CN115558708A - 一种基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法，涉及核酸检测技术领域。包括如下步骤：S1：根据目标基因的核酸序列设计合成核酸探针和扩增引物；S2：将待测样品滴加到表面覆盖有光敏凝胶的芯片模板上，进行电泳，电泳结束后，通过UV交联固定蛋白质和/或核酸；S3：以DNA为模板，利用扩增引物进行滚环扩增，得到扩增的线性DNA序列；S4：向扩增的线性DNA序列中加入末端带有标记抗体的核酸探针，通过核酸探针特异性结合线性DNA序列，产生用于检测的局部特异性信号，通过观察荧光信号实现痕量核酸检测。本发明是光敏凝胶固定核酸强力高效，固定稳固，不会影响DNA的活性，不影响探针的互补配对，可显著提升原方法的灵敏度，且检测效率高，较为经济。

Description

一种基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法。
背景技术
滚环扩增(RCA)是一种基于分子生物学的等温核酸扩增技术。RCA反应需要4个组分：①环状DNA模板，称为RCA模板；②与RCA模板部分互补的DNA/RNA引发链；③具有链置换活性的DNA/RNA聚合酶(如Phi29 DNA聚合酶)④脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)。RCA模板通常是一条15～200个碱基的单链DNA分子，在DNA连接酶(如T4 DNA连接酶或Taq DNA连接酶)和一条与模板的5’端和3’端部分互补的单链引物的作用下，模板DNA的5’磷酸端(5’一P)与3’羟基端(3’一OH)连接环化，以形成的环状模板用于后续扩增，通过酶催化剂将dNTP转化为由数千个串联重复的环拷贝组成的单链串联DNA分子。RCA的指数化扩增能力最高能达到109倍测。RCA产物(单链或双链DNA)还可以与各种核酸荧光染料(SYBR Green I、SYBR GreenlI等)结合，实现对扩增产物的实时或终点检测。
与其他扩增程序不同，RCA产生的单个扩增产物仍与DNA引物相连。因此，RCA非常适合固相格式，例如用于在特定微阵列位置产生局部信号的微阵列。RCA的这一独特特性可以允许同时进行许多检测(多路复用)而不会受到干扰。
传统的PCR扩增程序不能配置用于芯片上的扩增，主要是由于温度循环对反应组分(如分析物、样品或微阵列基板)的有害影响。而作为等温过程，RCA克服了对用于温度循环的昂贵和笨重设备的需求。RCA信号放大在检测DNA靶标上的应用已经证明了其可以应用于固体表面以及微阵列上的超灵敏检测。
目前，RCA检测技术一般用来进行核酸信号的检测。如Li等采用锁式探针对待检DNA单链进行特异性识别【Talanta 191,277-282,】，预先设计的锁式探针能与含有突变碱基的DNA单链特异性结合并在连接酶的作用下环化，投入的RCA引物可与得到的环状模板结合，发生RCA。通过投入SYBR Green I对RCA的双链产物进行染色，实现对待检物的荧光检测，其检测限为0.05nmol/L。该方法利用锁式探针实现目标物的特异性识别，再引入RCA对信号进行放大，只需荧光读数仪既可实现信号的读取；Stephen等将探针嵌入凝胶，构成捕获微阵列【Analytical Chemistry 83,7179-7185】，将捕获的所有miRNA作为扩增引物，进行滚环扩增，从而能够用多个荧光报告基因标记每个靶标，直接检测少量未加工人血清样品中的miRNA，而无需RNA提取或靶标扩增步骤。Kashkin等使用固定的特异性挂锁探针，该探针专为人类基因组研究而设计，能够特异性识别人类p53基因是否发生了单碱基突变，选择性进行环化，如果发生突变，那么将开启滚环扩增，输出信号【Molecular Biology 39,26-34】；wang等则在透明化的组织切片中残存的mRNA进行靶向RCA。以单细胞分辨率以高效率成功在小鼠大脑切片中同时识别了160至1020个基因【Science 361,eaat5691】。
然而，上述利用RCA进行核酸检测仍存在以下几点问题；1、目样本需要提取，富集核酸后才能扩增，损失率较高；2、样本需求量大，通常是组织块，没有办法分析稀有样品；3、事先包埋在微阵列里的探针无法对多种靶标进行检测，通量低。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种无需进行样本提取、样本需求小、检测效率高的基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是技术问题是提供一种无需进行样本提取、样本需求小、检测效率高的基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法，包括如下步骤：
