CN115551364A - 果胶提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于降低从含高比例钙敏感果胶的原料中提取的果胶的反应性的方法，该方法包括使提取的果胶经受酶解聚作用。

Description

果胶提取方法
技术领域
本发明涉及一种用于从含果胶原料中提取果胶的方法。本发明进一步涉及在该方法中获得的果胶的用途。
背景技术
果胶是食品工业中的常用添加剂。它可作为例如稳定剂、增稠剂和胶凝剂，例如用于果酱、果冻和其他基于水果的产品中以及基于酸化乳的产品(诸如酸乳)中。果胶还已经在食品工业中找到其他用途，例如作为脂肪替代物。
果胶是典型地以水不溶性亲本果胶物质(原果胶)的形式发现于绿色陆生植物(如水果和蔬菜)的初生细胞壁和胞间层中的结构多糖。商业果胶产品的主要来源是柑橘果皮和苹果渣，其中原果胶占干物质的10％-40％重量。
果胶是从原果胶的受限制的水解产生的水溶性化合物的通用命名。尚未完全理解原果胶的确切性质。然而，普遍认识到，原果胶是复合结构，其中果胶通过共价键、氢键和/或离子相互作用附接至其他细胞壁组分如纤维素、细胞壁蛋白和半纤维素上。
果胶分子具有高达超过200,000Da的分子量和高达超过1000个单元的聚合度。半乳糖醛酸单元的一定比例的羧酸基团被甲基-酯化。在植物中，残留的羧基被植物组织中固有地包含的钙、钾和镁的阳离子部分或完全中和。
果胶的来源将在某种程度上决定其他酯基是否存在于果胶结构中。在这方面，已知的是，一些果胶包含乙酰基。在这里，典型地，在C2或C3上的羟基可以被乙酰化。通过举例，糖用甜菜果胶在某种程度上在半乳糖醛酸残基的O-2和/或O-3处被乙酰化。
果胶的结构、特别是酯化度决定了它的物理和/或化学特性。例如，果胶胶凝取决于果胶的化学性质，尤其是酯化度和聚合度。然而，此外，果胶胶凝还取决于果胶浓度和环境条件像可溶固体含量、pH和钙离子浓度。
此外，根据食品化学品法典，为了在食品工业中使用，果胶在干燥和无灰的基础上应该具有最少65％的半乳糖醛酸。因此，通过本发明的方法获得的果胶适合用于食品应用。
果胶通常作为大量提取的果胶级分被提取，该果胶级分示出了分子变异性且遵循在钙离子与单独的果胶分子之间变化的相互作用，这些果胶分子对钙离子和其他带电荷的颗粒具有变化的亲和力。这些大量提取的果胶产品包含代表酯化度的宽分布的分子和不同的甲基酯化模式的分子。这影响果胶的重要品质参数，如凝胶的断裂强度、凝固温度曲线、与蛋白或阳离子的相互作用、以及果胶在食品制造应用中的溶解度。
在文件WO 2015/091629中，描述了一种分两步提取果胶的方法，其中第一步提取提供耐钙果胶并且第二步提取提供钙敏感果胶。在一些应用中，第二提取的果胶的高钙敏感性在食品生产过程中会产生不希望的效果，如预胶凝和不均匀混合。通过上述现有技术文件中的方法获得的产品中存在的果胶钙敏感性的广泛分布给应用带来了挑战。耐钙果胶级分适用于一些应用，而钙敏感级分适用于其他不同的应用。
所以本发明是对现有技术中所述方法的改进，其中将第二提取物或合并的第一和第二提取物经受第三步骤的酶处理。提取和酶处理的确切顺序很重要，因为这影响到最终官能度。因此，果胶的分子结构通过本文所述的方法进行了微调。如果第一级分同样用酶处理，这会负面影响某些食品应用中的功能性。在其他应用中，处理合并的第一和第二级分通常将降低钙敏感性的分布并且改善最终功能性。
一些酶处理是本领域已知的，例如文件“Rolin，Gums and Stabilisers for theFood Industry[用于食品工业的胶质和稳定剂]，1994，413-422”和“Westemg等人，Carbohydrate Polymers[碳水化合物聚合物]72(2008)32-42”中描述了使用多聚半乳糖醛酸酶处理高酯果胶以降低钙敏感性。然而，如本文所述，对第二提取物进行选择性的酶处理对一些果胶应用是必要的，并且如果没有专门执行酶处理，将会破坏整体功能性。这并不明显，因为有必要适应处理，以调整最终产品的反应性/功能性。此外，本文所述的方法还包括用多聚半乳糖醛酸酶联合处理果胶提取物以降低钙反应性，以及用果胶甲酯酶组合处理果胶提取物以降低酯化度。因此，该方法不限于降低高酯果胶的钙敏感性，还包括在利用第一和第二提取步骤时降低低酯果胶产品的钙反应性。
然而，许多果胶应用要求均匀的果胶级分，但是这导致相对低的果胶产量和高生产成本。
由于含果胶的资源的有效使用，从环境和可持续以及经济观点来看在工业中存在获得高提取率连同受控的并且一致的果胶功能性的方法的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于提取和/或分离果胶的方法，其中该方法导致提取的果胶的钙耐受性增加以及蛋白反应性降低。本发明的另一个目的是提供一种更均匀的果胶级分，其聚合物链中具有更短的半乳糖醛酸嵌段结构。
