CN115586141A - 一种基于显微高光谱的原位层析成像系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于显微高光谱的原位层析成像系统及方法，涉及高光谱成像技术领域，解决现有无法实现光谱成像、无法精准的确定各微观结构的定性信息的技术问题，包括一种基于显微高光谱的原位层析成像系统，包括高光谱相机、光学成像透镜组和光学显微镜组；高光谱相机包括外壳、成像光谱仪、面阵探测器和精密电控二维平台，光学成像透镜组与外壳连接；精密电控二维平台包括扫描结构和调焦结构，扫描结构用于带动成像光谱仪沿水平方向朝光学显微镜组的成像镜头的方向作相对运动，调焦结构用于带动成像光谱仪作纵向运动；本发明通过图像和光谱融合在一起的属性来对目标进行定性、定量、定位的多方位研究。

Description

一种基于显微高光谱的原位层析成像系统及方法

技术领域

本发明涉及高光谱成像技术领域，更具体的是涉及一种基于显微高光谱的原位层析成像系统及方法。

背景技术

高光谱成像(Hyperspectral Image)技术通过光谱图像信息为临床医学提供了一种有效的辅助诊断手段，具有巨大的发展潜力。HSI能够同时获取待测物体目标的图像信息和光谱信息，具有图谱合一的独特优势。利用HSI对组织等进行检测时，因光能够穿透生物组织一定的厚度，由于生物组织结构的不均一性，光会在各个方向发生散射效应，而血红蛋白、黑色素和水等则会吸收不同波长的光。因此，不同组织或器官的反射光谱、荧光光谱、透射光谱等取决于自身的生物化学和组织学特性，这就为鉴别正常组织和癌变组织提供了强有力的依据。图像中每个像素的光谱特征使HSI技术能够识别各种病理状况。在非侵入性癌症检测、糖尿病足溃疡、心脏和循环系统病理学及其他疾病检测、手术指导等方面发挥了重要作用。通过观察目标的微观尺度的组织及其光谱特征，进而对目标的构造、特性进一步了解和应用的新型的、非接触式的光学诊断技术技术，进而引入一种新型的图像获取技术，即高光谱显微成像技术。

高光谱成像(Hyperspectral Image)是集探测器技术、精密光学机械、微弱信号检测、计算机技术、信息处理技术于一体的综合性技术。是一种将成像技术和光谱技术相结合的多维信息获取技术，同时探测目标的二维几何空间与一维光谱信息，获取高光谱分辨率的连续、窄波段的图像数据。高光谱图像数据的光谱分辨率高达10-2λ数量级，在可见到短波红外波段范围内光谱分辨率为纳米(nm)级，光谱波段数多达数十个甚至上百个，各光谱波段间是通常连续，图像数据的每个像元均可以提取一条完整的高分辨率光谱曲线。

HSI也广泛应用在其他生物医学领域，如检测龋齿和人喉黏膜变化、视网膜领域等疾病。此外，HSI在除皮肤癌外的其他皮肤疾病检测方面也发挥了重要作用，如皮瓣移植预后及监测、皮损检测、皮肤色素检测等。血运障碍是皮瓣移植手术后的常见并发症，严重者可导致大块组织坏死或手术失败，而术后的早期监测可使外科医生通过及时的干预来减小并发症的影响。在生物医学检测的领域当中，各环节所需的各类生物切片的样本虽然在经过涂片、辅片、磨片等处理后呈现为薄片状态，但是这些样本在物理结构上仍然具有微小量的厚度及不均匀性。无法在显微镜单一的景深状态下能够清晰的呈现所观察视场中全部样本的细节信息。

目前，行业内主要通过图像目标提取、图像清晰度评价与图像融合等基于图像处理算法的方式来获取多景深显微镜图像的层析信息。

利用近红外线及光学干涉原理对生物组织进行成像。干涉成像的原理：简单地说就是将光源发出的光线分成两束，一束发射到被测物体(血管、组织)，这段光束被称为信号臂，另一束到参照反光镜，称为参考臂。然后把从组织(信号臂)和从反光镜(参考臂)反射回来的两束光信号叠加。当信号臂和参考臂的长度一致时，就会发生干涉。从组织中反射回来的光信号随组织的形状而显示不同强弱。把它与从反光镜反射回来的参考光信号叠加，光波定点一致时信号增强(增加干涉)，光波定点方向相反时信号减弱(削减干涉)。形成干涉的条件是频率相同，相位差恒定。

