CN115575358A - 一种对单分子荧光共振能量转移信号进行分析的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对单分子荧光共振能量转移信号进行分析的方法，结合基于Fiji(ImageJ)的信号点位置提取以及基于MATLAB的信号点强度提取，对大量smFRET原始数据进行简便、高效的分析。该方法相对于基于IDL或(和)MATLAB的smFRET分析算法，使用门槛较低，算法简单，且对输入图像格式要求较为宽松，能够批量、高效地对smFRET原始数据进行处理；通过高效分析获得大量的smFRET数据保证了FRET状态分析的可靠性。本发明对smFRET数据的高效处理具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及分析单分子荧光共振能量转移信号的方法，具体涉及一种基于Fiji(ImageJ)和MATLAB算法提取信号点信息并分析单分子荧光共振能量转移状态的方法。
背景技术
单分子生物物理技术克服了传统生物学研究手段无法提供个体差异信息和时间维度信息的缺点，发展成为研究生物分子活动的有力工具。荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)技术是基于两个荧光分子在空间距离很近时产生的一种能量转移现象而发展的成像方法，其实现主要依赖一对荧光发色的基团(供体和受体荧光团)：当两个荧光团的空间位置足够靠近时(<10nm)，供体基团吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现能量向邻近受体分子的转移。FRET可以作为“光谱标尺”提供供体荧光团和受体荧光团之间的距离信息。单分子技术与FRET技术的结合产生了单分子荧光共振能量转移(single-molecule FRET，smFRET)技术。smFRET是目前在水溶液中研究生物分子动态行为的重要单分子技术之一，可以在纳米尺度提供单个生物分子内部或分子间的空间信息。近二十年来，smFRET已被全世界多个研究团队使用来研究各种各样的生物体系，包括DNA、RNA、蛋白以及生物分子复合物等。
尽管smFRET技术自其被开发以来已经获得了广泛应用，但是smFRET数据的分析仍然是研究者关注的重点问题之一。一方面，背景噪点及非单分子荧光信号的存在会干扰smFRET信号点的分析，能否在这些信号的干扰下提取出真实的单分子信号决定了后续分析的质量；另一方面，从原始的smFRET信号提取出特定条件下的FRET状态往往需要大量数据的支撑，这使得高效的数据分析方法成为必然。已有的smFRET分析方法因实验团队而异：基于IDL(Interactive Data Language)编写脚本进行信号点提取是使用较多的方法之一，例如smFRET领域的权威专家Taekjip Ha团队提供了一种使用IDL脚本提取信号点并使用MATLAB进行后续分析的完整分析方案，但其算法较为复杂且涉及IDL及MATLAB两种编程语言，所使用的IDL脚本对图像采集方式、输入文件格式及图像大小有严格限制，并且未实现对多组smFRET原始图像的连续、高效的信号提取；此外，有工作基于MATLAB对信号点进行提取(例如，SPARTAN)，但一次只能处理一组smFRET原始图像，不能进行连续、高效的分析。
发明内容
针对现有分析方法算法复杂且不能对大量smFRET数据进行高效分析的缺点，本发明基于Fiji(ImageJ)和MATLAB开发了一种分析smFRET数据的新方法。Fiji(ImageJ)是被科研人员广泛使用的开源图像处理软件，使用门槛较低且对输入图像格式要求较为宽松，结合ImageJ宏(macro)语言的使用可以批量处理多个smFRET图像；本发明提供的MATLAB算法也较为简便，可以实现对smFRET信号的自动、高效筛选以及FRET状态的分析。本发明基于ImageJ和MATLAB开发，旨在提供一种可以简便、高效分析smFRET数据的方法。
本发明提供的技术方案如下：
一种简便、高效地对smFRET原始数据进行信号提取并基于大量数据进行FRET状态分析的方法，包括以下步骤：
1)使用ImageJ对采集的smFRET荧光信号原始图像进行预处理并提取信号点位置：
1a.预处理：
本发明使用光分离系统如DV2-CUBE(ET585/65M，635LPXR，ET655LP，Photometrics)分离FRET的双通道信号，获得供体(donor)如ATTO550和受体(acceptor)如ATTO647N的荧光信号合并在一起的原始smFRET图像(以2000帧为例，前1000帧对应收集的受体信号，后1000帧对应收集的供体信号)。为了便于后续处理，首先使用“Make Substack”将原始图像按受体和供体通道分别提取为acceptor.tif和donor.tif；分别对acceptor.tif和donor.tif的所有帧做“Subtract Background”(减背景信号处理)以降低背景信号对真实信号强度的影响，并另存为“Image Sequence”以便后续在MATLAB中进行处理。其中，“Subtract Background”处理的rolling ball radius(滚动半径)优选在10～50像素范围内，在本发明的一个实施例中，rolling ball radius＝30pixels。