相应地，本发明涉及一种用于降低从含高比例钙敏感果胶的含果胶原料中提取的果胶的反应性的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使用pH在1.0-2.5范围内的第一水性溶液对含高比例钙敏感果胶的含果胶原料进行第一提取程序，接着从该第一水性溶液中分离出第一含果胶残余物，得到包含钙敏感果胶和耐钙果胶两者的第一提取物；
(b)任选地在洗涤步骤之后，使用pH在3.0-6.0范围内的第二水性溶液对该第一含果胶残余物进行第二提取程序，该第二水性溶液任选地包含螯合剂，接着从该第二水性溶液中分离出第二含果胶残余物，得到包含钙敏感果胶的第二提取物；以及
(c)使步骤(a)的第二提取物或步骤(a)和(b)的合并的第一和第二提取物在提取物纯化之前或期间用能够解聚果胶的酶处理，得到包含耐钙果胶的果胶级分，其分子量低于含果胶原料中存在的果胶的分子量。
已经发现，酶解聚作用的结果是从含高比例钙敏感果胶的含果胶原料中提取高产量的耐钙果胶。
本发明的方法是特别有利的，因为它结合了更高的提取率以及与常规酸提取的果胶(典型地提取率低)相似的提取的果胶的性质，因此它可以应用于通常使用常规提取方法的果胶的许多应用中。
附图说明
图1：快速粘度分析仪(RVA)对LC果胶的分析。使用RVA在55℃-85℃的温度范围内测量表4中描述的样品的粘度(cP)。#1 4963430719、#2 3834-126-8、#3 3834-126-7、#43834-126-6。
具体实施方式
术语“果胶”应理解为通过从植物材料提取果胶而获得的果胶物质的水溶性形式。果胶具有含被鼠李糖半乳糖醛酸主链(重复的二糖α-(1-4)-D-半乳糖醛酸-α-(1-2)-L-鼠李糖的聚合物)中断的直链半乳糖醛酸链(α-(1-4)-连接的-D-半乳糖醛酸的聚合物)的嵌段的结构，它经常具有与L-鼠李糖的O-3或O-4位置连接的聚合阿拉伯半乳聚糖糖苷的侧链。半乳糖醛酸序列可以具有与它们的O-2或O-3位置连接的D-木糖和D-芹菜糖糖苷，其还可以被酯连接的乙酰基取代。α-(1-4)-连接的D-半乳糖醛酸残基的长链通常被称为“光滑区域”，而高度支化的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖区域通常被称为“毛状区域”。
“酯化度”(DE)意指果胶的半乳糖醛酸单元中包含的游离羧酸基团已经被甲基酯化的程度。如果超过50％的羧基被酯化，则所得到的果胶被称为“高酯果胶”(简称“HE果胶”)。如果小于50％的羧基被酯化，则所得到的果胶被称为“低酯果胶”(简称“LE果胶”)。如果果胶不含有任何(或仅含有少量)酯化的基团，它通常被称为果胶酸。
具有直链半乳糖醛酸链嵌段结构的果胶表现出增强的钙反应性，其中一个果胶分子的半乳糖醛酸残基与另一个果胶分子的半乳糖醛酸残基通过钙离子交联，以形成密集的网状结构。因此，果胶的“钙反应性”(也称为“钙敏感性”)导致在钙离子存在下果胶溶液的粘度的增加。
果胶产品中钙敏感果胶的含量可被描述为“钙敏感果胶比率”(CSP-比率或CSPR)，其是果胶产品中钙敏感果胶的分数。因此，纯的钙敏感果胶理论上具有CSPR＝1.0，具有50％钙敏感果胶的果胶具有CSPR＝0.5，并且纯的耐钙果胶具有CSPR＝0。在本文中，“耐钙果胶”(在文献中也称为“非钙敏感果胶”)意在包括在酶处理之前，在本方法的步骤(a)和(b)的含果胶提取物中，展现出增强的钙耐受性并且反应性明显低于钙敏感果胶的果胶，其中半乳糖醛酸嵌段的断裂导致嵌段更短，使得果胶钙反应性更低。举例来说，在通过以下实例1中所述的方法制备的果胶中，CSPR从约0.85降至约0.65。
术语“能够解聚果胶的酶”应理解为任何对果胶的半乳糖醛酸链的嵌段起作用，从而减少聚合度和果胶的分子量的酶。
术语“外切多聚半乳糖醛酸酶”应理解为通过水解非甲基酯化的同聚半乳糖醛酸来解聚果胶的酶，其中该酶作用于聚合物的末端并且通常作用于非还原的末端。
术语“内切多聚半乳糖醛酸酶”应理解为通过水解非甲基酯化的同聚半乳糖醛酸来解聚果胶的酶，其中该酶作用于寡糖/多糖链的中部。
术语“果胶酸裂解酶”应理解为通过非甲基酯化的同聚半乳糖醛酸的β-消除反应来解聚果胶的酶。
含果胶原料可以优选地获自柑橘属水果，苹果，糖用甜菜，向日葵盘，蔬菜或来自植物如苹果、糖用甜菜、胡萝卜、洋葱、桃、葡萄浆果、芒果、番石榴、南瓜属植物、南瓜、番茄、杏、香蕉、豆、马铃薯、向日葵或柑橘属水果的废品。柑橘属水果的实例是青柠、柠檬、葡萄柚、柑橘、红橘、袖子和橙子。
为了获得含果胶原料，取决于水果和蔬菜的类型以本领域技术人员通常已知的方式处理水果或蔬菜。这可以包括分解或挤压材料以分离汁和油，接着用水洗涤若干次以去除可溶性固体像糖以及油和脂肪的残余物。可以将洗涤过的材料挤压并直接用于果胶提取或干燥至超过85％干物质以安全地运输或储存。