利用干涉原理，光学相干层析成像(OCT)比较标准光源与反射信号以增强单一反射，减弱散射光线的放射。由于干涉只发生在信号臂和参考臂长度相同时，所以改变反光镜的位置，就改变了参考臂的长度，则可以得到不同深度的组织的信号。这些光信号经过计算机处理便可得到组织断层图像。但是，运用此技术无法实现光谱成像、无法精准的确定各微观结构的定性信息。

发明内容

本发明的目的在于：为了解决上述无法实现光谱成像、无法精准的确定各微观结构的定性信息的技术问题，本发明提供一种基于显微高光谱的原位层析成像系统及方法。

本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案：

一种基于显微高光谱的原位层析成像系统，包括高光谱相机、光学成像透镜组和光学显微镜组；

高光谱相机包括外壳、与光学成像透镜组相配合的成像光谱仪、与成像光谱仪一端连接的面阵探测器、与成像光谱仪底面连接的精密电控二维平台，光学成像透镜组与外壳连接；

其中，精密电控二维平台包括扫描结构和调焦结构，扫描结构用于带动成像光谱仪沿水平方向朝光学显微镜组的成像面方向作相对运动，调焦结构用于带动成像光谱仪作纵向运动。

进一步地，精密电控二维平台还包括扫描平台台面，扫描结构和调焦结构分别位于扫描平台台面相邻的两侧外侧壁上，扫描平台台面从上至下依次包括第一台面、第二台面和第三台面，第一台面与第二台面、第二台面与第三台面滑动连接，扫描结构带动第一台面沿水平方向朝光学显微镜组的成像镜头的方向运动，调焦结构带动第一台面和第二台面作纵向运动。

进一步地，扫描结构包括扫描电机、扫描推杆和顶块一，扫描电机与第二台面的外侧壁连接，扫描电机的输出端与扫描推杆的一端连接，扫描推杆的另一端与顶块一连接，顶块一与第一台面的外侧壁连接。

进一步地，调焦结构包括调焦电机、调焦推杆和顶块二，调焦电机与第一台面和第二台面的外侧壁连接，调焦电机的输出端与调焦推杆的一端连接，调焦推杆的另一端与顶块二连接，顶块二与第三台面的外侧壁连接。

进一步地，第一台面与第二台面、第二台面与第三台面均通过交叉滚子导轨滑动连接。

进一步地，第一台面和第二台面的中间位置分别设置有用于触发机械零点的限位片一和限位片二。

进一步地，精密电控二维平台通过控制主板实现运动控制，控制主板设置在扫描平台台面的内部。

进一步地，成像光谱仪的成像狭缝的长度为14.2mm，宽度为30um。

另外，本发明还提供一种基于显微高光谱的原位层析成像系统的成像方法，包括以下步骤：

步骤S1：将样品放置在显微样品台上，物镜下方的像成像在高光谱相机的成像狭缝上；

步骤S2：通过调焦结构带动成像光谱仪作纵向运动，确定调焦维度；

步骤S3：通过扫描结构带动成像光谱仪进行平移推扫成像，获取被测目标的一层图像数据；

步骤S4：通过调焦结构调整成像光谱仪在纵向方向上的位置，每调整一个间隔，重复执行步骤S3，得到多层图像数据；

步骤S5：将获取到的多层图像数据叠加，得到高光谱层析影像。

进一步地，步骤S3具体为：每次成X方向上的像后，在扫描结构带动成像光谱仪移动的过程中，面阵探测器会对待测目标扫出一条带状轨迹从而完成Y方向上的扫描，根据X方向和Y方向上的扫描信息得到被测目标的一层三维高光谱图像数据，采集完成后，扫描结构会带动成像光谱仪返回到起点位置处，等待执行下一次的采集指令。

本发明的有益效果如下：

1.本发明通过高光谱相机、光学成像透镜组和光学显微镜组的配合，采用像平面扫描的方式，利用内置的精密电控二维平台可对目标进行扫描成像，依据目标尺度变化的差异，通过对调焦结构进行微调整，使高光谱相机在纵向维度的空间位置发生变化，呈现同一位置但不同层级的高光谱影像，对多次基于同一原位点的不同层级的图像进行采集和处理，提取每幅图像里面最信息的行目标图像，通过对大量的基于同一目标原位影像的处理，可以得到由多个清晰的航带组成的显微高光谱图像，而每个像素点的光谱信息则没有受到任何的影响，最后可以得到目标原位的层析高光谱信息，使最终得到的显微高光谱图像突出了原位、层析的特性，通过图像和光谱融合在一起的属性来对目标进行定性、定量、定位的多方位研究。