1b.提取信号点位置：
为了获得一次拍摄过程中所有被激发的荧光分子信号位置，首先分别对acceptor.tif和donor.tif的所有帧做“Z project”(“Max Intensity”模式)，该处理将每个像素在所有帧中最大的信号强度赋值给该像素，得到一张2D的Z投影图，包含了所有在拍摄过程中出现过的荧光分子信号。
为了提取供体荧光信号点的位置，首先需要设置一定的阈值以去除大部分背景噪声：①为了提高信噪比以提高设置阈值对信号和背景的区分能力，先使用“Find Edges”处理供体通道的Z投影图，该项处理可以突出信号变化强烈的边界信号而降低在空间上无明显信号强度变化的背景区域信号强度；②其后使用“Threshold”设置阈值以选择适当强度范围内的信号。③阈值设置后，使用“Analyze Particles”(size＝9-49，circularity＝0.90-1.00，show＝[Count Masks]，display exclude summarize)对选中的信号点进行分析(size值与使用的荧光团和实验条件有关，本发明实验例的条件下单分子信号的大小一般为9-49pixel^2，可根据具体实验进行调整；circularity的取值范围在0-1，0对应分析的目标particle为线形，1对应分析的目标particle为圆形。由于衍射，单分子在图像上往往呈现为一个高斯信号点，因此将circularity设置为0.90-1.00，从而仅分析近似为圆形的信号点，筛除非高斯噪点以及聚集在一起的信号)。该步骤最终生成一张仅保留目标信号点而其他像素值为0的Mask图。④对得到的Mask图做“Find Maxima”(prominence＝0，strictexclude，output＝List)，得到每个目标信号点的位置坐标，将得到的坐标列表另存为pos.csv文件以便后续分析。
最后，对前述得到的供体通道Z投影图做“Subtract Background”，另存为donor_ref.tif作为后续分析的一张参考图。其中，“Subtract Background”处理的rolling ballradius(滚动半径)优选在10～50像素范围内，在本发明的一个实施例中，rolling ballradius＝30pixels。
对于acceptor.tif，对所有帧做“Z project”(“Max Intensity”模式)处理得到的受体通道Z投影图做“Subtract Background”(rolling ball radius优选为10-50pixels，例如＝30pixels)，另存为acceptor_ref.tif以进行后续共定位分析。
上述ImageJ处理步骤既可以对单张图进行分步操作，也可以被集成在一个ImageJMacro中运行，还可以通过简单的循环语句实现smFRET图像的批量、连续处理。
2)使用MATLAB算法提取信号点强度信息并进行FRET状态分析：
2a.提取信号点强度信息：
由于ImageJ提取到的信号点位置是经过“Find Edges”处理过的信号点位置，与实际的信号点中心坐标有一定偏差，因此需要对pos.csv中的位置坐标进行校正。以donor_ref.tif作为参考图，在pos.csv中的坐标位置周围(如3*3像素范围内，通常不超过5*5像素范围)寻找信号点最强的坐标位置，从而对ImageJ处理得到的供体信号点位置进行校正；以校正后的信号点位置为中心，计算其周围(如5*5像素范围，该值由信号点大小决定，可根据实际情况适当增加或缩小)内的信号强度平均值，得到相应供体信号点位置的信号强度随时间的变化轨迹。
由于受体与供体两通道可能存在轻微偏移，因此上述步骤得到的供体信号点位置不一定恰好对应受体信号点的中心位置。因此，以acceptor_ref.tif作为参考图，在校正后的供体信号点位置周围(如5*5像素范围内)寻找受体信号点最强的坐标位置，以该位置为中心，计算其周围(如5*5像素范围内，该值由信号点大小决定，可根据实际情况适当增加或缩小)的受体信号强度平均值，得到与每个供体信号点对应的受体信号的强度随时间的变化轨迹。
2b.FRET状态分析：
基于供体信号强度和受体信号强度，使用MATLAB进行后续分析。具体分析包括：①使用TJmultistepFinder.m函数(基于Jacob W.J.Kerssemakers等人的代码略作改编，原始文献为Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.(Nature.2006Aug 10；442(7103):709-12.Nature.2006；442(7103):709–712.))对供体信号强度进行阶梯函数形式的拟合并对过拟合进行适当校正，在该拟合下，一个step代表一个被激发的供体荧光分子，因此拟合结果中仅有一个step的信号是单分子供体信号；②将供体信号为单分子的信号点用于后续分析：对单分子荧光被激发的时间区间内的信号强度使用公式(1)计算FRET效率，最后对所有单分子信号点的FRET效率均值进行统计分析，绘制直方图观察分布情况。
其中，IA代表受体信号强度，ID代表供体信号强度。
