CN115531539B - 一种近红外sers信号增强纳米探针及其制备方法和在一体化诊疗感染细菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种近红外SERS信号增强纳米探针的制备方法,包括称取星形纳米金颗粒和硫化钼纳米颗粒进行复合获得Au‑MoS2纳米颗粒,再经过3‑乙基‑2‑[7‑(3‑乙基‑2‑苯并噻唑啉)‑1,3,5‑庚三烯]碘化苯并噻唑修饰及透质明酸包封获得纳米探针。利用本方法制备的纳米探针粒径可调,单分散且稳定性好,借助SERS成像技术可对细菌可快速灵敏标记(0.1s/dot)、细菌检测下限为102CFU/mL。本发明纳米探针不仅可利用SERS信号增强显着标识细菌感染部位辅助诊断;且利用光热疗法联合过氧化物酶活性协同杀伤感染部位细菌,达到显著治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料领域,尤其涉及一种近红外SERS信号增强纳米探针及其制备方法和在一体化诊疗感染细菌中的应用。
背景技术
细菌感染引起的疾病已经对全世界人类健康构成威胁。依靠抗生素治疗细菌感染性疾病已经成为普遍的治疗方法,但是过度使用抗生素也导致了多重耐药(MDR)细菌如MRSA的出现。世界卫生组织报道指出,与MDR细菌相关的传染病每年在全世界造成70多万人死亡。因此迫切需要微生物耐药性发展可能性低的替代治疗策略。随着纳米酶研究的不断深入,同时具有多重类酶活性的纳米酶被逐渐开发出来并应用于抗菌。Tao Yu1等发现将纳米金(AuNPs)固定在生物功能化的双功能介孔二氧化硅(MSN)上,所形成的纳米金体系(MSN-AuNPs)同时具有POD和类氧化酶(OXD)活性,可将其应用于抗菌。研究表明,单一采用纳米酶抗菌,很难实现对MDR细菌长期有效的杀灭,但提高纳米酶剂量会对正常组织产生毒性。同样地,仅使用PTT疗法对抗MDR,几乎不能将细菌全部杀死。因此,开展多种治疗方式联合抗击MDR细菌的策略将显著增加抗菌效果,实现协同抗菌的目的。
目前基于拉曼的方法可用作微生物群落成像的工具,通过样品扫描生成光谱图很慢,即使是仅包含几百个像素的原始图像也需要好几个小时,这是限制拉曼成像用于生物体的主要原因之一。在拉曼对生物成像的领域中,Loza F. Tadesse2等人研究了金纳米棒和细菌之间的等离子体和静电相互作用,从而实现细菌的表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering,简称SERS)标记,合成了五种纳米棒尺寸,纵向等离子共振范围从670到860nm,并表征水中革兰氏阴性大肠杆菌和粘质沙雷氏菌以及革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的SERS特征,证明了SERS特征可用于生物样品的检测,但由于不加修饰的金纳米棒容易聚集,无法区分生物背景的干扰,限制其在体内应用。而MichaelE.Hickey和Lili He3使用表面增强拉曼光谱将3-巯基苯基硼酸 (3-MPBA)用作细菌检测的捕获剂和标记物,进一步以3-MPBA作为SERS标签研究细菌种群。但因暴露的3-MPBA对细菌的生态学形貌造成破坏,另外作为拉曼信号标签的3-MPBA具有潜在的生物毒性,限制了其在生物体内的应用。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种近红外SERS信号增强纳米探针的制备方法,解决了现有技术存在的问题。
本发明采用一种近红外SERS信号增强纳米探针的制备方法,包括以下步骤:称取星形纳米金颗粒和硫化钼纳米颗粒进行复合获得Au-MoS2纳米颗粒,再经过3-乙基-2-[7-(3-乙基-2-苯并噻唑啉)-1,3,5-庚三烯]碘化苯并噻唑修饰及透质明酸包封获得纳米探针。