2.本发明在成像过程中，扫描结构的精度和调焦结构的移动细分精度都无需受制于需要与样本自身的结构尺寸完全一致，达到相同的细分精度尺寸。本发明通过将扫描结构和面阵探测器的相互配合可以获取到特定区域目标的显微高光谱影像信息和光谱信息，再通过调焦结构带动成像光谱仪进行纵向移动可以反复的对同一区域进行多次扫描成像，其可以克服样本自身受到景深差异带来的图像局部清晰和局部不清晰的问题，通过多次的扫描成像，获取多幅影像，即最终得到的既含待测目标原位的高光谱影像又包括其对应的层析影像且含有对应像元的特征光谱信息。

3.本发明中扫描结构通过直线电机加推杆的传动方式，与现有的使用同步驱动轮的方式相比，可以避免皮带老化导致的皮带轮松紧不一，进而引起的扫描和调焦精度降低的问题，提高了系统准确性能。

附图说明

图1是本发明的结构示意图；

图2是本发明中高光谱相机的内部结构示意图；

图3是本发明中精密电控二维平台的结构示意图；

图4是本发明中成像狭缝的成像过程；

图5是本发明的成像原理图；

图6是本发明的显微高光谱层析成像示意图；

图7为本发明中显微镜横向空间分辨率的示意图。

附图标记：1-高光谱相机；2-光学成像透镜组；3-光学显微镜组；4-外壳；5-成像光谱仪；6-面阵探测器；7-精密电控二维平台；8-扫描结构；9-扫描电机；10-扫描推杆；11-顶块一；12-调焦结构；13-调焦电机；14-调焦推杆；15-顶块二；16-扫描平台台面；17-第一台面；18-第二台面；19-第三台面；20-交叉滚子导轨；21-限位片一；22-控制主板；23-显微镜本体；24-物镜；25-显微样品台；26-显微镜光源。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

如图1到图3所示，本实施例提供一种基于显微高光谱的原位层析成像系统，包括高光谱相机1、光学成像透镜组2和光学显微镜组3；

高光谱相机1包括外壳4、与光学成像透镜组2相配合的成像光谱仪5、与成像光谱仪5一端连接的面阵探测器6、与成像光谱仪5底面连接的精密电控二维平台7，光学成像透镜组2与外壳4连接；

其中，精密电控二维平台7包括扫描结构8和调焦结构12，扫描结构8用于带动成像光谱仪5沿水平方向朝光学显微镜组3的成像面方向作相对运动，调焦结构12用于带动成像光谱仪5作纵向运动。

进一步地，成像光谱仪5的成像狭缝的长度为14.2mm，宽度为30um。

具体地，精密电控二维平台7中的扫描维度(在扫描电机9带动下的运动)的行程大约在20mm；而调焦维度(在调焦电机13带动下的运动)的行程也通过限位结构限制其行程在20mm左右。

扫描电机9带动成像光谱仪5与成像镜头直接做相对移动，狭缝尺寸大约为：长14.2mm，宽度30um，而标准C-mount接口的成像镜头后焦平面大约直径在25mm左右的一个圆形结构，所以本发明中描述的成像光谱仪5相对成像镜头后焦平面的相对运动不仅仅是尺寸数据上的，关键是要看狭缝长度能在圆形面上所形成的有效范围，通常情况下有效的范围是能覆盖14.2mm长度的镜头面区域，也就是说，二维平台中扫描维度的电机带动成像光谱仪5做的有效行程数值一般在10mm左右。

光学显微镜组3为现有的结构，主要包括显微镜本体23、物镜24、显微样品台25和显微镜光源26；在显微镜自身结构中，显微镜的光学成像关系中，物方的像与面阵探测器6所采集到的像是存在一个放大的关系的，也就是面阵探测器6探测到的是一个放大后的像，这个放大功能是显微镜中的显微物镜起到的作用。如图5所示，成像狭缝在扫描电机9的带动下，会与显微镜的不同倍率的物镜直接发生相对运动，并建立成像关系，而且二者所成的像还是具备缩放功能。通过成像关系的缩放，成像光谱仪5自身的长度14.2mm，宽度30um仍然会获取并采集到微小目标的高光谱影像。

本发明通过高光谱相机1、光学成像透镜组2和光学显微镜组3的配合，采用像平面扫描的方式，利用内置的精密电控二维平台7可对目标进行扫描成像，依据目标尺度变化的差异，通过对调焦结构12进行微调整，使高光谱相机1在纵向维度的空间位置发生变化，呈现同一位置但不同层级的高光谱影像，对多次基于同一原位点的不同层级的图像进行采集和处理，提取每幅图像里面最信息的行目标图像，通过对大量的基于同一目标原位影像的处理，可以得到由多个清晰的航带组成的显微高光谱图像，而每个像素点的光谱信息则没有受到任何的影响，最后可以得到目标原位的层析高光谱信息，使最终得到的显微高光谱图像突出了原位、层析的特性，通过图像和光谱融合在一起的属性来对目标进行定性、定量、定位的多方位研究。