本发明结合基于Fiji(ImageJ)的信号点位置提取以及基于MATLAB的信号点强度提取，对大量smFRET原始数据进行简便、高效的分析。该方法相对于基于IDL或(和)MATLAB的smFRET分析算法，使用门槛较低，算法简单，且对输入图像格式要求较为宽松，能够批量、高效地对smFRET原始数据进行处理；通过高效分析获得大量的smFRET数据保证了FRET状态分析的可靠性。本发明对smFRET数据的高效处理具有重要意义。
附图说明
图1.本发明实施例获取smFRET数据的实验设计。
图2.本发明使用的smFRET数据分析流程图，其中虚线矩形框内为ImageJ处理时仅对供体图像进行处理的步骤。
图3.本发明实施例的smFRET数据分析结果(数据来自1513个单分子信号点)。
具体实施方式
下面的实施例以同时结合有MBA与MBD的biotin-oligo为研究对象，介绍本发明在分析smFRET数据中的应用。
本实施例设计了如图1所示的实验以制备smFRET样品并获取smFRET数据，包括：
1)制备biotin-FRET-oligo：委托公司合成3’端修饰有生物素(biotin)的寡核苷酸链(biotin-oligo)，全长为58bp，含有与5’端标记有受体荧光团(Atto647N)的分子信标(Molecular beacon，MB)MBA以及3’端标记有供体荧光团(Atto550)的MBD互补的序列，两段序列间隔4bp。将biotin-oligo与MBA、MBD在体外互补，获得可以发生FRET的biotin-FRET-oligo。
2)制备具有PEG修饰的功能化盖玻片：对玻片表面进行聚乙二醇(PEG)修饰，一方面可以降低探针非特异吸附，另一方面可通过(biotin-PEG)-中性亲和素(NeutrAvidin)-(biotin-FRET-oligo)的相互作用将biotin-FRET-oligo连接在玻片表面。
3)获取smFRET数据：将biotin-FRET-oligo连接在玻片表面后，通过全内反射荧光显微镜(Total Internal Reflection Fluorescent Microscope，TIRFM)采集smFRET荧光信号。
具体实验如下：
1试剂与仪器
1.1主要试剂与材料
1)Biotin-Oligo(订购于生工生物工程(上海)股份有限公司)，MBA与MBD(订购于IDT(Integrated DNA Technologies,Inc))。
2)功能化盖玻片制备：盖玻片(可购于Warner Instruments)、Hellmanex III、无水乙醇、甲醇、乙酸、APTES((3-aminopropyl)triethoxysilane)、mPEG-SVA(mPEG-Succinimidyl Valerate)、SVA-PEG-SVA(Succinimidyl Valerate-PEG-SuccinimidylValerate)、Biotin-PEG-SVA(Biotin-PEG-Succinimidyl Valerate)(PEG试剂均购于Laysan Bio)，NaHCO3，NeutrAvidin。除特别说明，其余试剂均可购于Sigma-Aldrich。
3)磷酸缓冲液溶液(phosphate buffer saline，PBS)，成像缓冲液(PBS中加入glucose oxidase(1mg/mL)，catalase(0.04mg/mL)，0.8％dextrose，2mM Trolox)。试剂均可购于Sigma-Aldrich。
1.2主要仪器
1)超声波清洗仪。
2)生物安全柜。
3)荧光显微镜。
2实验方法
2.1制备biotin-FRET-oligo
Biotin-oligo、MBA、MBD均由公司合成(核酸序列见表3)。通过混合等摩尔量的biotin-oligo、MBA、MBD，使它们以4μM的终浓度在PBS中室温互补过夜，制备biotin-FRET-oligo。
2.2制备功能化盖玻片
1)清洗玻片：将盖玻片在Hellmanex III中浸泡过夜后，用超声波清洗仪超声25min(100％功率)；接着，用镊子夹起每一片盖玻片用流动的超纯水冲洗，再将盖玻片放入超纯水中超声15min(100％功率)；最后用无水乙醇以100％功率超声25min。
2)使用APTES处理玻片：将已清洗的玻片浸泡在2％APTES溶液(表1)中过夜，之后用大量超纯水进行清洗。
表1配制2％APTES溶液(150mL)
3)用PEG修饰玻片表面：配制0.1M的NaHCO3溶液(现用现配)，称取3种PEG到EP管中(表2)，用1mL的0.1M NaHCO3溶解并混匀，直到大部分固体都溶解，14800rpm离心1min；取50μL上清到被APTES处理后的盖玻片上，然后将另一片叠加上去，在湿润干净的盒子里室温静置3h，用超纯水冲洗。为了确保玻片表面均被PEG修饰，降低蛋白在表面的非特异吸附，可重复该步骤一次，但不加入Biotin-PEG-SVA，静置1h即可。
表2配制不同种类PEG
2.3制备smFRET样品
1)在功能化盖玻片表面孵育NeutrAvidin，使之与玻片表面的Biotin-PEG结合，然后用大量PBS冲洗未结合的NeutrAvidin；
2)将biotin-FRET-oligo用PBS稀释到100pM。在修饰有NeutrAvidin的功能化盖玻片上孵育biotin-FRET-oligo，通过biotin与NeutrAvidin的反应将biotin-FRET-oligo连接在盖玻片上，然后用大量PBS冲洗未结合的biotin-FRET-oligo。