优选地,星形纳米金颗粒由以下方法制备而得:在100mL浓度为1mM的氯金酸中加入100μL浓度为1M的盐酸,再加入1mL氯金酸、4mL浓度为1mM 的硝酸银及0.5mL浓度为100mM的抗坏血酸搅拌,最后加入1mL质量分数为1%的柠檬酸钠稳定。
优选地,硫化钼纳米颗粒由以下方法制备而得:称取1.235g七钼酸六铵四水合物、0.533g硫脲和1.4g聚乙烯吡咯烷酮加入20mL去离子水中搅拌溶解,后转移至高压反应釜中于220℃反应18h。
优选地,Au-MoS2纳米颗粒由以下方法制备而得:称取2mg MoS2置于超纯水超声振荡,再加入1mg Au NS快速搅拌6h。
优选地,修饰步骤中Au-MoS2纳米颗粒质量为1g;3-乙基-2-[7-(3-乙基-2- 苯并噻唑啉)-1,3,5-庚三烯]碘化苯并噻唑质量为1mg。
优选地,包封步骤中,修饰后的Au-MoS2纳米颗粒质量为10mg,透质明酸质量为2mg。
本发明另一方面还提供了一种近红外SERS信号增强纳米探针及该探针在制备细菌一体化诊疗药物中的应用。
采用本发明所提供的一种近红外SERS信号增强纳米探针的制备方法,由星形金纳米颗粒和硫化钼纳米颗粒复合,DTTC修饰及HA包封获得纳米探针 AMD@HA,粒径可调,单分散且稳定性好,借助SERS成像技术对细菌可快速灵敏标记(0.1s/dot)、检测下限可达102CFU/mL;进一步地,本纳米探针 AMD@HA拉曼信号强度相对于未修饰的DTTC得到飞跃式提升,拉曼位移峰信号增强104数量级;进一步地,本纳米探针AMD@HA可使用波长为785nm的近红外光激发,最大程度减少细胞和组织自发荧光的干扰,从而获得最佳的成像衬度,使得SERS标记可以在活体中进行无损成像;进一步地,本纳米探针 AMD@HA稳定性好,生物安全性高,以透质明酸HA作为扩散屏障,既增加了复合纳米探针的生物相容性,也避免了拉曼信号分子和周围正常组织的结合,从而形成对细菌的特异性成像;
进一步地,本纳米探针AMD@HA体内外研究表明,本材料可通过SERS 显着标识感染部位,并使用光热疗法(PTT)联合POD活性的纳米酶协同对感染部位细菌杀伤,从而明显提高治疗效果。因此,基于本发明纳米探针AMD@HA 可对感染细菌进行有效的SERS标记监测、通过光热疗法(PTT)联合过氧化物活性的纳米酶协同杀伤感染部位细菌,从而对感染细菌实现诊疗一体化。
附图说明
图1分别为Au NS纳米颗粒(a)、MoS2纳米颗粒(b)、AMD@HA 纳米探针(c)的SEM图;
图2为AMD@HA纳米探针的紫外吸收光谱图;
图3为不同浓度的AMD@HA纳米探针的SERS信号强度;
图4为不同浓度下光热升温曲线;
图5为不同浓度下的光热图像;
图6为AMD@HA纳米探针的过氧化物酶活性变化图;
图7为AMD@HA纳米探针的SERS信号对不同浓度细菌的标记;
图8为SERS信号强度与细菌浓度的相关性曲线;
图9为AMD@HA纳米探针对不同浓度细菌的标记的SERS图;
图10为AMD@HA纳米探针的小鼠体内SERS成像,其中a为小鼠的细菌感染伤口的不同时间SERS检测结果,b小鼠脓肿部位的照片,c-d分别不同天数的伤口部位细菌监测照片和曲线图;
图11为AMD@HA纳米探针的体内治疗效果图,其中a-b分别为感染伤口的光热图像和光热升温曲线,c-d为AMD@HA治疗后感染伤口的愈合照片和感染伤口面积与治疗时间的曲线图;
图12为AMD@HA纳米探针的体内安全性评估结果,其中a为细胞毒性测试结果,b为主要器官的变化图片。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
实施例一:如反应式1,一种近红外SERS信号增强纳米探针的制备方法,包括以下步骤:
S101星形纳米金颗粒(Au NS)的制备:在100mL浓度为1mM的氯金酸中加入100μL浓度为1M的盐酸,再向其中加入1mL氯金酸及4mL 浓度为1mM的硝酸银,再向其中加入0.5mL浓度为100mM的抗坏血酸搅拌2min,最后加入1mL 1mg/mL的柠檬酸钠稳定、经过透析及干燥处理获得星形纳米金颗粒(Au NS);
