CN115531535A - 用于光化学控制mTOR信号传导和mTOR依赖性自噬的组合物和方法 - Google Patents

用于光化学控制mTOR信号传导和mTOR依赖性自噬的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

开发了用于在受试者的组织中选择性抑制mTOR和/或增加自噬的组合物和方法，用于治疗癌症。提供了包含可光裂解的保护基团的笼锁的mTOR抑制剂前药以用于通过光化学治疗系统进行选择性化疗。提供了用可光去除的保护基团去活化(笼锁)以可控地阻断抑制剂的抑制活性的mTOR抑制剂的药物组合物。可光去除的基团在暴露于光照射后可裂解，在照射部位释放mTOR信号传导和自噬的活性抑制剂。示例性的笼锁的mTOR抑制剂前药是具有与其结合的DEACM部分的笼锁OSI‑027前药(cOSI‑027)。通过暴露于420nm的光以去除DEACM保护基团，从而在肿瘤区域激活cOSI‑027。

Description

用于光化学控制mTOR信号传导和mTOR依赖性自噬的组合物和 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年6月28日提交的美国临时申请号63/215,814的权益和优先权，该申请在此通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明大体上涉及抗癌治疗，特别是涉及作为治疗癌症的可控局部疗法的光可激活的mTOR抑制和自噬增强。
背景技术
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它在调节细胞代谢、增殖和存活中发挥重要作用(Faivre等人，Nature Reviews Drug Discovery 2006,5(8),671-688；Guertin等人，Cancer Cell 2007,12(1),9-22；Meric-Bernstam等人，J ClinOncol 2009,27(13),2278-2287；和Wullschleger等人，Cell 2006,124(3),471-484。)据报道，PI3K/Akt/mTOR通路是各种类型的癌症中最常见的失调通路(Engelman等人，NatureReviews Genetics 2006,7(8),606-619；Liu等人，Nature Reviews Drug Discovery2009,8(8),627-644；Samuels等人，Science 2004,304(5670),554-554)。因此，mTOR信号通路为各种癌症类型提供了合适的治疗靶点。
mTOR蛋白通过与其它蛋白结合形成两个大分子复合物(mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2))来调节下游信号通路。mTORC1在营养和能量感知以及调节蛋白质代谢方面发挥着重要作用。mTORC2通过刺激F-肌动蛋白应力纤维、桩蛋白、RhoA、Rac1、Cdc42和蛋白激酶C蛋(PKC酶力发挥作为肌动蛋白细胞骨架的调节剂的作用(Dos等人，CurrentBiology2004,14(14),1296-1302)。mTORC2蛋白还通过磷酸化Akt影响细胞增殖和存活。
自噬是与mTOR信号通路密切相关的过程。作为高度保守的细胞降解和再循环过程，它参与调节细胞稳态并且影响人类健康和病理生理学的多个方面(Parzych等人，Antioxid Redox Signal 2014,20(3),460-473)。例如，氨基酸饥饿可降低mTORC1信号传导的活性并诱导自噬体的形成，该自噬体与溶酶体融合以形成自溶酶体，用于蛋白质降解和氨基酸供应。虽然自溶酶体的形成通常是对应激(比如饥饿等)的适应性过程以促进细胞存活，但自噬也可以抑制细胞增殖并介导细胞死亡，这种细胞死亡被称为II型程序性细胞死亡或自噬性细胞死亡(Tsujimoto等人，Cell Death&Differentiation 2005,12(S2),1528-1534；Shimizu等人，Nature Cell Biology 2004,6(12),1221-1228)。此外，自噬的过度激活可能导致细胞器彻底降解，从而导致细胞死亡(Kroemer,G等人，Nature ReviewsMolecular Cell Biology 2008,9(12),1004-1010)。因此，mTOR信号传导和自噬过程能够为癌症治疗策略提供靶点。