本发明在成像过程中，扫描结构8的精度和调焦结构12的移动细分精度都无需受制于需要与样本自身的结构尺寸完全一致，达到相同的细分精度尺寸。本发明通过将扫描结构8和面阵探测器6的相互配合可以获取到特定区域目标的显微高光谱影像信息和光谱信息，再通过调焦结构12带动成像光谱仪5进行纵向移动可以反复的对同一区域进行多次扫描成像，其可以克服样本自身受到景深差异带来的图像局部清晰和局部不清晰的问题，通过多次的扫描成像，获取多幅影像，即最终得到的既含待测目标原位的高光谱影像又包括其对应的层析影像且含有对应像元的特征光谱信息。

实施例2

在实施例1的基础上，本实施例关于精密电控二维平台7的具体结构做出说明。

如图3所示，精密电控二维平台7还包括扫描平台台面16，扫描结构8和调焦结构12分别位于扫描平台台面16相邻的两侧外侧壁上，扫描平台台面16从上至下依次包括第一台面17、第二台面18和第三台面19，第一台面17与第二台面18、第二台面18与第三台面19滑动连接，扫描结构8带动第一台面17沿水平方向朝光学显微镜组3的成像镜头的方向运动，调焦结构12带动第一台面17和第二台面18作纵向运动。

作为一种优选地实施方式，台面的尺寸设置为60mmx60mm，确保能够满足各种类型的成像光谱仪5结构。

需要说明的是，扫描结构8与调焦结构12垂直设置，扫描结构8的运动方向与调焦结构12的运动方向均为水平方向，但是是相互垂直的。

实施例3

在上述实施例的基础上，本实施例关于扫描结构8和调焦结构12的具体结构做出说明。

如图3所示，扫描结构8包括扫描电机9、扫描推杆10和顶块一11，扫描电机9与第二台面18的外侧壁连接，扫描电机9的输出端与扫描推杆10的一端连接，扫描推杆10的另一端与顶块一11连接，顶块一11与第一台面17的外侧壁连接；

调焦结构12包括调焦电机13、调焦推杆14和顶块二15，调焦电机13与第一台面17和第二台面18的外侧壁连接，调焦电机13的输出端与调焦推杆14的一端连接，调焦推杆14的另一端与顶块二15连接，顶块二15与第三台面19的外侧壁连接。

为了满足扫描维度行程和调焦维度行程，优选地，扫描电机9和调焦电机13均设置在对应台面的各个直角处。

作为一种优选地实施方式，扫描电机9和调焦电机13的定位精度可以达到1um级别，重复定位精度能达到0.2um；供电需要DC12V。

另外，在第二台面18的侧面设置导轨座，顶块一11与导轨座滑动连接；通过导轨座与顶块一11的配合，能够确保扫描推杆10运行时的稳定性和平稳性。

本发明中扫描结构8通过直线电机加推杆的传动方式，与现有的使用同步驱动轮的方式相比，可以避免皮带老化导致的皮带轮松紧不一，进而引起的扫描和调焦精度降低的问题，提高了系统准确性能。

实施例4

在上述实施例的基础上，本实施例对本发明做出进一步地优化说明。

如图3所示，进一步地，第一台面17与第二台面18、第二台面18与第三台面19均通过交叉滚子导轨20滑动连接。

具体地，第一台面17与第二台面18、第二台面18与第三台面19之间均设置一组交叉滚子导轨20，每组的数量为两个且对称设置，确保第一台面17与第二台面18移动时的稳定性。

进一步地，第一台面17和第二台面18的中间位置分别设置有用于触发机械零点的限位片一21和限位片二。

限位片一21和限位片二的目的是扫描维度机械零点的触发部件和调焦维度上电机机械零点的触发部件，确保每次扫描的绝对起点位置是一致的，通过限位开关实现对扫描电机9和调焦电机13运行范围的控制。

只在机械零点位置设置有光电开关，而远端采用软件实现控制，因最大行程是25.4mm，所以，当软件里面的参数超出最大值时，系统不允许运行的，需在正确的参数下运行才可以，这样使得结构设计难度降低的同时，也使得体积更为精、小。

进一步地，精密电控二维平台7通过控制主板22实现运动控制，控制主板22设置在扫描平台台面16的内部；所有的部件的驱动控制信号都是通过此控制主板22进行发送等，进而实现精密运动控制。