在一个实施例中，含果胶原料包括来自柑橘属水果的干果皮，具有约85％重量或更多的干物质含量，优选地呈至多2cm长度的片的形式，这些片是通过在提取柑橘汁和精油之后加工来自汁工业的挤压过的果皮获得的。这些材料均具有高含量的果胶物质(呈水不溶性原果胶的形式)。在干物质基础上，具有在20％-35％重量范围内的可提取果胶含量的柑橘果皮是特别令人感兴趣的。
有利地使含果胶原料经过以下预处理以改变原料的粒度分布：研磨干燥的果皮或在水性果皮悬浮液中切削该原料。
借助于任何常规干燥设备如干燥箱、带式干燥器、转鼓式干燥器或流化床干燥器，可以进行该材料的干燥持续足以获得该材料中至少80％重量的干物质含量的时间段。材料中的干物质含量优选地为至少85％重量、更优选地为至少90％重量。该干燥可以在范围从环境温度至高于100℃的温度下进行，持续至多36小时的时间段。例如，该干燥可以在从40℃至100℃的范围内的温度下进行，持续至多36小时的时间段。该干燥可以在低于大气压的压力下进行，由此可以使用相对较低的干燥温度或相对较短的干燥时间段，导致更温和的处理。
在本方法的步骤(a)中，用具有1.0-2.5范围内的pH的第一水性溶液进行酸提取，导致耐钙果胶和钙敏感果胶两者从原料中提取到水性溶液中。所述第一水性溶液的pH适当地是从1.5至2.5。在本发明优选的实施例中，所述第一水性溶液的pH是从2至2.5。
为了增加所提取的果胶的产量，可以调节提取温度和提取时间。因此，本方法的步骤(a)可以在15℃-100℃之间的温度进行，如65℃-75℃之间的温度。
步骤(a)的酸提取程序可以适当地进行0.5至10小时的时间段，尤其1至8小时的时间段。
步骤(a)中使用的该第一水性溶液的量取决于例如有待提取的该含果胶的材料的来源和状态以及该材料中可提取果胶的含量。
在步骤(a)中可以使用有机酸或无机酸。有用的酸包括强或中等强无机酸，如由以下各项例示的，但不限于以下各项：盐酸、硫酸、亚硫酸、硝酸或磷酸。有机酸包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、柠檬酸、丙二酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、乙醛酸、乳酸、甘油酸(glycerolicacid)、马来酸、富马酸和苯甲酸。应当理解的是，可以使用酸的混合物。
已经发现，对步骤(a)中果胶的残余物(减去被酸溶液提取的果胶级分)进行第二提取使得释放相当数量的果胶(除了被酸提取的果胶级分外)。本方法步骤(b)中提取的果胶在化学特性以及功能果胶性质上与第一提取物显著不同。提取步骤(b)似乎是为了除去果胶材料，为提取更多的钙敏感果胶级分创造途径，这些级分不能仅仅用单一的酸提取来提取。
为了获得高产量的钙敏感果胶，重要的是步骤(b)中使用的水性溶液的pH要高于步骤(a)中使用的水性溶液的pH。在一个实施例中，步骤(b)中使用的水性溶液的pH是从3.0至6.0，尤其从3.5至4.5，即该第二水性溶液是弱酸性溶液。为了增加该第二溶液的pH，可以向步骤(a)的溶液中添加一种或多种碱。该碱可以是含有一价或二价阳离子的碱式盐。此类碱的实例是碳酸盐、碳酸氢盐以及锂、钠、钾、铵、钙和镁的氢氧化物。
在实施例中，该第二水性溶液可以包含部分被中和的无机酸的盐中的一种或多种，像多磷酸盐、硼酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、膦酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、沸石、阳离子有机树脂、部分被中和的有机酸的盐或聚羧酸盐，如酒石酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、葡糖酸盐、EDTA(乙二胺四乙酸)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、NTA(次氮基三乙酸盐)、咪唑及衍生物。
在实施例中，该第二水性溶液可以包含一种或多种螯合剂，因此其具有螯合功能，即能够和二价或多价阳离子形成络合物。
以此方式，该二价或多价阳离子被提取步骤(b)的螯合剂结合，而钙敏感果胶仍然可溶。因此，钙敏感果胶的较高的级分被提取出来，导致钙敏感果胶的产量提高。已经发现，提取步骤(b)似乎是去除了果胶材料，并且通过螯合剂为提取更多的钙敏感果胶级分创造途径。
在实施例中，该螯合剂选自以下的一种或多种：多磷酸盐、柠檬酸或其盐、草酸或其盐、磷酸或其盐、部分被中和的二价或多价有机酸(像EDTA、CDTA、DTPA、NTA、咪唑、碳酸或阳离子离子交换树脂)的盐。
第二提取程序可以适当地进行，持续0.5至5小时的时间段。