S102硫化钼纳米颗粒(MoS2)的制备:称取1.235g七钼酸六铵四水合物(NH4)6Mo7O24·4H2O)、0.533g硫脲(NH2CSNH2)和1.4g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入20mL去离子水中搅拌溶解,后转移至25mL高压反应釜中于220℃反应18h,最后经过透析及干燥处理获得硫化钼纳米颗粒;
S103复合纳米颗粒(Au-MoS2):称取2mg MoS2置于60mL超纯水超声振荡30min,加入1mg Au NS快速搅拌6h后经过透析及干燥处理获得 Au-MoS2复合纳米颗粒;
S104基于DTTC修饰后的复合纳米颗粒(Au-MoS2-DTTC):将1g S103 步骤中的复合纳米粒子中加入1mg 3-乙基-2-[7-(3-乙基-2-苯并噻唑啉)-1,3,5- 庚三烯]碘化苯并噻唑(DTTC)搅拌12h后经过透析及干燥处理获得 Au-MoS2-DTTC;
S105近红外SERS信号增强纳米探针:将10mg S104步骤中的 Au-MoS2-DTTC和2mg透质明酸HA混合搅拌12h获得纳米探针 AMD@HA。
(1)对实施例一制备的中间产物及纳米探针AMD@HA进行表征
对星形纳米金颗粒(Au NS)、硫化钼纳米颗粒(MoS2)及纳米探针 AMD@HA进行扫描电镜(SEM)测试,如图1a结果可知,Au NS纳米颗粒的形貌为星形,平均粒径在80nm;如图1b结果可知,MoS2纳米颗粒平均粒径为100nm,分散均匀;如图1c结果可知,AMD@HA纳米颗粒形貌完整,尺寸均一,粒径大小在100nm左右。且通过紫外吸收测试结果(图2) 显示AMD@HA纳米颗粒在785nm波段处具有明显的近红外特征吸收峰。
(2)对纳米探针AMD@HA的SERS性能、光热性能及酶活性进行测试 SERS性能调控方法:将实施例一的AMD@HA纳米颗粒用于拉曼制样,设置以下相同参数进行扫描:激光波长为785nm,物镜10倍,扫描时间1s,光栅为600nm,累计次数1次,滤光片衰减100%,扫描之前均通过RTD 模式将峰值最高处。如图3的拉曼光谱图测试显示AMD@HA纳米探针拉曼位移的尖峰和窄峰主要在491、507、783.7、846.1、1132.3和1233.1cm-1的波数处。AMD@HA纳米探针的SERS信号随着浓度增大而增强,当 AMD@HA纳米探针浓度为100μg/mL时,与同浓度下DTTC拉曼光谱相比, AMD@HA在507cm-1处的拉曼位移峰信号增强了104数量级。
光热性能测试方法:配制不同浓度的AMD@HA纳米探针水溶液(0 μg/mL,62.5μg/mL,125μg/mL,250μg/mL,500μg/mL,1000μg/mL)并对其进行光热升温实验,不同浓度的AMD@HA纳米探针水溶液在近红外激光(808nm,1.5W/cm2)下照射600s,使用热红外成像仪每隔10s记录温度。
通过图4的光热升温曲线和图5的光热图像表明,本发明制备的纳米探针的温度在300s内可以快速升高,最高可达70℃以上,具有较高的光热转换效应(27.2%),且随着纳米探针浓度的增大,其升温速率变快,说明所制备的纳米探针具有高效光热治疗的潜力。
复合纳米材料的过氧化物酶活性表征:将不同浓度的AMD@HA纳米探针加入到不同pH的0.1M的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中,其中H2O2的最终浓度为0.5M,TMB的最终浓度为0.4mM,混合之后,分别于不同的时间点测定溶液在652nm处的吸光度。之后加入终止剂H2SO4,终止酶促反应。