许多mTOR抑制剂已被考虑用于抗癌疗法，包括OSI-027(Mateo等人，Br J Cancer114,889-896(2016))。与mTORC1变构抑制剂雷帕霉素不同，OSI-027可以通过与mTOR蛋白上的ATP竞争性结合位点结合来抑制mTORC1和mTORC2通路。
已知mTORC1抑制剂(比如雷帕霉素等)可通过S6K1和IRS-1之间的负反馈回路诱导Akt的过度激活，这可能导致化疗耐药性(O’Reilly等人，Cancer Res 2006,66(3),1500-8)。然而，OSI-027可有效用于对雷帕霉素不敏感的癌症治疗，因为其具有完全阻断PI3K/Akt/mTOR通路的能力。PI3K/Akt/mTOR通路广泛地影响蛋白质和脂质合成、细胞骨架组织和细胞存活。此外，据报道，自噬在介导OSI-027诱导的细胞死亡中发挥重要作用(Bhagwat等人，Mol Cancer Ther 2011,10(8),1394-406；O’Connor等人，Cancer Research 2011,71(8Supplement),4463-44630)。因此，与许多其它候选药物相比，OSI-027表现出更强的细胞增殖抑制和更高的抗癌潜力。
不幸的是，OSI-027疗法会引起明显的不良副作用。正如最新的I期临床试验(NCT00698243)所报道，尽管29.7％的患者在8周至12周的随访评估中病情稳定，其中6名患者的病情无进展达24周以上，但OSI-027引起了剂量限制性毒性(DLT)和不良反应。根据试验观察，药物诱导了疲劳、胃肠道病症、心脏功能下降和心肌病、骨痛和高血糖。重要的是，OSI-027疗法还经常导致肾功能不全，这可能是由于mTOR抑制对肾小球通透性和急性肾小管坏死的影响(Mateo等人，British Journal of Cancer 2016,114(8),889-896)。因此，需要改善OSI-027作为治疗药物的特异性，并显著减少或避免与mTOR抑制作为抗癌疗法相关的不良反应。
因此，本发明的一个目的是提供通过高选择性地、可控地抑制mTOR和增强自噬来治疗癌症的组合物及其使用方法。
另一个目的是提供用于增强mTOR抑制剂的特异性的组合物和方法。
本发明的又一个目的是提供用于减少与mTOR抑制剂用于抗癌疗法相关的不良反应的组合物和方法。
另一个目的是提供用于可控和局部增加自噬活性的组合物和方法。
发明内容
开发了用于在受试者的组织中选择性抑制mTOR和/或增强自噬的组合物和方法。提供了与可光裂解的保护基团结合的mTOR抑制剂，用于通过光化学治疗系统进行选择性化疗。提供了用可光去除的保护基团去活化(笼锁)以可控地阻断抑制剂的抑制活性的mTOR抑制剂。可光去除的基团通过光照射裂解以在照射部位释放mTOR信号传导和癌细胞增殖的活性抑制剂。
提供了用于在受试者中治疗癌症的药物组合物，其包括有效量的笼锁的mTOR抑制剂前药。笼锁的(caged)前药包括mTOR抑制剂和阻碍抑制剂活性的可光去除的笼锁部分。笼锁部分与抑制剂可逆地结合，并且在暴露于光照射后可在体内去除。在示例性的形式中，mTOR抑制剂是OSI-027。示例性的可光去除的笼锁部分是7-(二乙基氨基)-4-(羟甲基)-香豆素(DEACM)。进一步示例性的可光去除的笼锁部分如式III至式VIII所示。