所述第二提取程序的温度可以适当地是在50℃与80℃之间、优选地在65℃与75℃之间。
选择在每个提取步骤(其在轻轻搅拌含果胶原料的悬浮液的同时进行)中的含果胶的材料和水性溶液的量，以便使该悬浮液具有在1％至20％重量的范围内(例如在2％至15％重量的范围内，如在从2％至6％重量的范围内)的干物质含量。
在实施例中，在步骤(a)与步骤(b)之间或步骤(b)与步骤(c)之间的过程可以包括至少一个洗涤步骤。该洗涤步骤去除第一水性(酸性)溶液的残余物和被提取的(或溶解的)耐钙果胶，并且从剩余的含果胶原料提取一些额外的果胶。该洗涤步骤可以在固定式过滤器上使用例如连续洗涤进行，作为逆流洗涤或作为通过渗滤方法的洗涤。如果必要的话，可重复该洗涤步骤。含提取的果胶的洗涤溶液随后可以与第一和第二提取物合并。
在步骤(b)中的第二提取后，可以使第二提取物(和任选地从洗涤步骤提取的果胶)在步骤(c)中单独经过纯化和酶处理，或者可以使第一和第二提取物(和任选地从洗涤步骤提取的果胶)合并，然后使其在步骤(c)中经过纯化和酶处理。纯化程序典型地包括离心、澄清、过滤、离子交换、浓缩、沉淀、洗涤、挤压、干燥和研磨。所有这些方法可以如本领域技术人员已知的进行。
根据本方法对第二提取物或合并的第一或第二提取物的酶处理，可以在步骤(c)中的离心之前或之后，或在步骤(c)中的第二提取物或合并的第一和第二提取物的浓缩之后有利地进行。
在步骤(c)的实施例中，酶处理在第二提取物或合并的第一和第二提取物的离心之后进行。在这个实施例中，酶处理优选地在第二提取物或合并的第一和第二提取物的澄清和过滤之前进行。已经发现，当在纯化第二提取物或合并的第一和第二提取物期间应用酶处理时，第二提取物或合并的第一和第二提取物的粘度会减小，因此促进加工步骤(c)下游的纯化。缺少酶处理时，后续单元操作的能力将会因粘度的增加受到限制。在替代性实施例中，酶处理可以在过滤之后并且离子交换之前进行。
在步骤(c)的又另一个实施例中，第二提取物或合并的第一和第二提取物的浓缩在添加酶之前方便地进行。浓缩可以例如通过膜过滤(如超滤)或通过在减压下蒸发进行。
在步骤(c)中，酶处理得到比起始原料中的果胶更耐钙的果胶级分。所得的耐钙果胶的分子量比原料中存在的果胶的分子量更低，如比原料中的果胶的分子量低约5-100kDa。控制分子量的降低，使其不会负面影响果胶的功能特性如粘度和胶凝能力。通过降低分子量可以获得更高的可加工性。从实例1中可以看出，酶处理不会降低％DE，而与原料中存在的果胶相比，分子量会降低。
在该酶处理期间的pH将取决于该方法中使用的酶。如果在该酶处理期间使用的pH接近于该酶的最佳pH，则该酶的效率将高于当pH不是在该酶的最佳pH时的效率。这导致例如可以使用更少量的酶或更短的酶处理时间来获得相同量的果胶。
在实施例中，使用单一的纯化酶进行酶处理。在此，可以更好地控制果胶改性并且观察到较少的果胶非特定的分解现象(如甲基酯化区域中果胶的解聚、毛状区域的分解或脱酯化)减少。因此，可以获得均匀的果胶级分。
本方法步骤(c)中使用的酶的实例是多聚半乳糖醛酸酶(外切多聚半乳糖醛酸酶或内切多聚半乳糖醛酸酶)或果胶酸裂解酶。
在另一个实施例，使用两种或更多种酶的混合物进行酶处理。在此，可以利用不同酶方法的优点来提供具有可以获得的不同功能性的果胶。在这个实施例中，步骤(c)进一步包括使第二提取物或合并的第一和第二提取物经受一种或多种能够使果胶脱脂化的酶的处理，得到一种果胶提取物，其包含与含果胶原料中存在的果胶相比钙反应性更低的果胶(具有降低的分子量和酯化度)。用于果胶功能性的进一步改性的有用的酶实例包括果胶甲酯酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸酯酶、半乳聚糖酶、阿拉伯糖酶和鼠李糖半乳糖醛酸水解酶。
作为本发明的优选实施例，果胶可以在加工过程中专门被改性，以通过酯酶(如果胶甲酯酶)增强脱脂化作用并且从而获得LE果胶。可以将果胶甲酯酶与纤维素酶一起添加，这增加了果胶从第二含果胶的残余物中的释放。因此，通过混合例如多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲酯酶，可以获得产量增加的耐钙LE果胶。
如果需要的话，所得LE果胶可以通过使用例如NH3进行酰胺化来进一步改性，从而得到酰胺化的LE果胶，其典型地具有比非酰胺化的LE果胶更高的胶凝强度。
一般来说优选的是，所述含酶溶液的pH高于所述第一水性溶液的pH。因此，在该酶处理期间的pH高于在该酸提取期间的pH。因此，所述含酶溶液的pH为从2.0至5.5，如从2.5至4.5。
在一个方面，进行该酶处理持续从0.5至20小时的时间段。
进行步骤(c)的酶处理的温度可以典型地在40℃与80℃之间、优选地45-60℃，如50-55℃。