需要说明的是，在精密电控二维平台7运行的过程中第三台面19是固定不动的。

本发明中精密电控二维平台7的工作原理为：开启调焦电机13，在顶块二15与第三台面19的固定作用下，调焦电机13带动第二台面18和第一台面17在纵向方向上运动，此过程中，扫描结构8随第二台面18同步运动，确定调焦维度后，开启扫描电机9，扫描电机9带动顶块一11朝光学显微镜组3的成像镜头的方向运动同时，同步带动第一台面17运动。

实施例5

在上述实施例的基础上，本实施例提供一种基于显微高光谱的原位层析成像系统的成像方法，包括以下步骤：

步骤S1：将样品放置在显微样品台25上，物镜24下方的像成像在高光谱相机1的成像狭缝上；

步骤S2：通过调焦结构12带动成像光谱仪5作纵向运动，确定调焦维度；

步骤S3：通过扫描结构8带动成像光谱仪5进行平移推扫成像，获取被测目标的一层图像数据；

步骤S4：通过调焦结构12调整成像光谱仪5在纵向方向上的位置，每调整一个间隔，重复执行步骤S3，得到多层图像数据；

步骤S5：将获取到的多层图像数据叠加，得到高光谱层析影像。

进一步地，步骤S3具体为：每次成X方向上的像后，在扫描结构8带动成像光谱仪5移动的过程中，面阵探测器6会对待测目标扫出一条带状轨迹从而完成Y方向上的扫描，根据X方向和Y方向上的扫描信息得到被测目标的一层三维高光谱图像数据，采集完成后，扫描结构8会带动成像光谱仪5返回到起点位置处，等待执行下一次的采集指令。

优选地，所述一个间隔为10um。

具体地，成像过程为：每次成一条线上的像后(X方向)，其检测系统的像平面维度在输送带前进扫描移动的过程中，排列的面阵探测器6平面则会对待测目标扫出一条带状轨迹从而完成纵向扫描(Y方向)，综合横纵扫描信息就可以得到样品的三维高光谱图像数据，无论是宏观状态下还是微观状态下，均能获取其目标的高光谱信息，通过对图像和光谱信息的分析可以对其进行定性和定量的分析。

如上述所说，精密电控二维平台7中的扫描电机9会带动成像光谱仪5运动，而成像光谱仪5获取图像是依靠其设计的狭缝结构来进行图像采集，那么如图4所示，圆圈中的线条简易指示为成像狭缝位置(即成像光谱仪5在扫描电机9带动下的位置)，那么成像狭缝从起点位置开始，在软件的控制下，一帧一帧的采集目标图像，直到到达终点位置处，面阵探测器6不再采集图像，扫描电机9完成了一个采集过程，再往前走，就超过了行程，狭缝被成像镜头的靶面会有遮光。所以扫描电机9会带着成像光谱仪5返回到起点位置处，以等待软件执行下一次采集指令，也就是系统执行自动复位功能。

上面也讲到了，系统成像是一个放大的关系，且系统扫描的都是目标的一个平面信息，由于不同目标自身的尺寸等因素，导致在不同倍率物镜下观察目标时，有的区域图像清晰，有的区域图像模糊，这是由于不同区域目标到面阵探测器6的距离不一样，也就是目标在物镜下观察时，景深的差异。为了克服这一现象，如图6所示，我们借助系统中的调焦电机13，实现成像光谱仪5与物镜24之间的空间距离的精细调整，通常情况下，显微状态下目标的景深在0～10um左右，所以，通过对调焦电机13维度的精密控制，实现不同景深尺度下，同一目标在其相同倍率物镜下，实现原位精准定位检测，通过不断的重复测试，将所设置的细分层，一层一层的高光谱图像采集完成。也就是对上面一个步骤的不断重复，调焦维度调整一个间隔，上面的那个步骤就执行一层，再调试，再测试，反复进行，直到所有目标的图像不清晰为止。

如果采用现有的借助电控扫描平移台的方式进行外置推扫成像，存在以下问题：

第一：不能保证待测样本在显微状态下始终处于原位状态，可能破坏样本自身的部分属性，获取到的信息可能存在偏差；

第二：对外置的电控扫描结构8的精度要求非常高，同样扫描150umx150um的区域的图像，那么外置扫描电控平台的移动精度很难达到；

第三：样品本身具有一定的尺度，在显微状态下观察时，由于景深、尺度等的问题，借助外置扫描的方式和纵向机械调整(通过外置电控平台来调整样品在显微物镜下的空间纵向位置)的方式精度控制很难做到，进而无法将待测目标的图像完全拍摄清楚，也做不到真正的层析成像的目的；