还提供了在受试者中治疗癌症的方法。该方法包括向受试者施用有效量的笼锁的mTOR抑制剂前药(包括mTOR抑制剂和阻碍抑制剂活性的可光去除的笼锁部分)的步骤，以及用光照射癌症以将可光去除的笼锁部分从mTOR中去除的步骤。典型地，用光照射癌症包括将受试者的一个或多个癌细胞暴露于光，其中，光与前药相互作用以在受试者的一个或多个癌细胞中抑制mTOR和/或增强自噬。在一些形式中，光具有大于300nm(例如，约420nm)的波长。通常在向受试者施用前药后立即或至多1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时或60小时或至多1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或其任何组合，向受试者施加光照。典型地，向受试者全身性施用笼锁的mTOR抑制剂前药，随后用光照射受试者则仅限于受试者肿瘤部位的组织或器官。在一些形式中，该方法包括向受试者施用一种或多种额外的活性剂或程序。例如，在一些形式中，该方法包括在使用笼锁的mTOR抑制剂前药治疗之前或之后对受试者施用手术或放疗。
组合物和方法对于治疗特征在于PI3K/AKT/mTOR通路失调的癌症特别有效。示例性的可治疗的癌症包括：皮肤癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、脑癌、胃癌、食道癌、肺癌、肝癌和结肠癌。在特定的形式中，待治疗的癌症是黑色素瘤。在前药激活后，优选量的笼锁的mTOR抑制剂前药(包括mTOR抑制剂和阻碍抑制剂活性的可光去除的笼锁部分)在受试者中有效减少肿瘤大小、降低肿瘤活力、减轻肿瘤负荷、防止转移、减轻或预防癌症的一种或多种症状或其组合。在一些形式中，以笼锁的mTOR抑制剂前药的形式施用的mTOR抑制剂的量是如果在不存在笼锁的情况下全身性施用则对受试者有毒的量。
在一些形式中，该方法包括在施用笼锁的mTOR抑制剂前药之前、或在施用笼锁的mTOR抑制剂前药之后、或在这两种情况下识别或监测癌症的一个或多个步骤。在进一步的形式中，该方法在受试者的相同或不同部位重复施用笼锁的mTOR抑制剂前药和用光照射癌症的步骤一次或多次，以减少肿瘤大小、减轻肿瘤负荷、降低肿瘤活力、防止转移或其组合。
在特定的形式中，用于治疗癌症的方法包括向患有癌症的受试者施用有效量的可光激活的mTOR抑制剂前药(包括与阻碍OSI-027的抗mTOR活性的7-(二乙基氨基)-4-(羟甲基)-香豆素(DEACM)结合的OSI-027)，以及用波长约420nm的光照射癌症。在另一种形式中，用于治疗癌症的方法包括向患有癌症的受试者施用有效量的可光激活的mTOR抑制剂前药(包括与阻碍OSI-027的抗mTOR活性的基于硼-二吡咯甲烷(BODIPY)的部分结合的OSI-027)，以及用波长约650nm的光照射癌症。有效量有效地在受试者的相同或不同部位有效减少肿瘤大小、减轻肿瘤负荷、降低肿瘤活力、防止转移、减轻或预防癌症的一种或多种症状或其组合。该方法在皮肤癌的诊断、预后、患者选择和治疗中特别有用。在某些形式中，该方法有效地治疗皮肤癌，包括基底细胞皮肤癌和鳞状细胞皮肤癌、Merkel细胞癌和黑色素瘤。
附图说明
图1是光控mTOR抑制系统的示意图。非活性的笼锁的OSI-027前药(cOSI-027)在暴露于420nm光照射后裂解为激活形式的OSI-027。然后活性的OSI-027阻断mTORC1和mTORC2活性，导致局部细胞增殖减少和局部细胞活力降低。
图2A至图2C示出了可光激活的笼锁的OSI-027前药(cOSI-027)的合成和检验。图2A是合成cOSI-027的示意图。图2B和2C分别示出了OSI-027和cOSI-027的1H-NMR谱图。
图3A至图3C是示出紫外可见光荧光光谱的图。图3A是分别示出了DEACM、OSI-027和cOSI-027的每一个随波长(250nm至500nm)变化吸光度(0至4a.u.)的图。图3B是分别示出了当cOSI-027以70mW/cm2在420nm光下分别暴露0min(新制)、1min、3min、5min、7min或10min时，其吸光度(0至4a.u.)随波长(250nm至500nm)变化的图。图3C是示出了当cOSI-027以70mW/cm2在420nm光下分别暴露0min(新制)、1min、3min、5min、7min或10min时，其荧光强度(0至3000a.u.)随波长(400nm至600nm)变化的图(激发波长为380nm)。
