CN115551565A - 高强度胶原组合物及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有大约0.005 mm至大约3 mm的厚度和高强度(例如大约0.5 MPa至大约200 MPa的高弹性模量)的工程化胶原支架。该工程化胶原支架可以是不可收缩的和/或不可扩张的。本公开还涉及使用这些胶原支架的方法。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求根据35 U.S.C.§119(e)的2020年3月31日提交的美国临时申请序列号63/002,644的优先权，其全部公开内容经此引用并入本文。
技术领域
本发明涉及具有大约0.005 mm至大约3 mm的厚度并具有高强度(例如大约0.5MPa至大约200 MPa的高弹性模量)的工程化胶原支架(engineered collagen scaffolds)。该工程化胶原支架可以是不可收缩(non-collapsible)和/或不可扩张的(non-expandable)。本公开还涉及使用这些胶原支架的方法。
背景与概述
替换、恢复或再生患者中的受损或功能失调组织的能力代表医学上的一项巨大挑战。所有组织和器官的一种重要组分是细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，其代表活细胞在其中分布和组织的非生命物质。该ECM提供了不仅决定组织的机械性质还在三维上支持细胞的物理支撑。此外，该ECM充当细胞行为的关键调节剂，通过基本的生物化学和生物力学信号转导(signaling)通知细胞。鉴于ECM对整体组织结构和功能的重要性，组织工程与再生医学工作的重点是开发重建 ECM支架以改善组织修复、恢复和再生结果的材料。
胶原是ECM和身体中最丰富的蛋白质，在其中其充当组织的结构与机械性质的主要决定因素。在体内，胶原由细胞作为单个分子产生，由三条多肽链组成。单独的胶原分子(也称为原胶原)具有两端被更随机组织的端肽封端的中心三螺旋结构域。由于在体内单独的胶原分子(单体)经历分级自组装以形成聚合物材料(例如ECM 的不溶性原纤维基质(fibrillar matrices))，所以胶原不仅是一种蛋白质，还是一种聚合物。在体内合成与组装的过程中，这些聚合胶原材料通过形成天然的分子内和分子间交联而进一步稳定，这有助于提供机械强度和控制胶原转换(即胶原降解和合成之间的平衡)。由于其作为ECM的结构和细胞信号转导元件的双重作用，所以胶原一直是研究和临床环境二者中的优选生物材料。其在体内的高可用性、跨组织和物种的保护、通过蛋白水解酶(例如基质金属蛋白酶)降解为副产物的预测降解性以及高生物相容性也使其非常适合组织工程和再生医学应用。
迄今为止，本领域中已知的工程化胶原支架通常由称为末端胶原(telocollagen)和去端肽胶原(atelocollagen)的胶原单体制成。末端胶原代表全长原胶原分子，其通常经由酸提取从组织中分离出来。去端肽胶原代表天然原胶原分子的修饰版本，其中端肽末端已经在蛋白质分离和纯化过程中被酶促切割。这些用于制备胶原材料的胶原单体的缺点是公认的，并且包括纯度和聚合能力方面显著的批次间差异、长聚合时间(通常大于30分钟)、形成的聚合物材料的稳定性和机械完整性差、以及形成的聚合物材料在体外和体内的快速蛋白水解降解。由末端胶原和去端肽胶原形成的胶原材料的不稳定性导致需要附加的材料加工策略以改善材料刚度(弹性模量)和强度以及抗蛋白水解降解性。这些材料加工策略主要使用经由物理和化学手段的外源交联或与其它材料共聚。虽然此类策略在改善胶原材料的机械性质与稳定性方面取得了不同程度的成功，但已知它们对胶原的固有生物信号转导能力具有有害影响，导致不良组织响应(tissue responses)，包括炎症(inflammatory)和异物反应(foreign body reactions)。此外，由末端胶原和去端肽胶原制备的材料的可实现密度受到限制，且远低于体内结缔组织中发现的胶原密度(浓度)。这一观察结果至关重要，因为胶原材料的物理特征(包括支架刚度和胶原密度)已经显示直接影响基本的细胞行为，包括在组织修复和再生过程中发生的增殖、迁移和分化过程。
因此，需要在不使用有害的外源加工或交联策略的情况下制得并接近天然胶原支架的体内结构和功能的高强度胶原支架，以在组织工程和再生医学领域提供优势。令人惊讶地，发明人已经开发了具有大约0.005 mm至大约3 mm的厚度并具有高强度(例如大约0.5MPa至大约200 MPa的高弹性模量)的工程化胶原支架。在一方面，这些胶原支架可以是不可收缩和/或不可扩张的，并且在强度方面类似于体内发现的高强度组织，例如心包膜、羊膜、心脏瓣膜等。此外，当临床用于组织替换和重建过程时，高强度性质有助于材料操作和应用。
与本领域中已知的那些相比，本公开的工程化胶原支架提供了若干优点。首先，与本领域中的那些相比，本公开的工程化胶原支架具有改善的机械性质。特别地，本公开的工程化胶原支架不是易碎的并具有改进的机械性质(例如大约0.5 MPa至大约200 MPa的高弹性模量)，而不采用已知对天然胶原生物信号转导和体内组织响应有害的外源交联和加工策略。此外，本公开的工程化胶原支架具有改善的抗降解性、缓慢的转换，并且本公开的工程化胶原支架不诱导炎症或异物反应。
在一个实施方案中，提供了不可收缩和/或不可扩张的工程化胶原支架。该胶原支架具有大约0.005 mm至大约3 mm的厚度和大约0.5 MPa至大约200 MPa的弹性模量。
在另一实施方案中，提供了治疗患者以再生、恢复或替换受损或功能失调的组织的方法。该方法包括将包含任何本文中描述的工程化胶原支架的医疗移植物植入患者体内。
还通过以下列举的条款描述了附加实施方案。还考虑了与背景与概述部分、说明性实施方案详述部分、实施例部分或本专利申请的权利要求中描述的任何适用实施方案结合的任何以下实施方案。
1．不可收缩和/或不可扩张的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.005mm至大约3 mm的厚度和大约0.5 MPa至大约200 MPa的弹性模量。
2．条款1的工程化胶原支架，其中在胶原支架被冻干和再水合时，该胶原支架不收缩。
3．条款1至2任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.01 mm至大约2.0 mm的厚度。
4．条款1至2任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.01 mm至大约1.0 mm的厚度。
5．条款1至2任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.01 mm至大约0.25 mm的厚度。
6．条款1至2任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.1 mm至大约1.0 mm的厚度。
7．条款1至2任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.5 mm至大约1.0 mm的厚度。
8．条款1至2任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.15 mm至大约0.25 mm的厚度。
9．条款1至8任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约18 MPa至大约200 MPa的弹性模量。
10．条款1至8任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约20 MPa至大约180 MPa的弹性模量。
11．条款1至8任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约40 MPa至大约120 MPa的弹性模量。
12．条款1至8任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约60 MPa至大约100 MPa的弹性模量。
13．条款1至8任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约80 MPa至大约180 MPa的弹性模量。
14．条款1至8任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.5 MPa至大约20 MPa的极限拉伸强度。
15．条款1至8任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约1 MPa至大约25MPa的极限拉伸强度。
16．条款1至15任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.2 MPa至大约20 MPa的极限拉伸强度。
17．条款1至15任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约5 MPa至大约15 MPa的极限拉伸强度。
18．条款1至15任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约2 MPa至大约20 MPa的极限拉伸强度。
19．条款1至18任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约5%至大约70%的破坏应变。
20．条款1至18任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约10%至大约40%的破坏应变。
21．条款1至20任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约2 N至大约8 N的缝线保留峰值负荷(suture retention peak load)。
