CN115552017A - 经修饰的b细胞及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经基因修饰的B细胞以及其用途，例如，用于治疗各种疾病和病症，包含癌症、心脏病、炎性疾病、肌肉萎缩疾病、神经疾病等。在某些实施例中，本发明涉及一种分离的经修饰的B细胞(“CAR‑B细胞”)，所述CAR‑B细胞能够表达嵌合受体(“CAR‑B受体”)，其中所述嵌合受体包括：(a)胞外结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞质结构域，所述胞质结构域包括至少一个信号传导结构域。在各个实施例中，本发明包括一种分离的经修饰的B细胞，其中所述B细胞能够表达和分泌有效载荷，其中所述有效载荷不在B细胞中天然表达或者以比在B细胞中天然表达的水平更高的水平表达。在各个实施例中，所述有效载荷是抗体或其片段。

Description

经修饰的B细胞及其使用方法
背景技术
迄今为止，大多数细胞免疫疗法都集中在T细胞中。例如，癌症免疫疗法主要集中于T细胞的修饰和施用，从而增强杀伤T细胞对肿瘤的应答。然而，尽管B细胞在免疫应答中起着关键作用，但修饰B细胞用于治疗各种疾病是一项尚未得到广泛研究的技术。
B细胞(也称为B淋巴细胞)是一种白细胞，除了别的之外，其负责身体抵抗感染和疾病。B细胞是适应性免疫系统的一部分，并且能够产生各种免疫应答，例如，响应于经识别的抗原而分泌抗体。另外，B细胞能够呈递抗原，并且还可以分泌细胞因子。
许多B细胞成熟为产生能够抵抗感染的抗体(蛋白质)的浆细胞。其它B细胞成熟为记忆B细胞。从单个B细胞传代的所有浆细胞产生针对刺激其成熟的抗原的相同抗体。相同的原理适用于记忆B细胞。因此，所有浆细胞和记忆细胞“记住”引起其形成的刺激。B细胞或B淋巴细胞不是胸腺依赖性的，具有较短寿命，并且负责免疫球蛋白的产生。参见例如，https://www.medicinenet.com/script/main/art.asp？articlekey＝2413。B细胞因此是免疫学上重要的细胞。
B细胞似乎与癌症治疗中的患者结果相关。例如，三级淋巴结构(TLS)的存在与更好的患者结果相关。参见例如，Helmink,B.A.等人,《自然(Nature)》,2020,577(7791),549-555；Petitprez F等人,《自然》,2020,577(7791),556-560。TLS是响应于免疫刺激而出现的免疫细胞(主要是T细胞和B细胞)的聚集体。虽然围绕肿瘤细胞的TLS包含B细胞，但B细胞在抗肿瘤应答中的作用尚不清楚。肿瘤中发现的B细胞可以产生阻碍免疫细胞功能的抑制因子。参见例如，Kessel,A.等人,《自身免疫评论(Autoimmun Rev.)》,2012,11(9),670-677；Khan,A.R.等人,《自然通讯(Nature Commun.)》,2015,6,5997。另外，目前的证据表明，在大多数癌症小鼠模型中，B细胞阻碍抗肿瘤应答。Affara,N.I.等人《癌细胞(Cancer Cell)》,2014,25(6),809-821；Shalapour,S.等人,《自然》,2017,551,340-345；Ammirante,M.等人,《自然》,2010,464,302-305。然而，TLS结构中B细胞的存在与癌症免疫疗法的阳性临床结果相关。Petitprez 2020。LPS激活的脾细胞(包含B细胞)与检查点抑制剂的组合的瘤内注射已经显示出产生抗肿瘤应答。Soldevilla等人,《肿瘤免疫学(Oncoimmunology)》,2018,7:8,e1450711。
CD79(也称为“分化簇79”)是与B细胞受体形成复合物并且能够在B细胞受体识别抗原后产生信号的跨膜蛋白。1CD79包含两条不同的链，所述两条不同的链被称为CD79A和CD79B(也称为Igα和Igβ)。CD79a和CD79b两者是免疫球蛋白超家族的成员。这些在通过二硫键稳定的B细胞表面上形成异源二聚体。两条CD79链在其胞内尾区中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(“ITAM”)，所述胞内尾区在B细胞中传播信号。2
Figure DA00039181007075270470
鉴于B细胞具有呈递抗原和分泌蛋白质的天然能力，作为用于靶向某些患病细胞类型并分泌治疗性有效载荷的细胞疗法具有很大的潜力。因此，除了T细胞疗法之外，还需要替代性治疗，如经工程化的B细胞，所述替代性治疗用于治疗各种疾病和病症，包含癌症、心脏病、炎性疾病、肌肉萎缩疾病、神经疾病等。
发明内容
现在已经发现，经工程化的B细胞在治疗如本文所叙述的各种疾病和病症中可以是有效的。本发明因此涉及经修饰的B细胞。
还已经发现，CD79a(免疫球蛋白α)当并入本发明的CAR-B构建体的胞内信号传导结构域中时表现出优于CD79b(免疫球蛋白β)的品质。另外，进一步发现，当用于本文所述的CAR-B构建体时，胞内CD79b(免疫球蛋白β)对功效不显示(或甚至显示负面作用)。本发明因此尤其涉及包括CD79a胞内信号传导结构域的CAR-B构建体。
在某些实施例中，本发明涉及一种分离的经修饰的B细胞(“CAR-B细胞”)，所述CAR-B细胞能够表达嵌合受体(“CAR-B受体”)，其中所述嵌合受体包括：(a)胞外结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞质结构域，所述胞质结构域包括至少一个信号传导结构域。所述胞质结构域优选地包括CD79a。在各个实施例中，所述胞外结构域包括胞外结合结构域和铰链结构域。在各个实施例中，所述胞外结合结构域识别在靶细胞的表面上表达的至少一种抗原或蛋白质。在各个实施例中，所述靶细胞选自由以下组成的组：肿瘤细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、骨细胞、血细胞、神经细胞、脂肪细胞、皮肤细胞和内皮细胞。在各个实施例中，所述B细胞表达多于一种CAR-B受体构建体。在各个实施例中，所述CAR-B受体包括多于一个胞外结合结构域。在各个实施例中，所述胞外结合结构域是单链可变片段(scFv)、或全长抗体、或受体或配体的胞外结构域。在各个实施例中，所述胞外结合结构域能够与选自由以下组成的组的抗原或蛋白质结合：PSMA、GPC3、ASGR1、ASGR2、肌聚糖蛋白、Corin、FAP(成纤维细胞激活蛋白)和Her2。在各个实施例中，所述铰链结构域源自由以下组成的组：IgG、CD28和CD8。在各个实施例中，所述铰链结构域包含选自由SEQ ID No.27、29、31组成的组的核酸序列。在各个实施例中，所述胞质结构域包括对于B细胞受体而言天然的至少一个信号传导结构域。在各个实施例中，所述胞质结构域包括选自由以下组成的组的结构域：CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、MyD88、CD21、Syk、FYN、LYN、PI3K、BTK、PLCγ2、CD3ζ和BLNK。在各个实施例中，所述胞质结构域进一步包括共刺激结构域。
在各个实施例中，本发明包括一种分离的经修饰的B细胞，其中所述B细胞能够表达和分泌有效载荷，其中所述有效载荷不在B细胞中天然表达或者以比在B细胞中天然表达的水平更高的水平表达。在各个实施例中，所述有效载荷是抗体或其片段。在各个实施例中，所述抗体是分泌抗体，并且可以包含阻断抗体(例如，抗PD-1)或激动剂抗体(抗CD137、GITR、OX40)，所述阻断抗体或激动剂抗体被工程化以含有天然或经工程化的Fc区，并且可以是可溶性的或膜结合的。在各个实施例中，所述有效载荷可以是免疫调节剂，如趋化因子或细胞因子。.在各个实施例中，所述有效载荷选自由以下组成的组：IL-1、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL18、IL-21、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、TSLP、CCL21、FLT3L、XCL1、LIGHT(TNFSF14)、OX40L、CD137L、CD40L、ICOSL、抗CD3抗体、CD47、TIM4-FC、CXCL13、CCL21、CD80、CD40L、IFNαA2、LIGHT、4-1BBL、MDGF(C19orf10)、FGF10、PDGF、集聚蛋白、TNF-α、GM-CSF、抗FAP抗体、抗TGF-β抗体；TGF-β陷阱、诱饵或其它抑制分子；抗BMP抗体；BMP陷阱、诱饵或其它抑制分子。在各个实施例中，所述B细胞能够表达多于一个有效载荷。在各个实施例中，所述B细胞能够表达多于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个有效载荷。
在各个实施例中，本发明涉及一种治疗患者的方法，所述方法包括施用本发明的经修饰的B细胞。在各个实施例中，所述经修饰的B细胞经瘤内、静脉内、皮下或皮内施用。在各个实施例中，所述方法进一步包括施用检查点抑制剂。在各个实施例中，所述检查点抑制剂是选自由以下组成的组的检查点分子：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3和NKG2A蛋白。在各个实施例中，所述检查点抑制剂是单克隆抗体。
在各个实施例中，本发明涉及一种分离的经修饰的B细胞，其能够表达嵌合受体，其中所述嵌合受体包括：(a)胞外结构域，其中所述胞外结构域包括胞外结合结构域和铰链结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞质结构域，所述胞质结构域包括至少一个信号传导结构域，其中所述经修饰的B细胞进一步能够表达有效载荷，其中所述有效载荷不在细胞表面上天然表达。在各个实施例中，所述胞外结合结构域识别在靶细胞的表面上表达的抗原或蛋白质。在各个实施例中，所述靶细胞选自由以下组成的组：肿瘤细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、骨细胞、血细胞、神经细胞、脂肪细胞、皮肤细胞和内皮细胞。在各个实施例中，所述B细胞表达多于一种CAR-B受体构建体。在各个实施例中，所述CAR-B受体包括多于一个胞外结合结构域。在各个实施例中，所述胞外结合结构域是单链可变片段(scFv)、抗体、或受体或配体的胞外结构域。在各个实施例中，所述胞外结合结构域能够与选自由以下组成的组的抗原或蛋白质结合：PSMA、GP3、ASGR1、ASGR2、肌聚糖蛋白、Corin、FAP和Her2。在各个实施例中，所述铰链结构域源自由以下组成的组：IgG、CD28和CD8。在各个实施例中，所述铰链结构域包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID No.27、29和31。在各个实施例中，所述胞质结构域包括对于B细胞而言天然的至少一个信号传导结构域。在各个实施例中，所述胞质结构域包括选自由以下组成的组的结构域：CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、MyD88、CD21、Syk、FYN、LYN、PI3K、BTK、PLCγ2、CD3ζ和BLNK。在各个实施例中，所述胞质结构域进一步包括共刺激结构域。在各个实施例中，所述有效载荷是分泌抗体或膜结合抗体或其片段。在各个实施例中，所述有效载荷选自由以下组成的组：IL-1、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IL-21、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、TSLP、CCL21、FLT3L、XCL1、LIGHT(TNFSF14)、OX40L、CD137L、CD40L、ICOSL、抗CD3抗体、CD47、TIM4-FC、CXCL13、CCL21、CD80、CD40L、IFNαA2、LIGHT、4-1BBL、MDGF(C19orf10)、FGF10、PDGF、集聚蛋白、TNF-α、GM-CSF、抗FAP抗体、抗TGF-β抗体；TGF-β陷阱、诱饵或其它抑制分子；抗BMP抗体；BMP陷阱、诱饵或其它抑制分子。在各个实施例中，所述B细胞能够表达多于一个有效载荷。在各个实施例中，所述B细胞能够表达多于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个有效载荷。在各个实施例中，所述经修饰的B细胞进一步编码至少一种选自由以下组成的组的蛋白质：CD79a、CD79b、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、CD3ζ和MyD88的胞质结构域。在各个实施例中，本发明涉及一种治疗患者的方法，所述方法包括施用所述经修饰的B细胞。在各个实施例中，所述方法进一步包括施用检查点抑制剂。在各个实施例中，所述检查点抑制剂选自一个或多个检查点分子的抑制剂，所述检查点分子来自由以下组成的组：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3和NKG2A。在各个实施例中，所述检查点抑制剂是单克隆抗体。在各个实施例中，本发明涉及一种分离的经修饰的B细胞，其能够表达嵌合受体，其中所述嵌合受体包括胞外结构域，其中所述胞外结构域包括铰链结构域和胞外结合结构域，其中所述胞外结合结构域不在B细胞上天然表达；并且其中所述胞外结合结构域能够识别所关注靶标。在各个实施例中，所述结合结构域是单链可变片段(scFv)、抗体、配体或受体。在各个实施例中，所述结合结构域是scFv。在各个实施例中，所述结合结构域是受体、配体或其片段。在各个实施例中，所述B细胞进一步能够表达有效载荷。在各个实施例中，本发明包括一种治疗患者的方法，所述方法包括向患者施用所述经修饰的B细胞。
在各个实施例中，本发明包括能够表达嵌合B细胞受体的核酸，其中所述嵌合受体包括：(a)胞外结构域，其中所述胞外结构域包括胞外结合结构域和铰链结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞质结构域，所述胞质结构域包括至少一个信号传导结构域。在各个实施例中，所述胞外结合结构域识别在靶细胞的表面上表达的抗原或蛋白质。在各个实施例中，所述胞外结合结构域是单链可变片段(scFv)、抗体、受体或配体。在各个实施例中，所述靶细胞选自由以下组成的组：肿瘤细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、骨细胞、血细胞、神经细胞、脂肪细胞、皮肤细胞和内皮细胞。在各个实施例中，载体表达多于一种CAR-B受体。在各个实施例中，所述CAR-B受体表达多于一个胞外结合结构域。在各个实施例中，所述胞外结合结构域能够与选自由以下组成的组的抗原或蛋白质结合：PSMA、GP3、ASGR1、ASGR2、肌聚糖蛋白、Corin、Her2、FAP、MUC1、CEA153、JAM-1和LFA-1。在各个实施例中，所述铰链结构域源自由以下组成的组：IgG、CD28和CD8。在各个实施例中，所述铰链结构域包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID No.27、29和31。在各个实施例中，所述胞质结构域包括对于B细胞受体而言天然的至少一个信号传导结构域。在各个实施例中，所述胞质结构域包括选自由以下组成的组的结构域：CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、MyD88、CD21、Syk、FYN、LYN、PI3K、BTK、PLCγ2、CD3ζ和BLNK。在各个实施例中，所述胞质结构域进一步包括共刺激结构域。
在各个实施例中，本发明涉及一种载体，所述载体包括能够表达嵌合B细胞受体的核酸，其中所述嵌合受体包括：(a)胞外结构域，其中所述胞外结构域包括胞外结合结构域和铰链结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞质结构域，所述胞质结构域包括至少一个信号传导结构域。在各个实施例中，所述胞外结合结构域识别抗原或蛋白质。在各个实施例中，所述靶细胞选自由以下组成的组：肿瘤细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、骨细胞、血细胞、神经细胞、脂肪细胞、皮肤细胞和内皮细胞。在各个实施例中，载体表达多于一种CAR-B受体。在各个实施例中，所述CAR-B表达多于一个胞外结合结构域。在各个实施例中，所述胞外结合结构域是单链可变片段(scFv)、抗体、受体或配体。在各个实施例中，所述胞外结合结构域能够与选自由以下组成的组的抗原或蛋白质结合：PSMA、GPC3、ASGR1、AGSR2、肌聚糖蛋白、Corin、Her2、FAP、MUC1、CEA153、JAM-1和LFA-1。在各个实施例中，所述铰链结构域源自由以下组成的组：IgG、CD28和CD8。在各个实施例中，所述铰链结构域包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID No.27、29和31。在各个实施例中，所述胞质结构域包括对于B细胞而言天然的至少一个信号传导结构域。在各个实施例中，所述胞质结构域包括选自由以下组成的组的信号传导结构域：CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、MyD88、CD21、Syk、FYN、LYN、PI3K、BTK、PLCγ2、CD3ζ和BLNK。在各个实施例中，所述胞质结构域进一步包括共刺激结构域。在各个实施例中，胞质区包含多个(2个或更多个)相同或唯一的结构域。
在各个实施例中，本发明涉及一种分离的经修饰的B细胞，其能够表达整联蛋白、归巢抗体、蛋白质、受体或其组合，其中所述整联蛋白、归巢抗体、蛋白质或受体不在B细胞中天然表达或者以比在B细胞中天然表达的水平更高的水平表达；并且其中所述整联蛋白、归巢抗体、蛋白质、受体或其组合被吸引到所关注位点或靶标。在各个实施例中，所述整联蛋白、归巢抗体、蛋白质和受体选自CLA(PSGL-1糖型)、CLA(PSGL-1糖型)、CCR10、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR9、CD43E、CD44、c-Met、CXCR3、CXCR4、LFA-1、LFA-1(αLβ2)、选择蛋白配体、VLA-4、VLA-4(α4β1)和α4β7或其组合。在各个实施例中，所述所关注位点是归巢组织或靶组织、特定位置或组织中的炎性位点、或肿瘤或肿瘤微环境，其中有效载荷的递送是令人期望的。在各个实施例中，所述归巢组织或靶组织选自皮肤、肠道(肠、结肠、肠系膜淋巴结(mLN)、派伊尔结(Peyer's Patch，PP)、小肠)、肝脏、肺、骨髓、心脏、外周淋巴结(LN)、CNS、胸腺和骨髓。在各个实施例中，所述所关注靶标选自CXCL16、CCL17、CCL17(22)、CCL20(MIP-3α)、CCL21、CCL25、CCL27、CCL28、CCL4、CCL5、CD62E、CD62P、CXCL10、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CXCL9/CXCL10、CXCR3、E/P选择蛋白、E选择蛋白、GPR15L、HGF、透明质酸盐、ICAM-1、CCR1、2、5的配体、MAdCAM、MAdCAM-1、PNAd、VAP-1、VCAM和VCAM-1或其组合。在各个实施例中，所述方法包括通过施用所述分离的经修饰的B细胞治疗患者。在各个实施例中，所述方法涉及进一步施用化合物或其衍生物，其中所述化合物或其衍生物能够增加整联蛋白、归巢抗体、蛋白质和受体或其组合的表达。在各个实施例中，所述化合物或其衍生物能够改变B细胞到所述患者体内的所关注位点或靶标的转运。在各个实施例中，所述化合物是全反式视黄酸(ATRA)或其衍生物。
在各个实施例中，本发明涉及一种分离的经修饰的B细胞，其能够表达免疫抑制分子，其中所述免疫抑制分子不在B细胞中天然表达或者以比在B细胞中天然表达的水平更高的水平表达。在各个实施例中，所述免疫抑制分子选自IL-10、TGF-β、PD-L1、PD-L2、LAG-3和TIM-3或其组合。在各个实施例中，所述免疫抑制分子能够减少B细胞在患者体内的所关注位点或靶标处的炎症和自身免疫活性。在各个实施例中，本发明涉及一种治疗患者的方法，所述方法包括施用所述分离的经修饰的B细胞。在各个实施例中，所述免疫抑制分子选自IL-10、TGF-β、PD-L1、PD-L2、LAG-3和TIM-3或其组合。在各个实施例中，所述免疫抑制分子能够减少B细胞在所述患者的所关注位点或靶标处的炎症和自身免疫活性。在各个实施例中，本发明涉及进一步施用化合物或其衍生物，所述化合物或其衍生物能够增加整联蛋白、归巢抗体、蛋白质、受体或其组合在所述B细胞中的表达。在各个实施例中，所述化合物或其衍生物能够改变B细胞到所述患者体内的所关注位点或靶标的转运。在各个实施例中，所述化合物是全反式视黄酸(ATRA)或其衍生物。在各个实施例中，本发明涉及一种分离的经修饰的B细胞，其中所述分离的经修饰的B细胞用化合物或其衍生物处理，其中所述化合物或其衍生物能够增加整联蛋白、归巢抗体、蛋白质、受体或其组合在B细胞中的表达。在各个实施例中，所述化合物或其衍生物能够改变B细胞到所述患者体内的所关注位点或靶标的转运。在各个实施例中，所述化合物是全反式视黄酸(ATRA)或其衍生物。在各个实施例中，所述化合物或其衍生物能够(i)增加整联蛋白、归巢抗体、蛋白质、受体或其组合在B细胞中的表达并且(ii)改变B细胞到所述患者体内的所关注位点或靶标的转运。在各个实施例中，所述化合物是全反式视黄酸(ATRA)或其衍生物。
在各个实施例中，本发明涉及一种分离的经修饰的B细胞，其能够表达组成型活性Toll样受体(TLR)中的至少一种或多种组成型活性TLR，其中所述TLR不在B细胞中天然表达或者以比在B细胞中天然表达的水平更高的水平表达。在各个实施例中，所述TLR选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13或其组合。在各个实施例中，所述TLR能够增强B细胞以增加患者体内的免疫应答。在各个实施例中，所述TLR能够产生有效的效应B细胞以增加患者体内的免疫应答。在各个实施例中，所述免疫抑制分子能够减少B细胞在患者体内的所关注位点或靶标处的炎症和自身免疫活性。在各个实施例中，所述TLR选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13或其组合。在各个实施例中，所述TLR能够(i)增强B细胞并且(ii)产生有效的效应B细胞以增加患者体内的免疫应答。在各个实施例中，向所述患者施用TLR激动剂中的至少一种或多种TLR激动剂。在各个实施例中，所述分离的经修饰的B细胞用TLR激动剂中的至少一种或多种TLR激动剂处理。在各个实施例中，所述TLR激动剂能够(i)增强B细胞并且(ii)产生有效的效应B细胞以增加患者体内的免疫应答。在各个实施例中，所述TLR激动剂与一种或多种选自以下的TLR结合：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13或其组合。在各个实施例中，所述TLR激动剂选自富含CpG的寡核苷酸、双链RNA模拟物、聚肌苷酸:聚胞苷酸(poly-I:C)。在各个实施例中，所述TLR激动剂包括CpG寡核苷酸。在各个实施例中，所述TLR激动剂能够(i)增强B细胞并且(ii)产生有效的效应B细胞以增加所述患者体内的免疫应答。在各个实施例中，所述TLR激动剂与一种或多种选自以下的TLR结合：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13或其组合。在各个实施例中，所述TLR激动剂选自富含CpG的寡核苷酸、双链RNA模拟物、聚肌苷酸:聚胞苷酸(poly-I:C)。在各个实施例中，所述TLR激动剂包括CpG寡核苷酸。
在各个实施例中，本发明涉及一种分离的经修饰的B细胞，其中所述B细胞用mRNA电穿孔，所述mRNA编码与靶向信号融合的抗原中的至少一种或多种抗原。在各个实施例中，(i)所述抗原不是由B细胞天然呈递的；(ii)所述抗原不是由B细胞同时在HLA I类分子和II类分子两者中天然呈递的；或者(iii)所述抗原不是由B细胞以高效率在HLAI类分子和II类分子两者中天然呈递的。在各个实施例中，所述靶向信号是溶酶体蛋白的靶向信号。在各个实施例中，所述靶向信号是溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP1)的靶向信号。在各个实施例中，所述抗原能够靶向溶酶体并且在HLA I类分子和II类分子两者中同时且有效地呈递。在各个实施例中，所述B细胞能够增加患者体内的抗原特异性免疫应答。在各个实施例中，(i)所述抗原不是由B细胞天然呈递的；(ii)所述抗原不是由B细胞同时在HLA I类分子和II类分子两者中天然呈递的；或者(iii)所述抗原不是由B细胞以高效率在HLA I类分子和II类分子两者中天然呈递的。在各个实施例中，所述靶向信号是溶酶体蛋白的靶向信号。在各个实施例中，所述靶向信号是溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP1)的靶向信号。在各个实施例中，所述抗原能够靶向溶酶体并且在HLA I类分子和II类分子两者中同时且有效地呈递。在各个实施例中，所述B细胞能够增加所述患者体内的抗原特异性免疫应答。
附图说明
图1阐述了本发明的嵌合B细胞受体(CAR-B)的实例。在某些实施例中，CAR-B构建体将包括胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。如在图1中所描绘的，在某些实施例中，胞外结构域可以包括结合结构域和铰链区。在某些实施例中，结合区可以是scFv。将CAR-B构建体克隆到载体中以进行表达。
图2A-2C示出了具有归巢结构域的经工程化的B细胞的实例。在各个实施例中，经工程化的B细胞可以包括：(a)scFv结合结构域和任选的铰链区；(b)通过跨膜结构域与细胞直接连接的scFv结合结构域；或(c)通过跨膜结构域与细胞直接连接的配体/受体结合结构域。
图3示出了本发明的某些CAR-B构建体的实例。(A)与GPC3结合的CAR-B。(B)与PSMA结合的CAR-B。
图4示出了能够与(A)GPC3和(B)PSMA结合的本发明的CAR-B受体的实例。“C”结构域与天然BCR C末端相对应。
图5阐述了各种抗PSMA CAR在HEK-293细胞表面上的表达。
图6A-6C阐述了展示了抗PSMA CAR和抗肌聚糖蛋白CAR与PSMA的结合的询问的FACS绘图。表达抗PSMA CAR-B构建体pWF396和pWF397的B细胞与PSMA结合，而表达pWF398(抗肌聚糖蛋白CAR-B)的B细胞不与PSMA结合。
图7展示了编码GFP的腺病毒F35转导人B细胞的能力。从外周血中分离人B细胞。用编码GFP的腺病毒感染B细胞。0ul、1ul、3ul、10ul，表示用于感染人B细胞的腺病毒制剂的微升体积。腺病毒制剂的滴度为大约1 x e12个颗粒/ml。
图8描述了在第零天向BALB/c小鼠注射CT26双侧肿瘤的实验。在第12天和第16天，向荷瘤小鼠瘤内注射体积为106/50μL的表达有效载荷的细胞。
图9展示了与盐水和3T3细胞(无有效载荷)相比，瘤内注射的有效载荷的12种不同组合在30至35天内对肿瘤体积的影响。
图10展示了与盐水和3T3细胞(无有效载荷)相比，瘤内注射的有效载荷的12种不同组合在30至35天内对肿瘤体积的影响。
图11A-11C展示了与盐水和3T3细胞(无有效载荷)相比，瘤内注射的有效载荷的前三种组合在30天内对肿瘤体积的影响。
图12展示了瘤内注射的B细胞的远位效应。然后，注射(i)新鲜的B细胞或(ii)首先在具有5μg/ml脂多糖的生长培养基(RPMI、10％FBS、1％Pen/Strep、5ng/ml重组小鼠IL-4、100uMβ-巯基乙醇)中刺激16至24小时。然后将5×106个B细胞瘤内注射到CT26小鼠模型中，并且测量远端(远位)肿瘤中的抗肿瘤应答。在第0天植入肿瘤，并且在第6天观察到可触及的肿瘤块。在第6天开始瘤内治疗。
图13A-13C展示了转染后24小时小鼠B细胞中三种CAR-B受体(也称为CAR-B受体)的表达。
图14展示了PSMA特异性CAR工程化的鼠类B细胞对患有CT26-PSMA肿瘤的BALB/c小鼠的肿瘤体积和存活率的功效。
图15展示了PSMA特异性CAR工程化同种异体B细胞对患有CT26-PSMA肿瘤的BALB/c小鼠的肿瘤体积和存活率的功效。
图16展示了PSMA特异性CAR工程化的鼠类B细胞对患有CT26-PSMA肿瘤的免疫受损的BALB/c小鼠的功效。
图17展示了鼠类B细胞对患有HEPA 1-6GPC3肿瘤的C57B1/6小鼠的肿瘤体积和存活率的功效。
图18展示了使用GFP作为对照，用识别GPC3的四种不同CAR构建体工程化的B细胞中的荧光素酶报告细胞中的NFKb信号传导。
图19展示了在人B细胞报告系中表达的CAR构建体中在不存在同源靶抗原的情况下的基础或强直性NFKb活性。
图20展示了用抗GPC3CAR-CD79a和CD80有效载荷mRNA电穿孔的鼠类B细胞在患有HEPA1-6GPC3肿瘤的同基因C57B1/6小鼠中的功效。
图21A-21C展示了盐水对照、抗GPC3CAR-CD79a和抗GPC3CAR-CD79a加上CD80组合B细胞组的应答。
图22A-22C展示了使用FACS绘图的电穿孔后GPC3 CAR的表达。
具体实施方式
本文所公开的本发明涉及经工程化或经修饰的B细胞的若干实施例：
1.已经使用例如结合结构域(如scFv、抗体、配体、受体或其片段)修饰成所关注位点/靶标的B细胞；
2.已经用归巢结构域修饰的B细胞，所述B细胞进一步包括激活以及任选地共刺激结构域，使得所述B细胞可以在与期望的靶标相互作用时归巢和激活；
3.被工程化以能够产生期望的蛋白质有效载荷的B细胞，如抗体、治疗蛋白、多肽、核酸序列(如RNAi)等；
4.包括归巢结构域/结合结构域、激活结构域、任选的共刺激结构域的经工程化的B细胞，并且所述经工程化的B细胞进一步被工程化以表达期望的蛋白质有效载荷，如抗体、治疗蛋白、多肽、核酸序列(如RNAi)等；
5.已经被修饰以表达整联蛋白、归巢抗体、蛋白质或受体的B细胞，使得所述B细胞被吸引至所关注的特异性位点/靶标(例如，归巢组织)处的特异性配体、趋化因子或引诱剂，并且由此可以归巢到所关注位点/靶标，例如，以递送期望的有效载荷；
6.已经被修饰以表达免疫抑制分子的B细胞，使得局限于所关注位点/靶标的B细胞的炎症和自身免疫活性得到降低，由此产生阳性治疗应答；
7.已经用化合物或其衍生物处理的B细胞，使得所述B细胞的转运通过特异性B细胞整联蛋白和/或归巢受体的表达而改变；
8.已经(i)用Toll样受体(TLR)激动剂处理，和/或(ii)被工程化以表达组成型活性TLR的B细胞，用于增强B细胞和/或产生有效的效应B细胞以便增加受试者的免疫应答；
9.已经用与溶酶体蛋白的靶向信号融合的编码所关注的特异性抗原的mRNA电穿孔的B细胞，使得所述B细胞可以同时且有效地在HLA I类和II类分子两者中呈递所关注的特异性抗原和/或抗原衍生的表位。
10.已经用自扩增RNA电穿孔的B细胞，所述自扩增RNA编码此前根据1至9中所述的任何项。
应当理解，本申请的经工程化或经修饰的B细胞的各个实施例不是互相排斥的，并且除非明确指出，否则可以以任何方式且不受任何限制彼此组合，以便实现促进本文所设想的任何结果和/或治疗应答。
肿瘤抗原：在某些实施例中，所关注位点/靶标是肿瘤抗原。本发明的抗原结合结构域(部分)的选择将取决于待治疗的癌症的具体类型。一些肿瘤抗原可以是膜结合的，而另一些肿瘤抗原可以是分泌的。例如，肿瘤抗原可以分泌并积聚在胞外基质中，或者肿瘤抗原可以表达为MHC复合物的一部分。肿瘤抗原是本领域熟知的，并且可以包含例如CD19、KRAS、HGF、CLL、胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、α-胎甲球蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、蛋白质、PSMA、Her2/neu、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体、间皮素、EGFR、BCMA、KIT和IL-13。
传染病抗原：在某些实施例中，所关注位点/靶标是传染病抗原，针对所述传染病抗原，可能期望免疫应答。传染病抗原是本领域熟知的，并且可以包含但不限于病毒、细菌、原生生物和寄生虫抗原，如寄生虫、真菌、酵母、支原体、病毒蛋白、细菌蛋白和碳水化合物，以及真菌蛋白和碳水化合物。另外，传染病抗原的传染病的类型没有特别限制，并且可以包含但不限于病毒性传染病中的难治性疾病，如AIDS、乙型肝炎、艾普斯登-巴尔病毒(Epstein Barr Virus，EBV)感染、HPV感染、HCV感染、SARS、SARS-CoV2等。寄生虫抗原可以包含但不限于疟疾寄生虫子孢子蛋白。
在某些实施例中，经修饰的B细胞表达经工程化的B细胞受体(CAR-B)，所述经工程化的B细胞受体包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在某些实施例中，胞外结构域包括结合结构域和铰链结构域。在某些实施例中，胞外结构域包括结合结构域，如scFv、配体、抗体、受体或其片段，所述结合结构域允许经修饰的B细胞通过与在那些细胞表面上表达的蛋白质结合来靶向特异性靶细胞。在某些实施例中，经修饰的肿瘤细胞靶向在肿瘤细胞表面上表达的蛋白质/抗原并与其结合。在某些实施例中，经修饰的B细胞进一步表达有效载荷。在某些实施例中，有效载荷能够增加肿瘤或淋巴结中树突状细胞(DC)的交叉呈递抗原或抗原片段的数量。在某些实施例中，有效载荷能够激活T细胞并且将T细胞吸引到肿瘤中。在某些实施例中，有效载荷能够在肿瘤中促进三级淋巴结构(TLS)的形成。在本发明的某些实施例中，经修饰的B细胞表达CAR-B和有效载荷两者。在某些实施例中，CAR-B包括刺激结构域，当与在肿瘤细胞表面上表达的抗原或蛋白质结合时，所述刺激结构域激活有效载荷的表达。
1.B细胞中的嵌合抗原受体(CAR-B)的设计和结构域定向
在各个实施例中，本发明提供了一种嵌合B细胞受体(CAR-B)。应当理解，嵌合B细胞受体(CAR-B)是经基因工程化的受体。根据本领域已知的技术，这些经工程化的受体可以容易地插入到B细胞中并且由B细胞表达。用CAR-B，单个受体可以被编程以识别在肿瘤细胞上表达的特异性蛋白质或抗原，并且当与所述蛋白质或抗原结合时引发抗肿瘤应答。在各个实施例中，CAR-B部分用作归巢机制，以将B细胞递送到靶组织。
应当理解，相对于携带受体的细胞，本发明的嵌合B细胞受体将包括胞外结构域(所述胞外结构域将包括抗原结合结构域，并且可以包括胞外信号传导结构域和/或铰链结构域)、跨膜结构域和胞内结构域。胞内结构域至少包括激活结构域，优选地包含CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、CD3ζFcγr2a和/或MyD88。应当进一步理解的是，抗原结合结构域被工程化使得所述抗原结合结构域位于分子/构建体的胞外部分中，使得所述抗原结合结构域能够识别其一个或多个靶标并且与所述一个或多个靶标结合。
在结构上，应当理解，这些结构域与相对于免疫细胞的位置相对应。表1中阐述了根据本发明的示例性CAR-B构建体：
表1
Figure BDA0003918100700000131
在各个实施例中，嵌合B细胞受体包含胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在各个实施例中，胞质结构域包括激活结构域。在各个实施例中，胞质结构域还可以包括共刺激结构域。在各个实施例中，胞外结构域包括抗原结合结构域。在各个实施例中，胞外结构域进一步包括抗原结合结构域与跨膜结构域之间的铰链区。图1提供了本发明的各个实施例的嵌合B细胞受体的示意图。
胞外结构域：许多胞外结构域可以与本发明一起使用。在各个实施例中，胞外结构域包括抗原结合结构域。在各个实施例中，胞外结构域还可以包括铰链区和/或信号传导结构域。在各个实施例中，含有IgG1恒定结构域的胞外结构域还可以包括IgG1(臼)或IgG1(杵)以促进定向CAR-B形成。
抗原结合结构域和结合结构域：如本文所使用的，“抗原结合结构域(antigenbinding domain)”、“抗原结合结构域(antigen-binding domain)”或“结合结构域”是指CAR-B的能够与在细胞表面上表达的抗原或蛋白质结合的一部分。在一些实施例中，抗原结合结构域与涉及过度增殖性疾病的细胞上的抗原或蛋白质结合。在优选的实施例中，抗原结合结构域与在肿瘤细胞表面上表达的抗原或蛋白质结合。鉴于下面的定义和描述，将进一步理解抗原结合分子。
当解离常数(Kd)为1x10-7M时，抗原结合结构域被称为与其靶抗原或蛋白质“特异性结合”。当Kd为1-5x10-9M时，抗原结合结构域以“高亲和力”与抗原特异性结合，并且当Kd为1-5x10-10M时，抗原结合结构域以“非常高的亲和力”与抗原特异性结合。在一个实施例中，抗原结合结构域的Kd为10-9M。在一个实施例中，解离速率<1x10-5。在其它实施例中，抗原结合结构域将与Kd介于约10-7M与10-13M之间的抗原或蛋白质结合，并且在又另一个实施例中，抗原结合结构域将以Kd 1.0-5.0x10结合。
当抗原结合结构域与一个靶标的结合比其与第二靶标的结合更紧密时，所述抗原结合结构域被称为是“选择性的”。
术语“中和”是指与配体结合并防止或减少所述配体的生物效应的抗原结合结构域。这可以通过例如直接阻断配体上的结合位点或通过与配体结合并且通过间接手段(如配体中的结构或能量改变)改变配体的结合能力来实现。在一些实施例中，所述术语还可以表示防止与其结合的蛋白质执行生物功能的抗原结合结构域。
术语“靶标”或“抗原”是指能够被抗原结合分子结合的分子或分子的一部分。在某些实施例中，靶标可以具有一个或多个表位。
术语“抗体”是指由免疫系统产生以识别特定抗原的所谓的免疫球蛋白、Y形蛋白。术语“抗体片段”是指抗体的抗原结合片段和Fc片段。抗原结合片段的类型包含：F(ab')2、Fab、Fab'和scFv分子。Fc片段完全由免疫球蛋白的重链恒定区产生。
胞外信号传导结构域：胞外结构域有益于淋巴细胞对抗原的信号传导和有效应答。在本发明中特别有用的胞外结构域可以源自(即，包括)CD28、CD28T(参见例如，美国专利申请US2017/0283500Al)、OX40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1、CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(TNFSF14)、NKG2C、CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、DAP-10、Fcγ受体、MHC 1类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞性激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 la、LFA-1、ITGAM、CD1 lb、ITGAX、CD1lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉的)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体或其任何组合。胞外结构域可以源自天然的或合成的来源。
铰链结构域：如本文所述，胞外结构域通常包括铰链部分。这是胞外结构域靠近细胞膜的一部分。胞外结构域可以进一步包括间隔子区。根据本发明可以使用多种铰链，包含如上所讨论的共刺激分子，以及免疫球蛋白(Ig)序列、3X strep II间隔子或其它合适的分子，以实现与靶细胞的期望的特殊距离。在一些实施例中，铰链区包括如本文所述的CD28或CD8或其部分的胞外结构域。
跨膜结构域：CAR-B可以被设计成包括与CAR-B-B的胞外结构域融合或以其它方式与所述胞外结构域连接的跨膜结构域。其可以类似地与CAR-B的胞内结构域融合。在一个实施例中，使用与CAR-B中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些实例中，跨膜结构域可以通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。跨膜结构域可以源自天然的或合成的来源。在所述来源是天然的情况下，所述结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本发明中特别有用的跨膜区可以源自(即，包括)CD28、CD28T、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1、CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(TNFSF14)、NKG2C、CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、DAP-10、Fcγ受体、MHC 1类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞性激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 la、LFA-1、ITGAM、CD1 lb、ITGAX、CD1 lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉的)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体或其任何组合。
任选地，短连接子可以在CAR-B的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域中的任何或一些结构域之间形成连接。
在某些实施例中，本发明的CAR-B中的跨膜结构域是CD28跨膜结构域。在一个实施例中，CD28跨膜结构域包括SEQ ID NO:1的核酸序列。在一个实施例中，CD28跨膜结构域包括编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施例中，CD28跨膜结构域包括SEQID NO:3的核酸序列。在另一个实施例中，CD28跨膜结构域包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明的CAR-B中的跨膜结构域是CD8跨膜结构域。
胞内(胞质)结构域：本发明的CAR-B受体的胞内(IC，或胞质)结构域可以提供免疫细胞的正常效应子功能中的至少一种正常效应子功能的激活。