图4A和4B通过HPLC和定量分析示出了cOSI-027的光裂解。图4A是通过HPLC分析示出了cOSI-027的光裂解的线图，当以70mW/cm2在420nm光下分别暴露0min、1min、3min、5min、7min、10min或15min时，该HPLC分析是在342nm波长处、0至1000mA.U.范围内对cOSI-027和OSI-027进行检测。图4B是示出了剩余的cOSI-027(0μM至400μM)和释放的OSI-027(0SM至300μM)随光照射时间(分别为0min、1min、3min、5min、7min、10min或15min)变化的图。
图5是示出了与来自分别用DMSO(对照)、OSI-027、DEACM和cOSI-027中的每一个处理的细胞(各自暴露(+)或未暴露(-)于光(420nm，70mW/cm2，3min))中的p-S6K、S6K、p-Akt、Akt、mTOR和GAPDH中的每一个分别对应的条带的显微照片。
图6A至图6B示出了Western免疫印迹和自噬定量的结果。图6A是示出了与来自分别用DMSO(对照)、OSI-027、DEACM和cOSI-027中的每一个处理的细胞(各自暴露(+)或未暴露(-)于光)中的LC3-I、LC3-II和GADPH中的每一个对应的条带的显微照片。图6B是分别示出了图6A中每个条带(包括DMSO、OSI-027、DEACM和cOSI-027，各自暴露(+)或未暴露(-)于光)的归一化LC3-II/LC3-I比值(0至15)的图。用420nm LED进行光照射(70mW/cm2，3min)。
图7A至图7B是示出了在暴露于不同制剂之后mCherry和/或GFP的存在的显微照片及对应的定量分析。图7A是分别示出了在用DMSO、OSI-027、DEACM和cOSI-027中的每一种处理的细胞(各自用光照射或不用光照射)中mCherry和/或GFP的存在的一组显微照片。图7B是示出了图7A中每组的LC3斑点的数量(0至300)的图。用420nm LED进行光照射(70mW/cm2，3min)。
图8是示出了分别用DMSO(对照)、OSI-027、DEACM和cOSI-027(各50μ0)处理的细胞组(分别暴露(+)或不暴露(-)于光)的细胞活力(0％至150％)的条形图。用420nm LED进行光照射(70mW/cm2，3min)。
图9是示出了通过红光响应性的、基于BODIPY的、可光去除的保护基团笼锁的OSI-027的1H-NMR谱图。
图10A至图10C是通过HPLC分析示出了通过红光响应性的、基于BODIPY的PPG笼锁的OSI-027的光裂解的图。图10A示出了光照射前的OSI-027前药。图10B示出了在656nm光照射(100mW/cm2)达5min后的OSI-027前药，笼锁OSI-027前药的峰值显著降低，而游离OSI-027被释放。图10C示出了通过HPLC分析的游离OSI-027。
具体实施方式
I.定义
术语“mTOR抑制剂”或“哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂”或“mTOR拮抗剂”是指当施用于细胞时，特异性地阻碍或降低哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因产物的活性的药物物质。mTOR是蛋白激酶中的磷脂酰肌醇-3-激酶相关激酶家族的成员，其功能是与其它蛋白质相互作用并作为两种不同蛋白质复合物(mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC1))的核心成分以调节不同的细胞过程。mTORC1/mTORC2双重抑制剂被设计为与mTOR的催化位点中的ATP竞争。它们抑制mTORC1和mTORC2的激酶依赖性功能并阻断PI3K/AKT信号传导的反馈激活。
术语“光化学控制”或“光化学机制”是指对已经用可光裂解的保护基团去活化或“笼锁”的药效团结构的控制。根据需要，通过暴露在可引起笼锁药剂的光化学释放的波长的光照射来去除可光裂解的保护基团。
术语“光激活”或“光去除”或“光裂解”是指从已经用可光裂解的保护基团去活化或“笼锁”的药效团结构中去除可光去除的保护基团的过程。