22．条款1至20任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.2 N至大约2N的缝线保留峰值负荷。
23．条款1至20任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.1 N至大约4N的缝线保留峰值负荷。
24．条款1至23任一项的工程化胶原支架，其中该工程化胶原支架在组合物中，并且该组合物进一步包含流体。
25．条款24的工程化胶原支架，其中存在的流体的百分比为大约5%至大约99%。
26．条款24或25任一项的工程化胶原支架，其中通过冻干该组合物、真空压制该组合物、或通过干热交联处理(dehydrothermal treatment)或其组合来干燥该组合物。
27．条款1至26任一项的工程化胶原支架，其中该胶原是I型胶原。
28．条款1至27任一项的工程化胶原支架，其中该胶原是纯化的I型胶原。
29．条款1至28任一项的工程化胶原支架，其中该工程化胶原支架是医疗移植物。
30．条款1至29任一项的工程化胶原支架，其中该工程化胶原支架是医疗移植物，并且该医疗移植物用于再生、恢复或替换受损或功能失调的组织。
31．条款30的工程化胶原支架，其中该工程化胶原支架是用于再生或替换或恢复组织的医疗移植物，所述组织选自心包膜(pericardium)、心脏瓣膜(heart valve)、皮肤、血管、气道组织(airway tissue)、体壁(body wall)和肿瘤切除后重建的组织。
32．条款1至31任一项的工程化胶原支架，其中该工程化胶原支架最终灭菌或无菌地制备。
33．条款32的工程化胶原支架，其中该胶原支架通过选自戊二醛处理、γ辐射、电子束辐射或环氧乙烷处理的方法来最终灭菌。
34．条款1至33任一项的工程化胶原支架，其中该胶原包含低聚胶原、单体胶原、末端胶原或去端肽胶原或其组合。
35．条款1至34任一项的工程化胶原支架，其被压缩为限定的形状。
36．条款35的工程化胶原支架，其中该形状为球。
37．条款35的工程化胶原支架，其中该形状为管。
38．条款35的工程化胶原支架，其中该形状为片材。
39．条款35至38任一项的工程化胶原支架，其中该压缩是侧限压缩(confinedcompression)。
40．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约1000 mg/cm3。
41．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约900 mg/cm3。
42．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约800 mg/cm3。
43．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约700 mg/cm3。
44．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约600 mg/cm3。
45．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约500 mg/cm3。
46．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约400 mg/cm3。
47．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约300 mg/cm3。
48．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约200 mg/cm3。
49．条款1至48任一项的工程化胶原支架，其中该工程化胶原支架在植入患者体内时不诱导炎症或异物反应。
50．条款1至49任一项的工程化胶原支架，其中该胶原选自猪胶原、人胶原和牛胶原。
51．条款1至49任一项的工程化胶原支架，其中该胶原是合成胶原。
52．条款1至50任一项的工程化胶原支架，其中该胶原是天然胶原。
53．条款1至49任一项的工程化胶原支架，其中该胶原是重组胶原。
54．条款1至53任一项的工程化胶原支架，其进一步包含细胞。
55．条款54的工程化胶原支架，其中该细胞是干细胞。
56．治疗患者以再生、恢复或替换受损或功能失调的组织的方法，该方法包括将包含条款1至55任一项的工程化胶原支架的医疗移植物植入患者体内。
57．条款56的方法，其中该医疗移植物用于再生、恢复或替换受损或功能失调的心包膜。
58．条款56的方法，其中该医疗移植物用于再生、恢复或替换受损或功能失调的心脏瓣膜。
59．条款56的方法，其中该医疗移植物用于再生、恢复或替换受损或功能失调的皮肤。
60．条款59的方法，其中瓣膜组织是主动脉瓣膜组织或肺动脉瓣膜组织。
61．条款1至55任一项的工程化胶原支架或条款56至60任一项的方法，其中该工程化胶原支架是外源交联的。
62．条款61的工程化胶原支架或方法，其中该工程化胶原支架用戊二醛交联。
附图概述
图1A显示了腔室压缩装置和相关的致密化/脱水过程。圆筒形腔室由Delrin制成，底部固定有实心球形片。圆筒填充有液体胶原，其在37℃聚合以形成复合的低密度胶原基质，该基质由被间质液(interstitial fluid)包围的原纤维胶原的互连网络组成。图1B显示了实心底部可以移除并用多孔聚乙烯泡沫的薄球形片代替，该薄球形片用多孔底面固定。随后可以将多孔聚乙烯泡沫的薄球形片放置在胶原支架的顶面上。图1C显示了可以在灰色箭头的方向上将压缩载荷施加至上部聚乙烯泡沫，经由上下表面驱动流体从该胶原支架中排出(白色箭头)以产生水合的致密化的胶原支架。
图2A显示了注射器压缩装置和相关的致密化/脱水过程，其中复合胶原支架在注射器系统中在不锈钢网盘上方聚合。在聚合后，将一片Whatman滤纸和改进的柱塞放置在注射器内部以压缩该支架。图2B显示了在灰色箭头的方向上压缩柱塞以在两个方向上(白色箭头)驱动流体从胶原支架中排出以产生致密化的胶原支架。
图3A显示了使用配方3通过压缩脱水制备的代表性原型胶原支架(直径6.3厘米)的照片。图3B显示了使用配方4通过压缩脱水制备的代表性原型胶原支架(直径6.3厘米)的照片。
图4A显示了胶原支架的弹性模量。图4B显示了胶原支架的UTS。图4C显示了随胶原含量而变的破坏应变。
图5显示了原型胶原支架(直径6.3厘米)的图像，该原型胶原支架用500毫克总胶原含量制备并采用真空压制、随后在90℃干热交联(DHT)处理来加工。该胶原支架在磷酸盐缓冲盐水中再水合。
图6显示了在大鼠中皮下植入前的材料的照片，包括在不存在和存在戊二醛(GTA)处理的情况下的配方3和4的胶原支架以及戊二醛处理的心包膜(PC GTA)。
图7显示了在大鼠中皮下植入后60天的材料移出物(explants)的照片，包括在不存在和存在戊二醛(GTA)处理的情况下的配方3和4的胶原支架和戊二醛处理的心包膜(PCGTA)。
图8A和8B显示了经由对在大鼠中皮下植入后60天的材料移出物的大体观察确定的组织反应与组织整合的半定量得分(平均值±SD；n＝10)的总结。图8A显示了由3.5mg/ml低聚物胶原制备的未压缩样品(14mm厚)的结果，和图8B显示了以6毫米/分钟压缩后所得胶原片(2mm厚和大约24.5mg/ml)的结果。
图9显示了在不存在和存在戊二醛(GTA)处理的情况下皮肤移出物和相关胶原支架(配方3)的组织学横截面(苏木精&伊红染色)的低倍(上)和高倍(下)放大图像。
图10显示了在不存在和存在戊二醛(GTA)处理的情况下皮肤移出物和相关胶原支架(配方4)的组织学横截面(苏木精&伊红染色)的低倍(上)和高倍(下)放大图像。
图11显示了皮肤移出物和相关戊二醛处理的心包膜(PC GTA)的组织学横截面(苏木精&伊红染色)的低倍(上)和高倍(下)放大图像。
说明性实施方案详述
本文中描述的材料和医疗移植物包含工程化胶原支架，所述支架可以以水合形式或以能够水合的烘干(干燥)形式制备。二者均可用于受损或功能失调的组织(例如心包膜、皮肤、气道组织、体壁和肿瘤切除后重建的组织等)的手术修复、再生、恢复或重建，以及用于制造先进的再生组织替代物(例如心脏瓣膜，例如主动脉瓣膜和肺动脉瓣膜，以及血管移植物(vascular grafts))。本文中描述的胶原支架在体内植入后持续存在、恢复组织连续性并保持它们的物理完整性、并诱导宿主组织整合、细胞化和适合部位的组织再生，而不会诱导炎症或异物反应。在各种实施方案中，本文中描述的胶原支架包括高强度的、薄的、片状材料或各种形状的高强度、薄材料形式，其物理和机械性质类似于各种天然存在的高强度组织和常规胶原基材料。
就组织而言所用的术语"恢复"、"再生"、"替换"和"修复"分别是指在先前以组织缺失或缺陷为特征的患者的区域中重建组织存在以及是指该同一区域中组织的再生长。在一些实施方案中，恢复的和/或再生的和/或修复的组织可以反映被替换的原始组织的外观、结构和功能中的一种或多种。
在一方面，本文中描述的发明涉及具有大约0.005 mm至大约3 mm的厚度并具有高强度(例如大约0.5 MPa至大约200 MPa的高弹性模量)的工程化胶原支架。在一个实施方案中，该工程化胶原支架可以是不可收缩和/或不可扩张的。在另一方面，提供了使用这些胶原支架的方法。
在各个方面，该工程化胶原支架可具有大约0.005 mm至大约3 mm、大约0.01 mm至大约2.0 mm、大约0.01 mm至大约1.0 mm、大约0.01 mm至大约0.25 mm、大约0.1 mm至大约1.0 mm、大约0.5 mm至大约1.0 mm、或大约0.15 mm至大约0.25 mm的厚度。在其它实施方案中，该胶原支架可具有大约18 MPa至大约200 MPa、大约20 MPa至大约180 MPa、大约40 MPa至大约120 MPa、大约60 MPa至大约100 MPa、或大约80 MPa至大约180 MPa的弹性模量。在其它实施方案中，该胶原支架可具有大约0.5 MPa至大约20 MPa、大约1 MPa至大约25 MPa、大约0.2 MPa至大约20 MPa、大约5 MPa至大约15 MPa、或大约2 MPa至大约20 MPa的极限拉伸强度。在其它说明性实施方案中，该工程化胶原支架可具有大约5%至大约70%、或大约10%至大约40%的破坏应变。在其它方面，该工程化胶原支架可具有大约2 N至大约8 N、大约0.2N至大约2 N、或大约0.1 N至大约4 N的缝线保留峰值负荷。