S1：根据目标基因的核酸序列设计合成核酸探针和扩增引物；
S2：将待测样品滴加到表面覆盖有光敏凝胶的芯片模板上，进行电泳，电泳结束后，通过UV交联固定蛋白质和/或核酸；
S3：以DNA为模板，利用扩增引物进行滚环扩增，得到扩增的线性DNA序列；
S4：向扩增的线性DNA序列中加入末端带有标记抗体的核酸探针，通过核酸探针特异性结合线性DNA序列，产生用于检测的局部特异性信号，通过观察荧光信号实现痕量核酸检测。
在本发明的较佳实施方式中，所述光敏凝胶采用如下方法制备：
将N-(3-甲基丙烯酰胺丙基)-2-(1-甲基-1H-吡咯-2-基)-2H-四唑-5-甲酰胺(MAP-mPyTC)与丙烯酰胺和N，N'-亚甲基双丙烯酰胺共聚，形成mPyTC改性的聚丙烯酰胺凝胶溶液；
稀释mPyTC改性的聚丙烯酰胺凝胶溶液，使其质量分数达到4％-8％，即得光敏凝胶。
进一步的，所述mPyTC改性的聚丙烯酰胺凝胶溶液由250ul 1X TBE溶液，129.5ulddH2O，100ul 30％浓度的丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺的复合液，12.5ul甘油，4ul APS，4ulTEMED制成的混合溶液进行稀释，稀释后的mPyTC改性的聚丙烯酰胺凝胶溶液质量分数为6％。
在本发明的另一较佳实施方式中，步骤S2中，表面覆盖有光敏凝胶的芯片模板的制备方法如下：
将光敏凝胶溶液铺展在芯片模板上，然后用硅烷化的载玻片覆盖，提起载玻片，将芯片模板保存在湿箱中，使用前加入电泳缓冲液0.5X TBE，120V电压冰上预电泳60分钟。
进一步的，硅烷化的载玻片的制备方法为：将标准载玻片用硅烷化试剂处理30分钟，然后分别用甲醇，去离子水洗涤两次，再用氮气干燥，即得。
在本发明的较佳实施方式中，步骤S2中，所述待测样品滴加到表面覆盖有光敏凝胶的芯片模板上前，还包括如下预处理步骤：向待测样品细胞中加入胰酶-EDTA，在37摄氏度进行消化，再用血清中和，PBS吹打重悬，然后滴加到表面覆盖有光敏凝胶的芯片模板表面。
进一步的，步骤S2中，在电泳前，待测样品在表面覆盖有光敏凝胶的芯片模板上加载5-10min，然后利用磷酸盐缓冲液冲洗过量的细胞后，再进行电泳。
在本发明的较佳实施方式中，所述UV光照的波长为300-340nm，光照的时间为30s-10min。
优选的，步骤S3中，滚环扩增的DNA模板选自环状DNA模板、哑铃状DNA环化、或是类哑铃状DNA环化中的任意一种。
优选的，步骤S4中，所述标记抗体选自荧光、酶、胶体金、超顺磁性微球标记抗体中的任意一种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)使用微阵列让细胞落孔，单细胞检测，能够精细划分细胞亚群，下限低，可满足稀有样品的检测需求，实现痕量检测；光敏凝胶固定核酸强力高效，固定稳固，不会影响DNA的活性，不影响探针的互补配对，可显著提升原方法的灵敏度；
(2)经过电泳分离的核酸，在紫外光照射下将会与胶内光敏分子稳定结合，不易损失，提高了检测灵敏度；且紫外激发时间更短，能避免引起核酸变性，节省实验时间，降低人力时间成本；紫外激发波谱更窄且波长更长，能量更低，降低紫外引起胶内部背景自发荧光；
(3)由于目标DNA与凝胶稳定结合，可以使用多轮不同的探针检测，大大提高样本检测效率；在多靶标检测时，可以反复洗脱，反复孵育不同探针，效率高；
(4)电泳所需时间短，不过度增加实验时间、成本、人力等负担；
(5)非选择性，可同时非选择性固定所有核酸嘧啶部分，电泳结果可保存较长时间，条带不弥散。避免由于方法本身造成对某特定核酸的漏检、误检；
(6)常温扩增，有利于保护胶内样本，避免变性；
(7)凝胶生产和制备价格低廉。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1为本申请的光敏凝胶捕捉核酸的示意图；
图2为本申请的实验流程图；
图3为本申请中滚环扩增DNA模板类型；
图4为本申请中滚环扩增方式示意图；
图5为本申请中滚环扩增实验原理示意图；
图6为本申请中以CY3修饰探针检测，滚环扩增检测AF594基因图；