术语“可光激活的前药”是指能够在受体上显示效果的已经用可光裂解的保护基团去活化或“笼锁”的药物。当通过暴露在具有可引起笼锁药剂的光化学释放的波长的光照射下来去除可光裂解的保护基团时，该药物变为被激活的。通常，在没有光照射的情况下，前药不会对受体表现出任何作用。
在抑制的上下文中，术语“抑制”或“减少”是指降低或减少活性和数量。这可以是活性或数量的完全抑制或减少，或者是部分抑制或减少。可以将抑制或减少与对照或标准水平进行比较。抑制可以作为％值来测量，例如1％至100％，比如5％、10％、25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％等。例如，包含mTOR抑制剂的组合物可在受体的癌细胞中使mTOR活性抑制或降低相同癌细胞在治疗前或未接受组合物或未用组合物治疗时的mTOR活性的10％、20％、30％、40％、50％、75％、85％、90％、95％或99％。在某些形式中，抑制和减少是根据受体中mRNA、蛋白质、细胞或组织的水平进行比较的。
术语“治疗”或“预防”是指在可能倾向于患有疾病、病症和/或病情但尚未被诊断为患有疾病、病症和/或病情的动物中改善、减少或以其它方式阻止疾病、病症或病情的发生或进展；抑制疾病、病症或病情，例如阻碍其进展；以及缓解疾病、病症或病情，例如引起疾病、病症和/或病情的消退。治疗疾病或病情包括改善疾病或病情的至少一种症状(即使潜在的病理生理学不受影响)，例如通过施用镇痛剂来治疗受试者的疼痛，虽然这种药剂不治疗疼痛的病因。治疗的理想效果包括降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。例如，如果缓解或消除了与癌症相关的一种或多种症状(包括但不限于降低和/或抑制肿瘤细胞增殖/生长的速率)，提高了患者的生活质量，降低了治疗疾病所需的其它药物的剂量，延缓了疾病的进展，和/或延长了个体的生存期，则个体被成功“治疗”。
术语“组合疗法”是指如下的疾病或其症状的治疗或用于实现所需生理变化的方法：其包括，向动物(例如哺乳动物，尤其是人类)施用有效量的两种或更多种化学药剂或成分以治疗疾病或其症状，或产生生理变化，其中，这些化学药剂或成分一起施用(例如作为同一组合物的一部分)，或在同一时间或不同时间分别且独立地施用(即，每种药剂或成分彼此间隔一段有限的时间施用)。
术语“给药方案”是指关于制剂、给药途径、药物剂量、给药间隔和治疗持续时间的药物施用方案。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”可互换使用，指的是哺乳动物，包括但不限于鼠类、猿类、人类、哺乳类家畜、哺乳类竞赛动物和哺乳类宠物。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指，例如，与未接受化合物治疗的相匹配的受试者相比，能够在被施用制剂的受试者中治疗癌症的一种或多种症状、逆转癌症的一种或多种症状的进展、阻止癌症的一种或多种症状的进展或预防癌症的一种或多种症状的发生的量。化合物的实际有效量可以根据所使用的具体化合物或其组合、配制的特定组合物、给药方式以及个体的年龄、体重、状况以及所治疗的症状或病情的严重程度而变化。
术语“药学上可接受的”或“生物相容的”是指，在合理的医学判断范围内，组合物、聚合物和其它材料和/或剂型适合用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。短语“药学上可接受的载剂”是指参与将任何主体组合物从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一个器官或身体的另一部分的药学上可接受的材料、成分或媒介(例如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包封材料)。在与主体组合物的其它成分相容并且对病人没有伤害的意义上，每种载剂都必须是“可接受的”。术语“药学上可接受的盐”是本领域公认的，包括化合物的相对无毒的无机酸和有机酸加成盐。