在另一实施方案中，提供了不可收缩和/或不可扩张的工程化胶原支架。该胶原支架具有大约0.005 mm至大约3 mm的厚度和大约0.5 MPa至大约200 MPa的弹性模量。如本文中所用，术语"不可收缩"是指该胶原支架在从脱水状态转变为水合状态时保持厚度和其它几何性质。如本文中所用，术语"不可扩张"是指材料在冻干或再水合时不膨胀或溶胀。因此，在一个说明性实施方案中，本文中描述的胶原支架在该胶原支架被冻干和再水合时不收缩。在一方面，该胶原支架因其高弹性模量而是不可收缩和/或不可扩张的，该高弹性模量部分取决于该胶原支架中的原纤维密度以及亲水(保水)性质。
在又一实施方案中，提供了治疗患者以再生、恢复或替换受损或功能失调的组织的方法。该方法包括将包含任何本文中描述的工程化胶原支架的医疗移植物植入患者体内。如本文中所用，"医疗移植物"是指施用于患者的任何本文中描述的胶原材料。
还通过以下列举的条款描述了附加实施方案。对于本文中描述的所有实施方案，考虑实施方案的任何适用的组合。下面描述的实施方案的任何适用组合均被视为是根据本发明。下面描述的实施方案与背景与概述部分、说明性实施方案详述部分、实施例部分或本专利申请的权利要求中描述的实施方案的任何组合均被视为是本发明的一部分。
1．不可收缩和/或不可扩张的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.005mm至大约3 mm的厚度和大约0.5 MPa至大约200 MPa的弹性模量。
2．条款1的工程化胶原支架，其中在胶原支架被冻干和再水合时，该胶原支架不收缩。
3．条款1至2任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.01 mm至大约2.0 mm的厚度。
4．条款1至2任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.01 mm至大约1.0 mm的厚度。
5．条款1至2任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.01 mm至大约0.25 mm的厚度。
6．条款1至2任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.1 mm至大约1.0 mm的厚度。
7．条款1至2任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.5 mm至大约1.0 mm的厚度。
8．条款1至2任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.15 mm至大约0.25 mm的厚度。
9．条款1至8任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约18 MPa至大约200 MPa的弹性模量。
10．条款1至8任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约20 MPa至大约180 MPa的弹性模量。
11．条款1至8任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约40 MPa至大约120 MPa的弹性模量。
12．条款1至8任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约60 MPa至大约100 MPa的弹性模量。
13．条款1至8任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约80 MPa至大约180 MPa的弹性模量。
14．条款1至8任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.5 MPa至大约20 MPa的极限拉伸强度。
15．条款1至8任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约1 MPa至大约25MPa的极限拉伸强度。
16．条款1至15任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.2 MPa至大约20 MPa的极限拉伸强度。
17．条款1至15任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约5 MPa至大约15 MPa的极限拉伸强度。
18．条款1至15任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约2 MPa至大约20 MPa的极限拉伸强度。
19．条款1至18任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约5%至大约70%的破坏应变。
20．条款1至18任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约10%至大约40%的破坏应变。
21．条款1至20任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约2 N至大约8 N的缝线保留峰值负荷。
22．条款1至20任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.2 N至大约2N的缝线保留峰值负荷。
23．条款1至20任一项的工程化胶原支架，其中该胶原支架具有大约0.1 N至大约4N的缝线保留峰值负荷。
24．条款1至23任一项的工程化胶原支架，其中该工程化胶原支架在组合物中，并且该组合物进一步包含流体。
25．条款24的工程化胶原支架，其中存在的流体的百分比为大约5%至大约99%。
26．条款24或25任一项的工程化胶原支架，其中通过冻干该组合物、真空压制该组合物、或通过干热交联处理或其组合来干燥该组合物。
27．条款1至26任一项的工程化胶原支架，其中该胶原是I型胶原。
28．条款1至27任一项的工程化胶原支架，其中该胶原是纯化的I型胶原。
29．条款1至28任一项的工程化胶原支架，其中该工程化胶原支架是医疗移植物。
30．条款1至29任一项的工程化胶原支架，其中该工程化胶原支架是医疗移植物，并且该医疗移植物用于再生、恢复或替换受损或功能失调的组织。
31．条款30的工程化胶原支架，其中该工程化胶原支架是用于再生或替换或恢复组织的医疗移植物，所述组织选自心包膜、心脏瓣膜、皮肤、血管、气道组织、体壁和肿瘤切除后重建的组织。
32．条款1至31任一项的工程化胶原支架，其中该工程化胶原支架最终灭菌或无菌地制备。
33．条款32的工程化胶原支架，其中该胶原支架通过选自戊二醛处理、γ辐射、电子束辐射或环氧乙烷处理的方法来最终灭菌。
34．条款1至33任一项的工程化胶原支架，其中该胶原包含低聚胶原、单体胶原、末端胶原或去端肽胶原或其组合。
35．条款1至34任一项的工程化胶原支架，其被压缩为限定的形状。
36．条款35的工程化胶原支架，其中该形状为球。
37．条款35的工程化胶原支架，其中该形状为管。
38．条款35的工程化胶原支架，其中该形状为片材。
39．条款35至38任一项的工程化胶原支架，其中该压缩是侧限压缩。
40．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约1000 mg/cm3。
41．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约900 mg/cm3。
42．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约800 mg/cm3。
43．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约700 mg/cm3。
44．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约600 mg/cm3。
45．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约500 mg/cm3。
46．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约400 mg/cm3。
47．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约300 mg/cm3。
48．条款1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约200 mg/cm3。
49．条款1至48任一项的工程化胶原支架，其中该工程化胶原支架在植入患者体内时不诱导炎症或异物反应。
50．条款1至49任一项的工程化胶原支架，其中该胶原选自猪胶原、人胶原和牛胶原。
51．条款1至49任一项的工程化胶原支架，其中该胶原是合成胶原。
52．条款1至50任一项的工程化胶原支架，其中该胶原是天然胶原。
53．条款1至49任一项的工程化胶原支架，其中该胶原是重组胶原。
54．条款1至53任一项的工程化胶原支架，其进一步包含细胞。
55．条款54的工程化胶原支架，其中该细胞是干细胞。
56．治疗患者以再生、恢复或替换受损或功能失调的组织的方法，该方法包括将包含条款1至55任一项的工程化胶原支架的医疗移植物植入患者体内。
57．条款56的方法，其中该医疗移植物用于再生、恢复或替换受损或功能失调的心包膜。
58．条款56的方法，其中该医疗移植物用于再生、恢复或替换受损或功能失调的心脏瓣膜。