在步骤(c)中的离心之前或之后向第二提取物或合并的第一和第二提取物中添加解聚酶的量根据使用的酶的类型以及工艺条件(特别是关于温度和时间)而变化，但典型地在0.001-2单位/L的提取物的范围内(以单位/mL测定酶活性的方法描述如下)。
在步骤(c)中浓缩第二提取物或合并的第一和第二提取物之后添加的解聚酶的量根据使用的酶的类型以及工艺条件(特别是温度和时间)而变化，但典型地在0.005-10单位/L的浓缩物的范围内。
在步骤(c)中的离心之前或之后向第二提取物或合并的第一和第二提取物中添加脱脂化酶的量根据使用的酶的类型以及工艺条件(特别是关于温度和时间)而变化，但典型地在2-2000单位/L的提取物的范围内。
在步骤(c)中浓缩第二提取物或合并的第一和第二提取物之后添加的解聚酶的量根据使用的酶的类型以及工艺条件(特别是温度和时间)而变化，但典型地在10-10.000单位/L的浓缩物的范围内。
果胶的沉淀可以用任何与水混溶的溶剂进行，并且果胶基本上不溶于该溶剂，例如2-丙醇或另一种醇或酮。通过任何方便的方法，例如像通过倾析、离心或过滤，将沉淀的果胶与液体分离，并且然后可以将沉淀物挤压并且在过滤器上洗涤以去除可溶性的盐和杂质。最后，可以将该果胶干燥并任选地在使用之前碾磨。
本发明此外涉及如通过以上描述的方法获得的耐钙果胶的用途，其中该果胶用于稳定饮料，构造酸化的乳制品，作为乳制甜食中的膳食纤维、用于果酱和果冻的胶凝剂、稳定剂，和/或作为蛋白络合剂。已经发现，根据本方法的步骤(c)，经过多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲酯酶处理的果胶与仅用果胶甲酯酶处理的果胶相比，展现出降低的胶凝温度。因此，使用由本方法制备的果胶使得有可能在制造胶状的食品产品(如果酱和果冻)时避免预胶凝。
饮料可以是例如酸化乳或稀释的果汁。
在一个实施例中，这些酸化的乳产品选自例如具有3.5至5的pH的酸化的乳产品，如酸化乳、饮用酸乳和具有水果的酸乳。
这些酸化的乳产品包括通过以下酸化获得的乳产品：通过用活的产酸细菌发酵，或者通过添加果汁或食品酸味剂。
此外，描述了以下用途，其中该果胶被用作乳制甜食中的稳定剂。
该果胶可以进一步被用作可溶性纤维(任选地：作为Ca-盐)、营养物(Fe、Ca、Zn)的载体、食品中的放射性核素的结合剂、用于常规低酯果胶或酰胺化果胶的前体、用于在食品工厂中从工艺用水回收蛋白的蛋白结合剂和废水工厂中的蛋白絮凝剂、包囊剂以及染料结合剂。
方法
酯化度(DE)的确定
根据Food Chemical Codex，Third Edition，National Academic Press，Washington 1981，page 216[食品化学品法典，第三版，国家学术出版社，华盛顿1981，第216页]中给出的程序确定酯化度。
将5g果胶样品至最接近0.1mg称重到250ml烧杯中，并且添加100ml的60％的2-丙醇水溶液和5ml浓盐酸的混合物。在磁力搅拌器上搅拌持续10分钟。在降低的真空下通过干燥且预称重的30ml粗玻璃过滤漏斗过滤。用六份15ml的HCl-60％的2-丙醇混合物洗涤。然后用60％的2-丙醇水溶液(6-8份20ml)洗涤直到滤液不含氯化物(用1.7g硝酸银在100ml蒸馏水中的溶液进行测试)。最后用大约30ml的100％的2-丙醇洗涤。在105℃下的烘箱中干燥持续21/2小时。在干燥器中冷却。称重。
使用20ml容量移液管移取20.00ml的0.5N氢氧化钠到烧杯中并与20.00ml的0.5N盐酸混合，该盐酸已经使用20ml容量移液管转移。添加两滴酚酞溶液(将1g酚酞溶解于100ml的96％乙醇中)指示剂并用0.1N氢氧化钠滴定。记录体积V0。
将洗涤且干燥过的果胶的十分之一精确地称重到250ml锥形烧瓶中，并用2ml的96％乙醇使其湿润。将该烧瓶放置在磁力搅拌器上，并且缓慢添加100ml的煮沸且冷却的去离子水。避免飞溅。搅拌直到所有果胶完全溶解。添加五滴该酚酞溶液，并用0.1N氢氧化钠滴定。体积被记录为以ml计的V1。添加20.00ml的0.5N氢氧化钠，并且剧烈摇动。允许内容物静止持续15分钟以便皂化酯基团。添加20.00ml的0.5N盐酸，并且摇动直到粉红色消失。添加三滴该酚酞溶液，并且用0.1N氢氧化钠滴定，直到达到微弱的持久的粉红色，将所需要的0.1N氢氧化钠的体积记录为V2 ml。
Figure BDA0003934464960000131
特性粘度的确定
通过将比浓粘度除以果胶浓度的函数外推至零浓度确定特性粘度。在给定的浓度下，比浓粘度是：
Figure BDA0003934464960000132