2.4 smFRET数据的获取
在成像缓冲液中使用TIRFM观察样品。使用奥林巴斯倒置荧光显微镜(OLYMPUSIX83)进行荧光成像。使用561nm激光激发，使用物镜UAPON OTIRF 100×/1.49，使用光分离系统DV2-CUBE(ET585/65M，635LPXR，ET655LP，Photometrics)分离FRET的双通道信号，使用EMCCD相机(Andor)和成像软件CellSens Dimension获取图像(参数设置：曝光时间设为30ms，电子倍增增益(EM gain)设为300)。
2.5分析smFRET数据
smFRET数据分析流程如图2所示。
1)在ImageJ中进行预处理及信号点提取：
①使用“Make Substack”将原始图像按通道分别提取为acceptor.tif和donor.tif；分别对acceptor.tif和donor.tif的所有帧做“Subtract Background”(rolling ball radius＝30pixels)，另存为“Image Sequence”。
②对①获得的acceptor.tif和donor.tif的所有帧做“Z project”(“MaxIntensity”模式)；其中，对于供体通道提取的图像donor.tif，获得其Z投影图后，使用“Find Edges”处理Z投影图；使用“Threshold”设置阈值以选择适当强度范围内的信号；使用“Analyze Particles”(size＝9-49，circularity＝0.90-1.00，show＝[Count Masks]，display exclude summarize)对选中的信号点进行分析，该步骤最终生成一张仅保留目标信号点而其他像素值为0的Mask图；对得到的Mask做“Find Maxima”(prominence＝0，strict exclude，output＝List)，将得到的坐标列表另存为pos.csv文件。
③对于donor.tif，对所有帧做“Z project”(“Max Intensity”模式)得到的Z投影图做“Subtract Background”(rolling ball radius＝30pixels)，另存为donor_ref.tif；对于acceptor.tif，对所有帧做“Z project”(“Max Intensity”模式)得到的Z投影图做“Subtract Background”(rolling ball radius＝30pixels)，另存为acceptor_ref.tif。
上述ImageJ处理步骤可以被集成在一个ImageJ Macro(getpositions.ijm)中运行，通过将原始图像存在同一个文件夹中并运行getpositions.ijm即可实现该文件夹下的原始smFRET数据的批量、高效信号点位置提取。
2)在MATLAB中提取信号点强度信息并进行FRET状态分析：
①以donor_ref.tif作为参考图，对ImageJ处理得到的donor信号点位置pos.csv进行校正；以校正后的信号点位置为中心，计算相应donor信号点位置的信号强度随时间的变化轨迹；
②以acceptor_ref.tif作为参考图，校正acceptor信号点位置，计算与每个donor信号点对应的acceptor信号的强度随时间的变化轨迹；
③使用TJmultistepFinder.m函数(基于Jacob W.J.Kerssemakers等人的代码略作改编，原始文献为Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.(Nature.2006 Aug 10；442(7103):709-12.Nature.2006；442(7103):709–712.))对信号强度进行阶梯函数形式的拟合并对过拟合进行适当校正；
④将donor信号为单分子的信号点用于后续分析：对单分子荧光被激发的时间区间内的信号强度使用公式(1)计算FRET效率，计算FRET效率平均值，最后对所有信号点的FRET效率均值进行统计分析，绘制直方图观察分布情况。
该实施例共通过显微拍摄得到40组原始smFRET数据，提取到1513个donor单分子信号点，得到的FRET效率均值分布如图3所示，呈现出高斯正态分布的特征。使用高斯函数对该分布进行拟合，该实施例条件下的FRET效率分布是均值为0.23的高斯分布，拟合优度R2＝0.99。
表3本实施例所使用的核酸序列
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
<120> 一种对单分子荧光共振能量转移信号进行分析的方法
<130> WX2021-03-134
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgacaggagt tgtgtttgtg gacgaagcaa gctcagtcac gacatcactt acgctagc 58
<210> 2
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> 2'-O-甲基化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 硫代磷酸修饰
<400> 2