59．条款56的方法，其中该医疗移植物用于再生、恢复或替换受损或功能失调的皮肤。
60．条款59的方法，其中瓣膜组织是主动脉瓣膜组织或肺动脉瓣膜组织。
61．条款1至55任一项的工程化胶原支架或条款56至60任一项的方法，其中该工程化胶原支架是外源交联的。
62．条款61的工程化胶原支架或方法，其中该工程化胶原支架用戊二醛交联。
如本文中所述，"工程化胶原支架"或"胶原支架"可以是指可离体或在植入患者体内后合成以形成含胶原原纤维的支架或其它胶原结构或材料的胶原组合物。在一个实施方案中，聚合可以在受控条件下发生，其中所述受控条件包括但不限于pH、磷酸盐浓度、温度、缓冲液组成、离子强度、以及细胞外基质组分(例如胶原和非胶原分子，如果包含非胶原ECM组分的话)的组成和浓度。"工程化胶原支架"是非天然胶原支架，或是另一种非天然胶原结构或材料。
在一个实施方案中，本公开的工程化胶原支架使用压缩技术制得。如本文中所用，术语"压缩"是指在向胶原支架组合物施加力时尺寸减小或密度增加。例如，压缩可以通过各种施加力的方法实现，例如但不限于侧限压缩、可变压缩、物理压缩、离心、超速离心、蒸发或抽吸(aspiration)等。
在一个实施方案中，所述压缩是可变压缩。如本文中所用，短语"可变压缩"是指通过以非线性方式施加力来压缩胶原。
在又一实施方案中，所述压缩是物理压缩。如本文中所用，短语"物理压缩"是指通过物理手段施加力来压缩胶原。对于其中所述压缩是物理压缩的实施方案，所述物理压缩可以在包括可调节模具和压板的腔室中进行(参见例如图1)。通常，可以将胶原插入模具中并随后进行压缩。
此外，在各种实施方案中，物理压缩可以根据多孔压板在模具内的放置而变化。例如，所述模具可以是可调节的，使得多孔聚乙烯作为压板的一部分和/或沿着样品模具的壁或底部定位。在一些实施方案中，所述压缩是来自至少一个方向的物理力。在其它实施方案中，所述压缩是来自两个或更多个方向的物理力。在再其它实施方案中，所述压缩是来自三个或更多个方向的物理力。在一些实施方案中，所述压缩是来自四个或更多个方向的物理力。
在其它实施方案中，所述压缩是离心。在其它实施方案中，所述压缩是超速离心。在再其它实施方案中，所述压缩是蒸发。在一些实施方案中，所述压缩是抽吸。在某些实施方案中，所述抽吸是真空抽吸。
在本公开的一些实施方案中，所述胶原是从组织溶解的。例如，所述胶原可以通过使用酸溶胶原和限定的聚合条件来制备，控制这些条件以产生具有一系列受控组装动力学(例如半聚合期(polymerization half-time))、分子组成和原纤维微结构-机械性质的三维胶原支架，例如如美国专利申请号11/435,635(2007年11月22日公开，公开号2007-0269476A1)和11/903,326(2008年10月30日公开，公开号2008-0268052)中所述，其各自经此引用全文并入本文。在其它实施方案中，所述胶原是可聚合胶原。在又一实施方案中，所述胶原是I型胶原。在再一实施方案中，所述胶原是纯化的I型胶原。
在一些实施方案中，所述工程化胶原支架是医疗移植物。在其它实施方案中，所述工程化胶原支架可用于制造再生组织替代物。在其它实施方案中，所述工程化胶原支架可以在体外使用。例如，本公开的工程化胶原支架的体外使用可用于研究目的，例如细胞组织培养、药物发现和药物毒性测试。
在一些实施方案中，所述胶原是非天然胶原。如本文中所用，短语"非天然胶原"是指已从源组织移除的胶原。在一个实施方案中，从源组织移除的非天然胶原可以是天然胶原。在一方面，所述非天然胶原可以从组织源溶解。在其他实施方案中，所述胶原是合成胶原。在再其他实施方案中，所述胶原是重组胶原。
在一方面，可以使用非天然胶原或胶原组分并可获自许多来源(包括例如猪皮、人皮或牛皮)以构建本文中描述的胶原支架。可用作用于分离胶原或胶原组分以制造本文中描述的胶原支架的含胶原源材料的合适组织是温血脊椎动物的粘膜下层组织(submucosatissues)或任何其它含细胞外基质的组织。在美国专利号4,902,508、5,281,422和5,275,826(其各自经此引用并入本文)中描述了制备粘膜下层组织的合适方法。在另一实施方案中，可以使用除粘膜下层组织之外的含细胞外基质材料的组织来获得根据本文中描述的方法和支架的胶原。制备用于获得纯化的胶原或部分纯化的细胞外基质组分的其它细胞外基质材料衍生组织的方法是本领域技术人员已知的。例如参见美国专利号5,163,955(心包组织)；5,554,389(膀胱粘膜下层组织)；6,099,567(胃粘膜下层组织)；6,576,265(大体为细胞外基质组织)；6,793,939(肝基底膜组织)；和美国专利申请公布号US-2005-0019419-A1(肝基底膜组织)；和国际公开号WO 2001/45765(大体为细胞外基质组织)，其各自经此引用并入本文。在各种其它实施方案中，所述含胶原源材料可选自胎盘组织、卵巢组织、子宫组织、动物尾巴组织和皮肤组织。在一些实施方案中，所述胶原选自猪胶原、牛胶原和人胶原。任何合适的含细胞外基质的组织均可用作含胶原源材料以分离纯化的胶原或分离部分纯化的细胞外基质组分。
用于制备作为纯化的胶原或部分纯化的细胞外基质组分的来源的粘膜下层组织的一种说明性制备方法描述在美国专利号4,902,508中，其公开内容经此引用并入本文。在一个实施方案中，对例如优选从猪、羊或牛物种(但不排除其它物种)收获的脊椎动物肠节段采用纵向擦拭运动施以磨损以移除细胞，或通过低渗或高渗溶解来完成细胞去除。在一个实施方案中，在低渗条件下冲洗粘膜下层组织，例如在低渗条件下用水或盐水冲洗，并任选进行灭菌。在另一说明性实施方案中，此类组合物可以通过机械去除粘膜的管腔部分和外部肌肉层和/或用低渗或高渗洗涤液(例如用水或盐水)溶解定居细胞来制备。在这些实施方案中，在分离纯化的胶原或部分纯化的细胞外基质组分之前，所述粘膜下层组织可以以水合或脱水状态储存。在各个方面，所述粘膜下层组织可以包括任何层离实施方案，包括从温血脊椎动物的肌层和至少粘膜的管腔部分二者层离的粘膜下层。
在一些实施方案中，所述胶原是低聚胶原。与常规的单体胶原制剂(即末端胶原和去端肽胶原)不同，低聚物可代表具有羧基和氨基末端端肽完整体(telopeptide intact)的全长三螺旋胶原分子(即原胶原)的小聚集体，通过天然存在的分子间交联保持在一起。保留这些分子特征，包括羧基和氨基末端端肽区域以及相关的分子间交联，为这种生物聚合物及其形成的胶原材料提供了合意但不常见的性质。更具体地，低聚物保留了原纤维胶原蛋白固有的原纤维形成(自组装)能力。低聚胶原的存在可以通过提高组装速率和通过产生具有不同原纤维微结构和提高的机械完整性(例如刚度)的胶原组合物来增强自组装潜力。在一些实施方案中，所述胶原包含低聚胶原。在其它实施方案中，所述胶原基本由低聚胶原组成。在再其它实施方案中，所述胶原由低聚胶原组成。
在一些实施方案中，所述胶原是单体胶原。在一些实施方案中，所述胶原是去端肽胶原。如本文中所用，术语"去端肽胶原"是指在体外用胃蛋白酶或另一合适的蛋白酶或试剂处理以消除或大幅减少含有分子间交联位点的端肽区域的胶原。在其它实施方案中，所述单体胶原是末端胶原。如本文中所用，术语"末端胶原"是指保留其端肽末端的酸溶胶原。
在某些实施方案中，所述胶原包含低聚胶原和去端肽胶原。在其它实施方案中，所述胶原包含低聚胶原、单体胶原和去端肽胶原。低聚胶原、单体胶原和/或去端肽胶原的量可以在胶原支架组合物中配制以有利地最大化所述工程化胶原支架的刚度、强度、流体与物质传递、蛋白水解降解或相容性。
在任一本文中描述的实施方案中，所述工程化胶原支架可具有预定百分比的胶原低聚物。在各种实施方案中，胶原低聚物的预定百分比可以为大约0.5%至大约100%、大约30%至大约100%、大约40%至大约100%、大约50%至大约100%、大约60%至大约100%、大约70%至大约100%、大约80%至大约100%、大约90%至大约100%、大约95%至大约100%、或大约100%。在又一实施方案中，所述胶原低聚物获自富含胶原低聚物的含胶原源材料(例如猪皮)。
在任一本文中描述的实施方案中，所述工程化胶原支架可具有通过平均聚合物分子量(average polymer molecular weight, AMW)量化的低聚物含量。如本文中描述的那样，AMW的调制可以影响所述胶原支架的聚合动力学、原纤维微结构、分子性质和原纤维架构，例如原纤维间支化、孔隙尺寸和机械完整性(例如支架刚度)。在另一实施方案中，纯化的胶原的低聚物含量(通过平均聚合物分子量量化)与支架刚度呈正相关。
在一些实施方案中，所述胶原是热可逆胶原。如本文中所用，"热可逆胶原"是指能够响应4℃与37℃之间的温度调制或导致可逆的基质向溶液转变的任何其它温度之间的温度调制在溶液与基质相之间可逆地转变的胶原。
在一些实施方案中，所述胶原是还原胶原。如本文中所用，"还原胶原"是指在体外被还原以消除或大幅减少反应性醛的胶原。例如，可以通过用还原剂(例如硼氢化钠)处理胶原来体外还原胶原。
在一些实施方案中，所述胶原是低聚物260胶原。如本文中所用，"低聚物260胶原"是通过导致低聚物分离的程序(例如由猪皮)制得的胶原制剂，其中所述胶原制剂在分子量260处具有显著的条带，其中所述条带在相应的单体制剂中不显著或缺乏。所述条带的存在可以通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来确定。低聚物260胶原进一步描述在美国专利申请号13/192,276(2012年2月2日公开，公开号2012-0027732 A1)中，其经此引用并入本文。
在其它说明性实施方案中，本文中描述的工程化胶原支架可以使用交联剂例如戊二醛、碳二亚胺类、醛、赖氨酰氧化酶(lysl-oxidase)、N-羟基琥珀酰亚胺酯、酰亚胺酯、酰肼类和马来酰亚胺类等等或其组合来交联。在一方面，可以在所述工程化胶原支架中的胶原聚合之前、期间或之后添加所述交联剂。