第四：还是采用外置推扫成像的方式，通过电动方式来控制显微物镜的升降来实现样品的层析成像时，其成本非常高，结构设计复杂，精度很难保证。

本发明可以获取显微不同放大倍率状态下目标的原位层析影像，依据不同的物镜，高光谱相机1所获取的视场大小也会有差异，低倍率物镜下可以获取大视场的高光谱影像，可以得到mm²级别的图像，对应目标的空间分辨率也随着物镜的数值孔径而得到确定；而高倍率物镜下则获取的视场相应的小很多，则得到目标的空间分辨率则相应的很高，能够分辨出更为精细的组织结构。

本发明可同时提供发光材料、靶向材料、药物载体、纳米药物、单颗粒、超分子组装体等纳米级别物质的图像影像数据和光谱分析，以及和组织细胞、细胞核、细菌、杆菌、病原体等相互作用之下的层析高光谱图像和光谱图像信息，同时进一步得到其定位、定性、定量的分析结果。

针对目前显微高光谱成像中，无法实现大面积显微成像的问题。

显微样品台25作为负载样品的结构，目前有电控方式和手动方式、电控加手动等多种，在上述完成某特别倍率下的显微层析成像后，可以通过软件或者其他方式来对显微样品台25进行精密移动控制，进而实现对载玻片上的其他区域进行检测测试，以此方式结合层析的流程实现对大面积样本区域的测试。

系统结构可以分为多种观察方式，高光谱相机1在侧方进行测试和在上方测试。在侧方的优势，可以借用高清像素的RGB相机可以获取到同步测试区域的RGB图像，可以为图像拼接、图像融合、精度提升等方面带来便携和好处。在上方测试，则不能同步得到高清晰的RGB图像来为后期图像处理带来技术支撑。

本发明利用高像素RGB相机为高分辨率、大面积显微层析高光谱成像提供拼接标定。

实施例5

在上述实施例的基础上，关于本发明的基本原理和工作过程做出进一步地说明。

基于像平面扫描方式的显微高光谱三维数据信息获取。

借助透射式成像光谱仪5，可以在紫外、可见光、近红外和中红外区域、获取许多非常窄且光谱连续的图像数据，为每个像元提供数十至数百个窄波段(通常波段宽度<10nm)光谱信息，能产生一条完整而连续的光谱曲线。成像光谱仪5每次成目标上一条线的像，并分光使每个光谱成分对应线阵上的一个像素点。因此，每一幅来自光谱相机的图像结构包括一个维度(空间轴)上的线阵像素和在另一个维度(光谱轴)上的光谱分布(光在光谱元素的强度)。

光谱相机的成像光谱仪5使用一个新的准直(轴上)光学构造和一个体全息透射光栅。这种构造提供高衍射效率和很好的线性光谱。由于轴上操作引起的几何畸变和透射光学的应用引起的独立的入射光偏振。透射光栅是人造全息在两块玻璃粘板之间的DCG(DiChormated Gelation)的上。DCG有很高的衍射效率、较低的色散、较低的多级衍射和不产生鬼线。由于这种材料较高的特征而普遍被用来生产光学元件。这种全息光栅是密封的，可以承受相当大的湿度、温度范围在-20～120℃、物理撞击和振动。

表一：

显微镜的景深计算方法:

景深表示，象平面上清晰的象所对应物平面的前后空间的深度：

注：这里以50X物镜为例：

1.5um＝(0.55um*1)/0.55+1/(50*0.55)*14um

(这里取中间值14um)公式中：D_tot：景深；NA：数值孔径；M：总放大率；λ：光波波长，(通常λ＝0.55um)；n：试样与物镜之间介质的折射率(空气:n＝1、油:n＝1.515)；e:可分辨的最小距离，检测器被放置在显微镜物镜的像面，其横向放大率是M(e一般是4um、5um、6um......24um)。

表二：

物镜	4X	10X	20X	40X	50X	100X
							数值孔径	0.1	0.25	0.45	0.65	0.55	1.25

显微镜横向空间分辨率:

如图7所示，显微镜横向空间分辨率σ指的是刚能分开物平面两点的最小距离；

式中：λ：光波波长(通常λ＝0.55um)；NA：物镜数值孔径；

横向空间分辨率取决于物镜的数值孔径，而与物镜放大倍数无关。

表三：

物镜	4/0.10	10/0.25	40/0.65	100/1.25
					空间分辨率	3.36um	1.34um	0.52um	0.27um

高光谱相机1所采用的精密电控二维平台7能够精准的为像平面扫描提供优于其他(外置扫描结构8，带动样品扫描的方式)扫描平台，集成在一起的调焦平台则能够为显微高光谱层析成像同样能够提供精准的微米级别的移动。