其中ηc是果胶溶液的粘度，ηr是溶剂(聚磷酸钠的1％水溶液，pH 4.75)的粘度。用玻璃球在21.0℃下在粘度计C(哈克有限公司(Haake，Gmbh))上测量粘度。然后用确定的特性粘度使用Mark-Houwink等式来计算果胶的分子量。
CSP比率(CSPR)的确定
将2.00g果胶在70℃下溶解在大约90g脱矿质水中。冷却至室温后，在搅拌期间加入20％重量的碳酸钠溶液，将pH提高至4.0。将脱矿质水添加至100.0g总重量并且混合该样品。
将15.00g样品缓慢地混合到在50ml离心机螺旋帽管中的30.00g 80％重量的2-丙醇水溶液中以使该果胶沉淀。在频繁摇动一小时之后，在以2800g离心持续20分钟并且倾析离心液之后收集沉淀的材料。向沉淀的材料中添加大约25ml的60％重量的2-丙醇水溶液，并将其彻底混合。在频繁混合一小时之后，如以上分离沉淀物。再一次重复用60％重量的2-丙醇洗涤，并且在最后分离之后，用手挤压过量的液体，并将挤压过的残余物转移到托盘中并且在通风烘箱中在60℃下干燥过夜。称重分离的果胶(a克)，并且通过在105℃干燥持续21/2小时确定该材料中干物质a’。
在50ml离心机螺旋帽管中，添加25.00g的在含有16％重量的2-丙醇的脱矿质水中的60mM的CaCl2并且将其与25.00g制备的果胶样品混合。将该混合物在连接到定时器上的IKA MTS2 Schfütler上以最低速度摇动以允许混合持续1/15分钟。在24小时之后，将该混合物以2800g离心持续20分钟并且通过布将液体虹吸出来。称重离心管中的沉淀材料，并且添加且混合等量的在含有8％重量的2-丙醇的脱矿质水中的30mM的CaCl2。将该管缓慢摇动持续另外24小时，并且以2800g离心持续20分钟并且通过布将液体虹吸出来。再一次重复沉淀的CSP的洗涤。最后将该管中的残余物与两份80％重量的2-丙醇水溶液混合，并且在一小时之后在棉布上分离，并且在排液之后，转移回到该管中并且再次与等量的60％重量的2-丙醇水溶液混合两次，并且在一小时之后，在该布上排液并且挤压。将挤压过的残余物转移到托盘中，并且在通风烘箱中在60℃下干燥过夜。称重残余物(b克)，并且通过在105℃下干燥持续21/2小时确定该材料的干物质b’。
CSP比率由以下式确定：
Figure BDA0003934464960000151
可以达到高于1.0的CSPR数字，因为在钙存在下特定小果胶分子的沉淀比2-丙醇沉淀更定量。高于1.0的CSPR数字指示了该样品是纯的钙敏感果胶。
多聚半乳糖醛酸酶酶活性的确定
比较了几种含多聚半乳糖醛酸酶的酶产品改善果胶功能性的能力。最初它们的果胶酶活性是在含从以下实例1描述的方法(没有酶处理)中获得的果胶的酶反应中确定的。
a)将果胶在室温下在水中再水合至0.5％(w/v)。
b)通过添加乙酸钠将pH调整至4.0。
c)酶反应期间，温度维持在40℃。
d)加入酶至时间＝0，并且将其与果胶溶液孵育不同的时间段，之后使酶在
Figure BDA0003934464960000153
下失活。
e)使用对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)测量酶反应期间产生的还原端基的数量。通过加热和碱性条件，还原端基和无色的PAHBAH反应，从而使PAHBAH被氧化。络合物是黄色并且通过分光光度法在410nm下进行量化。使用半乳糖醛酸来做标准曲线。
f)活性是以单位/ml给出的。在pH为4.0、温度为40℃时，一个单位/每分钟将从果胶中释放1.0微摩尔的还原端基。
Figure BDA0003934464960000152
在以下实例中进一步描述本发明。
实例
实例1：用多聚半乳糖醛酸酶处理合并的浓缩的果胶
材料
将柑橘果皮原料以27的水∶果皮(w∶p)比率，在70℃、pH为2.0的条件下提取持续3小时。然后用筛分分离过量液体，并在70℃下将第一残余物用水洗涤1小时，以构成12的w∶p比率。第二筛分之后，将包含来自离心分离液体的沉渣的第二残余物在70℃下、在pH为3.8±0.2(用碳酸钠溶液调节)、w∶p的比率为19的条件下用15g草酸一水合物/kg柑橘果皮进一步提取2小时。然后通过离心将混合物分离。合并第一和第二提取物并且通过离心分离。
将来自离心的液相混合，并且通过将液体通过带有一层Clarcel DIT-R助滤剂的真空过滤器澄清。将澄清汁通过弱酸化的Amberlite C200树脂进行离子交换(基本上以钠的形式)。将精制的果胶汁通过超滤浓缩至1.5％-2.0％的果胶浓度。
用不同量的多聚半乳糖醛酸酶(nL酶/kg浓缩物)处理果胶浓缩物。所有反应在pH为3.5和50℃下进行30分钟。对处理过的果胶的分析表明，多聚半乳糖醛酸酶剂量的增加导致果胶反应性(以CSPR表示)逐渐下降。
表1：果胶样品3826-109-X的特性。
Figure BDA0003934464960000161
流变学表征