存在于本公开的各种工程化胶原支架实施方案中的胶原的浓度可以不等。在一些实施方案中，所述胶原以大约50至大约1000 mg/cm3、大约50至大约900 mg/cm3、大约50至大约800 mg/cm3、大约50至大约700 mg/cm3、大约50至大约600 mg/cm3、大约50至大约500 mg/cm3、大约50至大约400 mg/cm3、大约50至大约300 mg/cm3、大约50至大约200 mg/cm3、大约100至大约1000 mg/cm3、大约100至大约900 mg/cm3、大约100至大约800 mg/cm3、大约100至大约700 mg/cm3、大约100至大约600 mg/cm3、大约100至大约500 mg/cm3、大约100至大约400 mg/cm3、大约100至大约300 mg/cm3、大约100至大约200 mg/cm3、大约200至大约1000mg/cm3、大约200至大约900 mg/cm3、大约200至大约800 mg/cm3、大约200至大约700 mg/cm3、大约200至大约600 mg/cm3、大约200至大约500 mg/cm3、大约200至大约400 mg/cm3、大约200至大约300 mg/cm3、大约300至大约1000 mg/cm3、大约300至大约900 mg/cm3、大约300至大约800 mg/cm3、大约300至大约700 mg/cm3、大约300至大约600 mg/cm3、大约300至大约500 mg/cm3、大约300至大约400 mg/cm3、大约400至大约1000 mg/cm3、大约400至大约900mg/cm3、大约400至大约800 mg/cm3、大约400至大约700 mg/cm3、大约400至大约600 mg/cm3、大约400至大约500 mg/cm3、大约500至大约1000 mg/cm3、大约500至大约900 mg/cm3、大约500至大约800 mg/cm3、大约500至大约700 mg/cm3、大约500至大约600 mg/cm3、大约50至大约2000 mg/cm3、或大约50至大约1500 mg/cm3的浓度存在于所述工程化胶原支架中。
在其它实施方案中，所述胶原可以以大约1mg/ml至大约50mg/ml、大约1mg/ml至大约40mg/ml、大约1mg/ml至大约30mg/ml、大约1mg/ml至大约20mg/ml、大约1mg/ml至大约15mg/ml、大约1mg/ml至大约12mg/ml、大约1mg/ml至大约10mg/ml、大约1mg/ml至大约9mg/ml、大约1mg/ml至大约8mg/ml、大约1mg/ml至大约7mg/ml、大约1mg/ml至大约6mg/ml、大约1mg/ml至大约5mg/ml、大约1mg/ml至大约4mg/ml、或大约1mg/ml至大约3mg/ml存在于用于聚合所述胶原以制造所述胶原支架的起始组合物中。
在一些实施方案中，所述胶原支架进一步包含聚合物。如本文中所用，术语"聚合物"是指由连接在一起的单独化学部分组成的分子，这些化学部分可以相同或不同，但优选相同。如本文中所用，术语"聚合物"是指端对端连接以形成线型分子的单独化学部分，以及以支化(例如"多臂"或"星形")结构的形式连接在一起的单独化学部分。在其它实施方案中，所述胶原支架进一步包含共聚物。如本文中所用，术语"共聚物"是指衍生自超过一种单体物类的聚合物，包括可通过两种单体物类共聚获得的共聚物、可以获自三种单体物类的那些("三元共聚物")、可以获自四种单体物类的那些("四元共聚物")等等。
在本公开的各个实施方案中，本文中描述的胶原支架可以在受控条件下聚合以获得特定的物理性质。例如，所述胶原支架可具有所需胶原原纤维密度、孔隙尺寸(原纤维-原纤维支化)、弹性模量、拉伸应变、拉伸应力、线性模量、压缩模量、极限拉伸强度、破坏应变、缝线保留峰值负荷、损耗模量、原纤维面积分数(fibril area fraction)、原纤维体积分数(fibril volume fraction)、胶原浓度、细胞接种密度、剪切储能模量(G'或弹性(类固体)行为)和相位角增量(phase angle delta)(δ或类流体(粘性)-固体(弹性)行为的量度；对于胡克固体，δ等于0o，对于牛顿流体，δ等于90o)。
如本文中所用，"模量"可以是弹性或线性模量(由使用常规机械测试方案获得的应力-应变曲线的线性区域的斜率来定义；即刚度)、压缩模量、损耗模量、或剪切储能模量(例如储能模量)。这些术语是本领域技术人员公知的。
如本文中所用，"原纤维体积分数"(即原纤维密度)定义为原纤维在三维上占据的总面积的百分比面积。
如本文中所用，拉伸或压缩应力"σ"是每单位面积承载的力，并由以下等式表示：
其中σ=应力，P=力，和A=横截面积。
力(P)产生与材料横截面正交(即垂直)的应力(例如如果应力倾向于拉长所述材料，其被称为拉伸应力，而如果应力倾向于缩短所述材料，其被称为压缩应力)。
如本文中所用，"应变"是指机械应变，其是机械应力导致的材料形变。应变常规定义为位移除以参考长度的比率。如本文中所用，"拉伸应变"是受到拉伸的材料的伸长率。
在任一本文中描述的实施方案中，所述胶原支架的原纤维体积分数可以为大约1%至大约60%。在各个实施方案中，所述胶原支架可含有具有特定特性的原纤维，例如，原纤维体积分数(即密度)为大约2%至大约90%、大约2%至大约80%、大约2%至大约70%、大约2%至大约60%、大约2%至大约50%、大约2%至大约40%、大约5%至大约60%、大约15%至大约60%、大约2%至大约30%、大约5%至大约30%、大约15%至大约30%、大约20%至大约30%、大约5%至大约90%、大约15%至大约90%、大约2%至大约80%、大约5%至大约80%、大约15%至大约80%、或大约20%至大约80%。
在任一本文中描述的说明性实施方案中，所述胶原支架可包含具有特定特性的原纤维，所述特定特性包括但不限于大约18 MPa至大约200 MPa、大约20 MPa至大约200 MPa、大约20 MPa至大约180 MPa、大约20 MPa至大约170 MPa、大约20 MPa至大约160 MPa、大约20 MPa至大约150 MPa、大约20 MPa至大约140 MPa、大约20 MPa至大约130 MPa、大约20MPa至大约120 MPa、大约20 MPa至大约110 MPa、大约20 MPa至大约100 MPa、大约20 MPa至大约90 MPa、大约20 MPa至大约80 MPa、大约20 MPa至大约70 MPa、大约20 MPa至大约60MPa、大约20 MPa至大约50 MPa、大约20 MPa至大约40 MPa、大约20 MPa至大约30 MPa、或大约20 MPa至大约25 MPa的模量(例如压缩模量、损耗模量、弹性模量或储能模量)。在其它实施方案中，所述胶原支架可具有大约0.5 MPa至大约200 MPa、大约0.5 MPa至大约190 MPa、大约0.5 MPa至大约180 MPa、大约0.5 MPa至大约170 MPa、大约0.5 MPa至大约160 MPa、大约0.5 MPa至大约150 MPa、大约0.5 MPa至大约140 MPa、大约0.5 MPa至大约130 MPa、大约0.5 MPa至大约120 MPa、大约0.5 MPa至大约110 MPa、大约0.5 MPa至大约105 MPa、大约0.5 MPa至大约100 MPa、大约0.5 MPa至大约90 MPa、大约0.5 MPa至大约80 MPa、大约0.5MPa至大约70 MPa、大约0.5 MPa至大约60 MPa、大约0.5 MPa至大约50 MPa、大约0.5 MPa至大约40 MPa、大约0.5 MPa至大约30 MPa、大约0.5 MPa至大约20 MPa、大约0.5 MPa至大约10 MPa、大约0.5 MPa至大约5 MPa、或大约0.5 MPa至大约1 MPa的弹性模量。
在任一本文中描述的实施方案中，所述胶原组合物可含有具有特定特性的原纤维，包括但不限于大约0°至大约12°、大约0°至大约5°、大约1°至大约5°、大约4°至大约12°、大约5°至大约7°、大约8°至大约10°、和大约5°至大约10°的相位角增量(δ)。
在各个方面，所述工程化胶原支架可具有大约0.005至大约3 mm、大约0.005至大约2 mm、大约0.005至大约1 mm、大约0.005至大约0.5 mm、大约0.01 mm至大约3.0 mm、大约0.01 mm至大约2.0 mm、大约0.01 mm至大约1.0 mm、大约0.01 mm至大约0.5 mm、大约0.01mm至大约0.25 mm、大约0.1 mm至大约1.0 mm、大约0.5 mm至大约1.0 mm、大约0.15 mm至大约0.25 mm、大约0.02 mm至大约0.2 mm、大约0.02 mm至大约0.15 mm、或大约0.02 mm至大约0.1 mm的厚度。
在其它实施方案中，所述胶原支架可具有大约0.5 MPa至大约20 MPa、大约1 MPa至大约25 MPa、大约0.2 MPa至大约20 MPa、大约5 MPa至大约15 MPa、大约2 MPa至大约20MPa、大约1 MPa至大约20 MPa、大约1 MPa至大约15 MPa、大约1 MPa至大约10 MPa、大约1MPa至大约5 MPa、大约1 MPa至大约4 MPa、大约1 MPa至大约3 MPa、大约1 MPa至大约2MPa、大约0.5 MPa至大约25 MPa、大约0.5 MPa至大约20MPa、大约0.5 MPa至大约15 MPa、大约0.5 MPa至大约10 MPa、大约0.5 MPa至大约5 MPa、大约0.5 MPa至大约4 MPa、大约0.5MPa至大约3 MPa、大约0.5 MPa至大约2 MPa、或大约0.5 MPa至大约1 MPa的极限拉伸强度。
在其它说明性实施方案中，所述工程化胶原支架可具有大约5%至大约70%、大约5%至大约60%、大约5%至大约50%、大约5%至大约40%、大约5%至大约30%、大约5%至大约20%、大约5%至大约10%、大约10%至大约70%、大约10%至大约60%、大约10%至大约50%、大约10%至大约40%、大约10%至大约30%、或大约10%至大约20%的破坏应变。