cuucguccac aaacacaacu ccugaag 27
<210> 3
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> 2'-O-甲基化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(22)
<223> 硫代磷酸修饰
<400> 3
cucagcguaa gugaugucgu gacugag 27
Claims (8)
1.一种对单分子荧光共振能量转移信号进行分析的方法，包括以下步骤：
1)使用ImageJ软件对采集的smFRET原始图像进行预处理并提取信号点位置，包括：
1a)预处理：
使用“Make Substack”将smFRET原始图像按受体和供体通道分别提取为acceptor.tif和donor.tif；分别对acceptor.tif和donor.tif的所有帧做“Subtract Background”处理以降低背景信号对真实信号强度的影响，并另存为“Image Sequence”；
1b)提取信号点位置：
首先，分别对acceptor.tif和donor.tif的所有帧做“Z project”处理，将每个像素在所有帧中最大的信号强度赋值给该像素，分别得到一张2D的受体通道和供体通道的Z投影图；
接着，使用“Find Edges”处理供体通道的Z投影图以突出信号变化强烈的边界信号而降低在空间上无明显信号强度变化的背景区域信号强度，然后使用“Threshold”设置阈值选择适当强度范围内的信号，再使用“Analyze Particles”对选中的信号点进行分析，生成一张仅保留目标信号点而其他像素值为0的Mask图；对得到的Mask图做“Find Maxima”处理，得到每个目标信号点的位置坐标，将得到的坐标列表另存为pos.csv文件；
同时，对供体通道和受体通道的Z投影图分别做“Subtract Background”处理，分别另存为donor_ref.tif和acceptor_ref.tif；
2)使用MATLAB算法提取信号点强度信息并进行FRET状态分析，包括：
2a)提取信号点强度信息：
以donor_ref.tif作为参考图，对pos.csv中的供体信号点位置坐标进行校正，然后以校正后的信号点位置为中心，计算相应供体信号点位置的信号强度随时间的变化轨迹；以acceptor_ref.tif作为参考图，在校正后的供体信号点位置周围寻找受体信号点最强的坐标位置，以该位置为中心，计算其周围的受体信号强度平均值，得到与每个供体信号点对应的受体信号的强度随时间的变化轨迹；
2b)FRET状态分析：
对供体信号强度进行阶梯函数形式的拟合，在该拟合下，一个step代表一个被激发的供体荧光分子，因此拟合结果中仅有一个step的信号是单分子供体信号；将供体信号为单分子的信号点用于后续分析：对单分子荧光被激发的时间区间内的信号强度使用公式(1)计算FRET效率：
其中，IA代表受体信号强度，ID代表供体信号强度；
最后对所有单分子信号点的FRET效率均值进行统计分析，绘制直方图观察分布情况。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中做“Subtract Background”处理时rolling ball radius为10～50pixels。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中做“Subtract Background”处理时rolling ball radius＝30pixels。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)对单张图进行分步操作，或者集成在一个ImageJ Macro中运行。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1b)中使用“Analyze Particles”对选中的信号点进行分析时，设定size＝9-49，circularity＝0.90-1.00。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2a)中，以donor_ref.tif作为参考图，在pos.csv中的坐标位置周围3*3像素范围内寻找信号点最强的坐标位置，从而对供体信号点位置进行校正；以校正后的信号点位置为中心，计算其周围5*5像素范围内的信号强度平均值，得到相应供体信号点位置的信号强度随时间的变化轨迹。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2a)中，以acceptor_ref.tif作为参考图，在校正后的供体信号点位置周围5*5像素范围内寻找受体信号点最强的坐标位置，以该位置为中心，计算其周围5*5像素范围内的受体信号强度平均值，得到与每个供体信号点对应的受体信号的强度随时间的变化轨迹。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2b)使用TJmultistepFinder.m函数对供体信号强度进行阶梯函数形式的拟合并对过拟合进行校正。
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