应当理解，合适的胞内分子包含但不限于CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、CD3ζ和MyD88。胞内分子可以进一步包含CD28、CD28T、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1、CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、MHC 1类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞性激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 la、LFA-1、ITGAM、CD1 lb、ITGAX、CD1 lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉的)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体或其任何组合。本发明的CAR-B的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以以随机或指定顺序彼此连接。
如本文所使用的术语“共刺激”结构域或分子是指用于放大或抵消细胞的初始激活信号的细胞表面分子的异质组。
在一个优选实施例中，胞质结构域被设计成包括hCD19的信号传导结构域，其中hCD19结构域包括SEQ ID NO.5中所示的核酸序列。在另一个实施例中，胞质结构域被设计成包括hCD40的信号传导结构域，其中hCD40结构域包括SEQ ID NO.7中所示的核酸序列。在另一个实施例中，胞质结构域被设计成包括hCD40和hCD79b的信号传导结构域，其中hCD40结构域包括SEQ ID NO.7中所示的核酸序列，并且hCD79b结构域包括SEQ ID NO.25中所示的核酸序列。在另一个实施例中，胞质结构域被设计成包括hCD40和hCD137的信号传导结构域，其中所述hCD40结构域包括SEQ ID NO.7中所示的核酸序列，并且hCD137结构域包括SEQID NO.13中所示的核酸序列。在另一个实施例中，胞质结构域被设计成包括hCD40和hFcγr2a的信号传导结构域，其中hCD40结构域包括SEQ ID NO.7中所示的核酸序列，并且hFcγr2a结构域包括SEQ ID NO.17中所示的核酸序列。在另一个实施例中，胞质结构域被设计成包括hCD40和hMyd88的信号传导结构域，其中hCD40结构域包括SEQ ID NO.7中所示的核酸序列，并且hMyd88结构域包括SEQ ID NO.21中所示的核酸序列。在另一个实施例中，胞质结构域被设计成包括hCD79a的信号传导结构域，其中hCD79a结构域包括SEQ ID NO.23中所示的核酸序列。在另一个实施例中，胞质结构域被设计成包括hCD79b的信号传导结构域，其中hCD79b结构域包括SEQ ID NO.25中所示的核酸序列。这些实施例优选地是人来源的，但可以源自其它物种。在各个实施例中，信号传导结构域包括与hCD79b串联的hCD79a或另一个hCD79a结构域。在各个实施例中，信号传导结构域包括与hCD79a串联的hCD79b或另一个hCD79b结构域。
2.经修饰的B细胞
表达有效载荷的经修饰的B细胞：在本发明的各个实施例中，提供了能够表达有效载荷的经修饰的B细胞。如本文所使用的，术语“有效载荷”是指用作治疗剂的氨基酸序列、编码肽或蛋白质的核酸序列或RNA分子。在某些实施例中，有效载荷用于递送至肿瘤或肿瘤微环境或引流淋巴结。在某些实施例中，令人期望的是B细胞向肿瘤或肿瘤微环境或引流淋巴结递送有效载荷，所述有效载荷能够例如增加肿瘤中交叉呈递树突状细胞(DC)的数量。交叉呈递DC将允许改善肿瘤抗原的呈递。在各个实施例中，有效载荷可以能够激活T细胞并将其吸引到肿瘤中。在肿瘤中激活更多的T细胞将补充交叉呈递的DC以重塑肿瘤环境，从而具有更有效的抗肿瘤免疫能力。有效载荷还可以促进肿瘤中三级淋巴结构(TLS)的形成。临床研究已经证明，B细胞、TLS与免疫检查点阻断的应答之间存在关系。
本发明的有效载荷的非排他性实例包含：IL-1、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IL-21、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、TSLP、CCL21、FLT3L、XCL1、LIGHT(TNFSF14)、OX40L、CD137L、CD40L、ICOSL、抗CD3抗体、CD47、TIM4-FC、CXCL13、CCL21、CD80、CD40L、IFNαA2、LIGHT、4-1BBL、MDGF(C19orf10)、FGF10、PDGF、集聚蛋白、TNF-α、GM-CSF、抗FAP抗体、抗TGF-β抗体；TGF-β陷阱、诱饵或其它抑制分子；抗BMP抗体；BMP陷阱、诱饵或其它抑制分子。
有效载荷表达的信号传导：在本发明的各个实施例中，有效载荷作为DNA构建体在经激活的转录途径的控制下在经修饰的B细胞中表达。在某些实施例中，有效载荷的表达受经激活的T细胞的核因子(“NFAT”)途径控制。NFAT途径是在免疫应答期间激活的转录因子途径并且由NFκΒ激活。在各个实施例中，经修饰的B细胞表达有效载荷和CAR-B两者。在各个实施例中，在经修饰的B细胞表达有效载荷和CAR-B两者的情况下，CAR-B可以进一步编码诱导NFκΒ途径的激活的信号传导分子。此类分子包含但不限于：CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、CD3ζ和MyD88。
在各个实施例中，本发明涉及表达至少一个有效载荷的分离的B细胞。在各个实施例中，本发明涉及表达多于一个有效载荷的分离的B细胞。在各个实施例中，本发明涉及表达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个不同的有效载荷的分离的B细胞。
B细胞进行归巢的修饰：在本发明的各个实施例中，经工程化的B细胞可以用归巢结构域进行修饰(例如，如图2所示)，使得B细胞可以归巢到所关注位点/靶标并且在与所述靶标相互作用时激活。另外，在B细胞膜上表达的识别靶组织上的地址素和配体的B细胞归巢受体、改变B细胞到特定位点的转运的化合物或其衍生物以及B细胞的抑制分子炎症和自身免疫活性可以在B细胞归巢以及专门免疫应答的发展中起作用。
表达所关注整联蛋白的经修饰的B细胞：由淋巴细胞表达的主要归巢受体是整联蛋白，所述整联蛋白是特征在于α和β链的异源二聚体结构的一大类分子。通常，整联蛋白的特异性α链和β链的配对决定归巢受体的类型。例如，α4链与β7链的配对表征主要整联蛋白分子(α4β7)，所述主要整联蛋白分子负责淋巴细胞与在派伊尔结(PP)和胃肠(GI)道固有层内皮小静脉(LPV)中的高内皮小静脉(HEV)上表达的粘膜地址素细胞粘附分子1(MAdCAM-1)结合。类似地，α4链与β1链的配对表征皮肤的归巢受体(α4β1)。
在本发明的各个实施例中，可以预先选择具有介导优选定位的特定性状的待修饰的B细胞。例如，可以富集表达CXCR3的记忆B细胞，并且然后进行工程化。CXCR3细胞可以吸引到在炎症位点处表达的配体。因此，经修饰的B细胞可以优先地定位于此类位点。
在本发明的各个实施例中，提供了表达整联蛋白的α4链和β7链的经修饰的B细胞。令人期望的是，α4β7整联蛋白的表达将促进经修饰的B细胞归巢至结肠。在各个实施例中，提供了表达整联蛋白的α4链和β1链的经修饰的B细胞。令人期望的是，α4β1整联蛋白的表达将促进经修饰的B细胞归巢至皮肤。在各个实施例中，提供了一种经修饰的B细胞，其表达整联蛋白的α链和β链的所期望的配对，使得所表达的整联蛋白促进经修饰的B细胞归巢至所期望的所关注位点/靶标。因此，在各个实施例中，考虑在B细胞中表达整联蛋白的α链和β链的任何所期望的组合，使得表达特异性整联蛋白的经修饰的B细胞靶向所期望的所关注位点/靶标。
表达所关注归巢受体的经修饰的B细胞：B细胞具有归巢至炎性组织的能力，并且改变其归巢受体表达可以补充其天然归巢倾向。B细胞定位还通过引诱剂分子(例如，靶标，如配体和趋化因子)在特定位置或组织中的炎性位点处的表达来驱动。此类分子还可以包含抗体，如将细胞靶向外周淋巴结地址素(PNAd)的MECA79抗体。Bahmani等人,《临床研究杂志(J Clin Invest.)》2018；128(11):4770-4786；Azzi等人,《细胞报告(Cell Rep.)》2016；15(6):1202-13。因此，B细胞可以被工程化以表达促进B细胞归巢至所关注位点/靶标以及此类B细胞与所期望的靶标的相互作用的某些抗体、蛋白质和受体。在某些情况下，此类受体的表达将B细胞重定向到所关注组织。
在本发明的各个实施例中，提供了一种经修饰的B细胞，其能够表达归巢抗体、蛋白质或受体，所述归巢抗体、蛋白质或受体的表达能够将B细胞定向到所关注的特异性位点/靶标。使用特异性归巢受体/配体对将T细胞示例性归巢至特异性归巢组织(靶组织)如表2中所示。相同的特异性归巢受体/配体对也能够促进B细胞归巢至特异性归巢组织(靶组织)。因此，在本发明的各个实施例中，使用如表2中所示的对应归巢受体/配体对促进经修饰的B细胞归巢至示例性归巢组织(靶组织)。
表2
Figure BDA0003918100700000201
Figure BDA0003918100700000211
表3中示出了根据本发明的示例性归巢组织(靶组织)类型以及能够实现组织限制的B细胞归巢的配体或趋化因子。
表3
Figure BDA0003918100700000212
在本发明的各个实施例中，提供了一种经修饰的B细胞，其表达抗体、蛋白质或受体中的一种或多种，所述抗体、蛋白质或受体使用如表2中所示的特异性归巢受体/配体对促进经修饰的B细胞归巢至示例性靶组织/归巢组织。在本发明的各个实施例中，提供了一种经修饰的B细胞，其表达归巢受体中的一种或多种归巢受体，所述归巢受体使用如表2和/或3中所示的配体或趋化因子促进经修饰的B细胞归巢至示例性靶组织/归巢组织。如本文所使用的，术语“B细胞归巢”是指将本申请的B细胞定位、靶向、转运、定向或重定向到所关注位点/靶标，例如，归巢组织或靶组织、特定位置或组织中的炎性位点、或肿瘤或肿瘤微环境，其中治疗性有效载荷的递送是令人期望的。如在B细胞归巢的上下文中所使用的，术语“抗体”、“蛋白质”或“受体”是指用作治疗剂的氨基酸序列、编码肽或蛋白质的核酸序列、或RNA分子，所述治疗剂当在本发明的经修饰的B细胞中表达时将B细胞定向到所关注位点/靶标。
在某些实施例中，归巢抗体、蛋白质或受体分子用于将表达此类分子的经修饰的B细胞归巢/靶向至所关注位点/靶标。在某些实施例中，归巢抗体、蛋白质或受体分子用于将表达此类分子的经修饰的B细胞归巢/靶向至特定位置或组织中的炎性位点。在某些实施例中，归巢抗体、蛋白质或受体用于将B细胞靶向至肿瘤或肿瘤微环境并且靶向至肿瘤引流淋巴结。在某些实施例中，将B细胞靶向至特定位置是令人期望的，使得本发明的经工程化或经修饰的B细胞可以将治疗性有效载荷递送到所期望的所关注位置，例如，归巢组织或靶组织、特定位置或组织中的炎性位点、或肿瘤或肿瘤微环境。因此，在某些实施例中，令人期望的是B细胞归巢至所关注位点/靶标，例如，肿瘤或肿瘤微环境和肿瘤引流淋巴结，并且将有效载荷递送至所关注位点/靶标，所述有效载荷能够例如增加所关注位点/靶标(例如，在肿瘤中)处的交叉呈递树突状细胞(DC)的数量。
在各个实施例中，归巢抗体、蛋白质或受体作为DNA构建体在经修饰或经工程化的B细胞中表达。在各个实施例中，归巢抗体、蛋白质或受体作为DNA构建体在组成型地激活的转录途径的控制下在经修饰的B细胞中表达。在各个实施例中，涉及B细胞归巢/靶向的归巢抗体、蛋白质或受体不在B细胞中天然表达或者以比在B细胞中天然表达的水平更高的水平表达。表4中示出了根据本发明的使用特异性归巢受体/配体对将经修饰的B细胞示例性归巢至特异性归巢组织/靶组织。应当理解，尽管表4中示出了示例性归巢组织、归巢受体和配体对，但本发明的经修饰的B细胞可以被工程化以表达任何归巢抗体、蛋白质或受体(例如，表2中所示的任何归巢受体)，使得经修饰的B细胞可以定向到所关注的特异性位点/靶标。
表4
归巢组织类型 归巢受体 配体/趋化因子
肝脏 CXCR6 CXCL16
小肠 CCR9 CCL25
大肠(结肠) CCR6 CCL20
淋巴结 CCR7 CCL21
骨髓 CXCR4 CXCL12
派伊尔结 CCR7和CXCR5 分别为CCL21和CXCL13
皮肤 CCR4 CCL17(22)
用于本发明的特异性归巢受体/配体对的归巢(靶)组织类型的非排他性实例包含：皮肤、肠道(肠、结肠、肠系膜淋巴结(mLN)、派伊尔结(PP)、小肠)、肝脏、肺、骨髓、心脏、外周淋巴结(LN)、CNS、胸腺和骨髓。
可以与本发明的特异性或对应的引诱剂/配体/趋化因子配对的归巢受体的非排他性实例包含：CLA(PSGL-1糖型)、CLA(PSGL-1糖型)、CCR10、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR9、CD43E、CD44、c-Met、CXCR3、CXCR4、LFA-1、LFA-1(αLβ2)、选择蛋白配体、VLA-4、VLA-4(α4β1)和α4β7。
可以与本发明的特异性或对应的归巢受体配对的配体/趋化因子的非排他性实例包含：CXCL16、CCL17、CCL17(22)、CCL20(MIP-3α)、CCL21、CCL25、CCL27、CCL28、CCL4、CCL5、CD62E、CD62P、CXCL10、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CXCL9/CXCL10、CXCR3、E/P选择蛋白、E选择蛋白、GPR15L、HGF、透明质酸盐、ICAM-1、用于CCR1、2、5的配体、MAdCAM、MAdCAM-1、PNAd、VAP-1、VCAM和VCAM-1。
在本发明的某些实施例中，提供了一种经修饰的B细胞，其表达或具有增加的示例性B细胞归巢受体(例如，如表2所示)的表达，使得经修饰的B细胞靶向表达对应配体/趋化因子的对应的所关注归巢组织(例如，如表2和/或3所示)。在本发明的某些实施例中，提供了一种经修饰的B细胞，其与特异性α链和β链配对和特异性B细胞归巢受体(例如，如表2和/或3所示)共表达整联蛋白，所述整联蛋白和/或归巢受体的表达促使或促进经修饰的B细胞归巢/靶向至所关注位点/靶标。在一些实施例中，提供了一种经修饰的B细胞，其共表达α4β7整联蛋白和CCR9。令人期望的是，α4β7和CCR9的共表达将促进本发明的经修饰的B细胞的小肠归巢。在一些实施例中，提供了一种经修饰的B细胞，其共表达α4β1整联蛋白和CCR4。令人期望的是，α4β1和CCR4的共表达将促进本发明的经修饰的B细胞的小肠归巢。
表达免疫抑制分子的经修饰的B细胞：B细胞是许多自身免疫疾病的关键促成因素。然而，B细胞可以在治疗上用于拮抗自身免疫。具体地，B细胞可以被工程化以表达至少一个或多个免疫抑制分子，所述免疫抑制分子可以降低B细胞的自身免疫活性，从而导致自身免疫疾病减少。免疫抑制分子是本领域熟知的。此类抑制分子可以包含但不限于IL-10、TGF-β、PD-L1、PD-L2、LAG-3和TIM-3。在本发明的某些实施例中，提供了一种经修饰的B细胞，其被工程化以表达选自以下的抑制分子中的至少一个或多个：IL-10、TGF-β、PD-L1、PD-L2、LAG-3和TIM-3或其任何组合，使得位点处的炎症和定位于位点的B细胞的自身免疫活性降低，由此产生阳性治疗应答。
改变B细胞转运的化合物:在本发明的某些实施例中，提供了一种经修饰的B细胞，其用至少一种或多种化合物或其衍生物处理，所述至少一种或多种化合物或其衍生物通过诱导特异性B细胞整联蛋白和/或归巢受体的表达来改变B细胞的转运。改变B细胞转运的化合物或其衍生物是本领域熟知的。在某些实施例中，提供了一种经修饰的B细胞，其用全反式视黄酸(ATRA)或其衍生物处理，所述ATRA或其衍生物由于α4β7整联蛋白和CCR9归巢受体的表达增加而促进B细胞归巢至肠道(小肠)。如本文所使用的，术语“化合物”是指以所期望的方式改变B细胞转运的化学品、药物、治疗剂或其衍生物。
在本发明的各个实施例中，将工程化以共表达特异性整联蛋白(例如，具有特异性α链和β链配对)和所关注的特异性B细胞归巢受体的经修饰的B细胞用至少一种或多种化合物或其衍生物处理，所述化合物或其衍生物改变经修饰的B细胞的转运并且由于特异性整联蛋白和/或归巢受体的表达增加而促进细胞归巢至所关注的特异性位点/靶标。在各个实施例中，经修饰以与特异性α链和β链配对和特异性B细胞归巢受体共表达整联蛋白的B细胞进一步表达至少一个或多个免疫抑制分子，使得靶向特定炎症位点的经修饰的B细胞的自身免疫活性降低，从而导致自身免疫疾病减少。在一些实施例中，将工程化以表达一个或多个免疫抑制分子，例如IL-10、TGF-β、PD-L1、PD-L2、LAG-3和TIM-3或其组合的经修饰的B细胞用ATRA或其衍生物处理指定时间段，使得α4β7整联蛋白和CCR9归巢受体的表达被诱导以促进B细胞归巢至所关注的特异性位点/靶标(例如，肠道)，但位点处的炎症和定位于位点的B细胞的自身免疫活性降低，从而产生阳性治疗应答。在一个实施例中，将工程化以表达一个或多个免疫抑制分子，例如IL-10、TGF-β或其组合的经修饰的B细胞用ATRA或其衍生物处理指定时间段，使得α4β7整联蛋白和CCR9归巢受体的表达被诱导以促进B细胞归巢至所关注的特异性位点/靶标(例如，肠道)，但位点处的炎症和定位于位点的B细胞的自身免疫活性降低，从而产生阳性治疗应答。
应当理解，经修饰以共表达特异性B细胞整联蛋白和将B细胞靶向所关注的特定归巢组织/靶组织的归巢受体的本发明的任何B细胞可以被进一步工程化以表达一个或多个免疫抑制分子，用于减少定位于位点的B细胞的炎症和自身免疫活性，和/或用通过诱导特异性B细胞整联蛋白和/或归巢受体的表达而改变经修饰的B细胞的归巢/靶向的化合物处理。
用TLR激动剂和TLR激活B细胞：B细胞具有摄取和呈递由其特异性B细胞受体(BCR)识别的抗原的天然能力。由Toll样受体(TLR)激活的B细胞导致有效的效应B细胞在免疫应答中防御身体。TLR在B细胞中的表达或增加所述表达可以提供用于增强B细胞调节适应性免疫应答的先天信号的机制。
用TLR激动剂激活B细胞：在本发明的各个实施例中，提供了一种B细胞，其中所述B细胞用至少一种TLR激动剂体外处理。在各个实施例中，TLR可以是TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和/或TLR13。在各个实施例中，TLR激动剂优先地与一种或多种选自由以下组成的组的TLR结合：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13。TLR激动剂是本领域熟知的，并且可以包含但不限于富含CpG的寡核苷酸和双链RNA模拟物、聚肌苷酸:聚胞苷酸(poly-I:C)。在各个实施例中，TLR激动剂可以是CpG寡核苷酸。
在各个实施例中，每个B细胞可以用一种TLR激动剂处理。在各个实施例中，每个B细胞可以用多于一种TLR激动剂处理。例如，每个B细胞可以用1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种或12种不同的TLR激动剂处理。可替代地，可以向患者施用B细胞的异质群体，每个B细胞用独特的TLR激动剂或TLR激动剂的组合处理。在一些实施例中，在向有需要的受试者或患者施用B细胞的同时或之前，将用作治疗剂的B细胞用一种或多种TLR激动剂处理。在某些实施例中，用一种或多种TLR激动剂进行的处理能够产生更有效的效应B细胞，以在免疫应答中防御身体。在某些实施例中，用一种或多种TLR激动剂进行的处理能够增强B细胞的免疫应答。在一些实施例中，用至少一种或多种TLR激动剂处理本发明的B细胞诱导一种或多种TLR的表达或激活。
用TLR表达激活B细胞：在本发明的各个实施例中，提供了能够表达组成型活性TLR的经修饰的B细胞。在各个实施例中，TLR作为DNA构建体在组成型激活的转录途径的控制下在经修饰或经工程化的B细胞中表达。在各个实施例中，TLR不在B细胞中天然表达或者以比在B细胞中天然表达的水平更高的水平表达。在各个实施例中，TLR可以是TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和/或TLR13。
在各个实施例中，每个B细胞可以表达多于一种组成型活性TLR。例如，每个B细胞可以表达1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种或13种不同的组成型活性TLR。可替代地，可以向患者施用B细胞的异质群体，每个B细胞能够表达和/或分泌独特的TLR或TLR的组合，所述TLR是组成型活性的。在各个实施例中，可以通过B细胞的异质群体向受试者或患者施用1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种或13种不同的组成型活性TLR。
在本发明的某些实施例中，B细胞是表达至少一种组成型活性TLR的经修饰的B细胞。在某些实施例中，用一种或多种TLR激动剂处理表达至少一种组成型活性TLR的经修饰的B细胞。在某些实施例中，组成型活性TLR的表达能够产生更有效的效应B细胞，以在免疫应答中防御身体。在某些实施例中，组成型活性TLR的表达能够增强B细胞的免疫应答。在某些实施例中，经修饰的B细胞表达组成型活性的TLR和本申请的任何CAR-B两者。在各个实施例中，在向有需要的受试者或患者施用经修饰的B细胞的同时或之前，用一种或多种TLR激动剂进一步处理表达组成型活性的TLR和/或CAR-B的经修饰的B细胞。在某些实施例中，B细胞可以被工程化以在不存在CAR-B的情况下表达有效载荷和修饰因子，如TLR，以进行瘤内施用。
在HLA I类和II类分子中同时呈递抗原的经修饰的B细胞：B细胞，除了其在抗体产生中的功能之外，还表达高水平的人白细胞抗原(HLA)II类分子并且可以抗原呈递至CD4+T细胞(Hong等人,2018,《免疫力(Immunity)》49,695-708)。在本发明的各个实施例中，提供了一种经修饰的B细胞，其能够在HLA I类和II类分子两者中同时呈递特异性抗原和/或抗原衍生的所关注表位，如肿瘤抗原或传染病抗原。肿瘤抗原和传染病抗原是本领域熟知的，并且描述于前述部分中。在某些实施例中，所关注的特异性抗原，例如，肿瘤抗原或传染病抗原，与溶酶体蛋白的靶向信号融合，所述溶酶体蛋白将抗原靶向溶酶体并且在HLA I类和II类分子两者中同时且有效地呈递抗原。在一些实施例中，靶向信号是溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP1)的靶向信号。在一些实施例中，靶向信号能够进入核内体再循环隔室。Clec9A的c末端序列是这种靶向部分。如本文所使用的，与靶向信号融合的特异性肿瘤抗原或传染病抗原是指用作治疗剂的氨基酸序列、编码肽或蛋白质的核酸序列、或RNA分子(例如，mRNA分子)。在一个实施例中，与靶向信号融合的特异性肿瘤抗原或传染病抗原是指用作治疗剂的mRNA分子。在某些实施例中，令人期望的是，与靶向信号(如LAMP1或Clec9A的靶向信号)融合的特异性肿瘤抗原和/或传染病抗原被靶向溶酶体或核内体，并且在HLAI类和II类分子两者中同时且有效地呈递。在某些实施例中，令人期望的是，在成熟之前或之后，用与靶向信号(如LAMP1或Clec9A的靶向信号)融合的编码所关注的特异性肿瘤抗原和/或传染病抗原的mRNA电穿孔B细胞(例如，人B细胞)能够在HLA I类和II类分子两者中同时且有效地呈递特异性抗原和/或抗原衍生的表位。在各个实施例中，所关注的特异性肿瘤抗原和/或传染病抗原不是由B细胞天然呈递的，不是由B细胞同时在HLA I类和II类分子两者中天然呈递的，或者不是由B细胞以高效率在HLA I类和II类分子两者中天然呈递的。设想的是，将此类电穿孔的B细胞引入到受试者(例如，人宿主)体内将通过在HLA I类和II类分子两者中同时且有效地呈递特异性抗原和/或抗原衍生的所关注表位来促进抗原特异性免疫应答的发展或增强抗原特异性免疫应答。
在各个实施例中，本发明涉及与靶向信号(如LAMP1的靶向信号)融合的编码至少一种所关注的特异性抗原(例如，肿瘤抗原或传染病抗原)的核酸序列(例如，mRNA序列)，所述核酸序列用作B细胞电穿孔中的治疗剂，用于在HLA I类和II类分子两者中同时且有效地呈递特异性抗原和/或抗原衍生的表位。在各个实施例中，本发明涉及与靶向信号融合的编码多于一种(例如，1种、2种、3种、4种、5种或更多种)特异性肿瘤抗原和/或所关注的传染病抗原的核酸序列，例如，mRNA序列。在各个实施例中，本发明涉及不同核酸序列的池(例如，不同mRNA序列的池)，用作如上所述的B细胞电穿孔中的治疗剂，其中每个池编码至少一种所关注的特异性抗原(例如，肿瘤抗原或传染病抗原)，所述特异性抗原与不同于其它mRNA序列的池的靶向信号融合。因此，在一些实施例中，可以向受试者施用B细胞的同质群体，其中每个B细胞用与靶向信号融合的编码至少一种所关注的特异性抗原的mRNA电穿孔。在一些实施例中，可以向受试者施用B细胞的同质群体，其中每个B细胞用与靶向信号融合的编码多于一种所关注的特异性抗原的mRNA电穿孔。在一些实施例中，可以向受试者施用B细胞的异质群体，其中每个B细胞用mRNA的组合电穿孔，每个mRNA编码与不同靶向信号融合的至少一种所关注的特异性抗原。
在一些实施例中，如上所述的用于电穿孔的B细胞可以是本申请的任何经修饰的B细胞。在一些实施例中，经修饰的B细胞包括B细胞的嵌合抗原受体(CAR-B)。在各个实施例中，经修饰的B细胞可以表达CAR-B并且在HLA I类和II类分子两者中同时且有效地呈递所关注的特异性抗原和/或抗原衍生的表位。
在各个实施例中，本发明涉及一种向有需要的患者施用分离的B细胞的方法。在各个实施例中，可以向患者施用B细胞的群体。在各个实施例中，每个B细胞可以表达多于一个有效载荷肽或蛋白质。例如，每个B细胞可以表达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个不同的有效载荷。可替代地，可以向患者施用B细胞的异质群体，每个B细胞能够表达和/或分泌独特的有效载荷或有效载荷的组合。在各个实施例中，可以通过B细胞的异质群体向患者施用1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个不同的有效载荷。
3.治疗方法
在一些方面，本发明因此包括用于治疗或预防肿瘤或癌组织的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的至少一种本文所公开的CAR-B。
提供了用于治疗疾病或病症(包含癌症)的方法。在一些实施例中，本发明涉及在受试者体内产生B细胞介导的免疫应答，包括向受试者施用有效量的本申请的经工程化的免疫细胞。在一些实施例中，B细胞介导的免疫应答针对一个或多个靶细胞。在一些实施例中，经工程化的免疫细胞包括B细胞的嵌合抗原受体(CAR-B)。在一些实施例中，靶细胞是肿瘤细胞。在一些方面，本发明包括一种用于治疗或预防恶性肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的至少一种本文所述的分离的抗原结合分子。在一些方面，本发明包括治疗或预防恶性肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的至少一个免疫细胞，其中所述免疫细胞包括至少一种嵌合抗原受体。
在一些方面，本发明包括一种药物组合物，所述药物组合物包括至少一种如本文所述的抗原结合分子和药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药物组合物进一步包括另外的活性剂。
在一些实施例中，受试者被诊断患有局限于肝脏的转移性疾病。在其它实施例中，转移性疾病是癌症。在仍其它实施例中，癌症从乳房、结肠、直肠、食道、肺、胰腺和/或胃中的原发性肿瘤转移。在仍其它实施例中，受试者被诊断为患有不可切除的转移性肝肿瘤。在又其它实施例中，受试者被诊断为患有来自原发性结直肠癌的不可切除的转移性肝肿瘤。在一些实施例中，受试者被诊断为患有肝细胞癌。
应当理解，经修饰的B细胞的靶剂量的范围可以优选地为1x106-2x1010个细胞/kg，更优选地为2x106个细胞/kg。应当理解，高于和低于此范围的剂量可能适用于某些受试者，并且适当的剂量水平可以由医疗保健提供者根据需要确定。另外，可以根据本发明提供多剂量的细胞。
还提供了用于减小受试者的肿瘤大小的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的经修饰的B细胞，其中所述细胞包括CAR-B受体，所述CAR-B受体包括与肿瘤上的抗原、有效载荷或CAR-B和有效载荷两者结合的抗原结合结构域。在一些实施例中，受试者患有实体瘤或血液恶性肿瘤，如淋巴瘤或白血病。在一些实施例中，将经修饰的B细胞递送到肿瘤床。在一些实施例中，癌症存在于受试者的骨髓中。
还提供了用于将B细胞归巢至受试者体内的所关注位点/靶标的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的经修饰的B细胞，其中所述细胞包括在所关注位点/靶标处被吸引到配体、趋化因子或引诱剂的整联蛋白、归巢抗体、蛋白质或受体。在一些实施例中，所关注位点/靶标是例如归巢组织或靶组织、特定位置或组织中的炎性位点、或肿瘤或肿瘤微环境，其中治疗性有效载荷的递送是令人期望的。
还提供了用于减少受试者体内的所关注位点/靶标处的B细胞的炎症和自身免疫活性的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的经修饰的B细胞，其中所述细胞包括免疫抑制分子。在一些实施例中，所关注位点/靶标是例如归巢组织或靶组织、特定位置或组织中的炎性位点、或肿瘤或肿瘤微环境，其中治疗性有效载荷的递送是令人期望的。
还提供了用于改变B细胞到受试者体内的所关注位点/靶标的转运的方法，所述方法包括用适合于改变B细胞转运的化合物或其衍生物处理本发明的B细胞，以及向有需要的受试者施用经处理的B细胞。在一些实例中，化合物或其衍生物通过增加由B细胞表达的整联蛋白、归巢抗体、蛋白质、受体或其组合的表达来改变B细胞转运。
还提供了用于增强B细胞和/或产生有效的效应B细胞以增加受试者的免疫应答的方法，所述方法包括用至少一种或多种TLR激动剂处理本发明的B细胞，以及向有需要的受试者施用经处理的B细胞。在一些实施例中，用至少一种或多种TLR激动剂处理本发明的B细胞诱导一种或多种TLR的表达或激活。在一些实施例中，用于增强B细胞和/或产生有效的效应B细胞以增加受试者的免疫应答的方法进一步包括向受试者施用本发明的经修饰的B细胞，所述经修饰的B细胞表达至少一种或多种组成型活性TLR。还提供了用于增强B细胞和/或产生有效的效应B细胞以增加受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的经修饰的B细胞，其中所述细胞表达CAR-B受体，所述CAR-B受体包括与肿瘤上的抗原、组成型活性TLR或CAR-B和组成型活性TLR两者结合的抗原结合结构域，其中所述细胞在向受试者施用所述细胞的同时或之前用至少一种或多种TLR激动剂处理。
还提供了用于增加受试者的抗原特异性免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的经修饰的B细胞，其中所述细胞用与靶向信号(如LAMP1或Clec9A的靶向信号)融合的编码特异性肿瘤抗原和/或传染病抗原的核酸序列(例如，mRNA)电穿孔，用于在HLAI类和II类分子中同时且有效地呈递特异性抗原和/或抗原衍生的表位。在一些实施例中，受试者患有实体瘤或血液恶性肿瘤，如淋巴瘤或白血病。
应当理解，使用本申请的经工程化或经修饰的B细胞的治疗方法的各个实施例不是互相排斥的，并且除非明确指出，否则可以以任何方式且不受任何限制彼此组合，以便实现促进本文所设想的任何结果和/或治疗应答。
在一些实施例中，经修饰的B细胞是自体B细胞。在一些实施例中，经修饰的B细胞是同种异体B细胞。在一些实施例中，经修饰的B细胞是异源B细胞。在一些实施例中，本申请的经修饰的B细胞在体内转染或转导。在其它实施例中，经工程化的细胞离体转染或转导。
如本文所使用的，术语“受试者”或“患者”是指个体。在一些方面，受试者是哺乳动物，如人。在一些方面，受试者可以是非人灵长类动物。非人灵长类动物包含狨猴、猴、黑猩猩、大猩猩、猩猩和长臂猿，仅举几例。术语“受试者”还包含家养动物，如猫、狗等；家畜(例如，美洲驼、马、牛)；野生动物(例如，鹿、麋鹿、驼鹿等)；实验室动物(例如，小鼠、兔、大鼠、沙鼠、豚鼠等)；以及禽类(例如，鸡、火鸡、鸭等)。优选地，受试者是人受试者。更优选地，受试者是人患者。
所述方法可以进一步包括施用一种或多种化疗剂。在某些实施例中，化疗剂是淋巴细胞清除(预调节)化疗剂。在美国临时专利申请62/262,143和62/167,750中描述了有益的预调节治疗方案连同相关的有益的生物标志物，所述美国临时专利申请特此通过引用整体并入本文。这些描述了例如调节需要T细胞疗法的患者的方法，所述方法包括向患者施用指定的有益剂量的环磷酰胺(介于200mg/m2/天与2000mg/m2/天之间)和指定剂量的氟达拉滨(fludarabine)(介于20mg/m2/天与900mg/m2/天之间)。优选的剂量方案涉及治疗患者，所述剂量方案包括在向患者施用治疗有效量的经工程化的B细胞之前，每日向患者施用约500mg/m2/天的环磷酰胺和约60mg/m2/天的氟达拉滨，持续三天。
在其它实施例中，抗原结合分子、经转导的(或以其它方式工程化的)细胞(如CAR)和化疗剂各自以有效治疗受试者的疾病或病症的量施用。
在某些实施例中，包括本文所公开的表达CAR的免疫效应细胞的组合物可以与任何数量的化疗剂联合施用。化疗剂的实例包含：烷化剂，如噻替哌和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；亚乙基亚胺和甲基胺类(methylamelamines)，包含六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲密胺(trimethylolomelamine resume)；氮芥类(nitrogen mustard)，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(cholophosphamide)、依弗酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲(nitrosurea)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、去甲氧基柔红霉素(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、菌酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(que-lamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，如甲氨蝶呤和5-氟脲嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素类，如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；百垂布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；
Figure BDA0003918100700000311
雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三环乙亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；盖克托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇(
Figure BDA0003918100700000312
百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb))和多西紫杉醇(
Figure BDA0003918100700000313
罗纳普朗克乐安(Rhone-Poulenc Rorer))；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，如TargretinTM(贝沙罗汀(bexarotene))、PanretinTM(阿利维A酸)；OntakTM(地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox))；埃斯波霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)；以及以上药物中的任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义还包含用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，如：抗雌激素类，包含例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛西芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(法乐通(Fareston))；和抗雄激素类，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及以上药物中的任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在适当的情况下，还可以施用化疗剂的组合，包含但不限于CHOP，即，环磷酰胺
Figure BDA0003918100700000321
阿霉素(羟基多柔比星)、氟达拉滨、长春新碱
Figure BDA0003918100700000322
和泼尼松(Prednisone)。
在一些实施例中，在施用经工程化的细胞或核酸后的同时或一周内施用化疗剂。在其它实施例中，在施用经工程化的细胞或核酸后1周至4周或1周至1个月、1周至2个月、1周至3个月、1周至6个月、1周至9个月或1周至12个月施用化疗剂。在其它实施例中，在施用细胞或核酸之前至少1个月施用化疗剂。在一些实施例中，所述方法进一步包括施用两种或更多种化疗剂。
多种另外的治疗剂可以与本文所述的组合物结合使用。例如，潜在有用的另外的治疗剂包含PD-1(或PD-L1)抑制剂，如纳武单抗(nivolumab)
Figure BDA0003918100700000323
派姆单抗(pembrolizumab)
Figure BDA0003918100700000324
派姆单抗、皮地利珠单抗(pidilizumab)和阿特珠单抗(atezolizumab)
Figure BDA0003918100700000325
其它另外的治疗剂包含单独的或与PD-1和/或PD-L1抑制剂组合的抗CTLA-4抗体(例如，
Figure BDA0003918100700000326
)、抗LAG-3抗体(例如，瑞拉利单抗(Relatlimab)、BMS)。
适于与本发明组合使用的另外的治疗剂包含但不限于依鲁替尼(ibrutinib)
Figure BDA0003918100700000327
奥法木单抗(ofatumumab)
Figure BDA0003918100700000328
利妥昔单抗(rituximab)
Figure BDA0003918100700000329
贝伐珠单抗(bevacizumab)
Figure BDA00039181007000003210
曲妥珠单抗(trastuzumab)
Figure BDA00039181007000003211
曲妥珠单抗美坦新偶联物(trastuzumab emtansine)
Figure BDA00039181007000003212
伊马替尼(imatinib)
Figure BDA00039181007000003213
西妥昔单抗(cetuximab)
Figure BDA00039181007000003214
帕尼单抗(panitumumab)
Figure BDA00039181007000003215
卡妥索单抗(catumaxomab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、奥法木单抗、托西莫单抗(tositumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib)、阿昔替尼(axitinib)、马赛替尼(masitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、托西尼布(toceranib)、来他替尼(lestaurtinib)、阿昔替尼(axitinib)、西地尼布(cediranib)、乐伐替尼(lenvatinib)、尼达尼布(nintedanib)、帕唑帕尼、瑞戈非尼(regorafenib)、司马沙尼(semaxanib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼、替沃扎尼(tivozanib)、托西尼布(toceranib)、凡德他尼、恩曲替尼(entrectinib)、卡博替尼(cabozantinib)、伊马替尼、达沙替尼(dasatinib)、尼罗替尼(nilotinib)、帕纳替尼(ponatinib)、拉多替尼(radotinib)、博舒替尼(bosutinib)、来他替尼、鲁索替尼(ruxolitinib)、帕克替尼(pacritinib)、考比替尼(cobimetinib)、司美替尼(selumetinib)、曲美替尼(trametinib)、比美替尼(binimetinib)、艾乐替尼(alectinib)、色瑞替尼(ceritinib)、克唑替尼(crizotinib)、阿柏西普(aflibercept)、adipotide、地尼白介素-毒素连接物、mTOR抑制剂，如依维莫司(Everolimus)和西罗莫司(Temsirolimus)、刺猬抑制剂，如索尼德吉(sonidegib)和维莫德吉(vismodegib)、CDK抑制剂，如CDK抑制剂(帕博西尼(palbociclib))。
在另外的实施例中，包括含有CAR的B细胞的组合物可以与抗炎剂一起施用。抗炎剂或药物包含但不限于类固醇和糖皮质激素(包含倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氢化可的松、氢化可的松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安奈德)、包含阿司匹林的非甾体类抗炎药(NSAIDS)、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、抗TNF药物、环磷酰胺和霉酚酸酯。示例性NSAID包含布洛芬、萘普生、萘普生钠、Cox-2抑制剂和唾液酸化物(sialylate)。示例性镇痛药包含对乙酰氨基酚、羟考酮、盐酸丙氧芬的曲马多。示例性糖皮质激素包含可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙或泼尼松。示例性生物应答调节剂包含针对细胞表面标志物(例如，CD4、CD5等)的分子、细胞因子抑制剂如TNF拮抗剂(例如，依那西普(etanercept)