将分别含0.65％重量的果胶样品1、2、4、6和8(表1)、在pH为3.2时含有65％的可溶性固体(蔗糖，320mg K/kg胶状物，100mg Ca/kg胶状物)的凝胶以2℃/分钟的速度从95℃冷却至20℃。在冷却期间，使用配有CC27-SN1921818487的安东帕(Anton Paar)PhysicaMCR301流变仪测量损耗模量和储能模量。
从这个实验得到的数据表明，在含有用减少量的多聚半乳糖醛酸酶处理过的果胶样品的凝胶中，90℃时的相角减小而胶凝温度升高。
相反，随着多聚半乳糖醛酸酶量的增加看到的胶凝温度降低被解释为通过用多聚半乳糖醛酸酶处理减少果胶中半乳糖醛酸嵌段结构而导致果胶反应性降低。在选定的应用中，当最终的果胶产品是所得的高酯果胶时并且当该高酯果胶被用作脱脂化和/或酰胺化的前体时，所述的多聚半乳糖醛酸酶处理的结果具有优势。
表2：90℃时的相角和用不同量的半乳糖醛酸酶处理的果胶的交叉温度(crossover temperature)。
表3：流变学实验的结果。
样品号 90℃时的相角 交叉/℃
3826-109-1 62.1 77
3826-109-2 58.8 80
3826-109-4 53.1 80
3826-109-6 47.8 85
3826-109-8 46.4 86
实例2：用多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲酯酶联合处理
材料
以与实例1中描述的类似的方式提取柑橘果皮原料，以产生两种类型的果胶前体样品；用pH为2.0的水性溶液在一个提取步骤后收集第一样品(3834-73)；在如实例1所述的两个提取步骤后收集第二样品(3758-44)，得到比3834-73样品包含更多钙敏感果胶的合并的果胶提取物(参见表4)。
将提取的液体样品经过澄清、离子交换和浓缩(基本上如实例1所述)但至2.5％-3.0％的果胶浓度。
将果胶前体浓缩物用多聚半乳糖醛酸酶(PG)(3834-69)、用0.4U/L的果胶浓缩物的酶剂量处理，或用果胶甲酯酶和多聚半乳糖醛酸酶(PME/PG)的组合、用268,9U/L的果胶浓缩物(PME)和0.05U/L的果胶浓缩物(PG)的酶剂量处理，分别产生高酯(HE)果胶或低酯(LC)果胶。反应在pH为3.8和50℃下进行并且使用pH-stat滴定法以在含PME的反应中达到不同的％DE。反应后，通过添加1.5体积的IPA沉淀果胶，并在60％的IPA中洗涤，干燥并研磨。
结构和功能分析
对处理过的果胶的分析表明，与一步酸提取(3834-73)的果胶相比，两步提取(3758-44)的果胶具有较低的％DE和增加的钙敏感性。这可以通过用多聚半乳糖醛酸酶处理来逆转，它提供了通过两步提取获得的超高产量和类似于一步提取(3758-73)(表4)的果胶功能性。
LC果胶产品可以通过使用果胶甲酯酶(PME)进行一步酸果胶提取后的脱脂化制得，以获得如表4中给出的结构和功能参数(#1 4963430719)。通过结合使用PME来脱脂化以及PG来降低钙敏感性，有可能从两步提取程序中获得LC果胶，提供与一步提取的果胶的PME处理相同的结构和功能参数(表4和图1，对照#1、#2、#3和#4)。因此，在使用PME和PG组合处理时，可以在生产LC果胶时使通过两步提取程序提取的果胶的增加的钙敏感性降低。通过胶凝强度分析以及快速粘度分析仪(RVA)测量功能参数。
表4：PG或PME/PG处理后果胶样品的特性。
Figure BDA0003934464960000181
Figure BDA0003934464960000191
上述说明书中提及的所有出版物通过引用结合在此。在不背离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和组合物的各种修改和变化对本领域的技术人员将是显而易见的。虽然已结合特定优选实施例描述了本发明，但应当理解，要求保护的本发明不应不适当地限于这类特定实施例。事实上，对于应用于食品工业的化学或相关领域的技术人员而言显而易见的、用于执行本发明的所述模式的各种修改旨在落入如下权利要求的范围内。

Claims (19)

1.一种用于降低从含高比例钙敏感果胶的含果胶原料中提取的果胶的钙反应性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使用pH在1.0-2.5范围内的第一水性溶液对含高比例钙敏感果胶的含果胶原料进行第一提取程序，接着从所述第一水性溶液中分离出第一含果胶残余物，得到包含钙敏感果胶和耐钙果胶两者的第一提取物；
(b)任选地在洗涤步骤之后，使用pH在3.0-6.0范围内的第二水性溶液对所述第一含果胶残余物进行第二提取程序，所述第二水性溶液任选地包含螯合剂，接着从所述第二水性溶液中分离出第二含果胶残余物，得到包含钙敏感果胶的第二提取物；