图7为本申请中靶标AF594和滚环扩增产物染色结果的荧光强度图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
在附图中，结构相同的部件以相同数字标号表示，各处结构或功能相似的组件以相似数字标号表示。附图所示的每一组件的尺寸和厚度是任意示出的，本发明并没有限定每个组件的尺寸和厚度。为了使图示更清晰，附图中有些地方适当夸大了部件的厚度。
本发明公开了一种基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法，包括如下步骤：
S1：根据目标基因的核酸序列设计合成核酸探针和扩增引物；
S2：将待测样品滴加到表面覆盖有光敏凝胶溶液的芯片模板上，进行电泳，电泳结束后，通过UV交联固定蛋白质和/或核酸；
S3：以DNA为模板，利用扩增引物进行滚环扩增，得到扩增的线性DNA序列；
S4：向扩增的线性DNA序列中加入末端带有标记抗体的核酸探针，通过核酸探针特异性结合线性DNA序列，产生用于检测的局部特异性信号，通过观察荧光信号实现痕量核酸检测。
下面通过具体实施例例来说明。
实施例1：光敏凝胶的合成路线
Figure BDA0003935806790000051
Step 1：2-(1-甲基-1H-吡咯-2-基)-2H-四唑-5-羧酸乙酯
Figure BDA0003935806790000052
1.溶解甲基-1氢-吡咯(5g，12.5mmol)于30mL三氟乙醇。
2.在-40℃，往1中溶液加入二乙酸碘苯(20g,62.5mmol)。
3.氮气保护，于-40℃，搅拌2h。
4.将产物浓缩至黑色油状，溶解于二氯甲烷。
5.往4中溶液加入5-甲酸乙酯四氮唑(3g,21.6mmol),三氟甲烷磺酸铜(II)(3.1g,8.6mmol),and三乙胺(16ml,108mmol)
6.氮气保护，室温搅拌24h。
7.反应结束后，用饱和氯化铵，卤水洗涤产物，无水硫酸镁干燥，过滤干燥。
8.用硅胶快速层析(洗脱剂为PE:EA＝5:1)进一步纯化产物，得到棕色油状产物I。
9.产率：450mg(9.6％)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.13-7.00(m,1H),6.65(dd,J＝3.9,1.9Hz,1H),6.24(dd,J＝3.9,3.0Hz,1H),4.47(q,J＝7.1Hz,2H),3.65(s,3H),1.37(t,J＝7.1Hz,3H).[M+H+],222.0。如图所示。
Step 2：2-(1-甲基-1H-吡咯-2-基)-2H-四唑-5-羧酸
Figure BDA0003935806790000061
1.溶解Step 1中产物I(450mg,2mmol)于1:1MeOH/H2O(20ml)中。
2.于0℃，往1中溶液加入氢氧化锂(850mg,10mmol)。
3.将2中混合物置于室温，氮气保护，搅拌反应2h。
4.反应结束后，于0℃加入2N HCL，调节pH为4-5。
5.用乙酸乙酯溶液萃取，并用卤水洗涤混合有机相，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩为棕色固体产物II(370mg，产率94％)。[M+H+],194.1。
Step 3：N-(3-甲基丙烯酰胺基丙基)-2-(1-甲基-1H-吡咯-2-基)-2H-四唑-5-甲酰胺
Figure BDA0003935806790000062
1.将N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐(370mg,1.67mmol)溶解于20mL四氢呋喃中。
2.于0℃，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCl.HCl,650mg,3.34mmol),1-羟基苯并三唑(HOBt,220mg,1.67mmol),反应30min。
3.将Step 2中产物II(300mg,1.67mmol),三乙胺(850mg,8.35mmol)加入2中混合溶液，搅拌回流反应过夜。
4.反应结束后，用制备型HPLC纯化产物，得到白色粉末III(41mg,产率6.7％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ6.97–6.82(m,1H),6.60(dd,J＝4.0,1.9Hz,1H),6.23(dd,J＝3.9,3.0Hz,1H),5.78–5.64(m,1H),5.50–5.23(m,1H),3.71(s,3H),3.50(t,J＝6.8Hz,2H),3.36(t,J＝6.7Hz,2H),2.03–1.92(m,3H),1.87(p,J＝6.7Hz,2H).[M+H+],318.1。