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)、阿达木单抗
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和英利昔单抗(infliximab)
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趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物应答调节剂包含单克隆抗体以及重组形式的分子。示例性DMARD包含硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹、金(口服(金诺芬)和肌内)和米诺环素。
在某些实施例中，本文所述的组合物与细胞因子结合施用。如本文所使用的“细胞因子”意指由一种细胞群体释放的蛋白质，所述细胞群作用于另一个作为细胞间介质的细胞。细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包含生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛激素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝细胞生长因子(HGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；催乳素；胎盘催乳素；副中肾管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子(NGF)，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子II；促红细胞产生素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素α、干扰素β和干扰素γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；以及粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-lα、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15，一种肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；以及包含LIF和试剂盒配体(KL)的其它多肽因子。如本文所使用的，术语细胞因子包含来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。
4.制备方法
多种已知的技术可以用于制备根据本发明的多核苷酸、多肽、载体、抗原结合分子、免疫细胞、组合物等。
在本文所述的免疫细胞的体外操纵或基因修饰之前，可以从受试者获得所述细胞。在一些实施例中，免疫细胞包括B细胞。可以从多个来源获得B细胞，包含外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在某些实施例中，可以使用技术人员已知的任何数量的技术(如FICOLLTM分离)从收集自受试者的单位血液中获得B细胞。细胞可以优选地通过单采血液成分术从个体的循环血液中获得。单采血液成分术产品通常含有淋巴细胞，包含T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在某些实施例中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆级分并将所述细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理。细胞可以用PBS进行洗涤。如将理解的，可以使用洗涤步骤，如通过使用半自动流通离心机，例如CobeTM 2991细胞处理器、Baxter Cyto-MateTM等。洗涤后，可以将细胞重悬浮于各种生物相容缓冲液或其它具有或没有缓冲液的盐水溶液中。在某些实施例中，可以去除单采血液成分术样品的不期望的组分。
可以在分离之后使用已知方法对如B细胞等免疫细胞进行基因修饰，或者可以在进行基因修饰之前对免疫细胞进行体外激活和扩增(或在祖细胞的情况下分化)。在另一个实施例中，如B细胞等免疫细胞用本文所述的嵌合B细胞受体进行基因修饰(例如，用包括编码CAR-B的一个或多个核苷酸序列的病毒载体转导)，并且然后在体外激活和/或扩增。用于激活和扩增B细胞的方法是本领域已知的，并且在例如美国专利第6,905,874号；第6,867,041号；第6,797,514号；以及PCT WO 2012/079000中进行描述，所述美国专利的内容特此通过引用整体并入。通常，此类方法包含在具有如IL-2等适当细胞因子的培养基中，使PBMC或分离的B细胞与通常连接到珠粒或其它表面的刺激剂和共刺激剂接触。
在其它实施例中，可以使用如在以下文献中描述的方法等方法来激活和刺激B细胞以与饲养细胞和适当的抗体和细胞因子一起增殖：美国专利第6,040,177号；第5,827,642号；以及WO/2012129514，所述美国专利的内容特此通过引用整体并入。
用于制备本发明的构建体和经工程化的免疫细胞的某些方法在PCT申请PCT/US2015/14520中描述，所述PCT申请的内容特此通过引用整体并入。制备构建体和细胞的另外的方法可以在美国临时专利申请第62/244,036号中找到，所述美国临时专利申请的内容特此通过引用整体并入。
为了克隆多核苷酸，可以将载体引入到宿主细胞(分离的宿主细胞)中以允许复制载体自身，并且由此扩增其中所含有的多核苷酸的拷贝。克隆载体可以含有序列组分，所述序列组分通常包含但不限于复制起点、启动子序列、转录起始序列、增强子序列和可选择标志物。这些元件可以由本领域普通技术人员适当地选择。例如，可以选择复制起点以促进载体在宿主细胞中的自主复制。
在某些实施例中，本公开提供了含有本文提供的载体的分离的宿主细胞。含有载体的宿主细胞可以用于表达或克隆载体中所含有的多核苷酸。合适的宿主细胞可以包含但不限于原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或更高等的真核细胞，如哺乳动物细胞。用于此目的的合适的原核细胞包含但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌(E.coli))、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marc-escans))和志贺氏菌属(Shigella)；以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。
可以使用本领域已知的任何合适的方法将载体引入到宿主细胞，包含但不限于DEAE-葡聚糖介导的递送、磷酸钙沉淀法、阳离子脂质介导的递送、脂质体介导的转染、电穿孔、微丸轰击、受体介导的基因递送、由聚赖氨酸、组蛋白、壳聚糖和肽介导的递送。用于转染和转化细胞以表达所关注载体的标准方法是本领域熟知的。在一另外的实施例中，不同表达载体的混合物可以用于基因修饰免疫效应细胞的供体群体，其中每个载体编码如本文所公开的不同CAR-B。所得的经转导的免疫效应细胞形成经工程化的细胞的混合群体，其中一定比例的经工程化的细胞表达多于一种不同的CAR-B。
在一个实施例中，本发明提供了一种储存表达靶向蛋白质的CAR-B的经基因工程化的细胞的方法。这涉及冷冻保存免疫细胞，使得所述细胞在解冻后仍是有活力的。表达CAR-B的免疫细胞的一部分可以通过本领域已知的方法进行冷冻保存，以提供此类细胞的永久来源，用于未来治疗患有恶性肿瘤的患者。当需要时，可以将冷冻保存的经转化的免疫细胞解冻，使所述经转化的免疫细胞生长和扩增，以获得更多此类细胞。
如本文所使用的，“冷冻保存”是指通过冷却到零下温度来保存细胞，如(典型地)77开尔文或196℃(液氮的沸点)。冷冻保护剂通常在零下温度下用于防止细胞因在低温下冷冻或升温到室温而受损。冷冻保护剂和最佳冷却速率可以防止细胞损伤。根据本发明可以使用的冷冻保护剂包含但不限于：二甲基亚砜(DMSO)(Lovelock和Bishop,《自然》,1959,183,1394-1395；Ashwood-Smith,《自然》,1961,190,1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷(Rinfiret,《纽约科学院年刊(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》,1960,85,576)和聚乙二醇(Sloviter和Ravdin,《自然》,1962,196,48)。优选的冷却速率为1℃至3℃/分钟。
术语“基本上纯的”用于指示给定组分以高水平存在。组分期望地是组合物中存在的主要组分。优选地，所述组分以大于30％、大于50％、大于75％、大于90％或甚至大于95％的水平存在，所述水平基于干重/干重相对于所考虑的总组合物来确定。在非常高的水平下(例如，在大于90％、大于95％或大于99％的水平下)，组分可以被视为呈“纯形式”。本发明的生物活性物质(包含多肽、核酸分子、抗原结合分子、部分)可以以基本上不含所述物质可能另外与之相关的一种或多种污染物的形式提供。当组合物基本上不含给定污染物时，所述污染物将处于低水平(例如，在基于上述干重/干重小于10％、小于5％或小于1％的水平下)。
在一些实施例中，通过首先从培养基中收获细胞，并且然后在适合于以治疗有效量施用的介质和容器系统(“药学上可接受的”载体)中洗涤并且浓缩细胞来调配细胞。合适的输注介质可以是任何等渗介质调配物，通常是盐水，NormosolTM R(雅培公司(Abbott))或Plasma-LyteTM A(百特公司(Baxter))，但是也可以使用在水中或林格氏乳酸(Ringer'slactate)中的5％葡萄糖。输注介质可以用人血清白蛋白补充。
组合物中细胞的所期望的治疗量通常为至少2个细胞或更通常地大于102个细胞，并且至多106个，至多并且包含108个或109个细胞，并且可以大于1010个细胞。细胞的数量将取决于组合物的期望用途以及其中包含的细胞类型。因此，所期望细胞的密度通常大于106个细胞/ml，并且通常大于107个细胞/ml，通常108个细胞/ml或更大。临床相关数量的免疫细胞可以分配到累积等于或超过105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个或1012个细胞的多次输注中。在本发明的一些方面，特别是因为所有输注的细胞将被重定向到特定的靶抗原，所以可以施用范围在106/千克(每位患者106至1011个)的较低数量的细胞。可以以这些范围内的剂量多次施用CAR-B治疗。对于接受疗法的患者，所述细胞可以是自体的、同种异体的或异源的。在一些方面，在单个产品中发现不同的CAR-B细胞。组合物可以少至2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或至多10个不同的CAR-B细胞。这些可以由表达嵌合CAR蛋白的细胞和表达其它CAR和/或有效载荷的B细胞组成。
本发明的B细胞可以单独施用，或者作为药物组合物与稀释剂和/或与其它组分如IL-2或其它细胞因子或细胞群体组合施用。本发明的药物组合物可以包括如本文所述的表达CAR-B的细胞群体，如B细胞，其与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。此类组合物可以包括缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选地被调配成用于静脉内施用。治疗还可以包含一种或多种皮质类固醇治疗，如地塞米松和/或甲基强的松龙。
本申请的组合物可以包括所公开的组分、基本上由其组成或由其组成。
本发明的药物组合物(溶液、悬浮液等)可以包含以下中的一种或多种：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、优选地生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、固定油如可以用作溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于张度调节的药剂如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选地是无菌的。
应当理解，通过用自杀基因转导免疫细胞(含有一种或多种CAR-B)可以使不良事件最小化。也可能期望的是将可诱导的“开启”或“加速器”开关掺入到免疫细胞中。这些技术可以使用二聚化结构域和这种结构域二聚化的任选激活剂。这些技术包含例如Wu等人,《科学(Science)》2014,350(6258)中描述的技术，所述技术在某些细胞中利用FKBP/雷帕霉素类似物(Rapalog)二聚化系统，所述文献的内容通过引用整体并入本文。另外的二聚化技术在以下文献中进行描述：例如，Fegan等人《化学评论(Chem.Rev.)》2010,110,3315-3336以及美国专利第5,830,462号；第5,834,266号；第5,869,337号；和第6,165,787号，所述文献和美国专利的内容通过引用整体并入本文。另外的二聚化对可以包含环孢霉素-A/亲环素、受体、雌激素/雌激素受体(任选地使用他莫昔芬)、糖皮质激素/糖皮质激素受体、四环素/四环素受体、维生素D/维生素D受体。二聚化技术的另外的实例可以在以下文献中找到：例如，WO 2014/127261、WO 2015/090229、US 2014/0286987、US 2015/0266973、US 2016/0046700、美国专利第8,486,693号、US 2014/0171649和US 2012/0130076，所述文献的内容进一步通过引用整体并入本文。
合适的技术包含在用本发明的CAR-B构建体转导细胞之前、之后或同时使用诱导型胱天蛋白酶-9(美国申请公开第2011/0286980号)或胸苷激酶。用于引入自杀基因和/或“开启”开关的另外的方法包含CRISPR、TALENS、MEGATALEN、锌指、RNAi、siRNA、shRNA、反义技术和本领域已知的其它技术。
抗CD20或抗CD19代表减少或消除经工程化的B细胞的另外的方式，如果此类细胞是不良事件或病理的原因。
应当理解，本文中的描述仅是示例性和说明性的，并且不限制所要求保护的本发明。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包含复数。
本文所使用的章节标题仅出于组织目的，而不应被解释为对所描述的主题进行限制。在本申请中引用的所有文件或文件的部分，包含但不限于专利、专利申请、论文、书籍和专著，均特此出于任何目的通过引用整体明确地并入。如根据本公开所用，除非另外指示，否则以下术语应理解为具有以下含义：
在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包含(including)”以及如“包含(includes)”和“包含(included)”等其它形式的使用不是限制性的。此外，除非另外特别说明，否则如“元件”或“组分”等术语涵盖包括一个单元的元件和组分以及包括多于一个亚单元的元件和组分两者。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”或“核酸”包含单链核苷酸聚合物和双链核苷酸聚合物两者。包括多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一种核苷酸类型的经修饰形式。所述修饰包含碱基修饰，如溴尿嘧啶核苷和肌苷衍生物；核糖修饰，如2',3'-二脱氧核糖；以及核苷酸间键合修饰，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯(phosphoro-anilothioate)、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯。
术语“寡核苷酸”是指包括200个或更少核苷酸的多核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链，例如，用于构建突变基因。寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可以包含用于检测测定的标记，所述标记包含放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原标记。寡核苷酸可以用作例如PCR引物、克隆引物或杂交探针。
术语“控制序列”是指可以影响与其连接的编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。此类控制序列的性质可以取决于宿主生物体。在特定实施例中，原核生物的控制序列可以包含启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。例如，真核生物的控制序列可以包含包括一个或多个转录因子识别位点的启动子、转录增强子序列和转录终止序列。“控制序列”可以包含前导序列(信号肽)和/或融合配偶体序列。
如本文所使用的，“可操作地连接”意指所述术语所应用的组分处于允许其在合适条件下执行其固有功能的关系。
术语“载体”意指用于将将蛋白质编码信息转移到宿主细胞中的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。术语“表达载体”或“表达构建体”是指合于转化宿主细胞并且含有指导和/或控制(与宿主细胞结合)与其可操作地连接的一个或多个异源编码区的表达的核酸序列的载体。表达构建体可以包含但不限于影响或控制转录、翻译，并且如果存在内含子，影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。
术语“宿主细胞”是指已经被核酸序列转化或能够被转化并由此表达所关注基因的细胞。所述术语包含亲本细胞的后代，无论后代与原始亲本细胞在形态上或遗传构成上是否相同，只要存在所关注基因即可。
术语“转化”是指细胞的遗传特性的变化，并且当细胞已经被修饰为含有新的DNA或RNA时，所述细胞已经被转化。例如，在细胞通过转染、转导或其它技术引入新的基因物质从其天然状态被基因修饰时，所述细胞被转化。在转染或转导后，转化DNA可以通过物理整合到细胞的染色体中而与细胞的DNA重组，或者可以作为附加型元件短暂地维持而不被复制，或者可以作为质粒独立复制。当转化DNA随着细胞分裂而复制时，认为细胞已经被稳定转化。
术语“转染”是指细胞摄取外来或外源DNA。许多转染技术是本领域熟知的并且在本文中公开。参见例如，Graham等人,《病毒学(VIROLOGY)》,1973,52:456；Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,2001,同上；Davis等人,《分子生物学基础方法(Basic Methods in Molecular Biology)》,1986,爱思唯尔(Elsevier)；Chu等人,《基因(Gene)》,1981,13:197。
术语“转导”是指通过病毒载体将外来DNA引入到细胞中的过程。参见例如，Jones等人,《基因学：原理和分析(Genetics:principles and analysis)》,1998,波士顿：琼斯和巴特利特出版社(Boston:Jones&Bartlett Publ)。
术语“多肽”或“蛋白质”是指具有蛋白质的氨基酸序列的大分子，包含天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代。术语“多肽”和“蛋白质”具体地涵盖抗原结合分子、抗体或具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。术语“多肽片段”是指与全长天然蛋白相比，具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。与天然蛋白相比，此类片段还可以含有经修饰的氨基酸。有用的多肽片段包含抗原结合分子的免疫功能片段。
术语“分离的”意指(i)不含通常发现的至少一些其它蛋白质；(ii)基本上不含来自同一来源，例如来自同一物种的其它蛋白质；(iii)与至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或与其天然缔合的其它物质分离；(iv)和不与其天然缔合的多肽可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用)；或(v)在自然界中不存在。
多肽(例如，抗原结合分子)的“变体”包括氨基酸序列，其中相对于另一个多肽序列，一个或多个氨基酸残基被插入到氨基酸序列中、从氨基酸序列缺失和/或取代到氨基酸序列中。变体包含融合蛋白。
术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列确定的。“同一性百分比”意指比较分子中氨基酸或核苷酸之间的相同残基的百分比，并且是基于所比较的分子中的最小分子的大小计算的。对于这些计算，优选地通过特定的数学模型或计算机程序(即，“算法”)来解决比对中的空位(如果有的话)。
为了计算同一性百分比，被比较的序列通常以使序列之间的匹配最大的方式进行比对。可以用于确定同一性百分比的计算机程序的一个实例是GCG程序包，所述程序包包含GAP(Devereux等人,《核酸研究(Nucl.Acid Res.)》,1984,12,387；威斯康星州麦迪逊威斯康星大学遗传学计算机组(Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)。计算机算法GAP用于比对要确定百分比序列同一性的两个多肽或多核苷酸。对序列进行比对，以实现其相应氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配范围”，如由算法确定的)。在某些实施例中，标准比较矩阵(参见例如，Dayhoff等人,1978,《蛋白序列和结构图谱学(Atlas of Protein Sequence and Structure)》,1978,5:345-352中关于PAM 250比较矩阵的内容；Henikoff等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》1992,89,10915-10919中关于BLO-SUM 62比较矩阵的内容)也被算法使用。
如本文所使用的，二十种常规(例如，天然存在的)氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见例如，《免疫学合成(Immunology A Synthesis)》(第2版,Golub和Green编辑,马萨诸塞州桑德兰Sinauer Assoc.出版社(Sinauer Assoc.,Sunderland,Mass.)(1991))，所述文献出于任何目的通过引用并入本文。二十种常规氨基酸、非天然氨基酸(如α-、α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸)的立体异构体(例如，D-氨基酸)也可以是本发明的多肽的合适的组分。非常规氨基酸的实例包含：4-羟基脯氨酸、γ-羧基-谷氨酸盐、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、e-N-乙酰基赖氨酸、0-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸以及其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文所使用的多肽标记中，根据标准使用和惯例，左手方向是氨基末端方向，并且右手方向是羧基末端方向。
保守氨基酸取代可以涵盖非天然存在的氨基酸残基，所述氨基酸残基通常通过化学肽合成而不是通过生物系统中的合成来并入。这些包含肽模拟物和氨基酸部分的其它反向或倒置的形式。可以基于共同的侧链性质将天然存在的残基分为几类：
a)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
b)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
c)酸性：Asp、Glu；
d)碱性：His、Lys、Arg；
e)影响链定向的残基：Gly、Pro；以及
f)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
例如，非保守取代可以涉及用这些种类之一的成员交换来自另一种类的成员。
根据某些实施例，在对抗原结合分子、经工程化的T细胞的共刺激结构域或激活结构域进行改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。根据氨基酸的疏水性和电荷特性已经为每个氨基酸分配了亲水指数。所述氨基酸是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。参见例如，Kyte等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,1982,157,105-131。已知某些氨基酸可以取代具有类似亲水指数或评分的其它氨基酸，并且仍然保留类似的生物活性。在本领域中还应理解，可以在亲水性的基础上有效地进行相似氨基酸的取代，特别是当由此产生的生物功能性蛋白质或肽旨在用于免疫学实施例时，如在本发明的情况中。表5中示出了示例性氨基酸取代。
表5
Figure BDA0003918100700000411
Figure BDA0003918100700000421
术语“衍生物”是指包含除了氨基酸(或核酸)插入、缺失或取代之外的化学修饰的分子。在某些实施例中，衍生物包括共价修饰，包含但不限于与聚合物、脂质或其它有机或无机部分的化学键合。在某些实施例中，经化学修饰的抗原结合分子的循环半衰期可以大于未经化学修饰的抗原结合分子的循环半衰期。在一些实施例中，衍生的抗原结合分子被共价修饰以包含一个或多个水溶性聚合物连接，包含但不限于聚乙二醇、聚氧乙二醇(polyoxyethylene glycol)或聚丙二醇。
肽类似物通常在制药工业中用作具有类似于模板肽的那些性质的性质的非肽药物。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物(peptide mimetics)”或“拟肽(peptidomimetics)”。Fauchere,J.L.,《药物研究进展(Adv.Drug Res.)》,1986,15,29；Veber,D.F.和Freidinger,R.M.,《神经科学趋势(Trends in Neuroscience)》,1985,8,392-396；以及Evans,B.E.等人,《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》,1987,30,1229-1239，所述文献出于任何目的通过引用并入本文。
术语“治疗有效量”是指确定在哺乳动物中产生治疗应答的CAR-B细胞的量。此类治疗有效量由本领域的普通技术人员容易地确定。
术语“患者”和“受试者”可互换使用，并且包含人和非人动物受试者以及患有正式诊断的病症的受试者、未患有正式辨别的病症的受试者、接受医疗护理的受试者、有罹患病症的风险的受试者等。
术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”包含治疗性治疗、预防性治疗和在其中降低受试者罹患病症的风险或其它风险因素的应用。治疗不需要完全治愈病症并且涵盖减轻症状或潜在风险因素的实施例。术语“预防”并不要求100％消除事件发生的可能性。相反，所述术语表示在化合物或方法存在的情况下，事件发生的可能性已经降低。
标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域中通常实现或如本文所述的来执行。前述技术和程序通常可以根据本领域熟知的常规方法并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种一般的和更具体的参考文献中所描述那样执行。参见例如，Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册》(第2版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)(1989))，所述文献出于任何目的通过引用并入本文。
5.序列
以下序列将进一步例示本发明：
CD28跨膜结构域-小鼠
(SEQ ID NO:1)
TTCTGGGCCCTTGTGGTGGTTGCCGGAGTGCTGTTTTGCTATGGGCTCCTGGTTACCGTTGCCCTTTGTGTGATTTGGACC
CD28跨膜结构域-小鼠
(SEQ ID NO:2)
FWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWT
CD28跨膜结构域-人
(SEQ ID NO:3)
TTTTGGGTATTGGTAGTGGTGGGCGGAGTTTTAGCCTGCTACAGCCTCCTGGTAACAGTGGCTTTTATCATCTTTTGGGTG
CD28跨膜结构域-人
(SEQ ID NO:4)
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
CD19胞质结构域-人
(SEQ ID NO:5)
CAGCGGGCTTTAGTCTTGCGGCGTAAACGTAAAAGAATGACAGATCCAACTCGCAGGTTCTTCAAAGTGACCCCCCCACCTGGGTCCGGACCGCAGAACCAATATGGGAATGTCCTGTCTCTGCCTACGCCTACAAGTGGACTGGGTAGGGCTCAGAGGTGGGCTGCCGGTCTCGGCGGAACTGCGCCATCTTACGGAAATCCCTCCTCCGACGTTCAGGCAGACGGGGCCCTGGGGTCTCGATCCCCGCCTGGTGTTGGACCAGAAGAGGAAGAGGGCGAGGGCTACGAAGAGCCCGACTCCGAAGAGGACAGTGAGTTTTACGAGAACGACAGCAACCTGGGGCAGGATCAGCTGTCACAGGATGGCTCAGGATATGAAAACCCTGAGGACGAGCCTTTGGGGCCTGAAGATGAGGACTCCTTTTCTAATGCAGAGTCATATGAGAATGAGGACGAAGAATTGACTCAACCCGTGGCAAGAACAATGGATTTCCTCAGTCCACACGGGAGTGCATGGGACCCCTCCAGAGAGGCTACTAGCCTCGGTTCTCAAAGCTATGAGGACATGAGGGGTATTCTGTACGCAGCGCCTCAGTTGAGGTCCATCCGCGGCCAGCCAGGCCCAAACCATGAGGAAGATGCCGATTCTTACGAAAACATGGACAACCCCGATGGTCCTGACCCCGCATGGGGGGGCGGCGGGAGGATGGGCACCTGGTCTACTCGCCD19胞质结构域-人
(SEQ ID NO:6)
QRALVLRRKRKRMTDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLSLPTPTSGLGRAQRWAAGLGGTAPSYGNPSSDVQADGALGSRSPPGVGPEEEEGEGYEEPDSEEDSEFYENDSNLGQDQLSQDGSGYENPEDEPLGPEDEDSFSNAESYENEDEELTQPVARTMDFLSPHGSAWDPSREATSLGSQSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENMDNPDGPDPAWGGGGRMGTWSTRCD40胞质结构域-人
(SEQ ID NO:7)
AAGAAGGTTGCAAAAAAACCTACTAATAAGGCTCCCCATCCTAAGCAAGAGCCCCAAGAAATTAACTTTCCCGATGATCTTCCGGGTTCTAACACGGCAGCCCCGGTGCAGGAGACCCTGCATGGTTGTCAACCCGTCACTCAGGAGGACGGGAAAGAGTCTCGTATCTCCGTCCAGGAGAGACAGCD40胞质结构域-人
(SEQ ID NO:8)
KKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ
CD40+CD79b胞质结构域-人
(SEQ ID NO:9)
AAGAAGGTTGCAAAAAAACCTACTAATAAGGCTCCCCATCCTAAGCAAGAGCCCCAAGAAATTAACTTTCCCGATGATCTTCCGGGTTCTAACACGGCAGCCCCGGTGCAGGAGACCCTGCATGGTTGTCAACCCGTCACTCAGGAGGACGGGAAAGAGTCTCGTATCTCCGTCCAGGAGAGACAGGACAAGGACGATAGTAAAGCAGGGATGGAGGAGGACCATACATACGAGGGACTGGATATCGATCAGACAGCCACGTACGAAGACATTGTGACACTGAGAACTGGCGAGGTGAAGTGGTCAGTGGGAGAACATCCGGGGCAGGAA
CD40+CD79b胞质结构域-人
(SEQ ID NO:10)
Figure BDA0003918100700000451
CD40+CD137胞质结构域-人
(SEQ ID NO:11)
AAGAAGGTTGCAAAAAAACCTACTAATAAGGCTCCCCATCCTAAGCAAGAGCCCCAAGAAATTAACTTTCCCGATGATCTTCCGGGTTCTAACACGGCAGCCCCGGTGCAGGAGACCCTGCATGGTTGTCAACCCGTCACTCAGGAGGACGGGAAAGAGTCTCGTATCTCCGTCCAGGAGAGACAGAAAAGAGGCCGAAAAAAGCTGCTGTACATCTTCAAACAACCCTTCATGCGACCTGTTCAGACGACACAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGTAGGTTTCCCGAAGAAGAGGAGGGAGGATGCGAACTT
CD40+CD137胞质结构域-人
(SEQ ID NO:12)
KKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD137胞质结构域-人
(SEQ ID NO:13)
AAAAGAGGCCGAAAAAAGCTGCTGTACATCTTCAAACAACCCTTCATGCGACCTGTTCAGACGACACAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGTAGGTTTCCCGAAGAAGAGGAGGGAGGATGCGAACTT
CD137胞质结构域-人
(SEQ ID NO:14)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD40和Fcγ受体2a胞质结构域-人
(SEQ ID NO:15)
AAGAAGGTTGCAAAAAAACCTACTAATAAGGCTCCCCATCCTAAGCAAGAGCCCCAAGAAATTAACTTTCCCGATGATCTTCCGGGTTCTAACACGGCAGCCCCGGTGCAGGAGACCCTGCATGGTTGTCAACCCGTCACTCAGGAGGACGGGAAAGAGTCTCGTATCTCCGTCCAGGAGAGACAGCGCAAAAAACGTATAAGCGCAAACTCTACAGATCCAGTAAAAGCCGCGCAATTCGAGCCTCCCGGCCGCCAGATGATTGCAATACGGAAACGTCAACTGGAGGAAACTAATAATGACTATGAGACGGCCGACGGTGGATACATGACCCTTAATCCCCGCGCGCCAACCGACGATGATAAGAACATATATCTGACGCTCCCCCCTAACGATCACGTTAACAGTAATAAT
CD40和Fcγ受体2a胞质结构域-人
(SEQ ID NO:16)
KKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQRKKRISANSTDPVKAAQFEPPGRQMIAIRKRQLEETNNDYETADGGYMTLNPRAPTDDDKNIYLTLPPNDHVNSNN
Fcγ受体2a胞质结构域-人
(SEQ ID NO:17)
CGCAAAAAACGTATAAGCGCAAACTCTACAGATCCAGTAAAAGCCGCGCAATTCGAGCCTCCCGGCCGCCAGATGATTGCAATACGGAAACGTCAACTGGAGGAAACTAATAATGACTATGAGACGGCCGACGGTGGATACATGACCCTTAATCCCCGCGCGCCAACCGACGATGATAAGAACATATATCTGACGCTCCCCCCTAACGATCACGTTAACAGTAATAAT
Fcγ受体2a胞质结构域-人
(SEQ ID NO:18)
RKKRISANSTDPVKAAQFEPPGRQMIAIRKRQLEETNNDYETADGGYMTLNPRAPTDDDKNIYLTLPPNDHVNSNN
Myd88+CD40胞质结构域-人
(SEQ ID NO:19)
ATGGCGGCGGGCGGGCCCGGCGCCGGAAGCGCCGCGCCAGTCTCATCTACGTCCAGTCTGCCACTGGCTGCCCTGAACATGAGAGTGAGACGCCGTTTATCCCTCTTCCTGAATGTGCGGACCCAGGTCGCCGCTGATTGGACCGCCCTGGCCGAAGAGATGGACTTTGAATACTTGGAAATCAGACAGCTGGAAACACAGGCAGACCCAACCGGGAGACTGCTTGACGCCTGGCAGGGACGCCCAGGGGCAAGTGTTGGTCGGTTACTGGAGCTTTTAACTAAGTTGGGCCGCGATGACGTGCTGTTGGAGTTAGGACCCAGTATCGAGGAGGATTGTCAGAAATACATCTTGAAACAGCAGCAGGAGGAGGCGGAAAAGCCCCTGCAGGTGGCGGCCGTTGACAGCAGTGTACCCAGAACAGCTGAGCTGGCCGGCATCACAACCCTGGATGATCCCCTGGGCCACATGCCTGAGAGGTTCGACGCTTTCATAAAGAAGGTTGCAAAAAAACCTACTAATAAGGCTCCCCATCCTAAGCAAGAGCCCCAAGAAATTAACTTTCCCGATGATCTTCCGGGTTCTAACACGGCAGCCCCGGTGCAGGAGACCCTGCATGGTTGTCAACCCGTCACTCAGGAGGACGGGAAAGAGTCTCGTATCTCCGTCCAGGAGAGACAG
Myd88+CD40胞质结构域-人
(SEQ ID NO:20)
MAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYLEIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIEEDCQKYILKQQQEEAEKPLQVAAVDSSVPRTAELAGITTLDDPLGHMPERFDAFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ
Myd88胞质结构域-人
(SEQ ID NO:21)
ATGGCGGCGGGCGGGCCCGGCGCCGGAAGCGCCGCGCCAGTCTCATCTACGTCCAGTCTGCCACTGGCTGCCCTGAACATGAGAGTGAGACGCCGTTTATCCCTCTTCCTGAATGTGCGGACCCAGGTCGCCGCTGATTGGACCGCCCTGGCCGAAGAGATGGACTTTGAATACTTGGAAATCAGACAGCTGGAAACACAGGCAGACCCAACCGGGAGACTGCTTGACGCCTGGCAGGGACGCCCAGGGGCAAGTGTTGGTCGGTTACTGGAGCTTTTAACTAAGTTGGGCCGCGATGACGTGCTGTTGGAGTTAGGACCCAGTATCGAGGAGGATTGTCAGAAATACATCTTGAAACAGCAGCAGGAGGAGGCGGAAAAGCCCCTGCAGGTGGCGGCCGTTGACAGCAGTGTACCCAGAACAGCTGAGCTGGCCGGCATCACAACCCTGGATGATCCCCTGGGCCACATGCCTGAGAGGTTCGACGCTTTCATA
Myd88胞质结构域-人
(SEQ ID NO:22)
MAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYLEIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIEEDCQKYILKQQQEEAEKPLQVAAVDSSVPRTAELAGITTLDDPLGHMPERFDAFI
CD79a胞质结构域-人
(SEQ ID NO:23)
AGGAAACGATGGCAGAACGAGAAGCTCGGGTTGGATGCCGGGGATGAATATGAAGATGAAAACCTTTATGAAGGCCTGAACCTGGACGACTGCTCCATGTATGAGGACATCTCCCGGGGCCTCCAGGGCACCTACCAGGATGTGGGCAGCCTCAACATAGGAGATGTCCAGCTGGAGAAGCCG
CD79a胞质结构域-人
(SEQ ID NO:24)
RKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP
CD79b胞质结构域-人
(SEQ ID NO:25)