(c)使步骤(b)的所述第二提取物或步骤(a)和(b)的合并的第一提取物和第二提取物在提取物纯化之前或期间用能够解聚果胶的酶处理，得到包含耐钙果胶的果胶级分，其分子量比所述含果胶原料中存在的果胶的分子量低。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述含果胶原料获自柑橘属水果、苹果、糖用甜菜、向日葵盘、胡萝卜、洋葱、桃、葡萄浆果、芒果、番石榴、南瓜属植物、南瓜、番茄、杏、香蕉或马铃薯。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述含果胶原料获自柑橘属水果的果皮，如青柠、柠檬、橙子、葡萄柚、柑橘、红橘或袖子的果皮。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述酶是多聚半乳糖醛酸酶。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述酶是外切多聚半乳糖醛酸酶和/或内切多聚半乳糖醛酸酶。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述酶是果胶酸裂解酶。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中制备的所述耐钙果胶的分子量比提取物(b)的所述果胶或步骤(a)和(b)的所述合并的第一提取物和第二提取物的分子量低约5-100kDa。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中纯化所述合并的提取物包括离心、澄清、过滤、离子交换、浓缩和沉淀的步骤。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤(c)在步骤(b)的所述第二提取物或步骤(a)和(b)的所述合并的第一提取物和第二提取物离心之前或之后进行。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(c)在步骤(b)的所述第二提取物或步骤(a)和(b)的所述合并的第一提取物和第二提取物澄清过滤之前进行。
11.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤(c)在步骤(b)的所述第二提取物或步骤(a)和(b)的所述合并的第一提取物和第二提取物浓缩之后进行。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中步骤(c)在约40℃-80℃、优选地约45℃-60℃、更优选地约50℃-55℃范围内的温度下进行。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中步骤(c)在2.0-5.5范围内的pH、优选地2.5-4.5范围内的pH下进行。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中步骤(c)进行0.5-20小时。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中在离心之前或之后向所述第二提取物或合并的第一提取物和第二提取物中添加酶的量是0.001-2单位/L的提取物。
16.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中在浓缩之后，向所述第二提取物或合并的第一提取物或第二提取物中添加酶的量是0.005-10单位/L的浓缩物。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中步骤(c)进一步包括使所述第二提取物或合并的第一和第二提取物经受使用一种或多种能够使果胶脱脂化的酶的处理，得到包含钙反应性更低的果胶的合并的提取物，其与所述含果胶原料中存在的所述果胶相比，具有降低的分子量和酯化度两者。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述步骤(C)包括用多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲酯酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸酯酶、半乳聚糖酶、阿拉伯糖酶或鼠李糖半乳糖醛酸水解酶的组合对所述第二提取物或合并的第一提取物和第二提取物进行处理。
19.如权利要求17所述的方法，其中，所述脱脂化酶是在2-10,000单位/L的提取物的范围内。
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