本酶活性测试机理为AMD@HA催化H2O2产生·OH,同时TMB被氧化为oxTMB,而oxTMB会显示出在652nm处的紫外吸收。如图6结果表明随着AMD@HA浓度的增加,氧化型oxTMB的产生量越多,表明过氧化物酶活性越高。在加入H2SO4之后,652nm处吸收峰消失,在450nm出现新的吸收峰,证明酶促反应终止。也进一步验证了本材料的高过氧化物酶活性可导致细菌本身产生的H2O2转化为羟基自由基,进而杀伤细菌。
(3)利用AMD@HA纳米探针对体外细菌的检测实验:
培养不同浓度的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA细菌)和200ug/mL AMD@HA探针共孵育4h,孵育后离心弃去未结合的纳米探针,将离心后聚集的细菌进行SERS信号监测,在507cm-1处,监测到纳米探针中DTTC的信号强度,作细菌浓度之间的拟合曲线。通过复合纳米粒子中拉曼信号分子的特征强度来标定细菌浓度。
不同浓度MRSA细菌(101-106CFU)的拉曼光谱图如图7,结果显示出随着细菌浓度升高,SERS信号强度增加,说明所制备的纳米探针和MRSA 表面可在6h进行强静电结合,从而对MRSA细菌的浓度进行准确标定。进一步地,图8为SERS信号强度与细菌浓度的相关曲线,说明本材料的SERS 信号强度与细菌浓度呈线性关系(Y=9.27x+0.27)。另外AMD@HA探针最低可标记102CFU的细菌,说明所制备的AMD@HA纳米探针对低浓度MRSA 细菌感染可实现快速、准确和高灵敏度检测。SERS图像并非对细菌信号的捕获,而是AMD@HA对细菌标记后,对标记部位的AMD@HA中的拉曼信号分子DTTC在507cm-1的特征峰进行检测(图9)。使用507cm-1处的拉曼位移峰进行检测,可以在1×102CFU/mL的最小浓度下标记MRSA细菌。收集到的SERS标记的细菌范围从1×102-1×106的不同细菌数,表明 ADM@HA中的HA在细菌感染部位被HA酶裂解,从而暴露DTTC,通过静电作用和细菌紧密结合,清晰地看到SERS对细菌的成像,具有优越的信噪比(图9)。
(4)利用AMD@HA纳米探针对小鼠体内细菌感染的监测及诊断
对小鼠皮下脓肿模型中细菌的SERS监测:使用6-8周小鼠(体重16-20 g),腹腔注射1%戊巴比妥钠(50mg/kg),待小鼠进入麻醉状态后,酒精消毒皮肤,将其造模部位皮肤脱毛,皮下注射MRSA细菌(108CFU/mL,100 μL),24h后形成皮下感染模型。后注射100μL浓度为2mg/mL的AMD@HA 纳米探针,在1h、2h、4h、6h、8h、12h及24h分别对小鼠感染部位进行SERS成像,测试纳米探针对细菌的标记情况。即感染细菌后的小鼠伤口进行SERS检测结果如图10a,通过不同时间纳米探针在伤口部位聚集情况,可看出在尾静脉注射4h后,纳米探针开始在伤口感染部位进行聚集,并长时间滞留在伤口感染部位,在16h后,信号并没有明显减弱。而图10b得小鼠脓肿部位的照片展示的脓肿部位与图10a结果吻合,进一步验证AMD@HA优异的SERS成像性能,可在不同天数进行伤口部位细菌监测(图10c和10d),及有效监测整个伤口愈合时期内的细菌感染数量,对细菌感染部位的定位诊断及干预治疗起引导作用。
(5)利用AMD@HA纳米探针对体内细菌感染进行光热治疗
构建MRSA细菌致小鼠皮肤感染模型,使用100μL AMD@HA纳米探针行尾静脉注射,4h后利用808nm激光器(1.5W/cm2,5min)对MRSA 感染部位照射,每隔两天拍照记录小鼠感染部位的溃烂情况。结果如图11a 和11b所示,经过激光器(波长为808nm、光强为1.5W/cm2)照射时,300 s内可以升温至50℃。图11c和11d结果显示,与不进行激光照射的对照组相比,经纳米探针光热治疗后,小鼠感染部位的溃烂得到了快速好转,12天后得到了完全治愈,说明本发明制备的纳米探针可实现对体内细菌感染的高效光热治疗。
(6)AMD@HA纳米探针的安全性测试