CTGGACAAGGATGACAGCAAGGCTGGCATGGAGGAAGATCACACCTACGAGGGCCTGGACATTGACCAGACAGCCACCTATGAGGACATAGTGACGCTGCGGACAGGGGAAGTGAAGTGGTCTGTAGGTGAGCACCCAGGCCAGGAG
CD79b胞质结构域-人
(SEQ ID NO:26)
LDKDDSKAGMEEDHTYEGLDIDQTATYEDIVTLRTGEVKWSVGEHPGQE
CD8铰链结构域-人
(SEQ ID NO:27)
TTCGTGCCTGTGTTCCTCCCAGCTAAGCCCACTACCACCCCCGCTCCAAGGCCGCCCACGCCCGCTCCTACTATTGCTAGTCAGCCTTTAAGTTTACGACCCGAAGCTTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCTGTGCACACCAGGGGGCTTGATTTTGCCTGCGAC
CD8铰链结构域-人
(SEQ ID NO:28)
FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
具有3X strep II标签的间隔子
(SEQ ID NO:29)
GGCGCTGGTAGTGGCGGTAACTGGAGCCACCCTCAATTTGAGAAGGGCGGGTCAGGCGGATCAGGTGGTAGTGGTGGGTCCAACTGGAGCCATCCGCAATTTGAAAAGGGCGGAAGCGGCGGTTCCGGCGGTTCAGGCGGTAGCAACTGGTCACATCCGCAATTTGAGAAAGGCGGGTCAGGCGGCGGG
具有3X strep II标签的间隔子
(SEQ ID NO:30)
GAGSGGNWSHPQFEKGGSGGSGGSGGSNWSHPQFEKGGSGGSGGSGGSNWSHPQFEKGGSGGG
人IgG1 Fc(跨膜型)
(SEQ ID NO:31)
CCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCCCCAGAGCTGCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGAGCTGCAACTGGAGGAGAGCTGTGCGGAGGCGCAGGACGGGGAGCTGGACGGGCTGTGGACGACCATCACCATCTTCATCACACTCTTCCTGTTAAGCGTGTGCTACAGTGCCACCGTCACCTTCTTCAAGGTGAAGTGGATCTTCTCCTCGGTGGTGGACCTGAAGCAGACCATCATCCCCGACTACAGGAACATGATCGGACAGGGGGCCTGA
人IgG1 Fc(跨膜型)
(SEQ ID NO:32)
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESCAEAQDGELDGLWTTITIFITLFLLSVCYSATVTFFKVKWIFSSVVDLKQTIIPDYRNMIGQGA
抗huPSMA scFv
(SEQ ID NO:33)
GAGGTTCAACTTGTTCAATCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCCGGGGCATCTGTGAAAGTATCATGCAAAACATCCGGCTATACGTTTACCGAATACACCATTCACTGGGTCAGACAGGCTCCCGGTCAAAGCCTCGAATGGATGGGAAATATTAACCCTAACAATGGCGGAACCACATATAATCAGAAATTCCAAGGCCGAGTGACGATAACTGTCGATAAGAGTACGTCCACAGCTTACATGGAACTCAGCTCTTTGAGATCCGAAGACACTGCAGTTTATTATTGTGCAGCTGGATGGAACTTCGACTATTGGGGACAAGGGACTCTTGTTACGGTGTCCAGTGGCAAACCAGGTAGTGGTAAACCCGGAAGCGGCAAGCCCGGGAGCGGTAAACCTGGTAGCGACATCGTCATGACTCAAAGCCCTGACTCACTCGCCGTGAGCCTGGGAGAGCGTGCAACGCTATCTTGTCGGGCCTCTCAGGATGTCGGAACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCTGACCAATCACCAAAACTCCTGATTTATTGGGCCTCAACACGTCACACAGGAGTGCCAGATAGGTTCACAGGTAGTGGCAGTGGAACTGATTTTACTTTGACAATTAGCAGCCTGCAAGCCGAAGATGTAGCCGTTTACTTCTGTCAACAATATAACTCATACCCACTAACGTTCGGTGCCGGGACGAAGGTAGAGATTAAA
抗huPSMA scFv
(SEQ ID NO:34)
Figure BDA0003918100700000501
抗肌聚糖蛋白scFv
(SEQ ID NO:35)
GAAGTCCAATTGGTTGAAAGCGGTGGTGGACTCGTCAAACCTGGCGGTAGCCTTAAACTTTCATGTGCCGCAAGCGGCTTCACGTTTAGTAACTATGCTATGAGTTGGGTCCGCCAAAGTCCAGAAAAGCGCCTCGAATGGGTGGCGGAGATCTCTGGAGGAGGAACATATACATATTATCCAGACACCATGACCGGTAGGTTTACAATCTCAAGAGACAACGCTAAGAACACCCTGTACCTGGAAATGTCAAGCCTGAGATCAGAAGATACGGCCATGTATTATTGTACGCGCCTACTCGACTATTGGGGTCAAGGAACTTCCGTGACGGTGTCAAGCGGAGGAGGTGGGAGCGGAGGAGGCGGAAGTGGCGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGTGGAAGTGATATAGTGATGACGCAAGCTGCCTTTTCAAACCCTGTTACTTTGGGGACTAGCGCATCAATCTCCTGTAGGTCCAGCAAATCTTTGCTGCACAGTAATGGAATCACCTATCTTTTCTGGTATTTGCAAAAGCCTGGGCAGAGCCCGCAACTGCTGATCTATCAAATGTCAAATCTTGCTTCCGGAGTTCCAGACCGCTTCTCAAGTTCCGGGTCCGGCACTGATTTTACCTTGAGAATTTCTAGGGTCGAAGCTGAAGACGTCGGTGTCTATTATTGCGCGCAAAACCTTGAGCTTCCATACACCTTCGGGGGGGGCACAAAACTTGAGATCAAG
抗肌聚糖蛋白scFv
(SEQ ID NO:36)
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQSPEKRLEWVAEISGGGTYTYYPDTMTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCTRLLDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLFWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIK
抗hu GPC3 scFv
(SEQ ID NO:37)
CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAACCAGGTCCAACATTGGGAGTGATTATGTTTCCTGGTACCAACACCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCGTTTATGGCGATAATCTGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGCCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGCACATGGGATTACACCCTGAATGGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTTCTAGAGGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCCCTCGAGATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGGTGGTAGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGCGCACTTCTTACCTGAACCATGGTGATTACTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTGTCTAGCGCCGCTGCA
抗hu GPC3 scFv
(SEQ ID NO:38)
QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGTRSNIGSDYVSWYQHLPGTAPKLLVYGDNLRPSGIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDYTLNGVVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTSYLNHGDYWGQGTLVTVSSAAA
pWF-82
(SEQ ID NO:39)
GAGGTTCAACTTGTTCAATCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCCGGGGCATCTGTGAAAGTATCATGCAAAACATCCGGCTATACGTTTACCGAATACACCATTCACTGGGTCAGACAGGCTCCCGGTCAAAGCCTCGAATGGATGGGAAATATTAACCCTAACAATGGCGGAACCACATATAATCAGAAATTCCAAGGCCGAGTGACGATAACTGTCGATAAGAGTACGTCCACAGCTTACATGGAACTCAGCTCTTTGAGATCCGAAGACACTGCAGTTTATTATTGTGCAGCTGGATGGAACTTCGACTATTGGGGACAAGGGACTCTTGTTACGGTGTCCAGTGGCAAACCAGGTAGTGGTAAACCCGGAAGCGGCAAGCCCGGGAGCGGTAAACCTGGTAGCGACATCGTCATGACTCAAAGCCCTGACTCACTCGCCGTGAGCCTGGGAGAGCGTGCAACGCTATCTTGTCGGGCCTCTCAGGATGTCGGAACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCTGACCAATCACCAAAACTCCTGATTTATTGGGCCTCAACACGTCACACAGGAGTGCCAGATAGGTTCACAGGTAGTGGCAGTGGAACTGATTTTACTTTGACAATTAGCAGCCTGCAAGCCGAAGATGTAGCCGTTTACTTCTGTCAACAATATAACTCATACCCACTAACGTTCGGTGCCGGGACGAAGGTAGAGATTAAATTCGTGCCTGTGTTCCTCCCAGCTAAGCCCACTACCACCCCCGCTCCAAGGCCGCCCACGCCCGCTCCTACTATTGCTAGTCAGCCTTTAAGTTTACGACCCGAAGCTTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCTGTGCACACCAGGGGGCTTGATTTTGCCTGCGACTTTTGGGTATTGGTAGTGGTGGGCGGAGTTTTAGCCTGCTACAGCCTCCTGGTAACAGTGGCTTTTATCATCTTTTGGGTGCAGCGGGCTTTAGTCTTGCGGCGTAAACGTAAAAGAATGACAGATCCAACTCGCAGGTTCTTCAAAGTGACCCCCCCACCTGGGTCCGGACCGCAGAACCAATATGGGAATGTCCTGTCTCTGCCTACGCCTACAAGTGGACTGGGTAGGGCTCAGAGGTGGGCTGCCGGTCTCGGCGGAACTGCGCCATCTTACGGAAATCCCTCCTCCGACGTTCAGGCAGACGGGGCCCTGGGGTCTCGATCCCCGCCTGGTGTTGGACCAGAAGAGGAAGAGGGCGAGGGCTACGAAGAGCCCGACTCCGAAGAGGACAGTGAGTTTTACGAGAACGACAGCAACCTGGGGCAGGATCAGCTGTCACAGGATGGCTCAGGATATGAAAACCCTGAGGACGAGCCTTTGGGGCCTGAAGATGAGGACTCCTTTTCTAATGCAGAGTCATATGAGAATGAGGACGAAGAATTGACTCAACCCGTGGCAAGAACAATGGATTTCCTCAGTCCACACGGGAGTGCATGGGACCCCTCCAGAGAGGCTACTAGCCTCGGTTCTCAAAGCTATGAGGACATGAGGGGTATTCTGTACGCAGCGCCTCAGTTGAGGTCCATCCGCGGCCAGCCAGGCCCAAACCATGAGGAAGATGCCGATTCTTACGAAAACATGGACAACCCCGATGGTCCTGACCCCGCATGGGGGGGCGGCGGGAGGATGGGCACCTGGTCTACTCGCTAG
pWF-82
(SEQ ID NO:40)
Figure BDA0003918100700000521
Figure BDA0003918100700000531
pWF-83
(SEQ ID NO: 41)
GAGGTTCAACTTGTTCAATCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCCGGGGCATCTGTGAAAGTATCATGCAAAACATCCGGCTATACGTTTACCGAATACACCATTCACTGGGTCAGACAGGCTCCCGGTCAAAGCCTCGAATGGATGGGAAATATTAACCCTAACAATGGCGGAACCACATATAATCAGAAATTCCAAGGCCGAGTGACGATAACTGTCGATAAGAGTACGTCCACAGCTTACATGGAACTCAGCTCTTTGAGATCCGAAGACACTGCAGTTTATTATTGTGCAGCTGGATGGAACTTCGACTATTGGGGACAAGGGACTCTTGTTACGGTGTCCAGTGGCAAACCAGGTAGTGGTAAACCCGGAAGCGGCAAGCCCGGGAGCGGTAAACCTGGTAGCGACATCGTCATGACTCAAAGCCCTGACTCACTCGCCGTGAGCCTGGGAGAGCGTGCAACGCTATCTTGTCGGGCCTCTCAGGATGTCGGAACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCTGACCAATCACCAAAACTCCTGATTTATTGGGCCTCAACACGTCACACAGGAGTGCCAGATAGGTTCACAGGTAGTGGCAGTGGAACTGATTTTACTTTGACAATTAGCAGCCTGCAAGCCGAAGATGTAGCCGTTTACTTCTGTCAACAATATAACTCATACCCACTAACGTTCGGTGCCGGGACGAAGGTAGAGATTAAATTCGTGCCTGTGTTCCTCCCAGCTAAGCCCACTACCACCCCCGCTCCAAGGCCGCCCACGCCCGCTCCTACTATTGCTAGTCAGCCTTTAAGTTTACGACCCGAAGCTTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCTGTGCACACCAGGGGGCTTGATTTTGCCTGCGACTTTTGGGTATTGGTAGTGGTGGGCGGAGTTTTAGCCTGCTACAGCCTCCTGGTAACAGTGGCTTTTATCATCTTTTGGGTGCTGGACAAGGATGACAGCAAGGCTGGCATGGAGGAAGATCACACCTACGAGGGCCTGGACATTGACCAGACAGCCACCTATGAGGACATAGTGACGCTGCGGACAGGGGAAGTGAAGTGGTCTGTAGGTGAGCACCCAGGCCAGGAGTGA
pWF-83
(SEQ ID NO: 42)
Figure BDA0003918100700000541
pWF-84：
(SEQ ID NO: 43)
GAGGTTCAACTTGTTCAATCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCCGGGGCATCTGTGAAAGTATCATGCAAAACATCCGGCTATACGTTTACCGAATACACCATTCACTGGGTCAGACAGGCTCCCGGTCAAAGCCTCGAATGGATGGGAAATATTAACCCTAACAATGGCGGAACCACATATAATCAGAAATTCCAAGGCCGAGTGACGATAACTGTCGATAAGAGTACGTCCACAGCTTACATGGAACTCAGCTCTTTGAGATCCGAAGACACTGCAGTTTATTATTGTGCAGCTGGATGGAACTTCGACTATTGGGGACAAGGGACTCTTGTTACGGTGTCCAGTGGCAAACCAGGTAGTGGTAAACCCGGAAGCGGCAAGCCCGGGAGCGGTAAACCTGGTAGCGACATCGTCATGACTCAAAGCCCTGACTCACTCGCCGTGAGCCTGGGAGAGCGTGCAACGCTATCTTGTCGGGCCTCTCAGGATGTCGGAACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCTGACCAATCACCAAAACTCCTGATTTATTGGGCCTCAACACGTCACACAGGAGTGCCAGATAGGTTCACAGGTAGTGGCAGTGGAACTGATTTTACTTTGACAATTAGCAGCCTGCAAGCCGAAGATGTAGCCGTTTACTTCTGTCAACAATATAACTCATACCCACTAACGTTCGGTGCCGGGACGAAGGTAGAGATTAAATTCGTGCCTGTGTTCCTCCCAGCTAAGCCCACTACCACCCCCGCTCCAAGGCCGCCCACGCCCGCTCCTACTATTGCTAGTCAGCCTTTAAGTTTACGACCCGAAGCTTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCTGTGCACACCAGGGGGCTTGATTTTGCCTGCGACTTTTGGGTATTGGTAGTGGTGGGCGGAGTTTTAGCCTGCTACAGCCTCCTGGTAACAGTGGCTTTTATCATCTTTTGGGTGAAGAAGGTTGCAAAAAAACCTACTAATAAGGCTCCCCATCCTAAGCAAGAGCCCCAAGAAATTAACTTTCCCGATGATCTTCCGGGTTCTAACACGGCAGCCCCGGTGCAGGAGACCCTGCATGGTTGTCAACCCGTCACTCAGGAGGACGGGAAAGAGTCTCGTATCTCCGTCCAGGAGAGACAGGACAAGGACGATAGTAAAGCAGGGATGGAGGAGGACCATACATACGAGGGACTGGATATCGATCAGACAGCCACGTACGAAGACATTGTGACACTGAGAACTGGCGAGGTGAAGTGGTCAGTGGGAGAACATCCGGGGCAGGAATAA
pWF-84：
(SEQ ID NO: 44)
Figure BDA0003918100700000551
pWF-85：
(SEQ ID NO:45)
GAGGTTCAACTTGTTCAATCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCCGGGGCATCTGTGAAAGTATCATGCAAAACATCCGGCTATACGTTTACCGAATACACCATTCACTGGGTCAGACAGGCTCCCGGTCAAAGCCTCGAATGGATGGGAAATATTAACCCTAACAATGGCGGAACCACATATAATCAGAAATTCCAAGGCCGAGTGACGATAACTGTCGATAAGAGTACGTCCACAGCTTACATGGAACTCAGCTCTTTGAGATCCGAAGACACTGCAGTTTATTATTGTGCAGCTGGATGGAACTTCGACTATTGGGGACAAGGGACTCTTGTTACGGTGTCCAGTGGCAAACCAGGTAGTGGTAAACCCGGAAGCGGCAAGCCCGGGAGCGGTAAACCTGGTAGCGACATCGTCATGACTCAAAGCCCTGACTCACTCGCCGTGAGCCTGGGAGAGCGTGCAACGCTATCTTGTCGGGCCTCTCAGGATGTCGGAACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCTGACCAATCACCAAAACTCCTGATTTATTGGGCCTCAACACGTCACACAGGAGTGCCAGATAGGTTCACAGGTAGTGGCAGTGGAACTGATTTTACTTTGACAATTAGCAGCCTGCAAGCCGAAGATGTAGCCGTTTACTTCTGTCAACAATATAACTCATACCCACTAACGTTCGGTGCCGGGACGAAGGTAGAGATTAAATTCGTGCCTGTGTTCCTCCCAGCTAAGCCCACTACCACCCCCGCTCCAAGGCCGCCCACGCCCGCTCCTACTATTGCTAGTCAGCCTTTAAGTTTACGACCCGAAGCTTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCTGTGCACACCAGGGGGCTTGATTTTGCCTGCGACTTTTGGGTATTGGTAGTGGTGGGCGGAGTTTTAGCCTGCTACAGCCTCCTGGTAACAGTGGCTTTTATCATCTTTTGGGTGAAGAAGGTTGCAAAAAAACCTACTAATAAGGCTCCCCATCCTAAGCAAGAGCCCCAAGAAATTAACTTTCCCGATGATCTTCCGGGTTCTAACACGGCAGCCCCGGTGCAGGAGACCCTGCATGGTTGTCAACCCGTCACTCAGGAGGACGGGAAAGAGTCTCGTATCTCCGTCCAGGAGAGACAGAAAAGAGGCCGAAAAAAGCTGCTGTACATCTTCAAACAACCCTTCATGCGACCTGTTCAGACGACACAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGTAGGTTTCCCGAAGAAGAGGAGGGAGGATGCGAACTTTAA
pWF-85：
(SEQ ID NO: 46)
Figure BDA0003918100700000561
pWF-86
(SEQ ID NO: 150)
GAGGTTCAACTTGTTCAATCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCCGGGGCATCTGTGAAAGTATCATGCAAAACATCCGGCTATACGTTTACCGAATACACCATTCACTGGGTCAGACAGGCTCCCGGTCAAAGCCTCGAATGGATGGGAAATATTAACCCTAACAATGGCGGAACCACATATAATCAGAAATTCCAAGGCCGAGTGACGATAACTGTCGATAAGAGTACGTCCACAGCTTACATGGAACTCAGCTCTTTGAGATCCGAAGACACTGCAGTTTATTATTGTGCAGCTGGATGGAACTTCGACTATTGGGGACAAGGGACTCTTGTTACGGTGTCCAGTGGCAAACCAGGTAGTGGTAAACCCGGAAGCGGCAAGCCCGGGAGCGGTAAACCTGGTAGCGACATCGTCATGACTCAAAGCCCTGACTCACTCGCCGTGAGCCTGGGAGAGCGTGCAACGCTATCTTGTCGGGCCTCTCAGGATGTCGGAACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCTGACCAATCACCAAAACTCCTGATTTATTGGGCCTCAACACGTCACACAGGAGTGCCAGATAGGTTCACAGGTAGTGGCAGTGGAACTGATTTTACTTTGACAATTAGCAGCCTGCAAGCCGAAGATGTAGCCGTTTACTTCTGTCAACAATATAACTCATACCCACTAACGTTCGGTGCCGGGACGAAGGTAGAGATTAAATTCGTGCCTGTGTTCCTCCCAGCTAAGCCCACTACCACCCCCGCTCCAAGGCCGCCCACGCCCGCTCCTACTATTGCTAGTCAGCCTTTAAGTTTACGACCCGAAGCTTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCTGTGCACACCAGGGGGCTTGATTTTGCCTGCGACTTTTGGGTATTGGTAGTGGTGGGCGGAGTTTTAGCCTGCTACAGCCTCCTGGTAACAGTGGCTTTTATCATCTTTTGGGTGAAGAAGGTTGCAAAAAAACCTACTAATAAGGCTCCCCATCCTAAGCAAGAGCCCCAAGAAATTAACTTTCCCGATGATCTTCCGGGTTCTAACACGGCAGCCCCGGTGCAGGAGACCCTGCATGGTTGTCAACCCGTCACTCAGGAGGACGGGAAAGAGTCTCGTATCTCCGTCCAGGAGAGACAGCGCAAAAAACGTATAAGCGCAAACTCTACAGATCCAGTAAAAGCCGCGCAATTCGAGCCTCCCGGCCGCCAGATGATTGCAATACGGAAACGTCAACTGGAGGAAACTAATAATGACTATGAGACGGCCGACGGTGGATACATGACCCTTAATCCCCGCGCGCCAACCGACGATGATAAGAACATATATCTGACGCTCCCCCCTAACGATCACGTTAACAGTAATAATTAA
pWF-86：
(SEQ ID NO: 47)
Figure BDA0003918100700000571
pWF-87：
(SEQ ID NO: 48)
GAGGTTCAACTTGTTCAATCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCCGGGGCATCTGTGAAAGTATCATGCAAAACATCCGGCTATACGTTTACCGAATACACCATTCACTGGGTCAGACAGGCTCCCGGTCAAAGCCTCGAATGGATGGGAAATATTAACCCTAACAATGGCGGAACCACATATAATCAGAAATTCCAAGGCCGAGTGACGATAACTGTCGATAAGAGTACGTCCACAGCTTACATGGAACTCAGCTCTTTGAGATCCGAAGACACTGCAGTTTATTATTGTGCAGCTGGATGGAACTTCGACTATTGGGGACAAGGGACTCTTGTTACGGTGTCCAGTGGCAAACCAGGTAGTGGTAAACCCGGAAGCGGCAAGCCCGGGAGCGGTAAACCTGGTAGCGACATCGTCATGACTCAAAGCCCTGACTCACTCGCCGTGAGCCTGGGAGAGCGTGCAACGCTATCTTGTCGGGCCTCTCAGGATGTCGGAACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCTGACCAATCACCAAAACTCCTGATTTATTGGGCCTCAACACGTCACACAGGAGTGCCAGATAGGTTCACAGGTAGTGGCAGTGGAACTGATTTTACTTTGACAATTAGCAGCCTGCAAGCCGAAGATGTAGCCGTTTACTTCTGTCAACAATATAACTCATACCCACTAACGTTCGGTGCCGGGACGAAGGTAGAGATTAAATTCGTGCCTGTGTTCCTCCCAGCTAAGCCCACTACCACCCCCGCTCCAAGGCCGCCCACGCCCGCTCCTACTATTGCTAGTCAGCCTTTAAGTTTACGACCCGAAGCTTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCTGTGCACACCAGGGGGCTTGATTTTGCCTGCGACTTTTGGGTATTGGTAGTGGTGGGCGGAGTTTTAGCCTGCTACAGCCTCCTGGTAACAGTGGCTTTTATCATCTTTTGGGTGATGGCGGCGGGCGGGCCCGGCGCCGGAAGCGCCGCGCCAGTCTCATCTACGTCCAGTCTGCCACTGGCTGCCCTGAACATGAGAGTGAGACGCCGTTTATCCCTCTTCCTGAATGTGCGGACCCAGGTCGCCGCTGATTGGACCGCCCTGGCCGAAGAGATGGACTTTGAATACTTGGAAATCAGACAGCTGGAAACACAGGCAGACCCAACCGGGAGACTGCTTGACGCCTGGCAGGGACGCCCAGGGGCAAGTGTTGGTCGGTTACTGGAGCTTTTAACTAAGTTGGGCCGCGATGACGTGCTGTTGGAGTTAGGACCCAGTATCGAGGAGGATTGTCAGAAATACATCTTGAAACAGCAGCAGGAGGAGGCGGAAAAGCCCCTGCAGGTGGCGGCCGTTGACAGCAGTGTACCCAGAACAGCTGAGCTGGCCGGCATCACAACCCTGGATGATCCCCTGGGCCACATGCCTGAGAGGTTCGACGCTTTCATAAAGAAGGTTGCAAAAAAACCTACTAATAAGGCTCCCCATCCTAAGCAAGAGCCCCAAGAAATTAACTTTCCCGATGATCTTCCGGGTTCTAACACGGCAGCCCCGGTGCAGGAGACCCTGCATGGTTGTCAACCCGTCACTCAGGAGGACGGGAAAGAGTCTCGTATCTCCGTCCAGGAGAGACAGTGA
pWF-87：
(SEQ ID NO:49)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTEYTIHWVRQAPGQSLEWMGNINPNNGGTTYNQKFQGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAGWNFDYWGQGTLVTVSSGKPGSGKPGSGKPGSGKPGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATLSCRASQDVGTAVDWYQQKPDQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQYNSYPLTFGAGTKVEIKFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVMAAGGPGAGSAAPVSSTSSLPLAALNMRVRRRLSLFLNVRTQVAADWTALAEEMDFEYLEIRQLETQADPTGRLLDAWQGRPGASVGRLLELLTKLGRDDVLLELGPSIEEDCQKYILKQQQEEAEKPLQVAAVDSSVPRTAELAGITTLDDPLGHMPERFDAFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ-pWF-88：
(SEQ ID NO:50)
GAGGTTCAACTTGTTCAATCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCCGGGGCATCTGTGAAAGTATCATGCAAAACATCCGGCTATACGTTTACCGAATACACCATTCACTGGGTCAGACAGGCTCCCGGTCAAAGCCTCGAATGGATGGGAAATATTAACCCTAACAATGGCGGAACCACATATAATCAGAAATTCCAAGGCCGAGTGACGATAACTGTCGATAAGAGTACGTCCACAGCTTACATGGAACTCAGCTCTTTGAGATCCGAAGACACTGCAGTTTATTATTGTGCAGCTGGATGGAACTTCGACTATTGGGGACAAGGGACTCTTGTTACGGTGTCCAGTGGCAAACCAGGTAGTGGTAAACCCGGAAGCGGCAAGCCCGGGAGCGGTAAACCTGGTAGCGACATCGTCATGACTCAAAGCCCTGACTCACTCGCCGTGAGCCTGGGAGAGCGTGCAACGCTATCTTGTCGGGCCTCTCAGGATGTCGGAACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCTGACCAATCACCAAAACTCCTGATTTATTGGGCCTCAACACGTCACACAGGAGTGCCAGATAGGTTCACAGGTAGTGGCAGTGGAACTGATTTTACTTTGACAATTAGCAGCCTGCAAGCCGAAGATGTAGCCGTTTACTTCTGTCAACAATATAACTCATACCCACTAACGTTCGGTGCCGGGACGAAGGTAGAGATTAAATTCGTGCCTGTGTTCCTCCCAGCTAAGCCCACTACCACCCCCGCTCCAAGGCCGCCCACGCCCGCTCCTACTATTGCTAGTCAGCCTTTAAGTTTACGACCCGAAGCTTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCTGTGCACACCAGGGGGCTTGATTTTGCCTGCGACTTTTGGGTATTGGTAGTGGTGGGCGGAGTTTTAGCCTGCTACAGCCTCCTGGTAACAGTGGCTTTTATCATCTTTTGGGTGAGGAAACGATGGCAGAACGAGAAGCTCGGGTTGGATGCCGGGGATGAATATGAAGATGAAAACCTTTATGAAGGCCTGAACCTGGACGACTGCTCCATGTATGAGGACATCTCCCGGGGCCTCCAGGGCACCTACCAGGATGTGGGCAGCCTCAACATAGGAGATGTCCAGCTGGAGAAGCCGTGA
pWF-88：
(SEQ ID NO:51)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTEYTIHWVRQAPGQSLEWMGNINPNNGGTTYNQKFQGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAGWNFDYWGQGTLVTVSSGKPGSGKPGSGKPGSGKPGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATLSCRASQDVGTAVDWYQQKPDQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQYNSYPLTFGAGTKVEIKFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP-pWF-89：
(SEQ ID NO:52)
GAGGTTCAACTTGTTCAATCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCCGGGGCATCTGTGAAAGTATCATGCAAAACATCCGGCTATACGTTTACCGAATACACCATTCACTGGGTCAGACAGGCTCCCGGTCAAAGCCTCGAATGGATGGGAAATATTAACCCTAACAATGGCGGAACCACATATAATCAGAAATTCCAAGGCCGAGTGACGATAACTGTCGATAAGAGTACGTCCACAGCTTACATGGAACTCAGCTCTTTGAGATCCGAAGACACTGCAGTTTATTATTGTGCAGCTGGATGGAACTTCGACTATTGGGGACAAGGGACTCTTGTTACGGTGTCCAGTGGCAAACCAGGTAGTGGTAAACCCGGAAGCGGCAAGCCCGGGAGCGGTAAACCTGGTAGCGACATCGTCATGACTCAAAGCCCTGACTCACTCGCCGTGAGCCTGGGAGAGCGTGCAACGCTATCTTGTCGGGCCTCTCAGGATGTCGGAACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCTGACCAATCACCAAAACTCCTGATTTATTGGGCCTCAACACGTCACACAGGAGTGCCAGATAGGTTCACAGGTAGTGGCAGTGGAACTGATTTTACTTTGACAATTAGCAGCCTGCAAGCCGAAGATGTAGCCGTTTACTTCTGTCAACAATATAACTCATACCCACTAACGTTCGGTGCCGGGACGAAGGTAGAGATTAAATTCGTGCCTGTGTTCCTCCCAGCTAAGCCCACTACCACCCCCGCTCCAAGGCCGCCCACGCCCGCTCCTACTATTGCTAGTCAGCCTTTAAGTTTACGACCCGAAGCTTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCTGTGCACACCAGGGGGCTTGATTTTGCCTGCGACTTTTGGGTATTGGTAGTGGTGGGCGGAGTTTTAGCCTGCTACAGCCTCCTGGTAACAGTGGCTTTTATCATCTTTTGGGTGCTGGACAAGGATGACAGCAAGGCTGGCATGGAGGAAGATCACACCTACGAGGGCCTGGACATTGACCAGACAGCCACCTATGAGGACATAGTGACGCTGCGGACAGGGGAAGTGAAGTGGTCTGTAGGTGAGCACCCAGGCCAGGAGTGA
pWF-89：
(SEQ ID NO:53)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTEYTIHWVRQAPGQSLEWMGNINPNNGGTTYNQKFQGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAGWNFDYWGQGTLVTVSSGKPGSGKPGSGKPGSGKPGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATLSCRASQDVGTAVDWYQQKPDQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQYNSYPLTFGAGTKVEIKFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVLDKDDSKAGMEEDHTYEGLDIDQTATYEDIVTLRTGEVKWSVGEHPGQEpWF-391：
(SEQ ID NO:54)
GAGGTTCAACTTGTTCAATCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCCGGGGCATCTGTGAAAGTATCATGCAAAACATCCGGCTATACGTTTACCGAATACACCATTCACTGGGTCAGACAGGCTCCCGGTCAAAGCCTCGAATGGATGGGAAATATTAACCCTAACAATGGCGGAACCACATATAATCAGAAATTCCAAGGCCGAGTGACGATAACTGTCGATAAGAGTACGTCCACAGCTTACATGGAACTCAGCTCTTTGAGATCCGAAGACACTGCAGTTTATTATTGTGCAGCTGGATGGAACTTCGACTATTGGGGACAAGGGACTCTTGTTACGGTGTCCAGTGGCAAACCAGGTAGTGGTAAACCCGGAAGCGGCAAGCCCGGGAGCGGTAAACCTGGTAGCGACATCGTCATGACTCAAAGCCCTGACTCACTCGCCGTGAGCCTGGGAGAGCGTGCAACGCTATCTTGTCGGGCCTCTCAGGATGTCGGAACTGCTGTAGACTGGTATCAACAGAAACCTGACCAATCACCAAAACTCCTGATTTATTGGGCCTCAACACGTCACACAGGAGTGCCAGATAGGTTCACAGGTAGTGGCAGTGGAACTGATTTTACTTTGACAATTAGCAGCCTGCAAGCCGAAGATGTAGCCGTTTACTTCTGTCAACAATATAACTCATACCCACTAACGTTCGGTGCCGGGACGAAGGTAGAGATTAAAGGCGCTGGTAGTGGCGGTAACTGGAGCCACCCTCAATTTGAGAAGGGCGGGTCAGGCGGATCAGGTGGTAGTGGTGGGTCCAACTGGAGCCATCCGCAATTTGAAAAGGGCGGAAGCGGCGGTTCCGGCGGTTCAGGCGGTAGCAACTGGTCACATCCGCAATTTGAGAAAGGCGGGTCAGGCGGCGGGTTTTGGGCTCTCGTGGTGGTGGCTGGAGTGCTTTTCTGCTATGGCCTGCTGGTAACCGTGGCCCTTTGTGTAATCTGGACCGATAAAGACGATGGAAAAGCCGGGATGGAAGAAGACCATACCTACGAGGGGCTCAATATTGATCAAACCGCCACGTATGAAGACATTGTAACACTGCGCACAGGTGAGGTCAAGTGGTCCGTCGGTGAACACCCAGGACAAGAATAA