本方案中提到采用精密电控二维平台7来协助高光谱相机1完成像平面的扫描和层析影像，在推扫成像过程中，每次都只能获取目标的一行信息，在扫描电机9的带动下，目标在显微镜下的高光谱图像开始了一行一行的拼接成像，而由于待测目标尺度等的影响，显微镜下待测目标上的各区域的尺度或者说是清晰度不尽相同，导致高光谱相机1获取到的影像也不能是完全清晰的，出现图像局部清晰局部模糊的特点。

通过计算和实验验证得到的数据可以清楚的看到：在利用像平面方式来获取目标的原位显微高光谱成像时，高光谱相机1实际的扫描行程在1cm左右，扫描的行数为1000行，获取目标的实际尺寸在150umx150um的一个区域(50倍物镜为例)，二者衡量的尺度并不在一个级别上。

高光谱相机1内置的精密电控二维平台7的扫描维度在以一定的移动速度完成1cm的行程的过程中，待测目标对应的线视场宽度为150um，扫描宽度为150um，相机的采集帧速和曝光时间参数则可以精准的确定下来，这样在移动扫描过程中，电控扫描台的移动速度也是可以精准计算得到。依据高光谱相机1的特性，每采集一帧数据都能获取到其对应行目标的特征光谱信息，即得到与高光谱相机1成像狭缝对应的待测目标的实体位置在成像靶面上每个像素点的辐射亮度信号值。而伴随着扫描维度电控位移台的移动，对于样品开始进行扫描成像，而在这个过程中，电控调焦维度不做任何移动，确保扫描电机9带动高光谱相机1完成对样品第一层的成像。

由于样品(液体、固定)微观尺度的差异，在显微状态下不同位置的清晰度不一致，前面计算得到50倍物镜下的景深深度在1.5um左右。那么在完成对样品的第一层(最底层)的高光谱成像后，其高光谱相机1在扫描电机9的带动下会自动复位，通过软件控制，使二维平台的调焦维度的电机带动内置的高光谱相机1在纵向维度上移动特定的步距。例如：在50倍的显微物镜下总共的景深深度是1.5um，由于在显微镜模式下，图像均是被放大后才被光谱相机捕捉，如在显微镜下调整0.1um的距离，那么对于由调焦电机13带动高光谱相机1做纵向微调的距离可能不只是0.1um，对调焦电机13的精度要求就可以降低，通过计算，可以得到，调焦维度需要移动的距离是50um。这样把待测目标分成若干等距离的分层，确保其待测样品都有一个清晰的图像存在。

而高光谱像平面成像方式则可确保样品始终处于原位状态，通过对内置调焦电机13的不断调整(通过软件来实现调焦电机13在纵向上的自动调整)，调整一次，高光谱相机1就执行一次推扫成像。这样不断的调整纵向空间和多次的推扫成像，完成对待测目标一层一层的成像，最终得到待测目标每一层的高光谱影像信息，多次、多层的高光谱影像的叠加即为目标真正的层析影像。最终得到的高光谱影像信息能够表达出待测目标的层析影像信息和光谱信息。

由于本方案采用的是内置推扫方式，每幅图像在生成时，都是成像光谱仪5的狭缝对着目标进行行扫描，也就是说，每幅图像里面的1000行信息中，均会有部分行是能够清晰的记录到样品由于景深问题而凸显出清晰图像的信息及对应的空间位置。

一方面，这种方式保证了待测样本始终处于原位状态，未对样品的空间等其他信息带来干扰；另一方面，采用像平面扫描的方式，再借助对调焦维度电机的精准移动控制，可以获取到样品的每一层高光谱影像信息和光谱信息。

这样使得高光谱相机1获得显微状态下目标的原位层析高光谱图像，突出了高光谱技术本身是“图谱合一”的同时，又借助特殊的结构设计和应用方式能够对显微状态下目标三维结构的层析扫描成像。

基于像平面扫描的显微高光谱成像系统，扫描成像时，是行扫描的方式，所以在生成每幅显微高光谱图像时，其所扫描完成的1000多行信息中，有部分行能够清晰记录到监测区域清晰的图像，而另外一些区域则不能清晰的记录到监测区域清晰的图像信息。这样由于样品景深的问题就凸显出来，而本方案则借助高光谱相机1内置的纵向维度的调焦结构12来细分由于景深差异引起的图像不清晰的问题，内置的纵向维度的调焦结构12能够依据程序设定的移动步距在其纵向维度(样品景深维度)进行移动。