在其它方面，所述工程化胶原支架可具有大约2 N至大约8 N、大约0.2 N至大约2N、或大约0.1 N至大约4 N、大约2 N至大约7 N、大约2 N至大约6 N、大约2 N至大约5 N、大约2 N至大约4 N、大约2 N至大约3 N、大约0.1 N至大约8 N、大约0.1 N至大约7 N、大约0.1N至大约6 N、大约0.1 N至大约5 N、大约0.1 N至大约4 N、大约0.1 N至大约3 N、大约0.1 N至大约2 N、大约0.1 N至大约1 N、大约0.2 N至大约8 N、大约0.2 N至大约7 N、大约0.2 N至大约6 N、大约0.2 N至大约5 N、大约0.2 N至大约4 N、大约0.2 N至大约3 N、大约0.2 N至大约2 N、大约0.2 N至大约1 N、或大约0.2 N至大约0.5 N的缝线保留峰值负荷。
在所有本文中描述的实施方案中，"大约"、"至大约"包括范围每个端点处提及的数。例如，"大约20%至大约80%"包括20%和80%，"大约20 MPa至大约200 MPa"包括20和200MPa等等。如本文中所用，关于数值(包括例如整数、分数和百分比)的"大约"通常是指本领域普通技术人员会认为等同于所述值(例如具有相同的功能或结果)的数值范围(例如所述值的+/- 5%至10%)。
在任一本文中描述的说明性实施方案中，所述胶原支架的定性和定量微结构特性可以通过低温扫描电子显微镜(cryostage scanning electron microscopy)、透射电子显微镜、共焦显微镜或二次谐波产生多光子显微镜等来确定。在另一实施方案中，拉伸、压缩和粘弹性性质可通过流变测定法或拉伸测试来测定。所有这些方法是本领域已知的，或进一步描述在美国专利申请号11/435,635(2007年11月22日公开，公开号2007-0269476 A1)、美国专利申请号11/914,606(2009年1月8日公开，公开号2009-0011021 A1)、美国专利申请号12/300,951(2009年7月9日公开，公开号2009-0175922 A1)、美国专利申请号13/192,276(2012年2月2日公开，公开号2012-0027732 A1)、美国专利申请号13/383,796(2012年5月10日公开，公开号2012-0115222 A1)中，或描述在Roeder等人, J. Biomech. Eng., 第124卷, 第214-222页(2002)；Pizzo等人, J. Appl. Physiol., 第98卷, 第1-13页(2004)；Fulzele等人, Eur. J. Pharm. Sci., 第20卷, 第53-61页(2003)；Griffey等人, J. Biomed. Mater. Res., 第58卷, 第10-15页(2001)；Hunt等人, Am. J. Surg., 第114卷,第302-307页(1967)；和Schilling等人, Surgery, 第46卷, 第702-710页(1959)中，经此引用并入本文。
在各个实施方案中，所述胶原支架组合物进一步包含细胞。本领域普通技术人员知识范围内的任何细胞类型均可用于本公开的胶原支架组合物。在一些实施方案中，所述细胞是干细胞。如本文中所用，"干细胞"是指来自胚胎、胎儿或成人的非特化细胞(unspecialized cell)，其能够自我复制或自我更新并且可以发育成多种特化细胞类型(即潜能(potency))。除非进一步说明，否则本文中使用的该术语涵盖寡能细胞(能分化成几种细胞类型例如淋系或髓系的那些细胞)和单能细胞(仅能分化成一种细胞类型的那些细胞)。在一些实施方案中，可以通过本领域技术人员公知的方法从例如骨髓、循环血或脐带血中分离造血干细胞。细胞标志物可用于选择和纯化造血干细胞。例如，合适的标志物是Lin-、Sca1+和c-Kit+小鼠或Lin-、CD34+和c-Kit+人造血干细胞标志物。在一个实施方案中，细胞标志物可以单独或组合使用以选择和纯化用于本文中描述的组合物和方法中的所需细胞类型。在一方面，所述胶原支架组合物可以用分离自要治疗的患者的自体细胞接种。在一个替代实施方案中，所述细胞本质上可以是异种的(xenogeneic)或同种异体的(allogeneic)。
在任一本文中描述的实施方案中，所述细胞以大约1×106至大约1×108个细胞/毫升的细胞密度、或以大约1×103至大约2×106个细胞/毫升的密度在所述胶原支架组合物上接种。在一个实施方案中，细胞以小于5×104个细胞/毫升的密度接种。在另一实施方案中，细胞以小于1×104个细胞/毫升的密度接种。在另一实施方案中，细胞以选自大约1×102至大约5×106、大约0.3×104至大约60×104个细胞/毫升、和大约0.5×104至大约50×104个细胞/毫升的范围的密度接种。所述细胞根据本文中描述的方法或本领域技术人员公知的用于细胞培养的方法来维持、增殖或分化。
在本文中描述的各实施方案的任一个中，本发明的工程化胶原支架组合物可以在聚合之前、期间或之后与营养剂组合，所述营养剂包括矿物质、氨基酸、糖、肽、蛋白质、维生素(例如抗坏血酸)、或促进造血干细胞培养或其它类型细胞培养的糖蛋白(例如层粘连蛋白和纤连蛋白)、透明质酸、或生长因子(例如血小板衍生生长因子或转化生长因子β)、和糖皮质激素(例如地塞米松)。在其它说明性实施方案中，可以在聚合之前或期间添加原纤维形成抑制剂，例如甘油、葡萄糖或多羟基化化合物。根据一个实施方案，作为胶原聚合之前或胶原聚合之后的最后步骤可以将细胞添加到所述胶原支架和其它细胞外基质组分中。在其它说明性实施方案中，可以在胶原聚合之前、期间或之后加入交联剂，例如碳二亚胺类、醛、赖氨酰氧化酶、N-羟基琥珀酰亚胺酯、亚胺酯、酰肼类和马来酰亚胺类等。在又一实施方案中，所述工程化胶原支架组合物可包括组分例如缓冲剂(例如磷酸盐缓冲盐水)、盐酸(例如0.01N)和葡萄糖。在一方面，如果要包含细胞的话，可以加入葡萄糖。在另一实施方案中，不存在通常存在于天然胶原基质中的ECM的非胶原组分。
在某些实施方案中，所述胶原支架组合物进一步包含流体。尽管随着压缩从所述胶原支架组合物中除去一些流体，但一定量的流体仍保留在压缩的胶原支架组合物中。在一些实施方案中，存在的流体的百分比为大约25%至大约99%、大约5%至大约99%、大约5%至大约95%、大约5%至大约90%、大约5%至大约80%、大约5%至大约70%、大约5%至大约60%、大约5%至大约50%、大约5%至大约40%、或大约5%至大约30%、大约10%至大约99%、大约10%至大约90%、大约10%至大约80%、大约10%至大约70%、大约10%至大约60%、大约10%至大约50%、大约10%至大约40%、大约10%至大约30%、或大约10%至大约20%。在一些实施方案中，存在的流体的百分比为大约20%至大约99%、大约30%至大约99%、大约40%至大约99%、大约45%至大约99%、大约50%至大约99%、大约60%至大约99%、大约70%至大约99%、或大约80%至大约99%。在一些实施方案中，存在的流体的百分比为大约50%至大约80%。在一些实施方案中，存在的流体的百分比为大约60%至大约70%。
在各个实施方案中，所述胶原支架组合物是冻干的。如本文中所用，术语"冻干"涉及从组合物中除去水，通常通过真空下的冷冻干燥。但是，可以通过技术人员已知的任何方法进行干燥，且所述方法不限于真空下的冷冻干燥。通常，将冻干胶原支架组合物冻干至干燥，并且在一个实施方案中冻干胶原支架组合物的水含量低于可检测水平。在另一实施方案中，所述胶原支架可通过冻干所述组合物、真空压制所述组合物、或通过干热交联处理或其组合来干燥。
在本文中提供的另一实施方案中，提供了一种治疗患者以再生、恢复或替换受损或功能失调的组织的方法。所述方法包括将包含任何本文中描述的工程化胶原支架的医疗移植物植入患者体内。在各个实施方案中，所述医疗移植物可用于再生或替换或恢复组织，所述组织选自心包膜、心脏瓣膜、皮肤、血管、气道组织、体壁和肿瘤切除后重建的组织。在另一实施方案中，瓣膜组织可以是主动脉瓣膜或肺动脉瓣膜组织。在一个实施方案中，所述医疗移植物(即所述胶原支架)在植入患者体内时不引起炎症或异物反应。
在一方面，所述工程化胶原支架在植入患者体内之前进行最终灭菌或无菌地制备。在各个实施方案中，最终灭菌方法可以是选自戊二醛处理、γ辐射、电子束辐射、过乙酸灭菌、酸性pH下的甲醛鞣制、环氧丙烷、环氧乙烷处理或气体等离子体灭菌的工艺。可以使用不会对胶原结构产生不利影响的灭菌技术。
在本文中提供的另一实施方案中，提供了通过压缩(例如侧限压缩)来制造工程化胶原支架的方法。任何本文中描述的工程化胶原支架的实施方案均可以通过所述制造方法生产。在一些实施方案中，所述制造方法包括在将所述胶原支架组合物压缩成限定形状之前聚合所述胶原的步骤。在某些实施方案中，所述制造方法包括在将所述胶原支架组合物压缩成限定形状之前调整所述胶原支架的物理性质的步骤。如本文中所用，术语"调整"是指在受控条件下修饰所述胶原支架以获得所需物理性质。例如，在压缩之前，可以在受控条件下修饰所述胶原支架以提供以下一种或多种物理性质的所需值或量：原纤维密度、孔隙尺寸(原纤维-原纤维支化)、弹性模量、厚度、拉伸应变、拉伸应力、线性模量、极限拉伸应力、破坏应变、缝线保留峰值负荷、压缩模量、损耗模量、原纤维面积分数、原纤维体积分数、胶原浓度、细胞接种密度、剪切储能模量(G'或弹性(类固体)行为)和相位角增量(δ或类流体(粘性)-固体(弹性)行为的量度；对于胡克固体，δ等于0o，对于牛顿流体，δ等于90o)。
由于在压缩所述胶原支架组合物之前调整物理性质，所以可以在压缩前向胶原支架中引入高水平的原纤维间缔合。该步骤允许在产生最终胶原支架前控制重要的机械性质，并在压缩最终胶原支架后保留受控的机械性质。因此，可以优化胶原支架的设计特征，以将所需的细胞机制可预测地诱导到所述胶原支架中。
本文中描述的胶原支架可以压缩成多种不同的限定形状。在一些实施方案中，所述限定形状为管。在其它实施方案中，所述限定形状为片材。在再其它实施方案中，所述限定形状为球。在一些实施方案中，所述限定形状为板(slab)。在其它实施方案中，所述限定形状为圆柱体(cylinder)。在再其它实施方案中，所述限定形状为椎体(cone)。