pWF-391：
(SEQ ID NO:55)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTEYTIHWVRQAPGQSLEWMGNINPNNGGTTYNQKFQGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAGWNFDYWGQGTLVTVSSGKPGSGKPGSGKPGSGKPGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATLSCRASQDVGTAVDWYQQKPDQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQYNSYPLTFGAGTKVEIKGAGSGGNWSHPQFEKGGSGGSGGSGGSNWSHPQFEKGGSGGSGGSGGSNWSHPQFEKGGSGGGFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWTDKDDGKAGMEEDHTYEGLNIDQTATYEDIVTLRTGEVKWSVGEHPGQE
pWF-394：
(SEQ ID NO:56)
GAAGTCCAATTGGTTGAAAGCGGTGGTGGACTCGTCAAACCTGGCGGTAGCCTTAAACTTTCATGTGCCGCAAGCGGCTTCACGTTTAGTAACTATGCTATGAGTTGGGTCCGCCAAAGTCCAGAAAAGCGCCTCGAATGGGTGGCGGAGATCTCTGGAGGAGGAACATATACATATTATCCAGACACCATGACCGGTAGGTTTACAATCTCAAGAGACAACGCTAAGAACACCCTGTACCTGGAAATGTCAAGCCTGAGATCAGAAGATACGGCCATGTATTATTGTACGCGCCTACTCGACTATTGGGGTCAAGGAACTTCCGTGACGGTGTCAAGCGGAGGAGGTGGGAGCGGAGGAGGCGGAAGTGGCGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGTGGAAGTGATATAGTGATGACGCAAGCTGCCTTTTCAAACCCTGTTACTTTGGGGACTAGCGCATCAATCTCCTGTAGGTCCAGCAAATCTTTGCTGCACAGTAATGGAATCACCTATCTTTTCTGGTATTTGCAAAAGCCTGGGCAGAGCCCGCAACTGCTGATCTATCAAATGTCAAATCTTGCTTCCGGAGTTCCAGACCGCTTCTCAAGTTCCGGGTCCGGCACTGATTTTACCTTGAGAATTTCTAGGGTCGAAGCTGAAGACGTCGGTGTCTATTATTGCGCGCAAAACCTTGAGCTTCCATACACCTTCGGGGGGGGCACAAAACTTGAGATCAAGGGCGCTGGGAGCGGCGGGAATTGGAGTCATCCACAATTCGAAAAGGGTGGGTCCGGCGGCAGTGGTGGAAGCGGCGGGAGTAACTGGTCACATCCCCAGTTTGAGAAAGGCGGTAGTGGTGGCAGCGGCGGTAGTGGTGGCAGTAATTGGAGCCATCCCCAATTCGAAAAGGGCGGTTCCGGCGGCGGATTTTGGGCTCTTGTTGTGGTGGCCGGAGTATTGTTTTGCTATGGCCTGCTCGTTACAGTGGCATTGTGCGTAATTTGGACTGATAAAGACGACGGCAAAGCCGGGATGGAAGAAGATCACACCTATGAGGGGCTTAATATAGATCAAACAGCCACATATGAAGATATTGTGACTCTAAGGACTGGAGAGGTTAAATGGAGTGTGGGTGAGCATCCAGGACAAGAATAA
pWF-394：
(SEQ ID NO:57)
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQSPEKRLEWVAEISGGGTYTYYPDTMTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCTRLLDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLFWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKGAGSGGNWSHPQFEKGGSGGSGGSGGSNWSHPQFEKGGSGGSGGSGGSNWSHPQFEKGGSGGGFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWTDKDDGKAGMEEDHTYEGLNIDQTATYEDIVTLRTGEVKWSVGEHPGQE
pWF-396：
(SEQ ID NO:58)
CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAACCAGGTCCAACATTGGGAGTGATTATGTTTCCTGGTACCAACACCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCGTTTATGGCGATAATCTGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGCCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGCACATGGGATTACACCCTGAATGGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTTCTAGAGGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCCCTCGAGATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGGTGGTAGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGCGCACTTCTTACCTGAACCATGGTGATTACTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTGTCTAGCGCCGCTGCATTCGTGCCTGTGTTCCTCCCAGCTAAGCCCACTACCACCCCCGCTCCAAGGCCGCCCACGCCCGCTCCTACTATTGCTAGTCAGCCTTTAAGTTTACGACCCGAAGCTTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCTGTGCACACCAGGGGGCTTGATTTTGCCTGCGACTTTTGGGTATTGGTAGTGGTGGGCGGAGTTTTAGCCTGCTACAGCCTCCTGGTAACAGTGGCTTTTATCATCTTTTGGGTGAGGAAACGATGGCAGAACGAGAAGCTCGGGTTGGATGCCGGGGATGAATATGAAGATGAAAACCTTTATGAAGGCCTGAACCTGGACGACTGCTCCATGTATGAGGACATCTCCCGGGGCCTCCAGGGCACCTACCAGGATGTGGGCAGCCTCAACATAGGAGATGTCCAGCTGGAGAAGCCGTGA
pWF-396：
(SEQ ID NO:59)
QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGTRSNIGSDYVSWYQHLPGTAPKLLVYGDNLRPSGIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDYTLNGVVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTSYLNHGDYWGQGTLVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP
pWF-397：
(SEQ ID NO:60)
CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAACCAGGTCCAACATTGGGAGTGATTATGTTTCCTGGTACCAACACCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCGTTTATGGCGATAATCTGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGCCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGCACATGGGATTACACCCTGAATGGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTTCTAGAGGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCCCTCGAGATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGGTGGTAGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGCGCACTTCTTACCTGAACCATGGTGATTACTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTGTCTAGCGCCGCTGCATTCGTGCCTGTGTTCCTCCCAGCTAAGCCCACTACCACCCCCGCTCCAAGGCCGCCCACGCCCGCTCCTACTATTGCTAGTCAGCCTTTAAGTTTACGACCCGAAGCTTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCTGTGCACACCAGGGGGCTTGATTTTGCCTGCGACTTTTGGGTATTGGTAGTGGTGGGCGGAGTTTTAGCCTGCTACAGCCTCCTGGTAACAGTGGCTTTTATCATCTTTTGGGTGCTGGACAAGGATGACAGCAAGGCTGGCATGGAGGAAGATCACACCTACGAGGGCCTGGACATTGACCAGACAGCCACCTATGAGGACATAGTGACGCTGCGGACAGGGGAAGTGAAGTGGTCTGTAGGTGAGCACCCAGGCCAGGAGTGA
pWF-397：
(SEQ ID NO:61)
QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGTRSNIGSDYVSWYQHLPGTAPKLLVYGDNLRPSGIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDYTLNGVVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTSYLNHGDYWGQGTLVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVLDKDDSKAGMEEDHTYEGLDIDQTATYEDIVTLRTGEVKWSVGEHPGQE
pWF-460：
(SEQ ID NO:62)
CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAACCAGGTCCAACATTGGGAGTGATTATGTTTCCTGGTACCAACACCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCGTTTATGGCGATAATCTGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGCCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGCACATGGGATTACACCCTGAATGGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTTCTAGAGGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCCCTCGAGATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGGTGGTAGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGCGCACTTCTTACCTGAACCATGGTGATTACTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTGTCTAGCCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCCCCAGAGCTGCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGAGCTGCAACTGGAGGAGAGCTGTGCGGAGGCGCAGGACGGGGAGCTGGACGGGCTGTGGACGACCATCACCATCTTCATCACACTCTTCCTGTTAAGCGTGTGCTACAGTGCCACCGTCACCTTCTTCAAGGTGAAGTGGATCTTCTCCTCGGTGGTGGACCTGAAGCAGACCATCATCCCCGACTACAGGAACATGATCGGACAGGGGGCCTGA
pWF-460：
(SEQ ID NO:63)
QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGTRSNIGSDYVSWYQHLPGTAPKLLVYGDNLRPSGIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDYTLNGVVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTSYLNHGDYWGQGTLVTVSSPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESCAEAQDGELDGLWTTITIFITLFLLSVCYSATVTFFKVKWIFSSVVDLKQTIIPDYRNMIGQGA
pWF-428：
(SEQ ID NO:64)
CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAACCAGGTCCAACATTGGGAGTGATTATGTTTCCTGGTACCAACACCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCGTTTATGGCGATAATCTGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGCCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGCACATGGGATTACACCCTGAATGGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCCAACAAGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGACTTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
pWF-428：
(SEQ ID NO:65)
QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGTRSNIGSDYVSWYQHLPGTAPKLLVYGDNLRPSGIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDYTLNGVVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
pWF-429：
(SEQ ID NO:66)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGGTGGTAGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGCGCACTTCTTACCTGAACCATGGTGATTACTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTGTCTAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCCCCAGAGCTGCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGAGCTGCAACTGGAGGAGAGCTGTGCGGAGGCGCAGGACGGGGAGCTGGACGGGCTGTGGACGACCATCACCATCTTCATCACACTCTTCCTGTTAAGCGTGTGCTACAGTGCCACCGTCACCTTCTTCAAGGTGAAGTGGATCTTCTCCTCGGTGGTGGACCTGAAGCAGACCATCATCCCCGACTACAGGAACATGATCGGACAGGGGGCCTGA
pWF-429：
(SEQ ID NO:67)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTSYLNHGDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESCAEAQDGELDGLWTTITIFITLFLLSVCYSATVTFFKVKWIFSSVVDLKQTIIPDYRNMIGQGA-
mu CXCL13
(SEQ ID NO:68)
ATGAGACTTTCAACAGCAACACTCCTCCTGTTGCTGGCTTCATGTCTGAGCCCTGGTCATGGTATTTTGGAGGCCCACTATACAAATCTCAAATGTCGGTGTTCAGGCGTAATATCCACCGTAGTCGGCCTGAACATTATCGATAGGATTCAGGTTACACCCCCCGGGAACGGATGTCCTAAGACCGAGGTGGTGATTTGGACCAAGATGAAGAAGGTCATTTGTGTGAACCCACGGGCTAAATGGCTGCAGCGTCTTTTGCGACACGTGCAGTCCAAGAGCTTGTCCAGCACACCTCAGGCCCCAGTTAGCAAGCGACGTGCAGCC
mu CXCL13
(SEQ ID NO:69)
MRLSTATLLLLLASCLSPGHGILEAHYTNLKCRCSGVISTVVGLNIIDRIQVTPPGNGCPKTEVVIWTKMKKVICVNPRAKWLQRLLRHVQSKSLSSTPQ APVSKRRAA
mu FLT3LG
(SEQ ID NO:70)
ATGACAGTGCTGGCCCCCGCGTGGTCTCCCAATAGCTCACTCCTCCTCTTGCTGCTACTGCTCAGCCCATGCCTCAGGGGCACCCCCGATTGTTACTTCAGCCACAGCCCAATCTCCTCCAACTTCAAAGTGAAATTTAGGGAACTGACCGACCACCTGCTGAAAGATTATCCTGTGACTGTGGCAGTGAACCTGCAAGACGAAAAGCATTGTAAGGCGCTATGGAGCCTCTTTCTTGCCCAACGATGGATTGAGCAACTCAAAACTGTAGCCGGAAGCAAAATGCAGACGCTACTGGAGGACGTGAATACTGAGATTCACTTCGTTACCAGTTGTACTTTCCAGCCACTGCCAGAGTGTCTCAGGTTTGTGCAGACTAATATCAGCCACCTGCTGAAGGATACTTGCACCCAGCTCCTGGCTCTCAAGCCTTGTATAGGCAAGGCTTGTCAAAATTTTAGCAGGTGTCTCGAAGTCCAGTGCCAGCCAGATTCATCCACACTGCTGCCGCCCCGAAGCCCTATCGCACTCGAAGCGACAGAGTTGCCAGAGCCTCGTCCCAGACAGCTTCTGCTGCTGCTACTTCTGCTGCTGCCGCTAACTCTGGTGCTACTTGCTGCCGCCTGGGGCCTCAGATGGCAACGCGCCAGACGCCGAGGCGAACTCCACCCTGGGGTGCCACTGCCATCCCACCCA
mu FLT3LG
(SEQ ID NO:71)
MTVLAPAWSPNSSLLLLLLLLSPCLRGTPDCYFSHSPISSNFKVKFRELTDHLLKDYPVTVAVNLQDEKHCKALWSLFLAQRWIEQLKTVAGSKMQTLLEDVNTEIHFVTSCTFQPLPECLRFVQTNISHLLKDTCTQLLALKPCIGKACQNFSRCLEVQCQPDSSTLLPPRSPIALEATELPEPRPRQLLLLLLLLLPLTLVLLAAAWGLRWQRARRRGELHPGVPLPS HP
mu XCL1
(SEQ ID NO:72)
ATGCGACTCTTGTTGTTGACTTTTCTCGGAGTGTGCTGCCTGACACCCTGGGTCGTAGAGGGAGTTGGCACTGAAGTACTAGAAGAGTCCTCCTGCGTTAACCTGCAGACACAGCGGCTCCCAGTCCAGAAAATTAAGACCTACATTATATGGGAAGGAGCAATGCGAGCGGTGATTTTTGTGACCAAGAGGGGTCTCAAGATTTGCGCGGACCCTGAGGCCAAGTGGGTCAAAGCAGCTATTAAGACAGTAGACGGAAGAGCCTCCACCAGGAAGAATATGGCAGAAACTGTACCGACCGGTGCGCAGCGGTCAACATCTACCGCAATCACACTCACCGGC
mu XCL1
(SEQ ID NO:73)
MRLLLLTFLGVCCLTPWVVEGVGTEVLEESSCVNLQTQRLPVQKIKTYIIWEGAMRAVIFVTKRGLKICADPEAKWVKAAIKTVDGRASTRKNMAETVPTGAQRSTSTAITLTG
mu Tim4(ECD)-muIgG2a Fc
(SEQ ID NO:74)
ATGAGCAAGGGCCTTCTCCTGCTGTGGCTAGTAACTGAATTGTGGTGGTTGTACCTGACACCTGCCGCTAGTGAGGACACCATCATTGGTTTCCTTGGGCAGCCCGTCACCCTCCCTTGCCATTACCTAAGCTGGAGCCAGTCACGGAACTCTATGTGCTGGGGAAAGGGGTCATGCCCTAATTCCAAGTGCAACGCCGAGCTGTTGCGCACGGACGGCACCAGAATAATCTCAAGAAAGTCCACCAAGTATACGCTGCTCGGCAAGGTGCAATTCGGTGAAGTGAGCTTGACCATAAGTAACACCAACCGCGGTGACTCCGGAGTTTATTGTTGCAGGATCGAAGTGCCAGGCTGGTTTAACGACGTGAAGAAAAACGTGCGGCTGGAACTGAGGAGGGCAACTACGACCAAGAAACCAACAACCACGACGAGACCTACCACCACTCCTTACGTGACAACCACGACACCGGAGCTGTTGCCAACTACCGTCATGACAACATCTGTGTTGCCAACTACCACCCCCCCCCAAACGCTCGCGACAACTGCCTTTTCCACAGCCGTTACCACATGTCCTTCCACCACCCCAGGCTCTTTTTCTCAAGAAACTACCAAGGGATCAGCTTTTACCACCGAGTCTGAAACTCTCCCAGCAAGTAATCACTCACAGCGGTCAATGATGACCATCAGCACAGACATCGCTGTCTTGAGACCTACTGGCAGCAATCCAGGCATTCTGCCCTCCACTTCACAGCTGACTACCCAAAAGACTACACTAACCACCAGCGAAAGTCTGCAGAAAACTACAAAGAGCCATCAAATAAACTCCCGGCAGACTCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA
mu Tim4(ECD)-muIgG2a Fc
(SEQ ID NO:75)
MSKGLLLLWLVTELWWLYLTPAASEDTIIGFLGQPVTLPCHYLSWSQSRNSMCWGKGSCPNSKCNAELLRTDGTRIISRKSTKYTLLGKVQFGEVSLTISNTNRGDSGVYCCRIEVPGWFNDVKKNVRLELRRATTTKKPTTTTRPTTTPYVTTTTPELLPTTVMTTSVLPTTTPPQTLATTAFSTAVTTCPSTTPGSFSQETTKGSAFTTESETLPASNHSQRSMMTISTDIAVLRPTGSNPGILPSTSQLTTQKTTLTTSESLQKTTKSHQINSRQTPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
mu 4-1BB-L
(SEQ ID NO:76)
ATGGATCAGCATACACTGGACGTGGAAGATACAGCCGATGCCAGACACCCTGCTGGAACGTCCTGTCCCAGCGACGCTGCCCTGCTCAGAGACACCGGGCTGCTCGCAGATGCTGCTCTGCTGAGTGATACCGTTCGGCCAACTAACGCGGCCCTACCCACAGATGCCGCATATCCCGCGGTAAATGTCAGGGACCGGGAAGCTGCCTGGCCACCGGCCCTCAATTTCTGCTCTAGACATCCGAAACTGTACGGTCTGGTCGCACTGGTACTGCTGCTACTTATAGCAGCTTGTGTTCCCATATTTACCCGCACTGAACCCAGACCCGCTCTCACTATTACAACTTCACCAAACTTGGGCACACGTGAAAACAATGCAGATCAGGTTACCCCTGTAAGTCATATTGGATGCCCCAACACCACACAACAGGGAAGTCCGGTGTTTGCAAAACTCCTTGCTAAGAATCAGGCTTCACTGTGTAACACTACTCTTAATTGGCACTCACAAGACGGGGCCGGGAGTAGCTATCTCAGCCAAGGTCTCCGCTATGAAGAAGATAAGAAAGAGTTGGTGGTGGACAGCCCAGGACTCTACTACGTCTTCCTGGAGCTAAAACTAAGCCCCACTTTTACTAACACTGGACATAAGGTCCAAGGTTGGGTGTCCCTCGTACTTCAAGCTAAACCCCAGGTGGACGACTTCGATAACCTGGCGTTGACAGTTGAGCTCTTTCCTTGCTCTATGGAAAATAAGCTCGTGGATCGGAGCTGGTCTCAACTGTTGCTGCTTAAAGCCGGTCATCGTCTGTCTGTTGGACTACGCGCATACTTGCATGGAGCCCAGGACGCATATCGTGATTGGGAACTGAGCTACCCGAATACCACTAGCTTTGGACTATTTCTTGTTAAACCAGATAATCCTTGGGAG
mu 4-1BB-L
(SEQ ID NO:77)
MDQHTLDVEDTADARHPAGTSCPSDAALLRDTGLLADAALLSDTVRPTNAALPTDAAYPAVNVRDREAAWPPALNFCSRHPKLYGLVALVLLLLIAACVPIFTRTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLCNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWE
mu LIGHT(切割-缺陷型突变体)
(SEQ ID NO:78)
ATGGAGAGCGTAGTGCAACCCAGCGTATTTGTGGTGGATGGACAGACCGACATCCCATTCAGACGCTTGGAACAGAACCACCGAAGAAGGCGGTGCGGCACCGTCCAGGTGTCCCTCGCTCTCGTGCTGCTGCTTGGTGCTGGCCTCGCAACACAAGGGTGGTTTCTTTTGAGACTCCATCAACGCTTGGGAGACATAGTGGCCCACCTGCCTGATGGTGGGAAGGGCTCTTGGCAGGACCAGCGATCACACCAGGCTAACCCCGCCGCTCACCTGACAGGGGCGAATGCCAGCTTGATCGGAATAGGTGGGCCGCTGCTGTGGGAAACTAGGCTTGGACTTGCCTTTCTGAGAGGGCTTACATACCATGACGGAGCCCTCGTAACAATGGAGCCTGGTTATTACTACGTGTACAGTAAGGTGCAGCTTTCTGGAGTCGGGTGTCCCCAGGGGCTGGCTAACGGACTGCCCATCACTCATGGACTATACAAACGCACATCCAGATATCCTAAAGAGCTGGAACTGTTGGTGTCCCGTAGGAGCCCGTGTGGCAGGGCCAACTCTTCCCGTGTGTGGTGGGACTCCTCTTTTCTGGGCGGCGTGGTCCATCTGGAAGCTGGTGAGGAAGTCGTCGTAAGAGTACCTGGAAACCGTCTGGTTCGCCCCCGCGATGGCACCAGGTCCTACTTCGGAGCTTTCATGGTA
mu LIGHT(切割-缺陷型突变体)
(SEQ ID NO:79)
MESVVQPSVFVVDGQTDIPFRRLEQNHRRRRCGTVQVSLALVLLLGAGLATQGWFLLRLHQRLGDIVAHLPDGGKGSWQDQRSHQANPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMV
mu IL12(跨膜型)
(SEQ ID NO:80)
ATGTGCCCACAGAAACTCACAATTTCTTGGTTCGCAATCGTCCTGCTGGTGTCACCCCTGATGGCAATGTGGGAGTTGGAAAAGGATGTATACGTCGTCGAGGTCGACTGGACACCTGACGCTCCGGGTGAAACTGTCAACCTCACTTGCGATACTCCTGAAGAGGACGACATCACGTGGACGAGCGACCAGCGACATGGAGTGATAGGGTCTGGCAAGACGCTTACTATCACGGTTAAGGAATTTCTCGACGCAGGGCAGTACACATGTCACAAGGGCGGCGAGACTCTGAGCCACTCCCATTTGCTGCTGCACAAGAAGGAGAATGGTATCTGGTCTACCGAAATCCTGAAGAATTTTAAGAACAAGACTTTTCTGAAATGCGAGGCCCCAAATTATTCCGGACGTTTCACTTGCAGTTGGCTCGTTCAAAGAAATATGGACTTGAAATTTAACATTAAATCCAGCTCTTCATCTCCTGACAGCAGGGCCGTAACTTGTGGAATGGCTTCATTGTCAGCTGAGAAAGTTACGCTTGACCAAAGGGATTATGAGAAATACAGCGTGAGTTGCCAGGAAGATGTGACATGTCCAACGGCAGAGGAAACGTTGCCAATTGAGCTCGCTTTGGAAGCTCGTCAACAAAACAAGTATGAAAACTATAGTACTAGCTTCTTCATACGGGACATCATCAAACCAGATCCACCTAAGAATTTGCAGATGAAGCCTCTGAAGAATTCACAAGTCGAGGTATCCTGGGAATACCCAGATTCATGGTCCACTCCTCATAGTTACTTTAGCCTGAAATTCTTTGTACGCATACAGCGGAAGAAGGAGAAAATGAAGGAGACGGAAGAAGGCTGCAATCAGAAAGGCGCTTTTCTTGTTGAAAAGACGAGCACTGAGGTTCAATGCAAAGGCGGGAATGTATGTGTTCAAGCCCAAGATAGGTATTATAATAGCTCCTGCTCTAAGTGGGCTTGCGTACCATGCAGAGTTAGAAGTGGCTCAACCTCAGGCTCCGGAAAACCTGGTTCCGGTGAAGGTTCCACAAAAGGGCGTGTGATTCCTGTGTCCGGCCCAGCTAGGTGTCTCTCCCAGTCACGGAATCTCCTGAAAACCACGGATGACATGGTAAAGACAGCTAGGGAGAAACTCAAGCACTACTCCTGCACAGCTGAGGATATCGATCATGAGGACATCACCAGGGACCAGACATCCACTCTGAAAACTTGCCTGCCTTTGGAACTCCACAAGAACGAATCTTGTCTGGCAACGCGTGAAACGAGTTCTACTACAAGAGGGTCCTGTCTTCCCCCTCAAAAGACAAGCCTTATGATGACCTTGTGTCTCGGTAGCATTTATGAGGACCTAAAGATGTATCAAACCGAGTTTCAGGCTATCAATGCAGCGCTCCAGAATCATAACCATCAGCAGATCATTCTTGACAAAGGAATGCTCGTGGCCATTGATGAACTAATGCAGAGCCTAAACCACAATGGCGAGACTCTTCGACAGAAACCGCCTGTGGGCGAGGCCGATCCATATAGAGTCAAAATGAAACTGTGTATTCTCCTGCATGCATTTAGTACTCGTGTAGTGACTATTAACAGAGTGATGGGTTACCTTTCCTCAGCTAATACACTTGTCCTCTTTGGCGCTGGGTTCGGCGCCGTCATAACGGTTGTTGTCATCGTGGTAATAATCAAGTGCTTTTGCAAGCACAGGTCTTGTTTTCGCAGGAATGAAGCCTCTAGAGAAACAAATAATTCACTGACCTTTGGCCCCGAAGAAGCTCTTGCAGAGCAAACGGTGTTTCTC
mu IL12(跨膜型)
(SEQ ID NO:81)
MCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGSTSGSGKPGSGEGSTKGRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSANTLVLFGAGFGAVITVVVIVVIIKCFCKHRSCFRRNEASRETNNSLTFGPEEALAEQTVFL
mu IL12(分泌型)
(SEQ ID NO:82)
ATGTGTCAGTCACGCTATCTTCTCTTCCTTGCTACTCTGGCCTTGCTCAATCACTTGTCCCTTGCTCGTGTGATTCCTGTGTCCGGCCCAGCTAGGTGTCTCTCCCAGTCACGGAATCTCCTGAAAACCACGGATGACATGGTAAAGACAGCTAGGGAGAAACTCAAGCACTACTCCTGCACAGCTGAGGATATCGATCATGAGGACATCACCAGGGACCAGACATCCACTCTGAAAACTTGCCTGCCTTTGGAACTCCACAAGAACGAATCTTGTCTGGCAACGCGTGAAACGAGTTCTACTACAAGAGGGTCCTGTCTTCCCCCTCAAAAGACAAGCCTTATGATGACCTTGTGTCTCGGTAGCATTTATGAGGACCTAAAGATGTATCAAACCGAGTTTCAGGCTATCAATGCAGCGCTCCAGAATCATAACCATCAGCAGATCATTCTTGACAAAGGAATGCTCGTGGCCATTGATGAACTAATGCAGAGCCTAAACCACAATGGCGAGACTCTTCGACAGAAACCGCCTGTGGGCGAGGCCGATCCATATAGAGTCAAAATGAAACTGTGTATTCTCCTGCATGCATTTAGTACTCGTGTAGTGACTATTAACAGAGTGATGGGTTACCTTTCCTCAGCTGGAAGCGGCGCCACCAACTTCTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGTGCCCACAGAAACTCACAATTTCTTGGTTCGCAATCGTCCTGCTGGTGTCACCCCTGATGGCAATGTGGGAGTTGGAAAAGGATGTATACGTCGTCGAGGTCGACTGGACACCTGACGCTCCGGGTGAAACTGTCAACCTCACTTGCGATACTCCTGAAGAGGACGACATCACGTGGACGAGCGACCAGCGACATGGAGTGATAGGGTCTGGCAAGACGCTTACTATCACGGTTAAGGAATTTCTCGACGCAGGGCAGTACACATGTCACAAGGGCGGCGAGACTCTGAGCCACTCCCATTTGCTGCTGCACAAGAAGGAGAATGGTATCTGGTCTACCGAAATCCTGAAGAATTTTAAGAACAAGACTTTTCTGAAATGCGAGGCCCCAAATTATTCCGGACGTTTCACTTGCAGTTGGCTCGTTCAAAGAAATATGGACTTGAAATTTAACATTAAATCCAGCTCTTCATCTCCTGACAGCAGGGCCGTAACTTGTGGAATGGCTTCATTGTCAGCTGAGAAAGTTACGCTTGACCAAAGGGATTATGAGAAATACAGCGTGAGTTGCCAGGAAGATGTGACATGTCCAACGGCAGAGGAAACGTTGCCAATTGAGCTCGCTTTGGAAGCTCGTCAACAAAACAAGTATGAAAACTATAGTACTAGCTTCTTCATACGGGACATCATCAAACCAGATCCACCTAAGAATTTGCAGATGAAGCCTCTGAAGAATTCACAAGTCGAGGTATCCTGGGAATACCCAGATTCATGGTCCACTCCTCATAGTTACTTTAGCCTGAAATTCTTTGTACGCATACAGCGGAAGAAGGAGAAAATGAAGGAGACGGAAGAAGGCTGCAATCAGAAAGGCGCTTTTCTTGTTGAAAAGACGAGCACTGAGGTTCAATGCAAAGGCGGGAATGTATGTGTTCAAGCCCAAGATAGGTATTATAATAGCTCCTGCTCTAAGTGGGCTTGCGTACCATGCAGAGTTAGAAGT
mu IL12(分泌型)
(SEQ ID NO:83)
MCQSRYLLFLATLALLNHLSLARVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRV RS
mu IFNαA2
(SEQ ID NO:84)
ATGGCCAGGCTTTGCGCTTTTCTCGTCATGCTGATCGTCATGAGTTACTGGTCCATTTGCAGCCTCGGATGTGATCTGCCCCACACCTACAACCTGCGCAACAAACGAGCTCTCAAAGTGTTGGCCCAAATGAGGCGGTTGCCCTTCCTTTCCTGTCTCAAAGACAGGCAAGATTTTGGATTTCCACTAGAGAAAGTAGACAATCAACAGATACAGAAAGCTCAAGCTATCCCCGTGTTGAGGGACTTGACTCAACAGACGTTGAATCTATTTACTAGCAAGGCCAGCTCTGCTGCTTGGAATGCCACCCTTCTTGACTCATTTTGCAATGACCTACATCAACAACTGAATGATCTCCAAACATGTTTGATGCAGCAGGTAGGTGTCCAAGAACCCCCGCTTACTCAGGAAGACGCCCTTCTGGCTGTCCGCAAGTACTTTCACAGAATCACAGTGTACCTGCGCGAAAAGAAACACTCCCCCTGCGCTTGGGAAGTGGTCAGGGCCGAGGTTTGGCGAGCCCTGAGTAGCTCCGTCAATCTCCTTCCTCGGTTGTCCGAGGAGAAAGAG
mu IFNαA2
(SEQ ID NO:85)
MARLCAFLVMLIVMSYWSICSLGCDLPHTYNLRNKRALKVLAQMRRLPFLSCLKDRQDFGFPLEKVDNQQIQKAQAIPVLRDLTQQTLNLFTSKASSAAWNATLLDSFCNDLHQQLNDLQTCLMQQVGVQEPPLTQEDALLAVRKYFHRITVYLREKKHSPCAWEVVRAEVWRALSSSVNLLPRLSEEKE
mu CD80
(SEQ ID NO:86)
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mu CD80
(SEQ ID NO:87)
MACNCQLMQDTPLLKFPCPRLILLFVLLIRLSQVSSDVDEQLSKSVKDKVLLPCRYNSPHEDESEDRIYWQKHDKVVLSVIAGKLKVWPEYKNRTLYDNTTYSLIILGLVLSDRGTYSCVVQKKERGTYEVKHLALVKLSIKADFSTPNITESGNPSADTKRITCFASGGFPKPRFSWLENGRELPGINTTISQDPESELYTISSQLDFNTTRNHTIKCLIKYGDAHVSEDFTWEKPPEDPPDSKNTLVLFGAGFGAVITVVVIVVIIKCFCKHRSCFRRNEASRETNNSLTFGPEEALAEQTVFL