实施例2：表面覆盖有光敏凝胶的芯片模板的制备
其具体的流程图如图2所示。
1、制备电泳用光敏凝胶
光敏凝胶溶液制备：将实施例1中制备得到的光敏凝胶N-(3-甲基丙烯酰胺丙基)-2-(1-甲基-1H-吡咯-2-基)-2H-四唑-5-甲酰胺(MAP-mPyTC)与丙烯酰胺和N，N'-亚甲基双丙烯酰胺共聚，形成mPyTC改性的聚丙烯酰胺(MMP)凝胶溶液。然后，用250ul 1X TBE溶液，129.5ul ddH2O，100ul 30％浓度的丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺的复合液，12.5ul甘油，4ulAPS，4ul TEMED制成的混合溶液进行稀释，使稀释后的mPyTC改性的聚丙烯酰胺凝胶溶液质量分数为6％。
2、在芯片模板表面覆盖光敏凝胶溶液
芯片模板由CAD软件设计，由深圳纳米芯片电子公司生产，其表面有大量微柱，可以在凝胶成型后形成大量小孔，供细胞沉降。硅烷化载玻片由标准载玻片用硅烷化试剂(175528，J&K)处理30分钟，然后用甲醇，去离子水洗涤两次，并用氮气干燥。开始制胶时，先将制备的光敏凝胶溶液铺展在芯片模板上，然后用硅烷化的载玻片覆盖。然后20分钟后提起载玻片，并保存在4℃的湿箱中，即得表面覆盖有光敏凝胶的芯片模板。
实施例3：样品细胞中核酸的检测
经过光敏凝胶溶液覆盖后的芯片模板在使用前，加入电泳缓冲液0.5X TBE，120V电压冰上预电泳60分钟。
然后，样品细胞加入0.25％胰酶-EDTA在37摄氏度进行3分钟消化，再用血清中和，PBS吹打重悬，并滴加到表面覆盖有光敏凝胶的芯片模板表面。加载细胞后，细胞经过5-10分钟沉降到细胞阱中。再用磷酸盐缓冲液冲洗过量的细胞后，加入电泳缓冲液0.5XTBE，120V电泳3min。电泳结束后，立即通过UV交联固定蛋白质和/或核酸，其中，光敏凝胶捕捉核酸的示意图如图1所示。
在本实施例中，通过过UV交联固定蛋白质和/或核酸时，其UV光照的波长为300-340nm，光照的时间为30s-10min。
进一步参见图2、图5所示，用滚环扩增检测(RCA)，实现对低拷贝核酸片段的信号放大，利于读取。
RCA反应包含4个组分：①环状DNA模板(RCA模板)序列设计为：(5'-PAGCCTCGCCTTTGCCTTCCTTTTACGACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACTCTTCGCCCCGCGAGCACAG)；②与RCA模板部分互补的DNA/RNA引发链(目标核酸片段)；③具有链置换活性的Phi29DNA聚合酶④脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)。RCA模板是一条单链DNA分子，如果存在目标序列，那么这条单链DNA分子将与目标序列互补形成局部双链的结构，并在DNA连接酶作用下，模板DNA的5’磷酸端(5’一P)与3’羟基端(3’一OH)连接环化，以形成的环状模板用于后续扩增。环状模板的扩增依赖于具有链置换和持续合成活性的Phi29 DNA聚合酶,其最适温度为30℃。Phi29 DNA聚合酶具有强大的5’一3’聚合活性和3’一5’外切酶活性，在20分钟内可产生大于70kbp的扩增子，其扩增灵敏度可达到单分子拷贝，且由于其具有3’一5’外切酶活性，能够对合成的单链序列进行校对，保真度较高。扩增产生的线性DNA序列，包含大量重复片段，此时加入末端带有荧光基团的核酸探针Cy3-N-羟基琥珀酰亚胺酯，序列设计为：5'-CCTCAATGCTGCTGCTGTACTAC，特异性结合线性序列，产生可检测的局部特异信号，过量的探针用TBST常温冲洗，降低背景干扰，并通过共聚焦显微镜观察荧光信号。
其中，Cy3(Cyanine 3)的结构式如下所示：
Figure BDA0003935806790000081
当然，在一些实施例中，滚环扩增的DNA模板除上述的环状DNA模板外，还可以选择哑铃状DNA环化模板、或是类哑铃状DNA环化模板，该DNA模板图如图3所示。
此外，在一些实施例中，滚环扩增DNA模板的类型也并不仅仅涉及上述线性扩增，还包括超分支扩增或多引物扩增等，其扩增方式如图4所示。