在另一实施方案中，本文中描述的方法、用途、和胶原支架以及胶原支架组合物包括以下实施例。所述实施例进一步说明了本文中描述的本发明的各个实施方案的附加特征。但是，要理解的是，所述实施例是说明性的并且不应被解释为限制本文中描述的本发明的其它实施方案。此外，应当理解的是，所述实施例的其它变型包括在本文中描述的本发明的各个实施方案中。
实施例1
通过压缩脱水形成水合胶原支架
腔室压缩系统：
从猪真皮中分离并纯化I型低聚胶原。生皮(hides)获自位于美国的封闭式畜群的出售体重的阉割公猪并已经证明没有感染性或传染性疾病。基于纯度、分子组成和聚合参数对酸溶胶原低聚物进行无菌过滤和品质控制。使用由Delrin制造的圆筒形腔室(图1)，采用定制的侧限压缩过程无菌地生成致密化的胶原支架。这些腔室的底面是可拆卸的以适应两种配置：1)实心底面以便在聚合之前和期间容纳液体胶原(图1A)和2)多孔底面，其具有孔洞以便于在压缩过程中促进从底部受控地除去流体(图1B和C)。为了生成胶原支架，将规定浓度和体积的液体胶原中和并添加到无菌圆筒形腔室中(直径为6.3cm或3.4cm)(图1A)。将这些腔室密封并在37℃温育以诱导胶原聚合，导致形成包含被间质液包围的原纤维胶原网络的复合胶原支架。在胶原聚合后，将无菌多孔聚乙烯泡沫放置在该复合胶原支架的顶面和底面上，并且将腔室的实心底面换成多孔底面(图1B)。随后以每秒0.05%的应变速率将该胶原压缩至所需厚度，同时从上表面和下表面除去流体(图1C)。在压缩后，将水合胶原支架无菌地从腔室中取出，并在测试前储存在密封的气密无菌容器中。
注射器压缩系统：
压缩脱水过程中的双向流体去除也可以使用改进的注射器系统来实现(图2)。注射器(6 cc Covidien Monoject，直径1.2cm)通过移除柱塞并恰好在尖端之前在注射器内部放置不锈钢网盘(每1"×1" 100×100个开口，0.006"开口；McMaster-Carr,Douglasville, GA)来修改。通过冲压出中心区域并将另一不锈钢网盘连接到产生的孔洞上来修改来自注射器的橡胶柱塞。在该橡胶柱塞的边缘也生成凹口，以便在将该柱塞插入注射器时促进流体流动并防止气压积聚。在将中和的胶原溶液添加到该注射器主体之前(在不锈钢网的上方)，注射器尖端被封闭(粘稠胶原溶液与该网的小网格之间的表面张力不允许流体流过该网)。将注射器密封并在37℃温育以允许胶原聚合。在聚合后，将改进的柱塞与一片Whatman滤纸一起放置在该注射器内部，以在不锈钢网与复合胶原支架之间提供隔垫(以便在压缩过程中不将网栅压印到支架上)。随后将注射器装载到注射器泵(型号NE-1600, New Era Pump Systems, Farmingdale, NY)上，以每秒0.05%的应变速率压缩至所需厚度。
实施例2
胶原支架厚度的定量
使用Mitutoyo 547-526S高精度测厚仪(Aurora, IL；+/-5µm精度)测定胶原支架的厚度和均匀性。沿材料片材(包括中心和边缘区域)进行至少5次测量(n≥5)，并测定相关的平均值和标准偏差。
实施例3
单轴拉伸测试
在环境空气中对标距长度和宽度分别为4mm和3mm的狗骨形材料样品(n≥3)进行单轴拉伸测试。从设置到完成机械测试的平均持续时间少于10秒，并且没有观察到样品脱水。使用适配有25 N测压传感器的伺服电动材料测试系统(TestResources, Shakopee,MN)以32赫兹的采样率以每秒40%的应变速率(1.6 mm/min)对所有样品进行单轴拉伸测试至失效。从应力应变曲线的线性区域计算弹性模量(ET)。极限应力(σU)代表样品经历的峰值应力，以及破坏应变(εf)是材料经历完全失效时的应变。
实施例3
缝线保留测试
在环境空气中对2×1cm的矩形样品进行缝线保留测试。为了在这些样品中可重现地放置缝线，使用缝合导子沿样品的长中心轴放置缝线，咬合距离为2mm。在将单根缝线(5-0Nylon，单丝)穿过样品后，使用导子以帮助用两个双向平结引出缝线，距离样品边缘2.5厘米。在缝线系到位后，通过将缝线套在固定在机器顶部夹子中的钩子上并将样品的底部边缘固定在底部夹子中来将样品放入拉伸测试机(与用于拉伸测试的相同)。将缝线以10 mm/min的速度抽拉至失效，并以牛顿(N)为单位的最大负荷记录为缝线保留强度。
实施例4
水合胶原支架
图3中显示了使用定制腔室压缩系统制备的原型水合胶原支架的代表性图像。表1提供了各种支架配方和相关性质的概括。
表1. 通过压缩脱水制备的各种胶原支架的性质的概括
实施例5
胶原浓度与胶原支架设计之间的关系
为了确定定制胶原支架设计的预测关系，使用腔室或注射器压缩脱水方法在宽胶原浓度范围(~100mg/ml至700mg/ml)制造支架。测量支架机械性质，包括弹性模量、极限拉伸强度(UTS)和破坏应变，并将其绘制为胶原含量的函数(图4)。
实施例6
通过压缩脱水制成的胶原支架
为了生成干燥的胶原支架，使用冻干或真空压制将水合的致密化的支架脱水至干燥。在冻干和真空压制之前，所有支架在水中彻底冲洗。对冻干而言，将胶原支架固定在框架中，该框架夹持边缘以防止卷曲。随后用液氮将支架快速冷冻并冻干过夜。对真空压制而言，将支架放置在两片多孔聚乙烯泡沫之间并在真空下压缩直到干燥。在一些情况中，对干燥的材料进一步施以干热交联(DHT)处理(其中在真空下加热材料以进一步去除水分子并产生分子间交联的过程)。对DHT处理而言，将干燥的支架放置在指定真空度和温度的真空烘箱中24小时。真空设置为50毫托(mTorr)并且温度设置为60、90或120℃。图5显示了干燥胶原支架在磷酸盐缓冲盐水中再水合后的一个例子。表2概括了通过压缩脱水和干燥制备的各种胶原支架配方的性质。总体而言，用DHT加工改善了支架机械完整性(即弹性模量、UTS)和支架在再水合后保持几何形状(即厚度)的能力。这对于具有高总胶原含量(>500毫克；>500mg/mL)的支架尤其显著。
表2. 通过压缩脱水并随后经由冻干或真空压制干燥制备的各种胶原支架性质的概括。通过真空压制和冻干制备的干燥支架的厚度值分别为377±25 µm和604±33 µm。
实施例7
在大鼠中皮下植入后胶原支架生物相容性和组织响应的评估
材料生物相容性和组织响应的临床前评价：
使用已创建的大鼠皮下植入模型评估材料生物相容性和组织响应。这项研究涉及成年雄性Sprague Dawley(Envigo, Indianapolis, Indiana)大鼠，并且所有材料均以10重复数进行评价。所有动物均在标准条件下饲养(例如，25℃温度，12小时循环光照/黑暗)并提供标准大鼠食物颗粒饮食和随意饮水。在手术时，动物体重为272g至308g。麻醉诱导后，将动物的背部剃光，用术前洗消液从臀部到肩部擦洗，并令其干燥。在背部两侧切开四个长度为大约2cm的侧向切口，平行于矢状面。将筋膜直接切开以恰好在切口侧面形成小袋。恰好在皮肤躯干肌下方将试样(圆形，直径8mm)皮下植入，并且切口部位用不可吸收的缝线缝合。手术后10-14天拆线。所有动物每周至少观察3次并每周称重以评估它们的生理和精神状态二者。60±2天后，对动物实施安乐死并在剃毛后拍摄它们的背侧。随后对背部的皮下组织进行暴露、拍照和射线照相。随后收集每个植入部位和相关正常组织并拍照，接着分成两半进行后续组织病理学分析和钙分析。将移出的组织固定在10%中性缓冲福尔马林中、包埋在石蜡中、切片、并用苏木精和伊红和von Kossa染色。在手术解剖/暴露和后续的组织病理学分析准备后立即对所有植入部位和相关材料进行盲性大体检查。如下文概括的那样，基于组织反应和组织整合的水平对试样进行评分。移出物的组织病理学分析由不知情的病理学家进行。
组织反应(在手术解剖/暴露后立即评估)
0 = 无
1 = 微量
2 = 少量
3 = 中等
4 = 广泛
组织整合(在用于钙分析的样品准备过程中评估)
0 = 无
1 = 微量
2 = 少量
3 = 中等
4 = 广泛
结果：
在已创建的60天大鼠皮下植入模型中评价了在未采用和采用戊二醛处理的情况下制备的胶原支架，特别是配方3和4(如初始在实施例1表1中所述)，的生物相容性和组织响应，戊二醛处理过的心包膜作为参考材料。在植入前每组的代表性材料的照片显示在图6中，表3提供了材料和机械性质的概括。胶原支架的戊二醛处理导致i)提高的弹性模量和UTS，ii)适度提高的缝线保留，以及iii)降低的破坏应变。配方3和4的胶原支架呈白色，而用戊二醛处理过的材料呈各种深浅不一的棕褐色。图7中提供了植入后60±2天的皮肤移出物与相关植入材料的代表性图像。对组织反应(即与植入物相关的纤维组织)和组织整合(即材料植入物与周围宿主组织之间的粘连)程度的差异进行大体观察并评分，结果概括在图8中。总体而言，除了未处理的配方3和4外，所有材料均显示出不同水平的异物反应和显著的纤维组织过度生长。组织病理学分析显示，配方3和4的支架呈现为具有线性取向纤维的均质材料，类似于天然胶原。对于这些材料，炎症模式普遍温和，并且纤维化响应通常极小，从植入物到周围组织平滑过渡(图9和10)。对戊二醛处理的胶原支架的炎症响应也是温和的(图9和10)；但是，通常在植入物周围观察到中等成熟的纤维化响应。与其它已发表的研究一致，戊二醛处理的心包膜显示为具有线性取向的纤维的粗纤维材料，具有始终呈环状的中度炎症响应(图11)。经常观察到淋巴细胞和其它炎症细胞在原纤维之间浸润，并且总是存在中度纤维化响应。没有与任何所述材料相关的可检测的钙化。
表3. 在已创建的大鼠皮下植入模型中评价生物相容性和组织响应的胶原支架和参考材料性质的概括。
实施例8
胶原聚合
用于聚合的工程化胶原支架的组合物可包含在0.01 N盐酸中的I型低聚胶原，其已通过与下面提供的10×缓冲液以10:1的比例混合来中和。如果要包含细胞，则可以包含葡萄糖。稀酸中的胶原溶液与该10×缓冲液的组合诱导原纤维形成反应。如本文中所述，该组合物可以添加到腔室压缩系统中，并且可以在37℃温育以诱导胶原聚合。
(10×磷酸盐缓冲盐水)
1.37 M NaCl
0.027 M KCl
0.081 M Na2HPO4
0.015 M KH2PO4