mu CD40-L
(SEQ ID NO:88)
ATGATCGAAACTTATTCCCAACCCTCACCGCGCTCAGTAGCAACTGGCCTACCAGCCAGCATGAAGATATTCATGTACCTCTTGACTGTATTCTTGATCACGCAAATGATTGGTAGTGTTTTGTTCGCCGTTTATCTCCACAGGCGCCTGGATAAAGTTGAAGAAGAGGTTAATCTCCATGAAGACTTCGTGTTCATTAAGAAACTCAAAAGATGTAACAAAGGTGAGGGATCTCTGTCTCTTCTGAACTGTGAGGAGATGCGACGGCAATTCGAGGACCTCGTAAAAGACATAACTCTCAACAAAGAAGAGAAGAAAGAAAACTCTTTCGAGATGCAACGGGGCGACGAGGACCCTCAAATTGCCGCACATGTCGTTTCTGAAGCGAATTCCAATGCCGCGTCCGTGCTCCAGTGGGCGAAGAAGGGATACTACACGATGAAGAGCAACCTTGTGATGCTTGAAAATGGCAAGCAGCTCACAGTTAAACGCGAGGGACTCTACTATGTATACACCCAAGTGACCTTTTGTTCCAACCGGGAGCCAAGTAGCCAACGCCCGTTCATCGTTGGGCTGTGGCTCAAGCCTTCTTCAGGGAGTGAACGAATCCTTCTCAAGGCAGCCAACACGCATTCCAGCAGCCAACTGTGTGAGCAACAATCCGTGCATCTTGGCGGGGTCTTTGAGCTGCAAGCGGGCGCCTCTGTGTTCGTGAATGTTACCGAAGCCAGCCAGGTTATCCACCGCGTGGGTTTCAGTAGTTTTGGCCTGCTCAAGCTG
mu CD40-L
(SEQ ID NO:89)
MIETYSQPSPRSVATGLPASMKIFMYLLTVFLITQMIGSVLFAVYLHRRLDKVEEEVNLHEDFVFIKKLKRCNKGEGSLSLLNCEEMRRQFEDLVKDITLNKEEKKENSFEMQRGDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLVMLENGKQLTVKREGLYYVYTQVTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQAGASVFVNVTEASQVIHRVGFSSFGLLKL
mu IL21
(SEQ ID NO:90)
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mu IL21
(SEQ ID NO:91)
MERTLVCLVVIFLGTVAHKSSPQGPDRLLIRLRHLIDIVEQLKIYENDLDPELLSAPQDVKGHCEHAAFACFQKAKLKPSNPGNNKTFIIDLVAQLRRRLPARRGGKKQKHIAKCPSCDSYEKRTPKEFLERLKWLLQKMIHQHLS
mu CCL21
(SEQ ID NO:92)
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mu CCL21
(SEQ ID NO:93)
MAQMMTLSLLSLVLALCIPWTQGSDGGGQDCCLKYSQKKIPYSIVRGYRKQEPSLGCPIPAILFLPRKHSKPELCANPEEGWVQNLMRRLDQPPAPGKQSPGCRKNRGTSKSGKKGKGSKGCKRTEQTQPSRG
抗mu CD3 scFv跨膜
(SEQ ID NO:94)
ATGGAAACCGACACATTGCTCCTCTGGGTTCTCCTTCTATGGGTCCCCGGTTCCACCGGAGATATCCAAATGACACAATCACCCAGCAGCCTGCCTGCCTCTCTGGGCGACCGCGTTACCATCAATTGTCAAGCTTCCCAAGATATAAGTAATTATCTCAACTGGTACCAGCAAAAGCCCGGTAAAGCGCCTAAATTGCTGATTTATTATACTAATAAACTCGCAGATGGAGTTCCTAGTAGATTTTCTGGTTCAGGGAGTGGACGGGACTCCAGTTTTACCATATCAAGTCTGGAATCCGAGGATATCGGCAGCTACTATTGCCAGCAATATTATAATTACCCTTGGACTTTTGGACCCGGGACTAAACTTGAGATCAAAAGAGGCGGAGGAGGCAGTGGTGGTGGTGGATCAGGCGGCGGTGGTAGTGAGGTACAACTCGTGGAATCAGGCGGCGGACTGGTCCAACCCGGCAAGAGCCTTAAACTCTCTTGTGAGGCCAGTGGATTTACATTCAGCGGTTATGGAATGCACTGGGTGAGACAAGCTCCCGGCAGGGGCCTAGAATCAGTGGCGTACATCACCAGCTCATCAATAAACATTAAATACGCTGATGCAGTCAAGGGCCGGTTTACTGTATCCCGCGACAACGCTAAGAATCTTCTCTTTCTGCAAATGAACATACTTAAGAGCGAGGATACTGCCATGTATTATTGTGCCCGCTTCGATTGGGATAAGAATTATTGGGGACAAGGCACCATGGTTACCGTTAGTAGTCCAAACATCACATCAAATAATAGCAACCCCGTGGAAGGGGACGACTCTGTTTCACTCACCTGTGATTCCTATACCGATCCTGATAATATCAACTATCTATGGTCTCGTAACGGTGAAAGTCTCAGCGAAGGCGACCGGTTGAAACTCTCCGAAGGTAACAGAACCCTTACGCTTCTGAACGTCACCCGGAACGATACCGGGCCCTATGTTTGCGAAACTAGGAACCCTGTTAGCGTGAATCGTAGCGACCCTTTCTCCCTAAATAATACTCTAGTGCTATTCGGAGCGGGATTCGGTGCCGTCATCACAGTAGTCGTTATTGTAGTCATTATTAAATGCTTTTGTAAACATAGGTCTTGCTTCAGAAGAAATGAGGCCAGCCGTGAAACTAATAATTCCCTGACCTTTGGGCCCGAAGAAGCTTTGGCTGAACAGACTGTGTTTCTC
抗mu CD3 scFv跨膜
(SEQ ID NO:95)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIQMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTNKLADGVPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSSPNITSNNSNPVEGDDSVSLTCDSYTDPDNINYLWSRNGESLSEGDRLKLSEGNRTLTLLNVTRNDTGPYVCETRNPVSVNRSDPFSLNNTLVLFGAGFGAVITVVVIVVIIKCFCKHRSCFRRNEASRETNNSLTFGPEEALAEQTVFL
mu TSLP
(SEQ ID NO:96)
ATGGTTCTTCTCAGGAGCCTCTTCATCCTGCAAGTACTAGTACGGATGGGGCTAACTTACAACTTTTCTAACTGCAACTTCACGTCAATTACGAAAATATATTGTAACATAATTTTTCATGACCTGACTGGAGATTTGAAAGGGGCTAAGTTCGAGCAAATCGAGGACTGTGAGAGCAAGCCAGCTTGTCTCCTGAAAATCGAGTACTATACTCTCAATCCTATCCCTGGCTGCCCTTCACTCCCCGACAAAACATTTGCCCGGAGAACAAGAGAAGCCCTCAATGACCACTGCCCAGGCTACCCTGAAACTGAGAGAAATGACGGTACTCAGGAAATGGCACAAGAAGTCCAAAACATCTGCCTGAATCAAACCTCACAAATTCTAAGATTGTGGTATTCCTTCATGCAATCTCCAGAA
mu TSLP
(SEQ ID NO:97)
MVLLRSLFILQVLVRMGLTYNFSNCNFTSITKIYCNIIFHDLTGDLKGAKFEQIEDCESKPACLLKIEYYTLNPIPGCPSLPDKTFARRTREALNDHCPGYPETERNDGTQEMAQEVQNICLNQTSQILRLWYSFMQSPE
mu GM-CSF
(SEQ ID NO:98)
ATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCCTGGGCATTGTGGTCTACAGCCTCTCAGCACCCACCCGCTCACCCATCACTGTCACCCGGCCTTGGAAGCATGTAGAGGCCATCAAAGAAGCCCTGAACCTCCTGGATGACATGCCTGTCACGTTGAATGAAGAGGTAGAAGTCGTCTCTAACGAGTTCTCCTTCAAGAAGCTAACATGTGTGCAGACCCGCCTGAAGATATTCGAGCAGGGTCTACGGGGCAATTTCACCAAACTCAAGGGCGCCTTGAACATGACAGCCAGCTACTACCAGACATACTGCCCCCCAACTCCGGAAACGGACTGTGAAACACAAGTTACCACCTATGCGGATTTCATAGACAGCCTTAAAACCTTTCTGACTGATATCCCCTTTGAATGCAAAAAACCAGGCCAAAAA
mu GM-CSF
(SEQ ID NO:99)
MWLQNLLFLGIVVYSLSAPTRSPITVTRPWKHVEAIKEALNLLDDMPVTLNEEVEVVSNEFSFKKLTCVQTRLKIFEQGLRGNFTKLKGALNMTASYYQTYCPPTPETDCETQVTTYADFIDSLKTFLTDIPFECKKPGQK
mu IFNγ
(SEQ ID NO:100)
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mu IFNγ
(SEQ ID NO:101)
MNATHCILALQLFLMAVSGCYCHGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDGDMKILQSQIISFYLRLFEVLKDNQAISNNISVIESHLITTFFSNSKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC
mu IL7
(SEQ ID NO:102)
ATGTTCCATGTTTCTTTTAGATATATCTTTGGAATTCCTCCACTGATCCTTGTTCTGCTGCCTGTCACATCATCTGAGTGCCACATTAAAGACAAAGAAGGTAAAGCATATGAGAGTGTACTGATGATCAGCATCGATGAATTGGACAAAATGACAGGAACTGATAGTAATTGCCCGAATAATGAACCAAACTTTTTTAGAAAACATGTATGTGATGATACAAAGGAAGCTGCTTTTCTAAATCGTGCTGCTCGCAAGTTGAAGCAATTTCTTAAAATGAATATCAGTGAAGAATTCAATGTCCACTTACTAACAGTATCACAAGGCACACAAACACTGGTGAACTGCACAAGTAAGGAAGAAAAAAACGTAAAGGAACAGAAAAAGAATGATGCATGTTTCCTAAAGAGACTACTGAGAGAAATAAAAACTTGTTGGAATAAAATTTTGAAGGGCAGTATA
mu IL7
(SEQ ID NO:103)
MFHVSFRYIFGIPPLILVLLPVTSSECHIKDKEGKAYESVLMISIDELDKMTGTDSNCPNNEPNFFRKHVCDDTKEAAFLNRAARKLKQFLKMNISEEFNVHLLTVSQGTQTLVNCTSKEEKNVKEQKKNDACFLKRLLREIKTCWNKILKGSI
mu ICOS-L
(SEQ ID NO:104)
ATGCAGCTAAAGTGTCCCTGTTTTGTGTCCTTGGGAACCAGGCAGCCTGTTTGGAAGAAGCTCCATGTTTCTAGCGGGTTCTTTTCTGGTCTTGGTCTGTTCTTGCTGCTGTTGAGCAGCCTCTGTGCTGCCTCTGCAGAGACTGAAGTCGGTGCAATGGTGGGCAGCAATGTGGTGCTCAGCTGCATTGACCCCCACAGACGCCATTTCAACTTGAGTGGTCTGTATGTCTATTGGCAAATCGAAAACCCAGAAGTTTCGGTGACTTACTACCTGCCTTACAAGTCTCCAGGGATCAATGTGGACAGTTCCTACAAGAACAGGGGCCATCTGTCCCTGGACTCCATGAAGCAGGGTAACTTCTCTCTGTACCTGAAGAATGTCACCCCTCAGGATACCCAGGAGTTCACATGCCGGGTATTTATGAATACAGCCACAGAGTTAGTCAAGATCTTGGAAGAGGTGGTCAGGCTGCGTGTGGCAGCAAACTTCAGTACACCTGTCATCAGCACCTCTGATAGCTCCAACCCGGGCCAGGAACGTACCTACACCTGCATGTCCAAGAATGGCTACCCAGAGCCCAACCTGTATTGGATCAACACAACGGACAATAGCCTAATAGACACGGCTCTGCAGAATAACACTGTCTACTTGAACAAGTTGGGCCTGTATGATGTAATCAGCACATTAAGGCTCCCTTGGACATCTCGTGGGGATGTTCTGTGCTGCGTAGAGAATGTGGCTCTCCACCAGAACATCACTAGCATTAGCCAGGCAGAAAGTTTCACTGGAAATAACACAAAGAACCCACAGGAAACCCACAATAATGAGTTAAAAGTCCTTGTCCCCGTCCTTGCTGTACTGGCGGCAGCGGCATTCGTTTCCTTCATCATATACAGACGCACGCGTCCCCACCGAAGCTATACAGGACCCAAGACTGTACAGCTTGAACTTACAGACCACGCC
mu ICOS-L
(SEQ ID NO:105)
MQLKCPCFVSLGTRQPVWKKLHVSSGFFSGLGLFLLLLSSLCAASAETEVGAMVGSNVVLSCIDPHRRHFNLSGLYVYWQIENPEVSVTYYLPYKSPGINVDSSYKNRGHLSLDSMKQGNFSLYLKNVTPQDTQEFTCRVFMNTATELVKILEEVVRLRVAANFSTPVISTSDSSNPGQERTYTCMSKNGYPEPNLYWINTTDNSLIDTALQNNTVYLNKLGLYDVISTLRLPWTSRGDVLCCVENVALHQNITSISQAESFTGNNTKNPQETHNNELKVLVPVLAVLAAAAFVSFIIYRRTRPHRSYTGPKTVQLELTD HA
mu CD47
(SEQ ID NO:106)
ATGTGGCCCTTGGCGGCGGCGCTGTTGCTGGGCTCCTGCTGCTGCGGTTCAGCTCAACTACTGTTTAGTAACGTCAACTCCATAGAGTTCACTTCATGCAATGAAACTGTGGTCATCCCTTGCATCGTCCGTAATGTGGAGGCGCAAAGCACCGAAGAAATGTTTGTGAAGTGGAAGTTGAACAAATCGTATATTTTCATCTATGATGGAAATAAAAATAGCACTACTACAGATCAAAACTTTACCAGTGCAAAAATCTCAGTCTCAGACTTAATCAATGGCATTGCCTCTTTGAAAATGGATAAGCGCGATGCCATGGTGGGAAACTACACTTGCGAAGTGACAGAGTTATCCAGAGAAGGCAAAACAGTTATAGAGCTGAAAAACCGCACGGTTTCGTGGTTTTCTCCAAATGAAAAGATCCTCATTGTTATTTTCCCAATTTTGGCTATACTCCTGTTCTGGGGAAAGTTTGGTATTTTAACACTCAAATATAAATCCAGCCATACGAATAAGAGAATCATTCTGCTGCTCGTTGCCGGGCTGGTGCTCACAGTCATCGTGGTTGTTGGAGCCATCCTTCTCATCCCAGGAGAAAAGCCCGTGAAGAATGCTTCTGGACTTGGCCTCATTGTAATCTCTACGGGGATATTAATACTACTTCAGTACAATGTGTTTATGACAGCTTTTGGAATGACCTCTTTCACCATTGCCATATTGATCACTCAAGTGCTGGGCTACGTCCTTGCTTTGGTCGGGCTGTGTCTCTGCATCATGGCATGTGAGCCAGTGCACGGCCCCCTTTTGATTTCAGGTTTGGGGATCATAGCTCTAGCAGAACTACTTGGATTAGTTTATATGAAGTTTGTCGCTTCCAACCAGAGGACTATCCAACCTCCTAGGAATAGG
mu CD47
(SEQ ID NO:107)
MWPLAAALLLGSCCCGSAQLLFSNVNSIEFTSCNETVVIPCIVRNVEAQSTEEMFVKWKLNKSYIFIYDGNKNSTTTDQNFTSAKISVSDLINGIASLKMDKRDAMVGNYTCEVTELSREGKTVIELKNRTVSWFSPNEKILIVIFPILAILLFWGKFGILTLKYKSSHTNKRIILLLVAGLVLTVIVVVGAILLIPGEKPVKNASGLGLIVISTGILILLQYNVFMTAFGMTSFTIAILITQVLGYVLALVGLCLCIMACEPVHGPLLISGLGIIALAELLGLVYMKFVASNQRTIQPPRNR
Mu肌聚糖蛋白α：
(SEQ ID NO:108)
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Mu肌聚糖蛋白α：
(SEQ ID NO:109)
MAAAVTWIPLLAGLLAGLRDTKAQQTTLHLLVGRVFVHPLEHATFLRLPEHVAVPPTVRLTYHAHLQGHPDLPRWLHYTQRSPYNPGFLYGSPTPEDRGYQVIEVTAYNRDSFDTTRQRLLLLIGDPEGPRLPYQAEFLVRSHDVEEVLPTTPANRFLTALGGLWEPGELQLLNITSALDRGGRVPLPIEGRKEGVYIKVGSATPFSTCLKMVASPDSYARCAQGQPPLLSCYDTLAPHFRVDWCNVSLVDKSVPEPLDEVPTPGDGILEHDPFFCPPTEATDRDFLTDALVTLLVPLLVALLLTLLLAYIMCFRREGRLKRDMATSDIQMFHHCSIHGNTEELRQMAASREVPRPLSTLPMFNVRTGERLPPRVDSAQM PLILDQH
Mu FGF10
(SEQ ID NO:110)
ATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCCTCAGCCTTTCCCCACCTGCCGGGCTGCTGTTGCTGCTTCTTGTTGCTCTTTTTGGTGTCTTCGTTCCCTGTCACCTGCCAAGCTCTTGGTCAGGACATGGTGTCACAGGAGGCCACCAACTGCTCTTCTTCCTCCTCGTCCTTCTCCTCTCCTTCCAGTGCGGGAAGGCATGTGCGGAGCTACAATCACCTCCAAGGAGATGTCCGCTGGAGAAGGCTGTTCTCCTTCACCAAGTACTTTCTCACGATTGAGAAGAACGGCAAGGTCAGCGGGACCAAGAATGAAGACTGTCCGTACAGTGTCCTGGAGATAACATCAGTGGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATCAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAGTTTAACAACGACTGTAAGCTGAAAGAGAGAATAGAGGAAAATGGATACAACACCTATGCATCTTTTAACTGGCAGCACAATGGCAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCCAGGAGAGGACAAAAAACAAGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTCCTCCCCATGACGATCCAAACA
Mu FGF10
(SEQ ID NO:111)
MWKWILTHCASAFPHLPGCCCCFLLLFLVSSFPVTCQALGQDMVSQEATNCSSSSSSFSSPSSAGRHVRSYNHLQGDVRWRRLFSFTKYFLTIEKNGKVSGTKNEDCPYSVLEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMTIQT
Mu集聚蛋白
(SEQ ID NO:112)
ATGCCTCCTCTGCCACTGGAACACAGACCCAGGCAGCAGCCTGGTGCCTCCGTGCTGGTTCGGTACTTCATGATCCCCTGCAACATCTGCTTGATCCTCTTGGCTACTTCTACGTTGGGCTTTGCGGTGCTGCTTTTCCTCAGCAACTACAAACCTGGGATCCACTTCACAGCAGCGCCTTCTATGCCTCCTGATGTGTGCAGGGGAATGTTATGTGGCTTTGGTGCTGTGTGTGAACCTAGTGTTGAGGATCCAGGCCGGGCCTCCTGTGTGTGCAAGAAGAATGTCTGCCCTGCTATGGTAGCTCCTGTGTGTGGCTCAGATGCTTCCACCTATAGCAACGAGTGTGAGCTACAGCGTGCACAGTGCAACCAGCAACGGCGCATCCGCCTACTCCGCCAAGGGCCATGTGGGTCCCGGGACCCCTGTGCCAATGTGACCTGCAGTTTCGGTAGTACCTGTGTACCTTCAGCCGATGGACAGACCGCCTCGTGTCTGTGTCCTACAACCTGCTTTGGGGCCCCTGATGGCACAGTGTGTGGCAGTGATGGTGTTGACTACCCTAGTGAGTGCCAGCTGCTCCGTCATGCCTGTGCCAACCAGGAGCACATCTTTAAGAAGTTCGATGGTCCTTGTGACCCCTGCCAGGGCAGCATGTCAGACCTGAATCATATTTGCCGGGTGAACCCACGTACACGGCACCCAGAAATGCTTCTGCGGCCTGAGAACTGCCCCGCCCAACACACACCTATCTGTGGAGATGATGGGGTCACCTATGAAAACGACTGTGTCATGAGCCGTATAGGTGCAGCCCGTGGCCTGCTTCTCCAGAAAGTGCGCTCTGGTCAATGCCAGACTCGAGACCAGTGCCCGGAGACCTGCCAGTTTAACTCTGTATGCCTGTCCCGCCGCGGCCGTCCCCACTGTTCCTGCGATCGCGTCACCTGTGATGGGGCTTACAGGCCAGTGTGTGCCCAGGATGGGCACACGTATGACAATGACTGTTGGCGCCAACAGGCCGAGTGTCGACAACAGCAGACCATTCCCCCCAAGCACCAGGGCCCGTGTGACCAGACCCCATCCCCGTGCCGTGGAGCGCAGTGTGCATTTGGGGCAACATGCACAGTGAAGAATGGGAAAGCTGTGTGCGAGTGCCAGCGGGTGTGCTCGGGCGGCTACGATCCTGTGTGCGGCAGTGATGGTGTCACTTACGGCAGTGTGTGCGAGCTGGAATCCATGGCCTGTACCCTTGGGCGGGAAATCCGAGTGGCCCGCAGAGGACCGTGTGACCGATGTGGGCAGTGCCGGTTTGGATCCTTGTGCGAGGTGGAGACTGGACGCTGTGTGTGCCCCTCTGAGTGTGTGGAGTCAGCCCAGCCCGTATGTGGCTCTGACGGACACACATATGCTAGTGAATGTGAGCTGCATGTCCACGCCTGTACACACCAGATCAGCCTATACGTGGCCTCAGCCGGACACTGCCAGACCTGTGGAGAAACAGTTTGTACCTTTGGGGCTGTGTGCTCAGCTGGACAGTGTGTATGTCCCCGTTGTGAGCACCCCCCACCTGGCCCTGTGTGCGGCAGTGATGGCGTCACCTACCTCAGTGCCTGTGAGCTCCGAGAGGCTGCCTGTCAGCAGCAGGTACAAATTGAGGAGGCCCGTGCAGGGCCGTGTGAGCCGGCTGAGTGTGGCTCAGGGGGCTCTGGGTCTGGGGAAGACAATGCGTGTGAGCAGGAGCTGTGTCGGCAGCATGGTGGTGTCTGGGATGAGGACTCAGAAGACGGGCCGTGTGTCTGTGACTTTAGTTGCCAGAGTGTCCTTAAAAGCCCAGTGTGTGGCTCAGATGGAGTCACCTATAGCACGGAGTGCCATCTGAAGAAGGCCAGATGTGAAGCGCGGCAAGAGCTGTACGTCGCTGCTCAGGGAGCCTGCCGGGGCCCTACCTTGGCTCCACTGCTACCTATGGCCTCCCCACACTGTGCCCAAACCCCCTATGGCTGCTGCCAGGACAATGTCACTGCTGCCCAGGGTGTGGGCTTGGCTGGCTGTCCCAGCACCTGCCATTGCAACCCACACGGCTCCTATAGCGGCACTTGTGACCCAGTCACAGGGCAGTGCTCCTGCCGACCAGGTGTAGGAGGCCTCAGGTGTGATCGCTGTGAGCCTGGCTTCTGGAACTTCCGTGGCATTGTCACCGATGGACATAGTGGTTGCACTCCCTGCAGCTGTGACCCTCGGGGTGCTGTAAGAGATGACTGTGAGCAGATGACTGGATTGTGTTCCTGTAGACCTGGTGTGGCTGGTCCCAAGTGTGGGCAGTGTCCAGATGGTCAAGCCCTGGGCCATCTTGGCTGTGAAGCAGATCCCACAACACCAGTGACTTGTGTGGAAATGCACTGTGAGTTTGGCGCCTCCTGCGTAGAGGAGGCTGGTTTTGCCCAGTGTGTCTGCCCAACTCTCACATGTCCAGAGGCTAACTCTACCAAGGTCTGTGGATCAGATGGTGTCACATACGGCAATGAATGCCAGCTGAAGACCATTGCCTGCCGCCAGCGTCTGGACATCTCCATTCAGAGTCTTGGTCCATGCCGGGAGAGTGTTGCTCCTGGGGTTTCCCCTACATCTGCATCTATGACCACCCCAAGGCATATCCTGAGCAGGACACTGGCGTCTCCCCACAGCAGCCTTCCTCTGTCTCCCAGCACTACTGCCCATGATTGGCCCACCCCATTACCCACATCACCTCAGACCGTAGTCGGCACCCCCAGGAGCACTGCAGCCACACCCTCTGATGTGGCCAGTCTTGCTACAGCGATCTTCAGGGAATCTGGCAGCACCAACGGCAGTGGCGATGAGGAGCTCAGTGGCGATGAGGAGGCCAGTGGGGGCGGGTCTGGGGGACTTGAGCCCCCGGTGGGCAGCGTTGTGGTGACCCACGGGCCACCCATCGAGAGGGCTTCCTGTTACAACTCACCTTTGGGCTGCTGCTCAGATGGCAAGACACCCTCACTGGACTCAGAAGGCTCCAACTGTCCAGCTACCAAGGCATTCCAGGGCGTGCTGGAGCTTGAGGGGGTCGAGGGACAGGAACTGTTCTACACACCAGAGATGGCTGACCCCAAGTCAGAGTTGTTTGGGGAGACTGCAAGGAGCATTGAGAGCACGCTGGACGACCTGTTCCGGAATTCGGATGTTAAGAAGGACTTCTGGAGCATCCGCCTACGGGAACTGGGGCCTGGCAAATTAGTCCGTGCCATTGTGGATGTTCACTTTGACCCCACCACAGCCTTCCAGGCACCAGATGTGGGTCAGGCCTTGCTCCAACAGATCCAGGTATCCAGGCCGTGGGCCCTGGCAGTGAGGAGGCCTCTGCGGGAGCATGTGCGATTCTTGGACTTTGACTGGTTTCCCACTTTTTTTACGGGAGCTGCAACAGGAACCACAGCTGCTGTGGCCACAGCCAGAGCCACCACTGTGAGCCGACTGTCTGCCTCTTCTGTCACCCCACGAGTCTACCCCAGTTACACCAGCCGGCCTGTTGGCAGAACTACGGCACCGCTAACCACTCGCCGGCCACCAACCACTACCGCCAGTATTGACCGACCTCGGACTCCAGGCCCGCAACGGCCCCCAAAGTCCTGTGATTCCCAGCCTTGCCTCCACGGAGGTACCTGCCAGGACCTGGATTCTGGCAAGGGTTTCAGCTGCAGCTGTACTGCAGGCAGGGCTGGCACTGTCTGTGAGAAAGTGCAGCTCCCCTCTGTGCCAGCTTTTAAGGGCCACTCCTTCTTGGCCTTCCCCACCCTCCGAGCCTACCACACGCTGCGTCTGGCACTAGAATTCCGGGCGCTGGAGACAGAGGGACTGCTGCTCTACAATGGCAATGCACGTGGCAAAGATTTCCTGGCTCTGGCTCTGTTGGATGGTCATGTACAGTTCAGGTTCGACACGGGCTCAGGGCCGGCGGTGCTAACAAGCTTAGTGCCAGTGGAACCGGGACGGTGGCACCGCCTCGAGTTGTCACGGCATTGGCGGCAGGGCACACTTTCTGTGGATGGCGAGGCTCCTGTTGTAGGTGAAAGTCCGAGTGGCACTGATGGCCTCAACTTGGACACGAAGCTCTATGTGGGTGGTCTCCCAGAAGAACAAGTTGCCACGGTGCTTGATCGGACCTCTGTGGGCATCGGCCTGAAAGGATGCATTCGTATGTTGGACATCAACAACCAGCAGCTGGAGCTGAGCGATTGGCAGAGGGCTGTGGTTCAAAGCTCTGGTGTGGGGGAATGCGGAGACCATCCCTGCTCACCTAACCCCTGCCATGGCGGGGCCCTCTGCCAGGCCCTGGAGGCTGGCGTGTTCCTCTGTCAGTGCCCACCTGGCCGCTTTGGCCCAACTTGTGCAGATGAAAAGAACCCCTGCCAACCGAACCCCTGCCACGGGTCAGCCCCCTGCCATGTGCTTTCCAGGGGTGGGGCCAAGTGTGCGTGCCCCCTGGGACGCAGTGGTTCCTTCTGTGAGACAGTCCTGGAGAATGCTGGCTCCCGGCCCTTCCTGGCTGACTTTAATGGCTTCTCCTACCTGGAACTGAAAGGCTTGCACACCTTCGAGAGAGACCTAGGGGAGAAGATGGCGCTGGAGATGGTGTTCTTGGCTCGTGGGCCCAGTGGCTTACTCCTCTACAATGGGCAGAAGACGGATGGCAAGGGGGACTTTGTATCCCTGGCCCTGCATAACCGGCACCTAGAGTTCCGCTATGACCTTGGCAAGGGGGCTGCAATCATCAGGAGCAAAGAGCCCATAGCCCTGGGCACCTGGGTTAGGGTATTCCTGGAACGAAATGGCCGCAAGGGTGCCCTTCAAGTGGGTGATGGGCCCCGTGTGCTAGGGGAATCTCCGAAATCCCGCAAGGTCCCGCACACCATGCTCAACCTCAAGGAGCCCCTCTATGTGGGGGGAGCTCCTGACTTCAGCAAGCTGGCTCGGGGCGCTGCAGTGGCCTCCGGCTTTGATGGTGCCATCCAGCTGGTGTCTCTAAGAGGCCATCAGCTGCTGACTCAGGAGCATGTGTTGCGGGCAGTAGATGTAGCGCCTTTTGCAGGCCACCCTTGTACCCAGGCCGTGGACAACCCCTGCCTTAATGGGGGCTCCTGTATCCCGAGGGAAGCCACTTATGAGTGCCTGTGTCCTGGGGGCTTCTCTGGGCTGCACTGCGAGAAGGGGATAGTTGAGAAGTCAGTGGGGGACCTAGAAACACTGGCCTTTGATGGGCGGACCTACATCGAGTACCTCAATGCTGTGACTGAGAGCGAGCTGACCAATGAGATCCCAGCCCCCGAAACTCTGGATTCCCGGGCCCTTTTCAGTGAGAAAGCGCTGCAGAGCAACCACTTTGAGCTGAGCTTACGCACTGAGGCCACGCAGGGGCTGGTGCTGTGGATTGGAAAGGTTGGAGAACGTGCAGACTACATGGCTCTGGCCATTGTGGATGGGCACCTACAACTGAGCTATGACCTAGGCTCCCAGCCAGTTGTGCTGCGCTCCACTGTGAAGGTCAACACCAACCGCTGGCTTCGAGTCAGGGCTCACAGGGAGCACAGGGAAGGTTCCCTTCAGGTGGGCAATGAAGCCCCTGTGACTGGCTCTTCCCCGCTGGGTGCCACACAATTGGACACAGATGGAGCCCTGTGGCTTGGAGGCCTACAGAAGCTTCCTGTGGGGCAGGCTCTCCCCAAGGCCTATGGCACGGGTTTTGTGGGCTGTCTGCGGGACGTGGTAGTGGGCCATCGCCAGCTGCATCTGCTGGAGGACGCTGTCACCAAACCAGAGCTAAGACCCTGCCCCACTCTCTGA
Mu集聚蛋白
(SEQ ID NO:113)
MPPLPLEHRPRQQPGASVLVRYFMIPCNICLILLATSTLGFAVLLFLSNYKPGIHFTAAPSMPPDVCRGMLCGFGAVCEPSVEDPGRASCVCKKNVCPAMVAPVCGSDASTYSNECELQRAQCNQQRRIRLLRQGPCGSRDPCANVTCSFGSTCVPSADGQTASCLCPTTCFGAPDGTVCGSDGVDYPSECQLLRHACANQEHIFKKFDGPCDPCQGSMSDLNHICRVNPRTRHPEMLLRPENCPAQHTPICGDDGVTYENDCVMSRIGAARGLLLQKVRSGQCQTRDQCPETCQFNSVCLSRRGRPHCSCDRVTCDGAYRPVCAQDGHTYDNDCWRQQAECRQQQTIPPKHQGPCDQTPSPCRGAQCAFGATCTVKNGKAVCECQRVCSGGYDPVCGSDGVTYGSVCELESMACTLGREIRVARRGPCDRCGQCRFGSLCEVETGRCVCPSECVESAQPVCGSDGHTYASECELHVHACTHQISLYVASAGHCQTCGETVCTFGAVCSAGQCVCPRCEHPPPGPVCGSDGVTYLSACELREAACQQQVQIEEARAGPCEPAECGSGGSGSGEDNACEQELCRQHGGVWDEDSEDGPCVCDFSCQSVLKSPVCGSDGVTYSTECHLKKARCEARQELYVAAQGACRGPTLAPLLPMASPHCAQTPYGCCQDNVTAAQGVGLAGCPSTCHCNPHGSYSGTCDPVTGQCSCRPGVGGLRCDRCEPGFWNFRGIVTDGHSGCTPCSCDPRGAVRDDCEQMTGLCSCRPGVAGPKCGQCPDGQALGHLGCEADPTTPVTCVEMHCEFGASCVEEAGFAQCVCPTLTCPEANSTKVCGSDGVTYGNECQLKTIACRQRLDISIQSLGPCRESVAPGVSPTSASMTTPRHILSRTLASPHSSLPLSPSTTAHDWPTPLPTSPQTVVGTPRSTAATPSDVASLATAIFRESGSTNGSGDEELSGDEEASGGGSGGLEPPVGSVVVTHGPPIERASCYNSPLGCCSDGKTPSLDSEGSNCPATKAFQGVLELEGVEGQELFYTPEMADPKSELFGETARSIESTLDDLFRNSDVKKDFWSIRLRELGPGKLVRAIVDVHFDPTTAFQAPDVGQALLQQIQVSRPWALAVRRPLREHVRFLDFDWFPTFFTGAATGTTAAVATARATTVSRLSASSVTPRVYPSYTSRPVGRTTAPLTTRRPPTTTASIDRPRTPGPQRPPKSCDSQPCLHGGTCQDLDSGKGFSCSCTAGRAGTVCEKVQLPSVPAFKGHSFLAFPTLRAYHTLRLALEFRALETEGLLLYNGNARGKDFLALALLDGHVQFRFDTGSGPAVLTSLVPVEPGRWHRLELSRHWRQGTLSVDGEAPVVGESPSGTDGLNLDTKLYVGGLPEEQVATVLDRTSVGIGLKGCIRMLDINNQQLELSDWQRAVVQSSGVGECGDHPCSPNPCHGGALCQALEAGVFLCQCPPGRFGPTCADEKNPCQPNPCHGSAPCHVLSRGGAKCACPLGRSGSFCETVLENAGSRPFADFNGFSYLELKGLHTFERDLGEKMALEMVFLARGPSGLLLYNGQKTDGKGDFVSLALHNRHLEFRYDLGKGAAIIRSKEPIALGTWVRVFLERNGRKGALQVGDGPRVLGESPKSRKVPHTMLNLKEPLYVGGAPDFSKLARGAAVASGFDGAIQLVSLRGHQLLTQEHVLRAVDVAPFAGHPCTQAVDNPCLNGGSCIPREATYECLCPGGFSGLHCEKGIVEKSVGDLETLAFDGRTYIEYLNAVTESELTNEIPAPETLDSRALFSEKALQSNHFELSLRTEATQGLVLWIGKVGERADYMALAIVDGHLQLSYDLGSQPVVLRSTVKVNTNRWLRVRAHREHREGSLQVGNEAPVTGSSPLGATQLDTDGALWLGGLQKLPVGQALPKAYGTGFVGCLRDVVVGHRQLHLLEDAVTKPELRPCPTL
Mu IL10
(SEQ ID NO:114)
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Mu IL10
(SEQ ID NO:115)
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Mu MYDGF(C19orf10)
(SEQ ID NO:116)
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Mu MYDGF(C19orf10)
(SEQ ID NO:117)
MAAPSGGFWTAVVLAAAALKLAAAVSEPTTVPFDVRPGGVVHSFSQDVGPGNKFTCTFTYASQGGTNEQWQMSLGTSEDSQHFTCTIWRPQGKSYLYFTQFKAELRGAEIEYAMAYSKAAFERESDVPLKSEEFEVTKTAVSHRPGAFKAELSKLVIVAKAARSEL
pWF-521
(SEQ ID NO:118)
CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAACCAGGTCCAACATTGGGAGTGATTATGTTTCCTGGTACCAACACCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCGTTTATGGCGATAATCTGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGCCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGCACATGGGATTACACCCTGAATGGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCCAACAAGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGACTTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCAGGCGCCGGATCTGGTGGAAACTGGAGTCATCCCCAATTCGAGAAGGGCGGAAGCGGTGGGAGTGGCGGGTCCGGTGGAAGCAACTGGTCACACCCACAATTCGAGAAAGGCGGTTCTGGCGGATCTGGTGGATCTGGCGGAAGTAACTGGTCTCATCCTCAATTCGAAAAGGGCGGAAGCGGTGGCGGCAGGCTAGGTGGAGGCTCAGTGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGGTGGTAGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGCGCACTTCTTACCTGAACCATGGTGATTACTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTGTCTAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCCCCAGAGCTGCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGAGCTGCAACTGGAGGAGAGCTGTGCGGAGGCGCAGGACGGGGAGCTGGACGGGCTGTGGACGACCATCACCATCTTCATCACACTCTTCCTGTTAAGCGTGTGCTACAGTGCCACCGTCACCTTCTTCAAGGTGAAGTGGATCTTCTCCTCGGTGGTGGACCTGAAGCAGACCATCATCCCCGACTACAGGAACATGATCGGACAGGGGGCCTGA
