰叔酰胺型交联剂制得的凝胶显示出较低的背景。此外，在与二丙烯酰叔酰胺型交联剂交联的凝胶中不存在甘氨酸前沿(双丙烯酰胺交联的凝胶的特征)。实施例4

制备不同单体∶交联剂比例的浓料液，该比例的范围是从19∶1至37.5∶1(常规单体∶交联剂比例)经60∶1，75∶1至最终的150∶1。通过使核酸大小标志在不同基质中电泳来表征分辨率。已经发现，随着单体∶交联剂比例的增加分辨率也提高，在75∶1处达到最佳值。

按照单体∶交联剂比例19∶1和37.5∶1制得的凝胶所给出的分辨率(在实用中)是不能令人满意的。谱带的形成不精确，对相近大小的片段也不能区分。但是随着单体∶交联剂比例的增大，核酸片段的分辨率和谱带形成有明显改进。如附图4所示，当单体∶交联剂比例处于75∶1～150∶1范围内时可获得最佳值。当该比例超过上述范围时，凝胶强度和可使用性受到损害。当比例超过150∶1时虽然还可能使该凝胶聚合，但凝胶的固化时间和其可有效使用性比较不能令人满意。

尽管已详细描述了本发明而且举出了它的具体实施方案，但是对于本领域专业技术人员而言，在不脱离本发明主旨和范围的条件下，显然可以做出各种改变和改进。

Claims

1.一种含有凝胶的用于分离和检测分子的组合物，该凝胶含有一种丙烯酰胺单体，所述丙烯酰胺单体与含有至少一个仲氨基基团的氨基化合物的丙烯酰胺衍生物交联，该衍生物还含有至少一个叔酰氨基，其中丙烯酰胺单体∶丙烯酰衍生物比例的范围是约40∶1～约150∶1，组合物中凝胶的浓度为组合物重量的3.0％～25.0％。

2.权利要求1中所述的组合物，其中丙烯酰胺单体∶丙烯酰衍生物比例的范围是约50∶1～约150∶1。

3.权利要求1中所述的组合物，其中组合物中凝胶的浓度为3.0％～15.0％。

4.权利要求1中所述的组合物，其中的丙烯酰胺单体是下式(II)的化合物：

R₄-CH₂-CH₂-C(＝R₁)NR₃R₂ (II)式中R₁是O或S，R₂、R₃和R₄各自独立地代表氢或被至少一个-OH基团或被至少一个＝O基团任选取代的C₁-C₅烷基。

5.权利要求1中的组合物，其中的丙烯酰衍生物是下式化合物之一：

式中每个R基团可以是H、甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基。

6.权利要求5所述的组合物，其中的丙烯酰衍生物是二丙烯酰哌嗪。

7.一种检测分子的方法，该方法包括：

将含有分子的样品放置在含有一种凝胶的组合物上，该凝胶含有一种丙烯酰胺单体，该丙烯酰胺单体与含有至少一个仲氨基的氨基化合物的丙烯酰胺衍生物交联，所述衍生物还含有至少一个叔酰氨基，其中的丙烯酰胺单体∶丙烯酰衍生物比例的范围是约40∶1-约150∶1组合物中凝胶的浓度是组合物重量的3.0％-25.0％，

再使该组合物与一种溶剂接触足够长的时间，以使分子经该组合物差异迁移一段预定的距离，和

再使该组合物与一种银溶液接触，使该组合物显象并检测样品中各分子的相对位置。

8.权利要求7所述的方法，其中丙烯酰胺单体∶丙烯酰衍生物比例的范围是约50∶1～约150∶1。

9.权利要求7所述的方法，其中组合物中凝胶的浓度为3.0％～15.0％。

10.权利要求7所述的方法，其中的丙烯酰胺单体是下式(II)化合物：

R₄-CH₂-CH₂-C(＝R₁)NR₃R₂ (II)式中R₁是O或S，R₂，R₃和R₄各自独立地代表氢或被至少一个-OH基团或被至少一个＝O基团任选取代的C₁-C₅烷基。

11.权利要求7所述的方法，其中的丙烯酰衍生物是下式化合物之一：

12.权利要求11所述的方法，其中的丙烯酰衍生物是二丙烯酰哌嗪。

13.权利要求1所述的组合物，其中丙烯酰胺单体∶丙烯酰衍生物比例的范围是约40∶1～约100∶1。

14.权利要求7所述的方法，其中丙烯酰胺单体∶丙烯酰衍生物比例的范围是约40∶1～100∶1。