Claims (10)

1.一种基于显微高光谱的原位层析成像系统，其特征在于，包括高光谱相机(1)、光学成像透镜组(2)和光学显微镜组(3)；

所述高光谱相机(1)包括外壳(4)、与所述光学成像透镜组(2)相配合的成像光谱仪(5)、与所述成像光谱仪(5)一端连接的面阵探测器(6)、与成像光谱仪(5)底面连接的精密电控二维平台(7)，所述光学成像透镜组(2)与所述外壳(4)连接；

其中，所述精密电控二维平台(7)包括扫描结构(8)和调焦结构(12)，所述扫描结构(8)用于带动成像光谱仪(5)沿水平方向朝光学显微镜组(3)的成像面方向作相对运动，所述调焦结构(12)用于带动成像光谱仪(5)作纵向运动。

2.根据权利要求1所述的一种基于显微高光谱的原位层析成像系统，其特征在于，所述精密电控二维平台(7)还包括扫描平台台面(16)，所述扫描结构(8)和所述调焦结构(12)分别位于所述扫描平台台面(16)相邻的两侧外侧壁上，扫描平台台面(16)从上至下依次包括第一台面(17)、第二台面(18)和第三台面(19)，所述第一台面(17)与第二台面(18)、第二台面(18)与第三台面(19)滑动连接，扫描结构(8)带动第一台面(17)沿水平方向朝光学显微镜组(3)的成像镜头的方向运动，调焦结构(12)带动第一台面(17)和第二台面(18)作纵向运动。

3.根据权利要求2所述的一种基于显微高光谱的原位层析成像系统，其特征在于，所述扫描结构(8)包括扫描电机(9)、扫描推杆(10)和顶块一(11)，所述扫描电机(9)与第二台面(18)的外侧壁连接，扫描电机(9)的输出端与所述扫描推杆(10)的一端连接，扫描推杆(10)的另一端与所述顶块一(11)连接，顶块一(11)与第一台面(17)的外侧壁连接。

4.根据权利要求3所述的一种基于显微高光谱的原位层析成像系统，其特征在于，所述调焦结构(12)包括调焦电机(13)、调焦推杆(14)和顶块二(15)，所述调焦电机(13)与第一台面(17)和第二台面(18)的外侧壁连接，调焦电机(13)的输出端与所述调焦推杆(14)的一端连接，调焦推杆(14)的另一端与所述顶块二(15)连接，顶块二(15)与第三台面(19)的外侧壁连接。

5.根据权利要求2所述的一种基于显微高光谱的原位层析成像系统，其特征在于，所述第一台面(17)与第二台面(18)、第二台面(18)与第三台面(19)均通过交叉滚子导轨(20)滑动连接。

6.根据权利要求2所述的一种基于显微高光谱的原位层析成像系统，其特征在于，第一台面(17)和第二台面(18)的中间位置分别设置有用于触发机械零点的限位片一(21)和限位片二。

7.根据权利要求2所述的一种基于显微高光谱的原位层析成像系统，其特征在于，所述精密电控二维平台(7)通过控制主板(22)实现运动控制，所述控制主板(22)设置在扫描平台台面(16)的内部。

8.根据权利要求1所述的一种基于显微高光谱的原位层析成像系统，其特征在于，所述成像光谱仪(5)的成像狭缝的长度为14.2mm，宽度为30um。

9.一种基于权利要求1-8任一所述的显微高光谱的原位层析成像系统的成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：将样品放置在显微样品台(25)上，物镜(24)下方的像成像在高光谱相机(1)的成像狭缝上；

步骤S2：通过调焦结构(12)带动成像光谱仪(5)作纵向运动，确定调焦维度；

步骤S3：通过扫描结构(8)带动成像光谱仪(5)进行平移推扫成像，获取被测目标的一层图像数据；

步骤S4：通过调焦结构(12)调整成像光谱仪(5)在纵向方向上的位置，每调整一个间隔，重复执行所述步骤S3，得到多层图像数据；

步骤S5：将获取到的多层图像数据叠加，得到高光谱层析影像。

10.根据权利要求9所述的一种基于显微高光谱的原位层析成像系统的成像方法，其特征在于，所述步骤S3具体为：每次成X方向上的像后，在扫描结构(8)带动成像光谱仪(5)移动的过程中，面阵探测器(6)会对待测目标扫出一条带状轨迹从而完成Y方向上的扫描，根据X方向和Y方向上的扫描信息得到被测目标的一层三维高光谱图像数据，采集完成后，扫描结构(8)会带动成像光谱仪(5)返回到起点位置处，等待执行下一次的采集指令。

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