pWF-521
(SEQ ID NO:119)
QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGTRSNIGSDYVSWYQHLPGTAPKLLVYGDNLRPSGIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDYTLNGVVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSGAGSGGNWSHPQFEKGGSGGSGGSGGSNWSHPQFEKGGSGGSGGSGGSNWSHPQFEKGGSGGGRLGGGSVQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTSYLNHGDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESCAEAQDGELDGLWTTITIFITLFLLSVCYSATVTFFKVKWIFSSVVDLKQTIIPDYRNMIGQGA
pWF-533
(SEQ ID NO:120)
CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAACCAGGTCCAACATTGGGAGTGATTATGTTTCCTGGTACCAACACCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCGTTTATGGCGATAATCTGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGCCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGCACATGGGATTACACCCTGAATGGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAtcttcaGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGC
pWF-533
(SEQ ID NO:121)
QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGTRSNIGSDYVSWYQHLPGTAPKLLVYGDNLRPSGIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDYTLNGVVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
pWF-534
(SEQ ID NO:122)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGGTGGTAGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGCGCACTTCTTACCTGAACCATGGTGATTACTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTGTCTAGCGCCTCCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCCCCAGAGCTGCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGAGCTGCAACTGGAGGAGAGCTGTGCGGAGGCGCAGGACGGGGAGCTGGACGGGCTGTGGACGACCATCACCATCTTCATCACACTCTTCCTGTTAAGCGTGTGCTACAGTGCCACCGTCACCTTCTTCAAGGTGAAGTGGATCTTCTCCTCGGTGGTGGACCTGAAGCAGACCATCATCCCCGACTACAGGAACATGATCGGACAGGGGGCCTGA
pWF-534
(SEQ ID NO:123)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTSYLNHGDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESCAEAQDGELDGLWTTITIFITLFLLSVCYSATVTFFKVKWIFSSVVDLKQTIIPDYRNMIGQGA
mu IL15
(SEQ ID NO:124)
ATGAAAATTTTGAAACCATATATGAGGAATACATCCATCTCGTGCTACTTGTGTTTCCTTCTAAACAGTCACTTTTTAACTGAGGCTGGCATTCATGTCTTCATTTTGGGCTGTGTCAGTGTAGGTCTCCCTAAAACAGAGGCCAACTGGATAGATGTAAGATATGACCTGGAGAAAATTGAAAGCCTTATTCAATCTATTCATATTGACACCACTTTATACACTGACAGTGACTTTCATCCCAGTTGCAAAGTTACTGCAATGAACTGCTTTCTCCTGGAATTGCAGGTTATTTTACATGAGTACAGTAACATGACTCTTAATGAAACAGTAAGAAACGTGCTCTACCTTGCAAACAGCACTCTGTCTTCTAACAAGAATGTAGCAGAATCTGGCTGCAAGGAATGTGAGGAGCTGGAGGAGAAAACCTTCACAGAGTTTTTGCAAAGCTTTATACGCATTGTCCAAATGTTCATCAACACGTCC
mu IL15
(SEQ ID NO:125)
MKILKPYMRNTSISCYLCFLLNSHFLTEAGIHVFILGCVSVGLPKTEANWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTS
抗人GPC3 CAR(79a)
(SEQ ID NO:126)
CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAACCAGGTCCAACATTGGGAGTGATTATGTTTCCTGGTACCAACACCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCGTTTATGGCGATAATCTGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGCCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGCACATGGGATTACACCCTGAATGGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTTCTAGAGGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCCCTCGAGATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGGTGGTAGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGCGCACTTCTTACCTGAACCATGGTGATTACTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTGTCTAGCGCCGCTGCAGTGGTCCCCGTGCTGCAGAAAGTTAATAGCACCACCACTAAACCTGTCCTGAGGACTCCTAGTCCAGTGCACCCAACAGGGACCAGTCAGCCACAGAGACCGGAAGACTGCAGACCAAGAGGTTCAGTGAAGGGAACCGGCCTGGATTTCGCCTGCGATTTTTGGGCCCTGGTCGTCGTCGCAGGAGTTTTGTTTTGCTATGGACTGCTCGTCACAGTTGCTTTGTGTGTTATCTGGACAAGGAAACGGTGGCAAAATGAGAAGTTTGGGGTGGACATGCCAGATGACTATGAAGATGAAAATCTCTATGAGGGCCTGAACCTTGATGACTGTTCTATGTATGAGGACATCTCCAGGGGACTCCAGGGCACCTACCAGGATGTGGGCAACCTCCACATTGGAGATGCCCAGCTGGAAAAGCCATGA
抗人GPC3 CAR(79a)
(SEQ ID NO:127)
QSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGTRSNIGSDYVSWYQHLPGTAPKLLVYGDNLRPSGIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDYTLNGVVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTSYLNHGDYWGQGTLVTVSSAAAVVPVLQKVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWTRKRWQNEKFGVDMPDDYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLQGTYQDVGNLHIGDAQLEKP
抗人PSMA(XENP14484)CAR 79a
(SEQ ID NO:128)
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抗人PSMA(XENP14484)CAR 79a
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小鼠IL 12a-小鼠IgG2a Fc
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小鼠IL 12a-小鼠IgG2a Fc
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小鼠IL 12b-小鼠IgG2a Fc
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小鼠IL 12b-小鼠IgG2a Fc
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小鼠IL 12a-小鼠IgG2a Fc(沉默)
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小鼠IL 12a-小鼠IgG2a Fc(沉默)
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小鼠IL 12b-小鼠IgG2a Fc(沉默)
(SEQ ID NO:136)
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小鼠IL 12b-小鼠IgG2a Fc(沉默)
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CD3ζ胞质结构域-人
(SEQ ID NO:138)
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CD3ζ胞质结构域-人
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pWF-506
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pWF-506
(SEQ ID NO:141)
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pWF-507：
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pWF-507：
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pWF-508：
(SEQ ID NO:144)
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pWF-508：
(SEQ ID NO:145)
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pWF-509：
(SEQ ID NO:146)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGTRSNIGSDYVSWYQHLPGTAPKLLVYGDNLRPSGIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDYTLNGVVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTSYLNHGDYWGQGTLVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVLDKDDSKAGMEEDHTYEGLDIDQTATYEDIVTLRTGEVKWSVGEHPGQE
pWF-509：
(SEQ ID NO:147)
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pWF-510：
(SEQ ID NO:148)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQSVLTQPPSVSAAPGQRVTISCSGTRSNIGSDYVSWYQHLPGTAPKLLVYGDNLRPSGIPDRFSASKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDYTLNGVVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTSYLNHGDYWGQGTLVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP
pWF-510：
(SEQ ID NO:149)
ATGGAAACCGATACACTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGATCTACCGGTCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAACCAGGTCCAACATTGGGAGTGATTATGTTTCCTGGTACCAACACCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCGTTTATGGCGATAATCTGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGCCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGCACATGGGATTACACCCTGAATGGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTTCTAGAGGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCCCTCGAGATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGGTGGTAGTAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGCGCACTTCTTACCTGAACCATGGTGATTACTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTGTCTAGCGCCGCTGCATTCGTGCCTGTGTTCCTCCCAGCTAAGCCCACTACCACCCCCGCTCCAAGGCCGCCCACGCCCGCTCCTACTATTGCTAGTCAGCCTTTAAGTTTACGACCCGAAGCTTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCTGTGCACACCAGGGGGCTTGATTTTGCCTGCGACTTTTGGGTATTGGTAGTGGTGGGCGGAGTTTTAGCCTGCTACAGCCTCCTGGTAACAGTGGCTTTTATCATCTTTTGGGTGAGGAAACGATGGCAGAACGAGAAGCTCGGGTTGGATGCCGGGGATGAATATGAAGATGAAAACCTTTATGAAGGCCTGAACCTGGACGACTGCTCCATGTATGAGGACATCTCCCGGGGCCTCCAGGGCACCTACCAGGATGTGGGCAGCCTCAACATAGGAGATGTCCAGCTGGAGAAGCCGTGA
通过引用并入
本说明书中所提及的所有公开、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开、专利或专利申请被专门地且单独地指示通过引用并入。然而，本文引用的参考文献不应被解释为承认这种参考文献是本发明的现有技术。在通过引用并入的参考文献中提供的任何定义或术语不同于本文提供的术语和讨论的程度，以本发明术语和定义为准。
等效方案
前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践本发明。前述描述和实例详述了本说明的某些优选实施例，并且描述了发明人所设想的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容在文本中的详细程度如何，本发明可以以多种方式实践，并且本发明应该根据所附权利要求和其任何等效物来解释。
提供以下实例(包含所进行的实验和所实现的结果)仅用于说明目的，并且不应被解释为限制本发明。
实例
实例1-与PSMA结合的B细胞嵌合抗原受体(CAR-B)构建体。
DNA构建体：设计示例性CAR-B构建体以识别前列腺特异性膜抗原(“PSMA”)。PSMA是在前列腺癌细胞上比在其它非癌细胞上表达得更高的抗原。制备各种构建体，所述构建体包括胞外结构域(所述胞外结构域包括对PSMA具有特异性的scFv)、来自CD8的胞外铰链区、CD28跨膜结构域和各种胞内信号传导结构域。表6中提供了构建体列表：
表6
Figure BDA0003918100700001071
Figure BDA0003918100700001081
抗PSMA CAR-B在HEK-293细胞上的表达。使用Takara慢病毒制备试剂盒，将编码pWF82至pWF89的构建体用于在Lentix细胞中制备慢病毒。使用对PSMA具有特异性的抗体(生物素-PSMA，义翘神州公司(Sinobiological)，并且描绘于图5中)使用流式细胞术来测量各种CAR-B构建体的表达。
抗PSMA CAR-B在人B细胞中的表达。为了测量抗PSMA CAR-B在B细胞中的表达和结合，制备两种另外的构建体：
表7
Figure BDA0003918100700001082
基于MMLV的载体用于制备逆转录病毒。逆转录病毒用于感染从脾脏中分离的小鼠B细胞。转导后，B细胞在表达CD40L和可溶性IL-4的饲养细胞上进一步扩增。通过使用重组生物素-PSMA检测抗PSMA CAR-B的表达。使用PE标记的链霉亲和素来检测在HEK-293细胞中的PSMA结合。
结果：此实验的结果描绘于图6中，并且证明有可能产生表达可以与抗原特异性结合的CAR-B的小鼠B细胞。例如，表达pWF396或pWF397的B细胞与PSMA结合，而表达pWF394的B细胞不与PSMA结合(pWF398被设计成与肌聚糖蛋白而非PSMA结合)。
实例2-与GPC3结合的B细胞上的嵌合抗原受体(CAR-B)构建体。
DNA构建体：示例性CAR构建体被设计成识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)。在其它肿瘤类型中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3在肝细胞癌细胞上表达，但不在大多数非癌细胞上表达。GPC3可以用于将抗GPC3 CAR靶向肝细胞癌以及表达GPC3的其它癌症(例如，卵巢透明细胞癌、小儿癌症、肺癌(即，肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、尿路上皮癌、甲状腺癌、胃癌等)。制备各种构建体，所述构建体包括胞外结构域(所述胞外结构域包括对GPC-3具有特异性的scFv)、来自CD8的胞外铰链区、CD28跨膜结构域和各种胞内信号传导结构域。构建另外的抗PSMA CAR-B作为这些实验的对照。表8中提供了构建体列表。
表8
Figure BDA0003918100700001091
抗GPC-3在HEK-293细胞上的表达。慢病毒转导用于在HEK293细胞表面上表达GPC3CAR-B蛋白。用对GPC-3(优瑞科制药公司(Eureka Therapeutics))具有特异性的抗独特型抗体通过流式细胞术确定表达。
抗GPC-3CAR-B在人B细胞中的表达。编码CAR构建体的pWF 396、397和398用于制备MMLV逆转录病毒。这种逆转录病毒用于转导通过阴性选择(干细胞技术公司(Stem CellTechnologies))分离的小鼠B细胞并且通过与表达CD40L的HeLa细胞共培养并且添加可溶性IL-4来激活24小时。转导后48小时，使用流式细胞术确认表达。使用针对人GPC3的抗独特型抗体检测CAR-B的表达。抗独特型抗体从优瑞科制药公司获得。
结果：表达抗GPC-3 CAR B、pWF-396和397的小鼠B细胞被表达并且被抗GPC3独特型抗体特异性结合。
实例3-表达GFP的腺病毒变体F35
显示表达GFP的腺病毒变体F35有效地感染人B细胞。从外周血中分离人B细胞。以0μL、1μL、3μL、10μL的体积用编码GFP的腺病毒感染B细胞。腺病毒制剂的滴度为大约1 x e12个颗粒/ml。
实例4-向肿瘤细胞递送有效载荷
进行大型筛选研究以检查有效载荷对CT26模型中的NIH3T3成纤维细胞的影响。有效载荷包含各种免疫调节剂，包含细胞因子和趋化因子。首先，将CT26肿瘤注射到BALB/c小鼠的左胁腹和右胁腹。参见图8。十二天和十六天后，将小鼠注射到具有4至5个有效载荷的各种组合的右胁腹肿瘤中。测量肿瘤体积，持续至多35天。
BALB/C CT26肿瘤模型的产生：将CT26肿瘤注射到总共139只小鼠的左胁腹和右胁腹。
有效载荷的选择：鉴定了十二种肽的潜力：(i)募集和激活树突状细胞；(ii)启动树突状细胞和T细胞归巢并引导到肿瘤位点中；以及(iii)激活效应T细胞。表9中列出了所筛选的有效载荷。
表9
有效载荷 SEQ ID NO.
FLT3L 70、71
XCL1 72、73
TIM4-Fc 74、75
CXCL13 68、69
mCCL21 92、93
mCD80–膜结合 86、87
mCD40L–膜结合 88、89
mlFNa A2 84、85
mlL-12 80、81
mlL-21 90、91
mLIGHT突变体 78、79
M4-1BBL-膜结合 76、77
mIL-15 124、125
各自被给予4至5个有效载荷的组合、全部12个有效载荷或3T3细胞(无有效载荷)或盐水作为对照。总共有二十七组(n＝5只小鼠/组)。实验组在表10中鉴定。
表10
Figure BDA0003918100700001101
Figure BDA0003918100700001111
剂量：第一次注射时肿瘤体积介于100mm3与150mm3之间。对于接受4个有效载荷的各个组，每个有效载荷以每次注射2.5x105个细胞来递送，总共106个细胞。对于接受5个有效载荷的各个组，每个有效载荷以每次注射[x]个细胞来递送，总共3x106个细胞。第五有效载荷与Poly(I:C)(其是ds-RNA类似物)共同施用。通过瘤内注射施用有效载荷。除了poly(I:C)组和大的12路组(其中体积为150μL)外，所有组的施用体积为50μL。
有效载荷施用程序：用维尔烯(versene)(不在存在胰蛋白酶的情况下)收获细胞。一旦收集，就对细胞进行计数、旋转并且重悬于可以在对细胞进行重新计数之后调整至20x106/ml的体积中。TLR激动剂(Invivogen公司(Invivogen)目录号ODN：1826)通过将冻干粉末重悬于所提供的水中。将TLR激动剂以10mg/ml重悬并且加热至70℃，并且然后在使用前使其在室温下静置1小时。TLR激动剂的剂量为50μg/50μl。
结果：图9-11中描绘了结果。同侧注射的有效载荷的若干组合证明了在对侧肿瘤中的抗肿瘤活性，表现为在这个模型中延迟的肿瘤生长。组3、8和21显示出在30天内肿瘤生长的最显著损伤。
实例5-表达和分泌有效载荷的经修饰的B细胞
实验设计：BALB/c小鼠CT26肿瘤模型用于评估表达不同有效载荷的经修饰的B细胞对肿瘤体积和存活率的功效。向小鼠以100μL的体积注射肿瘤细胞。在第6天，一旦肿瘤体积达到175mm3，向小鼠注射表达如下所述的各种有效载荷的经修饰的B细胞。测量肿瘤体积和存活率，持续17天。
小鼠PBMC的分离：分别从血液或脾脏中分离小鼠PBMC或脾细胞。使用Lympholyte-M(CedarLane公司(CedarLane)，目录号CL5030)分离PBMC。将脾细胞通过70微米尼龙细胞滤网借助于手动细胞分离进行分离。然后使用
Figure BDA0003918100700001112
小鼠B细胞分离试剂盒(干细胞技术公司，目录号19854)通过免疫磁性阴性选择从PBMC或脾细胞中分离B细胞。
有效载荷的选择：将表达有效载荷肽或蛋白质的核酸序列转染或转导到分离的B细胞中。鉴定了以下十二种肽的潜力：(i)募集和激活树突状细胞；(ii)启动树突状细胞和T细胞归巢并引导到肿瘤位点中；以及(iii)激活效应T细胞。表9中列出了所筛选的有效载荷。
各自被给予4至5个有效载荷的组合或分离的B细胞(无有效载荷)或盐水作为对照。总共有二十七组(n＝5只小鼠/组)。实验组在表11中鉴定。
表11
小组编号 处理
3 FLT3L、XCL1、CXCL13、CD40L-MB、TLR
8 FLT3L、XCL1、mLIGHT、CD80-MB
21 FLT3L、XCL1、CCL21、CD40L-MB
26 盐水
27 B细胞(无有效载荷)
表达B细胞的有效载荷的产生：对于转染，将经纯化或经培养的B细胞洗涤并且以5x106个至25x106个细胞/ml悬浮于Cytoporation培养基T(BTX，目录号47-0002)中，并且与7.5μg至50μg RNA混合(RNA构建体在内部设计和制备，或使用
Figure BDA0003918100700001121
从TriLink购买并且用Pseudo-U完全取代)。使用BTX
Figure BDA0003918100700001122
电穿孔系统对200μL细胞/RNA悬浮液进行电穿孔。
剂量：第一次注射时肿瘤体积介于100mm3与150mm3之间。对于接受4个有效载荷的各个组，每个有效载荷以每次注射2.5x105个细胞来递送，总共递送106个细胞。对于接受5个有效载荷的各个组，每个有效载荷以每次注射2.5x105个细胞来递送，总共递送1.25x106个细胞。在瘤内注射有效载荷。对于接受4个有效载荷的各个组，施用体积为50μL，对于接受5个有效载荷的各个组，施用体积为100μL。
有效载荷施用程序：用维尔烯(不在存在胰蛋白酶的情况下)收获细胞。一旦收集，就对细胞进行计数、旋转并且重悬于可以调整至20x106/ml的体积中。TLR激动剂(InvivoGen公司目录号ODN：1826)通过将冻干粉末重悬于所提供的水中。将TLR激动剂以10mg/ml重悬并且加热至70℃，并且然后在使用前使其在室温下静置1小时。TLR激动剂的剂量为50μg/50μl。
实例6-瘤内注射的B细胞的抗肿瘤活性
利用70微米尼龙细胞滤网通过手动细胞分离获得并分离小鼠脾细胞。使用自体(BALB/c)或同种异体(C57Bl/6)供体小鼠(数据显示利用同种异体B细胞)。通过
Figure BDA0003918100700001123
小鼠B细胞分离试剂盒(Stem Cell
Figure BDA0003918100700001124
目录号19854)使用免疫磁性阴性选择从上述脾细胞中分离B细胞。
然后，注射(i)新鲜的B细胞或(ii)首先在具有5μg/ml脂多糖的生长培养基(RPMI、10％FBS、1％Pen/Strep、5ng/ml重组小鼠IL-4、100uMβ-巯基乙醇)中刺激16至24小时。然后将5×106个B细胞瘤内注射到CT26小鼠模型中，并且测量远端(远位)肿瘤中的抗肿瘤应答。在第0天植入肿瘤，并且在第6天观察到可触及的肿瘤块。在第6天开始瘤内治疗。图12中阐述了结果。
实例7-使用RNA电穿孔表达B细胞中的嵌合抗原受体(CAR)以制备CAR B细胞
如下从血液或脾脏中分离小鼠PBMC或脾细胞。使用Lympholyte-M(CedarLane公司，目录号CL5030)分离小鼠PBMC，并且通过70微米尼龙细胞滤网借助于手动细胞分离来分离脾细胞。然后使用
Figure BDA0003918100700001133
小鼠B细胞分离试剂盒(干细胞技术公司，目录号19854)通过免疫磁性阴性选择分别从PBMC或脾细胞中分离B细胞。
然后将B细胞在具有5ug/ml至15ug/ml脂多糖的生长培养基(RPMI、10％FBS、1％Pen/Strep、5ng/ml重组小鼠IL-4和100uMβ-巯基乙醇)中刺激16至24小时。然后使用已知技术(病毒转染或电穿孔)转染或转染B细胞，以实现CAR-B的稳定或瞬时表达。结合strep II标签进行翻译后检测。所描绘的代表性CAR-B如下：
1.XENP PSMA CBCR(3X strep II标签)
2.HyHEL10 CBCR(3X strep II标签)
3.D1.3-M3 HEL CBCR(3X strep II标签)
对于转染，将经纯化或经培养的B细胞洗涤并且以5x106个至25x106个细胞/ml悬浮于Cytoporation培养基T(BTX，目录号47-0002)中，并且与7.5ug至50ug RNA混合(RNA构建体在内部设计和制备，或使用
Figure BDA0003918100700001131
从TriLink购买并且用Pseudo-U完全取代)。获得200ul细胞/RNA悬浮液并且使用BTX
Figure BDA0003918100700001132
电穿孔系统进行电穿孔。然后将细胞在PBS中洗涤并且制备以用于IV注射到免疫无能的小鼠体内，所述小鼠具有表达相应抗原(例如，GPC3、HEL、PSMA)的已建立的HepG2肿瘤细胞。然后使用抗Strep II标签抗体测量所关注蛋白质的翻译和表达。图13中阐述了结果。在图13中，X轴示出了通过流式细胞术测量的表达信号的强度，并且Y轴阐述了表达期望的所关注蛋白质(PSMA、HEL)的细胞的百分比。
该实验证明，期望的RNA序列被成功转染或转导(相应地)，RNA被成功翻译，并且期望的所关注蛋白质在细胞表面上表达。
实例8-表达整联蛋白和归巢受体的经修饰的B细胞
使用已知的技术构建表达整联蛋白、归巢受体或两者的核酸构建体。用核酸构建体转染或转导(相应地)小鼠和人B细胞以表达整联蛋白、归巢受体或两者。将这些经修饰的细胞静脉内施用到小鼠或人宿主体内。延时成像将测量经修饰的B细胞在所关注位点/靶标(如归巢组织或靶组织、特定位置或组织中的炎性位点、或肿瘤或肿瘤微环境)处的积聚，以确定整联蛋白和/或具有定义的归巢特异性的归巢受体的表达赋予B细胞归巢至所关注位点/靶标并且在所述所关注位点/靶标处积聚的能力，其中治疗有效载荷的递送是令人期望的。根据实例5的技术进行筛选研究，以检查所关注位点/靶标处的有效载荷的递送和效果。
实例9-改变B细胞转运
将分离的B细胞与特定浓度的诱导α4β7整联蛋白和归巢受体CCR9的表达的全反式视黄酸(ATRA)或其衍生物一起培养。此后，收获B细胞，并且将其静脉内施用到小鼠体内。接受者小鼠有两个实验组。将第一组小鼠用DSS或TNBS进行预处理以诱导肠道炎症。将第二组小鼠不用DSS或TNBS进行处理。通过用DSS或TNBS预处理诱导类似于在人肠道疾病中观察到的炎症的炎症。由于α4β7整联蛋白和归巢受体CCR9的表达增加，用ATRA或其衍生物处理的所施用B细胞将归巢至与其归巢潜力一致的炎症区域。
实例10-表达免疫抑制分子的经修饰的B细胞
使用已知的技术构建表达选自以下的免疫抑制分子的核酸构建体：IL-10、TGF-β、PD-L1、PD-L2、LAG-3和TIM-3或其任何组合。用核酸构建体转染或转导(相应地)小鼠和人B细胞以表达以上列出的一种或多种免疫抑制分子。将这些经修饰的细胞静脉内施用到小鼠或人宿主体内或在炎症位点附近或别处。延时成像将测量经修饰的B细胞在所关注位点/靶标(如归巢组织或靶组织、特定位置或组织中的炎症位点、或肿瘤或肿瘤微环境)的积聚，以确定所述位点处的炎症和定位在所述位点的B细胞的自身免疫活性降低，由此引起阳性治疗应答。
实例11-用TLR激活B细胞
将B细胞用TLR激动剂处理和/或修饰以表达组成型活性TLR，用于增强B细胞的免疫应答并且产生有效的效应B细胞以增加受试者的抗原特异性免疫应答。在施用B细胞的同时或在施用B细胞之前，将分离的小鼠或人B细胞用TLR激动剂进行体外处理。在一些实例中，将小鼠或人B细胞用多于一种TLR激动剂进行处理。
将用或不用上述实例的CAR-B构建体转染或转导的经修饰的B细胞工程化以表达一种或多种组成型活性TLR。将每种TLR作为DNA构建体在组成型激活的转录途径的控制下引入到经修饰的B细胞中(使用已知的技术转导或转染)。将表达一种或多种组成型活性TLR(有或无CAR-B构建体)的经修饰的B细胞还用一种或多种TLR激动剂在向有需要的受试者或患者施用经修饰的B细胞的同时或在施用经修饰的B细胞之前进行处理。延时成像和其它已知的技术将测量经修饰的B细胞在期望位置中的积聚，并且确认TLR和任何表达的具有所定义特异性的CAR-B的表达。
此实验将证明编码所关注的特异性TLR的期望的DNA序列用或不用CAR-B构建体被成功转染或转导(相应地)到B细胞中，并且用或不用TLR激动剂处理，RNA被成功翻译，期望的TLR在B细胞中表达用于产生增强B细胞的免疫应答的有效的效应B细胞。
实例12-使用RNA电穿孔的B细胞在HLA I类和II类分子两者中的抗原呈递
mRNA构建体：示例性mRNA构建体是通过将特异性抗原(例如，肿瘤抗原或传染病抗原)与溶酶体蛋白LAMP1的靶向信号融合以将特异性抗原靶向溶酶体并且在HLA I类和II类分子两者中同时且有效地呈递抗原来设计的。肿瘤抗原和传染病抗原是本领域熟知的，并且可以包含期望针对其产生免疫应答的任何所关注抗原。制备各种mRNA构建体，所述构建体编码与LAMP1的靶向信号融合的至少一种所关注的特异性抗原，当转染到合适的免疫细胞中时，所述靶向信号能够通过HLA I类和II类分子两者同时且有效地呈递特异性抗原。
实验设计：使用已知的mRNA电穿孔技术，用上述mRNA构建体(即，编码与LAMP1靶向信号融合的所关注的特异性抗原)在体外对分离的小鼠或人B细胞进行电穿孔。在一些实例中，还使用已知的技术用根据前述实例中的任何实例的CAR-B构建体转导或转染小鼠或人B细胞。将用或不用所关注CAR-B构建体转导的mRNA电穿孔的B细胞静脉内引入到小鼠或人宿主体内。延时成像将测量经修饰的B细胞在期望位置中的积聚，并且还确认具有所定义特异性的CAR-B的表达。使用已知的技术测量特异性肿瘤抗原或所关注传染病抗原的翻译和表达，以确定所关注抗原靶向溶酶体并且通过HLA I类和II类分子同时且有效地呈递。
此实验将证明编码与靶向信号融合的所关注的特异性抗原的期望的mRNA序列被成功转染到B细胞(如果需要，也可以用CAR-B构建体转导)中，mRNA被成功翻译，并且电穿孔的和经修饰的B细胞通过HLA I类和II类分子两者同时且有效地呈递所关注的特异性抗原用于增加受试者的抗原特异性免疫应答。
实例13-表达PSMA特异性CAR的B细胞减少CT26-PSMA肿瘤中的肿瘤生长
小鼠肿瘤模型：使用工程化以表达人PSMA的BALB/c CT26-PSMA肿瘤模型来评估PSMA特异性CAR工程化的鼠类B细胞对肿瘤体积和存活率的功效。向八周龄BALB/c小鼠的一个后胁腹注射体积为50μl的1.0x106个CT26-PSMA肿瘤细胞。在第5天，当肿瘤体积达到大约60mm3时，将小鼠平均分配到3组，每组10只小鼠。在第6天开始使用用编码两种不同的PSMA特异性CAR形式的mRNA工程化的鼠类B细胞或在第6天在100μl或盐水中以1.5x106个细胞的剂量静脉内施用的未经工程化的B细胞对小鼠进行处理。在第5天、第9天、第11天和第13天用卡尺测量肿瘤体积。在第13天，相对于盐水，在PSMA-CAR组(形式79a)中存在57％的统计学上显著的肿瘤减少。在第13天，相对于盐水，在PSMA-CAR处理组(形式79b)中肿瘤体积没有显著减少(图14)。
鼠类B细胞的工程化：通过70微米尼龙细胞滤网借助于手动细胞分离从BALB/c供体脾脏中分离小鼠脾细胞。然后使用EasySep小鼠B细胞分离试剂盒(干细胞技术公司，目录号19854)通过免疫磁性阴性选择从脾细胞中分离B细胞。将B细胞在具有抗CD40(250ng/ml)的生长培养基(RPMI、10％FBS、25mM HEPES、1％Pen/Strep、5ng/ml重组小鼠IL-4、100μMβ-巯基乙醇)中刺激24小时。然后使用设置为280V的BTX AgilePulse电穿孔系统，用20μg CARmRNA构建体/3.6x106个B细胞对细胞进行电穿孔，持续1毫秒。将细胞洗涤，并且以15x106个B细胞/ml的浓度重悬于PBS中。每剂量使用100μl细胞悬浮液。
PSMA构建体CD79a：pmRNA_d7_13_抗hPSMA(XENP14484)scFv-mCD8H-mCD28M-mCD79aE#ab-1
PSMA构建体CD79b：pmRNA_d7_13_抗hPSMA(XENP14484)scFv-mCD8H-mCD28M-mCD79bE#ac-1
实例14-表达PSMA特异性CAR的同种异体B细胞减少CT26-PSMA肿瘤中的肿瘤生长
小鼠肿瘤模型：使用工程化以表达人PSMA的BALB/c CT26-PSMA肿瘤模型来评估PSMA特异性CAR工程化的同种异体鼠类B细胞对肿瘤体积和存活率的功效。向八周龄BALB/c小鼠的一个后胁腹注射体积为50μl的1.0x106个CT26-PSMA肿瘤细胞。在第5天，当肿瘤体积达到大约70mm3时，将小鼠平均分配到3个组，每组10只小鼠。在第6天开始使用用编码PSMA特异性CAR的mRNA工程化的自体鼠类B细胞和编码CCR7的mRNA或用编码在100μl或盐水中以1.5x106个细胞的剂量静脉内施用的PSMA特异性CAR的mRNA工程化的同种异体鼠类B细胞对小鼠进行处理。在第5天、第8天和第10天用卡尺测量肿瘤体积。在第10天，相对于盐水，在同种异体和自体工程化的B细胞组中存在51％的统计学上显著的肿瘤减少(图15)。(p<0.005)。
鼠类B细胞的工程化：通过70微米尼龙细胞滤网借助于手动细胞分离从自体BALB/c和同种异体C57Bl/6供体脾脏中分离小鼠脾细胞。然后使用EasySep小鼠B细胞分离试剂盒(干细胞技术公司，目录号19854)通过免疫磁性阴性选择从脾细胞中分离B细胞。将B细胞在具有抗CD40(250ng/ml)的生长培养基(RPMI、10％FBS、25mM HEPES、1％Pen/Strep、5ng/ml重组小鼠IL-4、100μMβ-巯基乙醇)中刺激24小时。然后使用设置为280V的BTX AgilePulse电穿孔系统，用20ug CAR mRNA构建体/3.6x106个B细胞对细胞进行电穿孔，持续1毫秒。将细胞洗涤，并且以15x106个B细胞/ml的浓度重悬于PBS中。每剂量使用100μl细胞悬浮液。
实例15-PSMA-CAR工程化的B细胞的抗肿瘤活性依赖于完整的宿主免疫系统
小鼠肿瘤模型：在WT和免疫受损的NSG小鼠中研究抗肿瘤PSMA-CAR B细胞的作用。
WT小鼠：使用工程化以表达人PSMA的BALB/c CT26-PSMA肿瘤模型来评估PSMA特异性CAR工程化的鼠类B细胞对WT小鼠的肿瘤体积和生存率的功效。向八周龄BALB/c小鼠的一个后胁腹注射体积为50μl的1.0x106个CT26-PSMA肿瘤细胞。在第5天，当肿瘤体积达到大约60mm3时，将小鼠平均分配到4个组，每组10只小鼠。在第6天开始使用用编码两种不同的PSMA特异性CAR形式的mRNA工程化的鼠类B细胞或在第6天在100μl或盐水中以1.5x106个细胞的剂量静脉内施用的未经工程化的B细胞对小鼠进行处理。在第5天、第9天、第11天和第13天用卡尺测量肿瘤体积。在第13天，相对于盐水，在PSMA-CAR组(形式79a)中存在57％的统计学上显著的肿瘤减少。在第13天，相对于盐水，在PSMA-CAR处理组(形式79b)或未经工程化的B细胞中肿瘤体积没有显著减少(图14)。
NSG小鼠:使用工程化以表达人PSMA的BALB/c CT26-PSMA肿瘤模型来评估PSMA特异性CAR工程化的鼠类B细胞对免疫受损的小鼠的肿瘤体积和生存率的功效。向八周龄NSG小鼠的一个后胁腹注射体积为50μl的1.0x106个CT26-PSMA肿瘤细胞。在第5天，当肿瘤体积达到大约60mm3时，将小鼠平均分配到2个组，每组10只小鼠。在第6天开始使用用编码在第6天在100μl或盐水中以1.5x106个细胞的剂量静脉内施用的PSMA特异性CAR形式的mRNA工程化的鼠类B细胞对小鼠进行处理。在第5天、第8天、第10天和第13天用卡尺测量肿瘤体积。在第13天，相对于盐水，在PSMA-CAR组(形式79a)中肿瘤体积没有显著减少(图16B)。