0.1N NaOH
55.5 mM 葡萄糖。
Claims (62)
1.一种不可收缩和/或不可扩张的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约0.005mm至大约3 mm的厚度和大约0.5 MPa至大约200 MPa的弹性模量。
2.权利要求1的工程化胶原支架，其中在所述胶原支架被冻干和再水合时，所述胶原支架不收缩。
3.权利要求1至2任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约0.01 mm至大约2.0 mm的厚度。
4.权利要求1至2任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约0.01 mm至大约1.0 mm的厚度。
5.权利要求1至2任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约0.01 mm至大约0.25 mm的厚度。
6.权利要求1至2任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约0.1 mm至大约1.0 mm的厚度。
7.权利要求1至2任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约0.5 mm至大约1.0 mm的厚度。
8.权利要求1至2任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约0.15 mm至大约0.25 mm的厚度。
9.权利要求1至8任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约18 MPa至大约200 MPa的弹性模量。
10.权利要求1至8任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约20 MPa至大约180 MPa的弹性模量。
11.权利要求1至8任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约40 MPa至大约120 MPa的弹性模量。
12.权利要求1至8任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约60 MPa至大约100 MPa的弹性模量。
13.权利要求1至8任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约80 MPa至大约180 MPa的弹性模量。
14.权利要求1至8任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约0.5 MPa至大约20 MPa的极限拉伸强度。
15.权利要求1至8任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约1 MPa至大约25 MPa的极限拉伸强度。
16.权利要求1至15任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约0.2 MPa至大约20 MPa的极限拉伸强度。
17.权利要求1至15任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约5 MPa至大约15 MPa的极限拉伸强度。
18.权利要求1至15任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约2 MPa至大约20 MPa的极限拉伸强度。
19.权利要求1至18任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约5%至大约70%的破坏应变。
20.权利要求1至18任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约10%至大约40%的破坏应变。
21.权利要求1至20任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约2 N至大约8N的缝线保留峰值负荷。
22.权利要求1至20任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约0.2 N至大约2 N的缝线保留峰值负荷。
23.权利要求1至20任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原支架具有大约0.1 N至大约4 N的缝线保留峰值负荷。
24.权利要求1至23任一项的工程化胶原支架，其中所述工程化胶原支架在组合物中，并且所述组合物进一步包含流体。
25.权利要求24的工程化胶原支架，其中存在的所述流体的百分比为大约5%至大约99%。
26.权利要求24或25任一项的工程化胶原支架，其中通过冻干所述组合物、真空压制所述组合物、或通过干热交联处理或其组合来干燥所述组合物。
27.权利要求1至26任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原是I型胶原。
28.权利要求1至27任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原是纯化的I型胶原。
29.权利要求1至28任一项的工程化胶原支架，其中所述工程化胶原支架是医疗移植物。
30.权利要求1至29任一项的工程化胶原支架，其中所述工程化胶原支架是医疗移植物，并且所述医疗移植物用于再生、恢复或替换受损或功能失调的组织。
31.权利要求30的工程化胶原支架，其中所述工程化胶原支架是用于再生或替换或恢复组织的医疗移植物，所述组织选自心包膜、心脏瓣膜、皮肤、血管、气道组织、体壁和肿瘤切除后重建的组织。
32.权利要求1至31任一项的工程化胶原支架，其中所述工程化胶原支架最终灭菌或无菌地制备。
33.权利要求32的工程化胶原支架，其中所述胶原支架通过选自戊二醛处理、γ辐射、电子束辐射或环氧乙烷处理的方法来最终灭菌。
34.权利要求1至33任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原包含低聚胶原、单体胶原、末端胶原或去端肽胶原或其组合。
35.权利要求1至34任一项的工程化胶原支架，其被压缩为限定的形状。
36.权利要求35的工程化胶原支架，其中所述形状为球。
37.权利要求35的工程化胶原支架，其中所述形状为管。
38.权利要求35的工程化胶原支架，其中所述形状为片材。
39.权利要求35至38任一项的工程化胶原支架，其中所述压缩是侧限压缩。
40.权利要求1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约1000 mg/cm3。
41.权利要求1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约900 mg/cm3。
42.权利要求1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约800 mg/cm3。
43.权利要求1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约700 mg/cm3。
44.权利要求1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约600 mg/cm3。
45.权利要求1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约500 mg/cm3。
46.权利要求1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约400 mg/cm3。
47.权利要求1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约300 mg/cm3。
48.权利要求1至39任一项的工程化胶原支架，其中胶原浓度为大约50至大约200 mg/cm3。
49.权利要求1至48任一项的工程化胶原支架，其中所述工程化胶原支架在植入患者体内时不诱导炎症或异物反应。
50.权利要求1至49任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原选自猪胶原、人胶原和牛胶原。
51.权利要求1至49任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原是合成胶原。
52.权利要求1至50任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原是天然胶原。
53.权利要求1至49任一项的工程化胶原支架，其中所述胶原是重组胶原。
54.权利要求1至53任一项的工程化胶原支架，其进一步包含细胞。
55.权利要求54的工程化胶原支架，其中所述细胞是干细胞。
56.一种治疗患者以替换、恢复或再生受损或功能失调的组织的方法，所述方法包括将包含权利要求1至55任一项的工程化胶原支架的医疗移植物植入患者体内。
57.权利要求56的方法，其中所述医疗移植物用于再生、恢复或替换受损或功能失调的心包膜。
58.权利要求56的方法，其中所述医疗移植物用于再生、恢复或替换受损或功能失调的心脏瓣膜。
59.权利要求56的方法，其中所述医疗移植物用于再生、恢复或替换受损或功能失调的皮肤。
60.权利要求59的方法，其中瓣膜组织是主动脉瓣膜组织或肺动脉瓣膜组织。
61.权利要求1至55任一项的工程化胶原支架或权利要求56至60任一项的方法，其中所述工程化胶原支架是外源交联的。
62.权利要求61的工程化胶原支架，其中所述工程化胶原支架用戊二醛交联。
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