当然，探针也并不仅仅只包含荧光基团的核酸探针Cy3-N-羟基琥珀酰亚胺酯，还可以选择用酶、胶体金、超顺磁性微球标记抗体中的任意一种，此处不作进一步限制。
试验例
本发明中，具体以滚环扩增检测AF594基因，并以Cy3修饰探针进行检测为例，其结果如图6、图7所示。
通过本发明的检测方法，可以发现，靶标AF594基因和滚环扩增产物染色结果的荧光强度相当。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：根据目标基因的核酸序列设计合成核酸探针和扩增引物；
S2：将待测样品滴加到表面覆盖有光敏凝胶溶液的芯片模板上，进行电泳，电泳结束后，通过UV交联固定蛋白质和/或核酸；
S3：以DNA为模板，利用扩增引物进行滚环扩增，得到扩增的线性DNA序列；
S4：向扩增的线性DNA序列中加入末端带有标记抗体的核酸探针，通过核酸探针特异性结合线性DNA序列，产生用于检测的局部特异性信号，通过观察荧光信号实现痕量核酸检测。
2.如权利要求1所述的基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法，其特征在于：所述光敏凝胶采用如下方法制备：
将N-(3-甲基丙烯酰胺丙基)-2-(1-甲基-1H-吡咯-2-基)-2H-四唑-5-甲酰胺(MAP-mPyTC)与丙烯酰胺和N，N'-亚甲基双丙烯酰胺共聚，形成mPyTC改性的聚丙烯酰胺凝胶；
稀释mPyTC改性的聚丙烯酰胺凝胶溶液，使其质量分数达到4％-8％，即得光敏凝胶。
3.如权利要求2所述的基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法，其特征在于：所述mPyTC改性的聚丙烯酰胺凝胶溶液由250ul 1X TBE溶液，129.5ul ddH2O，100ul 30％浓度的丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺的复合液，12.5ul甘油，4ul APS，4ul TEMED制成的混合溶液进行稀释，稀释后的mPyTC改性的聚丙烯酰胺凝胶溶液质量分数为6％。
4.如权利要求1所述的基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法，其特征在于：步骤S2中，表面覆盖有光敏凝胶的芯片模板的制备方法如下：
将光敏凝胶溶液铺展在芯片模板上，然后用硅烷化的载玻片覆盖，提起载玻片，将芯片模板保存在湿箱中，使用前加入电泳缓冲液0.5X TBE，120V电压冰上预电泳60分钟。
5.如权利要求4所述的基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法，其特征在于：所述硅烷化的载玻片的制备方法为：将标准载玻片用硅烷化试剂处理30分钟，然后分别用甲醇，去离子水洗涤两次，再用氮气干燥，即得。
6.如权利要求1所述的基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法，其特征在于：步骤S2中，所述待测样品滴加到表面覆盖有光敏凝胶的芯片模板上前，还包括如下预处理步骤：向待测样品细胞中加入胰酶-EDTA，在37摄氏度进行消化，再用血清中和，PBS吹打重悬，然后滴加到表面覆盖有光敏凝胶的芯片模板表面。
7.如权利要求6所述的基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法，其特征在于：步骤S2中，在电泳前，待测样品在表面覆盖有光敏凝胶的芯片模板上加载5-10min，然后利用磷酸盐缓冲液冲洗过量的细胞后，再进行电泳。
8.如权利要求1所述的基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法，其特征在于：所述UV光照的波长为300-340nm，光照的时间为30s-10min。
9.如权利要求1所述的基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法，其特征在于：步骤S3中，滚环扩增的DNA模板选自环状DNA模板、哑铃状DNA环化、或是类哑铃状DNA环化中的任意一种。
10.如权利要求1所述的基于光敏凝胶的痕量核酸检测方法，其特征在于：步骤S4中，所述标记抗体选自荧光、酶、胶体金、超顺磁性微球标记抗体中的任意一种。
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