鼠类B细胞的工程化：通过70微米尼龙细胞滤网借助于手动细胞分离从自体BALB/c和同种异体C57Bl/6供体脾脏中分离小鼠脾细胞。然后使用EasySep小鼠B细胞分离试剂盒(干细胞技术公司，目录号19854)通过免疫磁性阴性选择从脾细胞中分离B细胞。将B细胞在具有抗CD40(250ng/ml)的生长培养基(RPMI、10％FBS、25mM HEPES、1％Pen/Strep、5ng/ml重组小鼠IL-4、100μMβ-巯基乙醇)中刺激24小时。然后使用设置为280V的BTX AgilePulse电穿孔系统，用20ug CAR mRNA构建体/3.6x106个B细胞对细胞进行电穿孔，持续1毫秒。将细胞洗涤，并且以15x106个B细胞/ml的浓度重悬于PBS中。每剂量使用100μl细胞悬浮液。
PSMA构建体CD79a：pmRNA_d7_13_抗hPSMA(XENP14484)scFv-mCD8H-mCD28M-mCD79aE#ab-1
PSMA构建体CD79b：pmRNA_d7_13_抗hPSMA(XENP14484)scFv-mCD8H-mCD28M-mCD79bE#ac-1
实例16-表达GPC3特异性CAR的B细胞减少HEPA 1-6 GPC3肿瘤中的肿瘤生长
小鼠肿瘤模型：使用工程化以表达人GPC3的C57Bl/6HEPA 1-6肿瘤模型(HEPA1-6-GPC3)来评估鼠类B细胞对肿瘤体积和存活率的功效。向八周龄C57Bl/6小鼠的一个后胁腹注射体积为200μl的5.0x106个HEPA 1-6-GPC3肿瘤细胞。在第19天，当肿瘤体积达到大约250mm3时，将小鼠平均分配到3个组，每组10只小鼠。在第20天开始使用用编码在第20天和第27天在100μl或盐水中以1.5x106个细胞的剂量静脉内施用的GPC3特异性CAR或PSMA特异性CAR的mRNA工程化的鼠类B细胞对小鼠进行处理。在第19天、第23天、第26天和第30天用卡尺测量肿瘤体积。在第30天，相对于盐水，在GPC3-CAR组中存在68％的统计学上显著的肿瘤减少。在第30天，相对于盐水，在PSMA-CAR处理组中肿瘤体积没有显著减少。(注：本研究于2021年1月19日仍在进行中)(图17)。
鼠类B细胞的工程化：通过70微米尼龙细胞滤网借助于手动细胞分离从C57Bl/6供体脾脏中分离小鼠脾细胞。然后使用EasySep小鼠B细胞分离试剂盒(干细胞技术公司，目录号19854)通过免疫磁性阴性选择从脾细胞中分离B细胞。将B细胞在具有抗CD40(250ng/ml)的生长培养基(RPMI、10％FBS、25mM HEPES、1％Pen/Strep、5ng/ml重组小鼠IL-4、100μMβ-巯基乙醇)中刺激24小时。然后使用设置为280V的BTX AgilePulse电穿孔系统，用20μg CARmRNA构建体/3.6x106个B细胞对细胞进行电穿孔，持续1毫秒。将细胞洗涤，并且以15x106个B细胞/ml的浓度重悬于PBS中。每剂量使用100μl细胞悬浮液。
GPC3 mRNA构建体：pmRNA_d7_13_抗hGPC3 scFv-mCD8H-mCD28M-mCD79aE#15-1
PSMA构建体：pmRNA_d7_13_抗hPSMA(XENP14484)scFv-mCD8H-mCD28M-mCD79aE#ab-1
实例17-多聚化GPC3可以以剂量响应方式在表达GPC3 CAR的细胞中激活荧光素酶的NFκB表达
CAR-B构建体设计：使用三种基本形式来设计五种CAR-B构建体：(i)CAR 2(scFv、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域(参见图XA))；(ii)CAR 3(具有以下中的每一种中的2种的多聚化受体复合物：scFv、铰链结构域、FC结构域、跨膜结构域和胞质尾(参见图XB))；(iii)CAR 4(具有以下中的每一种中的2种的多聚化受体复合物：FAB结构域、铰链结构域、FC结构域、跨膜结构域和胞质尾(参见图XC))。五种CAR-B构建体如下：
表12
Figure BDA0003918100700001191
NFκΒ报告基因测定：抗原诱导的信号传导。用编码以上列出的CAR-B构建体之一的mRNA转导Ramos NFκB-荧光素酶报告细胞。用含10μg RNA的200μL电穿孔缓冲液在280V和1毫秒下转染Ramos NFκB-荧光素酶报告细胞，随后在生长培养基中培养过夜。将细胞在室温下放置4小时，以使细胞静止以便减少背景。将30,000个经转染的细胞以30μL/孔的体积转移到多孔板中的每个孔中。然后将经转染的Ramos细胞与用链霉亲和素、链霉亲和素对照或GPC3-Fc蛋白多聚化的GPC3蛋白在生长培养基中温育3小时。向每个孔中添加30μL的Bioglo底物(普洛麦格公司(Promega))，并且使用光度计在5分钟内读取板。如图18所示，多聚化的GPC3能够在表达除了pWF-509(GPC3-CD79b)之外的四种GPC3 CAR-B中的三种的细胞中激活荧光素酶的NFκB表达。所有四种构建体在FACS测定中显示出与GPC3的良好结合。因此，CD79b是具有良好结合亲和力的CAR不发出信号的实例。
NFκΒ报告基因测定：强直性信号传导。还使用NFκΒ报告基因测定评估强直性信号传导。产生CAR构建体，其在不存在同源抗原结合的情况下诱导升高的强直性信号传导。图19示出了四种CAR-B构建体在人B细胞报告细胞系中表达，并且在不存在同源靶抗原的情况下测量NFκΒ荧光素酶活性。每种构建体显示出显著的强直性信号传导活性。具有强直性信号传导CAR B的经工程化的B细胞在体内保持高数量，并且导致替代因子或其它有效载荷的高且持久的表达。
实例18-CD80有效载荷增强抗GPC3CAR-CD79a B细胞的抗肿瘤活性
实验设计：同基因C57Bl/6小鼠HEPA1-6GPC3肿瘤是被工程化以表达人GPC3的人HCC的模型。此模型用于评估用抗GPC3CAR-CD79a和CD80有效载荷mRNA电穿孔的鼠类B细胞的功效。在基质胶中向小鼠的一个后胁腹注射体积为200ul的5.0X106个HEPA1-6GPC3肿瘤细胞。在第11天、第14天和第17天，向小鼠施用200ul IV剂量的1.5x106个B细胞、用抗GPC3CAR-CD79a工程化的B细胞、用抗GPC3CAR-CD79a和CD80工程化的B细胞或盐水，如图20所指示的。用如下所述的mRNA对B细胞进行工程化。在多天内监测肿瘤体积，如图20所指示的。
在图20中，在第44天和在多个更早时间点，抗GPC3CAR-CD79a和抗GPC3CAR-CD79a加上CD80组合两者相对于盐水或未经工程化的B细胞显示出统计学上显著的作用。另外，到第44天，在盐水对照或B细胞对照组中没有完全应答，但抗GPC3CAR-CD79a和抗GPC3CAR-CD79a加上CD80组合分别产生4个和7个完全应答，如图21A-21C所指示。这些数据表明，包含CD80有效载荷作为mRNA增强了用抗原特异性GPC3 CAR共电穿孔的B细胞的抗肿瘤活性。
B细胞制备：通过70微米尼龙细胞滤网借助于机械细胞分离从C57Bl/6供体脾脏中分离小鼠脾细胞。然后使用EasySep小鼠B细胞分离试剂盒(干细胞技术公司，目录号19854)通过免疫磁性阴性选择从脾细胞中分离B细胞。将B细胞在具有250ng/ml CD40抗体(抗鼠类CD40 Ab)的生长培养基(RPMI、10％FBS、1％Pen/Strep、5ng/ml重组小鼠IL-4、100uMβ-巯基乙醇)中刺激24小时。然后使用设置为400V的BTX AgilePulse电穿孔系统，用20ug mRNA/1.0x107个B细胞对细胞进行电穿孔，持续1毫秒、2毫秒间隔5个脉冲。当对两种mRNA进行共转染时，使用20ug的每种mRNA。在电穿孔后立即将细胞在PBS中洗涤，并且以1.0x107/200ul的剂量制备进行IV施用。在电穿孔后90分钟内将经电穿孔的细胞施用于小鼠。
在电穿孔后十二小时，对小等分试样的细胞进行染色以表达抗GPC3CAR-CD79a和CD80表达。为了检测抗GPC3CAR-CD79a表达，使用GPC3-Avitag和链霉亲和素-BV421。用抗CD80-PE FACS抗体测量CD80表达。图22A-22C中的FACS绘图示出了电穿孔后GPC3 CAR的表达。CD80在未经工程化的B细胞中以基础水平表达，因此占约10％阳性。该水平保持在CAR样品中，但在CAR+CD80样品中急剧增加。后者表明CD80的有效表达。

Claims (150)

1.一种分离的经修饰的B细胞，其能够表达嵌合受体(CAR-B)，其中所述嵌合受体包括：
a)胞外结构域，其中所述胞外结构域包括胞外结合结构域和铰链结构域；
b)跨膜结构域；以及
c)胞质结构域，所述胞质结构域包括至少一个信号传导结构域。
2.根据权利要求1所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞外结合结构域识别在靶细胞的表面上表达的至少一种抗原或蛋白质。
3.根据权利要求1所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞外结合结构域识别至少一种抗原，所述至少一种抗原是分泌蛋白。
4.根据权利要求3所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述分泌蛋白积聚在胞外基质中。
5.根据权利要求2所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述靶细胞选自由以下组成的组：肿瘤细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、骨细胞、血细胞、神经细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、内皮细胞、肝细胞、肺上皮细胞和成纤维细胞。
6.根据权利要求1所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述B细胞表达多于一种CAR-B受体构建体。
7.根据权利要求1所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述CAR-B受体包括多于一个胞外结合结构域。
8.根据权利要求1所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞外结合结构域是单链可变片段(scFv)、或全长抗体或抗体片段、或受体或配体的胞外结构域。
9.根据权利要求1所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞外结合结构域能够与选自由以下组成的组的抗原或蛋白质结合：PSMA、GPC3、ASGR1、ASGR2、肌聚糖蛋白、Corin、FAP、MUC1、CEA153、JAM-1、LAF-1和Her2。
10.根据权利要求1所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述铰链结构域源自由以下组成的组：免疫球蛋白(例如，IgG、IgM)、CD28和CD8。
11.根据权利要求1所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞质结构域包括对于B细胞受体而言是天然的至少一个信号传导结构域。
12.根据权利要求1所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞质结构域包括至少一个信号传导结构域，所述至少一个信号传导结构域是免疫球蛋白。
13.根据权利要求1所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞质结构域包括选自由以下组成的组的结构域：CD79a(免疫球蛋白α)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、MyD88、CD21、Syk、FYN、LYN、PI3K、BTK、PLCγ2、CD3ζ和BLNK。
14.根据权利要求13所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞质结构域包括作为CD79a的结构域。
15.根据权利要求13所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞质结构域进一步包括共刺激结构域。
16.一种分离的经修饰的B细胞，其中所述B细胞能够表达和分泌有效载荷，其中所述有效载荷不在B细胞中天然表达或者以比在B细胞中天然表达的水平更高的水平表达。
17.根据权利要求16所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述有效载荷是抗体或其片段。
18.根据权利要求17所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述抗体是分泌抗体或其片段。
19.根据权利要求17所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述抗体是膜结合的。
20.根据权利要求16所述的经修饰的B细胞，其中所述有效载荷选自以下的组：细胞因子、趋化因子、T细胞共刺激分子和检查点分子，所述组由以下组成：IL-1、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IL-21、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、TSLP、CCL21、FLT3L、XCL1、LIGHT(TNFSF14)、OX40L、CD137L、CD40L、ICOSL、抗CD3抗体、CD47、TIM4-FC、CXCL13、CCL21、CD80、CD40L、IFNαA2、LIGHT、4-1BBL、MDGF(C19orf10)、FGF10、PDGF、集聚蛋白、TNF-α、GM-CSF、抗FAP抗体、抗TGF-β抗体；TGF-β陷阱、诱饵或其它抑制分子；抗BMP抗体；BMP陷阱、诱饵或其它抑制分子。
21.根据权利要求16所述的经修饰的B细胞，其中所述B细胞能够表达多于一个有效载荷。
22.根据权利要求16所述的经修饰的B细胞，其中所述B细胞能够表达多于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个有效载荷。
23.一种治疗患者的方法，所述方法包括施用根据权利要求14所述的经修饰的B细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其中瘤内、静脉内、皮下、皮内或在炎性病变内施用所述经修饰的B细胞。
25.根据权利要求23所述的方法，其进一步包括在使用或不使用另外的化疗剂的情况下施用一种或多种检查点抑制剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述检查点抑制剂能够抑制选自由以下组成的组的检查点分子：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3和NKG2A。
27.根据权利要求23所述的方法，其进一步包括施用T细胞共刺激分子。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述T细胞共刺激分子选自由以下组成的组：CD80、CD86、ICOSL、4-1BBL、OX40L、CD27和LIGHT。
29.一种分离的经修饰的B细胞，其能够表达嵌合受体，其中所述嵌合受体包括：
a)胞外结构域，其中所述胞外结构域包括胞外结合结构域和铰链结构域；
b)跨膜结构域；以及
c)胞质结构域，所述胞质结构域包括至少一个信号传导结构域，
其中所述经修饰的B细胞进一步能够表达有效载荷，其中所述有效载荷不在B细胞中天然表达。
30.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞外结合结构域识别在靶细胞的表面上表达的抗原或蛋白质。
31.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞外结合结构域识别分泌的抗原或蛋白质。
32.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述靶细胞选自由以下组成的组：肿瘤细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、骨细胞、血细胞、神经细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、内皮细胞、肝细胞、肺上皮细胞和成纤维细胞。
33.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述B细胞表达多于一种CAR-B受体构建体。
34.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述CAR-B受体包括多于一个胞外结合结构域。
35.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞外结合结构域是单链可变片段(scFv)、全长抗体、抗体片段、或受体或配体的胞外结构域。
36.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞外结合结构域能够与选自由以下组成的组的抗原或蛋白质结合：PSMA、GP3、ASGR1、ASGR2、肌聚糖蛋白、Corin以及Her2、FAP、MUC1、CEA153、JAM-1和LFA-1。
37.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述铰链结构域源自由以下组成的组：免疫球蛋白(例如，IgG或IgM)、CD28和CD8。
38.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞质结构域包括对于B细胞而言是天然的至少一个信号传导结构域。
39.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞质结构域包括至少一个信号传导结构域，所述至少一个信号传导结构域是免疫球蛋白。
40.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞质结构域包括选自由以下组成的组的结构域：CD79a(免疫球蛋白α)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、MyD88、CD21、Syk、FYN、LYN、PI3K、BTK、PLCγ2、CD3ζ和BLNK。
41.根据权利要求40所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞质结构域包括作为CD79a(免疫球蛋白α)的结构域。
42.根据权利要求41所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞质结构域进一步包括共刺激结构域。
43.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述有效载荷是分泌抗体或膜结合抗体或其片段。
44.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述有效载荷选自以下的组：细胞因子、趋化因子、T细胞共刺激分子和检查点分子，所述组由以下组成：IL-1、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IL-21、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、TSLP、CCL21、FLT3L、XCL1、LIGHT(TNFSF14)、OX40L、CD137L、CD40L、ICOSL、抗CD3抗体、CD47、TIM4-FC、CXCL13、CCL21、CD80、CD40L、IFNαA2、LIGHT、4-1BBL、MDGF(C19orf10)、FGF10、PDGF、集聚蛋白、TNF-α、GM-CSF、抗FAP抗体、抗TGF-β抗体；TGF-β陷阱、诱饵或其它抑制分子；抗BMP抗体；BMP陷阱、诱饵或其它抑制分子。
45.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述B细胞能够表达多于一个有效载荷。
46.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述B细胞能够表达多于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个有效载荷。
47.根据权利要求29所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述经修饰的B细胞进一步编码至少一种选自由以下组成的组的蛋白质：CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、CD3ζ和MyD88的胞质结构域。
48.一种治疗患者的方法，所述方法包括施用根据权利要求29所述的经修饰的B细胞。
49.根据权利要求48所述的方法，其进一步包括施用检查点抑制剂。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述检查点抑制剂能够抑制选自由以下组成的组的检查点分子：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3和NKG2A。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述检查点抑制剂是单克隆抗体。
52.一种分离的经修饰的B细胞，其能够表达嵌合受体，其中所述嵌合受体包括胞外结构域，其中所述胞外结构域包括铰链结构域和胞外结合结构域，其中所述胞外结合结构域不在B细胞上天然表达；并且其中所述胞外结合结构域能够识别所关注靶标。
53.根据权利要求52所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述结合结构域是单链可变片段(scFv)、全长抗体、抗体片段、配体或受体的胞外结构域。
54.根据权利要求53所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述结合结构域是scFv。
55.根据权利要求52所述的分离的经修饰的B细胞，其中在本文中所述B细胞能够表达多于一个嵌合受体。
56.根据权利要求52所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述B细胞进一步能够表达有效载荷。
57.一种治疗患者的方法，所述方法包括施用根据权利要求52所述的经修饰的B细胞。
58.一种能够表达嵌合B细胞受体的核酸，其中所述嵌合受体包括：
a)胞外结构域，其中所述胞外结构域包括胞外结合结构域和铰链结构域；
b)跨膜结构域；以及
c)胞质结构域，所述胞质结构域包括至少一个信号传导结构域。
59.根据权利要求58所述的核酸，其中所述胞外结合结构域识别在靶细胞的表面上表达的抗原或蛋白质。
60.根据权利要求58所述的核酸，其中所述胞外结合结构域识别作为分泌蛋白的抗原或蛋白质。
61.根据权利要求58所述的核酸，其中所述分泌蛋白积聚在胞外基质中。
62.根据权利要求58所述的核酸，其中所述胞外结合结构域是单链可变片段(scFv)、全长抗体、抗体片段、或受体或配体的胞外结构域。
63.根据权利要求58所述的核酸，其中所述靶细胞选自由以下组成的组：肿瘤细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、骨细胞、血细胞、神经细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、内皮细胞、肝细胞、肺上皮细胞或成纤维细胞。
64.根据权利要求58所述的核酸，其中所述载体表达多于一个CAR-B受体。
65.根据权利要求58所述的核酸，其中所述CAR-B受体表达多于一个胞外结合结构域。
66.根据权利要求58所述的核酸，其中所述胞外结合结构域能够与选自由以下组成的组的抗原或蛋白质结合：PSMA、GP3、ASGR1、AGSR2、肌聚糖蛋白、Corin、Her2、PAF1、MUC1、CEA153、JAM-1和LFA-1。
67.根据权利要求58所述的核酸，其中所述铰链结构域源自由以下组成的组：免疫球蛋白结构域(例如，IgG或IgM)、CD28和CD8。
68.根据权利要求58所述的核酸，其中所述胞质结构域包括对于B细胞受体而言是天然的至少一个信号传导结构域。
69.根据权利要求58所述的核酸，其中所述胞质结构域包括选自由以下组成的组的结构域：CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、MyD88、CD21、Syk、FYN、LYN、PI3K、BTK、PLCγ2、CD3ζ和BLNK。
70.根据权利要求69所述的核酸，其中所述胞质结构域包括作为CD79a(免疫球蛋白α)的结构域。
71.根据权利要求69所述的核酸，其中所述胞质结构域进一步包括共刺激结构域。
72.一种载体，其包括能够表达嵌合B细胞受体的核酸，其中所述嵌合受体包括：
a)胞外结构域，其中所述胞外结构域包括胞外结合结构域和铰链结构域；
b)跨膜结构域；以及
c)胞质结构域，所述胞质结构域包括至少一个信号传导结构域。
73.根据权利要求72所述的载体，其中所述胞外结合结构域识别在靶细胞的表面上表达的抗原或蛋白质。
74.根据权利要求72所述的载体，其中所述胞外结合结构域识别作为分泌蛋白的抗原或蛋白质。
75.根据权利要求72所述的载体，其中所述分泌蛋白积聚在胞外基质中。
76.根据权利要求72所述的载体，其中所述靶细胞选自由以下组成的组：肿瘤细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、骨细胞、血细胞、神经细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、内皮细胞、肝细胞、肺上皮细胞或成纤维细胞。
77.根据权利要求72所述的载体，其中所述载体表达多于一个CAR-B受体。
78.根据权利要求72所述的载体，其中所述CAR-B表达多于一个胞外结合结构域。
79.根据权利要求72所述的载体，其中所述胞外结合结构域是单链可变片段(scFv)、全长抗体、抗体片段、受体或配体的胞外结构域。
80.根据权利要求72所述的载体，其中所述胞外结合结构域能够与选自由以下组成的组的抗原或蛋白质结合：PSMA、GPC3、ASGR1、AGSR2、肌聚糖蛋白、Corin、Her2、PAF1、MUC1、CEA153、JAM-1和LFA-1。
81.根据权利要求72所述的载体，其中所述铰链结构域源自由以下组成的组：免疫球蛋白结构域(例如，IgG或IgM)、CD28和CD8。
82.根据权利要求72所述的载体，其中所述胞质结构域包括对于B细胞而言是天然的至少一个信号传导结构域。
83.根据权利要求72所述的载体，其中所述胞质结构域包括选自由以下组成的组的信号传导结构域：CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、MyD88、CD21、Syk、FYN、LYN、PI3K、BTK、PLCγ2、CD3ζ和BLNK。
84.根据权利要求72所述的载体，其中所述胞质结构域进一步包括共刺激结构域。
85.一种分离的经修饰的B细胞，其能够表达整联蛋白、归巢抗体、蛋白质、受体或其组合，其中所述整联蛋白、归巢抗体、蛋白质或受体不在B细胞中天然表达或者以比在B细胞中天然表达的水平更高的水平表达；并且其中所述整联蛋白、归巢抗体、蛋白质、受体或其组合被吸引到所关注位点或靶标。
86.根据权利要求85所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述整联蛋白、归巢抗体、蛋白质和受体选自CLA(PSGL-1糖型)、CLA(PSGL-1糖型)、CCR10、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR9、CD43E、CD44、c-Met、CXCR3、CXCR4、LFA-1、LFA-1(αLβ2)、选择蛋白配体、VLA-4、VLA-4(α4β1)和α4β7或其组合。
87.根据权利要求86所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述所关注位点是归巢组织或靶组织、特定位置或组织中的炎性位点、或肿瘤或肿瘤微环境，其中有效载荷的递送是令人期望的。
88.根据权利要求87所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述归巢组织或靶组织选自皮肤、肠道(肠、结肠、肠系膜淋巴结(mLN)、派伊尔结(Peyer's Patch，PP)、小肠)、肝脏、肺、骨髓、心脏、外周淋巴结(LN)、CNS、胸腺和骨髓。
89.根据权利要求88所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述所关注靶标选自CXCL16、CCL17、CCL17(22)、CCL20(MIP-3α)、CCL21、CCL25、CCL27、CCL28、CCL4、CCL5、CD62E、CD62P、CXCL10、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CXCL9/CXCL10、CXCR3、E/P选择蛋白、E选择蛋白、GPR15L、HGF、透明质酸盐、ICAM-1、CCR1、2、5的配体、MAdCAM、MAdCAM-1、PNAd、VAP-1、VCAM和VCAM-1或其组合。
90.一种治疗患者的方法，所述方法包括施用权利要求82的分离的经修饰的B细胞。
91.根据权利要求90所述的方法，其进一步包括施用化合物或其衍生物，其中所述化合物或其衍生物能够调节整联蛋白、归巢抗体、蛋白质和受体或其组合的表达。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述化合物或其衍生物能够改变B细胞到所述患者体内的所关注位点或靶标的转运。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述化合物是全反式视黄酸(ATRA)或其衍生物。
94.一种分离的经修饰的B细胞，其能够表达免疫抑制分子，其中所述免疫抑制分子不在B细胞中天然表达或者以比在B细胞中天然表达的水平更高的水平表达。
95.根据权利要求94所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述免疫抑制分子选自IL-10、TGF-β、PD-L1、PD-L2、LAG-3和TIM-3或其组合。
96.根据权利要求95所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述免疫抑制分子能够减少B细胞在患者体内的所关注位点或靶标处的炎症和自身免疫活性。
97.一种治疗患者的方法，所述方法包括施用根据权利要求94所述的分离的经修饰的B细胞。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述免疫抑制分子选自IL-10、TGF-β、PD-L1、PD-L2、LAG-3和TIM-3或其组合。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述免疫抑制分子能够减少B细胞在所述患者体内的所关注位点或靶标处的炎症和自身免疫活性。
100.根据权利要求99所述的方法，其进一步包括施用化合物或其衍生物，所述化合物或其衍生物能够增加整联蛋白、归巢抗体、蛋白质、受体或其组合在所述B细胞中的表达。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述化合物或其衍生物能够改变B细胞到所述患者体内的所关注位点或靶标的转运。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述化合物是全反式视黄酸(ATRA)或其衍生物。
103.一种分离的经修饰的B细胞，其中所述分离的经修饰的B细胞用化合物或其衍生物处理，其中所述化合物或其衍生物能够增加整联蛋白、归巢抗体、蛋白质、受体或其组合在B细胞中的表达。
104.根据权利要求103所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述化合物或其衍生物能够改变B细胞到所述患者体内的所关注位点或靶标的转运。
105.根据权利要求104所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述化合物是全反式视黄酸(ATRA)或其衍生物。
106.一种治疗患者的方法，所述方法包括施用权利要求100的分离的经修饰的B细胞，其中所述化合物或其衍生物能够(i)调节整联蛋白、归巢抗体、蛋白质、受体或其组合在B细胞中的表达并且(ii)改变B细胞到所述患者体内的所关注位点或靶标的转运。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述化合物是全反式视黄酸(ATRA)或其衍生物。
108.一种分离的经修饰的B细胞，其能够表达组成型活性Toll样受体(TLR)中的至少一种或多种组成型活性TLR，其中所述TLR不在B细胞中天然表达或者以比在B细胞中天然表达的水平更高的水平表达。
109.根据权利要求108所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述TLR选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13或其组合。
110.根据权利要求109所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述TLR能够增强B细胞以增加患者体内的免疫应答。
111.根据权利要求110所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述TLR能够产生有效的效应B细胞以增加患者体内的免疫应答。
112.一种治疗患者的方法，所述方法包括施用根据权利要求108所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述免疫抑制分子能够减少B细胞在患者体内的所关注位点或靶标处的炎症和自身免疫活性。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述TLR选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13或其组合。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述TLR能够(i)增强B细胞并且(ii)产生有效的效应B细胞以增加患者体内的免疫应答。
115.根据权利要求114所述的方法，其进一步包括向所述患者施用TLR激动剂中的至少一种或多种TLR激动剂。
116.一种分离的经修饰的B细胞，其中所述分离的经修饰的B细胞用TLR激动剂中的至少一种或多种TLR激动剂处理。
117.根据权利要求116所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述TLR激动剂能够(i)增强B细胞并且(ii)产生有效的效应B细胞以增加患者体内的免疫应答。
118.根据权利要求117所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述TLR激动剂与一种或多种选自以下的TLR结合：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13或其组合。
119.根据权利要求118所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述TLR激动剂选自富含CpG的寡核苷酸、双链RNA模拟物、聚肌苷酸:聚胞苷酸(poly-I:C)。
120.根据权利要求119所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述TLR激动剂包括CpG寡核苷酸。
121.一种治疗患者的方法，所述方法包括施用根据权利要求116所述的分离的经修饰的B细胞。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述TLR激动剂能够(i)增强B细胞并且(ii)产生有效的效应B细胞以增加所述患者体内的免疫应答。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述TLR激动剂与一种或多种选自以下的TLR结合：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13或其组合。
124.根据权利要求123所述的方法，其中所述TLR激动剂选自富含CpG的寡核苷酸、双链RNA模拟物、聚肌苷酸:聚胞苷酸(poly-I:C)。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述TLR激动剂包括CpG寡核苷酸。
126.一种分离的经修饰的B细胞，其中所述B细胞用mRNA电穿孔，所述mRNA编码与靶向信号融合的抗原中的至少一种或多种抗原。
127.根据权利要求126所述的分离的经修饰的B细胞，其中(i)所述抗原不是由B细胞天然呈递的；(ii)所述抗原不是由B细胞同时在HLA I类分子和II类分子两者中天然呈递的；或者(iii)所述抗原不是由B细胞以高效率在HLAI类分子和II类分子两者中天然呈递的。
128.根据权利要求127所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述靶向信号是溶酶体蛋白的靶向信号。
129.根据权利要求128所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述靶向信号是溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP1)的靶向信号。
130.根据权利要求129所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述抗原能够靶向溶酶体并且在HLA I类分子和II类分子两者中同时且有效地呈递。
131.根据权利要求130所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述B细胞能够增加患者体内的抗原特异性免疫应答。
132.一种治疗患者的方法，所述方法包括施用根据权利要求126所述的分离的经修饰的B细胞。
133.根据权利要求132所述的方法，其中(i)所述抗原不是由B细胞天然呈递的；(ii)所述抗原不是由B细胞同时由HLA I类分子和II类分子两者天然呈递的；或者(iii)所述抗原不是由B细胞以高效率由HLAI类分子和II类分子两者天然呈递的。
134.根据权利要求133所述的方法，其中所述靶向信号是溶酶体蛋白的靶向信号。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述靶向信号是溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP1)的靶向信号。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述抗原能够靶向溶酶体并且在HLA I类分子和II类分子两者中同时且有效地呈递。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述B细胞能够增加所述患者体内的抗原特异性免疫应答。
138.根据权利要求132至137中任一项所述的方法，其中所述患者用多于一种经不同修饰的B细胞治疗。
139.根据权利要求132至137中任一项所述的方法，其中所述患者用多于两种经不同修饰的B细胞治疗。
140.一种分离的经修饰的B细胞，其能够表达嵌合受体(CAR-B)，其中所述嵌合受体包括：
a)胞外结构域，其中所述胞外结构域包括胞外结合结构域和铰链结构域；
b)跨膜结构域；以及
c)胞质结构域。
141.根据权利要求140所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞外结构域包括免疫球蛋白结构域。
142.根据权利要求140所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述嵌合受体能够形成同源二聚体。
143.根据权利要求140所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞外结合结构域识别在靶细胞的表面上表达的抗原或蛋白质。
144.根据权利要求143所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞外结合结构域识别分泌的抗原或蛋白质。
145.根据权利要求143所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述靶细胞选自由以下组成的组：肿瘤细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、骨细胞、血细胞、神经细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、内皮细胞、肝细胞、肺上皮细胞和成纤维细胞。
146.根据权利要求143所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞外结合结构域是单链可变片段(scFv)、全长抗体、抗体片段、或受体或配体的胞外结构域。
147.根据权利要求143所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述胞外结合结构域能够与选自由以下组成的组的抗原或蛋白质结合：PSMA、GP3、ASGR1、ASGR2、肌聚糖蛋白、Corin以及Her2、FAP、MUC1、CEA153、JAM-1和LFA-1。
148.根据权利要求14所述的分离的经修饰的B细胞，其中所述铰链结构域源自由以下组成的组：免疫球蛋白(例如，IgG或IgM)、CD28和CD8。
149.一种分离的经修饰的B细胞，其能够表达嵌合受体(CAR-B)，其中所述嵌合受体包括氨基酸序列SEQ ID NO:146。
150.一种分离的经修饰的B细胞，其能够表达嵌合受体(CAR-B)，其中所述嵌合受体包括氨基酸序列SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144或两者。
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