安全性评估:测试了加NIR激光照射和不加NIR激光照射的不同浓度的 AMD@HA对L929细胞的体外细胞毒性。在给药和加激光给药治疗14天后,进行了主要器官的组织学评估以及血液的溶血实验,同时对老鼠在治疗周期中的体重进行监测。对治疗14天后的鼠血进行了血常规测试。
通过(图12a)体外细胞水平评估,结果表明,AMD@HA对正常细胞没有明显的细胞毒性。图12b显示AMD@HA给药和激光照射后,主要器官的组织学评估,包括心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺,未出现异常。进一步的溶血实验也同样表明AMD@HA体内相容性高,没有观察到体重减轻或血液生化和血液学指标的明显迹象,表明肝脏和肾脏的功能正常。
综上所述,采用本发明所提供的方法,依次通过Au NS纳米颗粒的制备、 MoS2纳米颗粒的制备,Au NS和MoS2的复合(Au-MoS2),拉曼信号分子 DTTC的修饰以及最外层HA的修饰获得近红外SERS信号增强纳米探针。
本发明一方面利用静电作用在带有正电的AMD@HA纳米颗粒表面包裹不带电的HA层,HA在正常生理环境中不易裂解,满足了应用在体内的纳米探针所必备稳定性及安全性,同时避免在体内循环时复合纳米粒子表面的信号分子DTTC脱落;另一方面通过细菌在感染部位产生的HA酶,将纳米探针表面包裹的HA裂解,暴露出SERS成像信号分子DTTC,使得纳米粒子带强正电,从而和细菌表面所带负电的膜蛋白进行结合,最终实现体内细菌感染的高灵敏度诊断。另外本发明的AMD@HA纳米探针不仅具有过氧化物酶活性,可将体内H2O2催化形成·OH,从而对细菌进行杀伤;且在808nm 具有光热转换效应,可实现对体内细菌感染的高效光热治疗。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明保护的范围之内。
Claims (3)
1.一种近红外SERS信号增强纳米探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:称取星形纳米金颗粒和硫化钼纳米颗粒进行复合获得Au-MoS2纳米颗粒,再经过3-乙基-2-[7-(3-乙基-2-苯并噻唑啉)-1,3,5-庚三烯]碘化苯并噻唑修饰及透质明酸包封获得纳米探针,所述Au-MoS2纳米颗粒由以下方法制备而得:称取2mg硫化钼置于超纯水超声振荡,再加入1mg星形纳米金颗粒快速搅拌6h,所述修饰步骤具体为由1g Au-MoS2纳米颗粒加入1mg 3-乙基-2-[7-(3-乙基-2-苯并噻唑啉)-1,3,5-庚三烯]碘化苯并噻唑搅拌获得,所述包封步骤中,10mg修饰后的Au-MoS2纳米颗粒加入2mg透质明酸搅拌获得,所述星形纳米金颗粒由以下方法制备而得:在100mL浓度为1mM的氯金酸中加入100μL浓度为1M的盐酸,再加入1mL氯金酸、4mL浓度为1mM的硝酸银及0.5mL浓度为100mM的抗坏血酸搅拌,最后加入1mL质量分数为1%的柠檬酸钠稳定,经过透析及干燥处理;所述硫化钼纳米颗粒由以下方法制备而得:称取1.235g七钼酸六铵四水合物、0.533g硫脲和1.4g聚乙烯吡咯烷酮加入20mL去离子水中搅拌溶解,后转移至高压反应釜中于220℃反应18h,经过透析及干燥处理。
2.一种近红外SERS信号增强纳米探针,根据权利要求1任一项方法制备而得。
3.权利要求2所述的一种近红外SERS信号增强纳米探针在制备细菌一体化诊疗药物中的应用。
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2022
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CN115531539A (zh) | 2022-12-30 |
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