药学上可接受的盐的示例包括：衍生自无机酸(例如盐酸和硫酸)的盐和衍生自有机酸(例如乙磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸)的盐。适用于形成盐的无机碱的示例包括：氨、钠、锂、钾、钙、镁、铝和锌的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。盐还可以由适合的有机碱形成，包括无毒且碱性强度足以形成这种盐的有机碱。出于说明的目的，这类有机碱可以包括：单烷基胺、二烷基胺和三烷基胺，例如甲胺、二甲胺和三乙胺；单羟烷基胺、二羟烷基胺或三羟烷基胺，例如单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺；氨基酸，例如精氨酸和赖氨酸；胍；N-甲基氨基葡萄糖；N-甲基葡萄糖胺；L-谷氨酰胺；N-甲基哌嗪；吗啉；乙二胺；以及N-苄基苯乙胺。
II.组合物
已证明mTOR抑制和/或自噬增强的光化学控制可以显著提高mTOR抑制剂用于临床治疗癌症中的选择性和特异性，同时降低毒性。提供了用于光化学控制mTOR抑制并减少副作用的组合物。
可光激活的mTOR抑制剂的组合物包含具有可光裂解的保护基团的去活化(笼锁)的mTOR抑制剂前药。当暴露于具有能够裂解保护基团并释放活性药物的波长的光源时，该组合物在受试者中的某个部位抑制mTOR和/或增加自噬。优选的可光激活的mTOR抑制剂是笼锁的OS1-027，其包括可光去除的部分DEACM。
A.mTOR抑制剂
光激活疗法包括一种或多种在体内抑制或降低哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因产物的活性的药剂。
mTOR是蛋白激酶中磷脂酰肌醇-3-激酶相关激酶(PI3K)家族的成员，它在调节细胞代谢、增殖和存活中发挥重要作用。mTOR是PI3K/AKT通路的下游效应子，其功能是与其它蛋白质相互作用并作为两种不同的蛋白质复合物(mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC1))的核心成分调节不同的细胞过程。mTORC1包括mTOR和两个正调控亚基、Raptor和哺乳动物LST8(mLST8)，以及两个负调控亚基、富含脯氨酸的AKT底物40(PRAS40)和DEPTOR。mTORC2包括mTOR、mLST8、mSin1、Protor、Rictor和DEPTOR。
典型地，mTOR抑制剂抑制或降低mTOR、PI3K、mTORC1、mTORC2或PI3K/Akt/mTOR通路中的一种或多种的活性。例如，在某些形式中，mTOR抑制剂抑制或降低mTORC1和mTORC2的部分或全部激酶依赖性功能；减少或阻止mTORC2或mTORC1或两者上的AKT磷酸化；阻断PI3K/AKT信号传导的反馈激活；当施用于受试者时，在受试者中减少蛋白质翻译、减弱细胞周期进程、抑制血管生成或其组合。在优选的形式中，mTOR抑制剂是mTOR/PI3K双重抑制剂。例如，在某些形式中，mTOR抑制剂抑制mTORC1、mTORC2和PI3K的所有催化同工型。在特别优选的形式中，mTOR抑制剂通过在肿瘤细胞中诱导G1期阻滞来阻断肿瘤细胞增殖；诱导肿瘤细胞凋亡；在肿瘤细胞诱导中自噬，或其组合。
在一些形式中，当以有效减少或预防肿瘤生长的量施用于患有癌症的受试者时，mTOR抑制剂具有细胞毒性和/或产生严重的不良副作用。
示例性的mTOR抑制剂是mTOR的小分子抑制剂。在一些形式中，mTOR抑制剂是雷帕霉素(也称为西罗莫司)或环孢素A。在其它形式中，mTOR抑制剂是雷帕霉素衍生物或类似物(雷帕霉素类似物(rapalog))，例如替西罗莫司(CCI-779)、依维莫司(RAD001)或地磷莫司(也称为AP23573)、乌米莫司(umirolimus)、佐他莫司。在其它形式中，mTOR抑制剂是“第二代”mTOR抑制剂，例如ATP竞争性mTOR激酶抑制剂。
在优选的形式中，mTOR抑制剂是OSI-027。
1.OSI-027
在某些形式中，mTOR抑制剂是小分子反式-4-[4-氨基-5-(7-甲氧基-1H-吲哚-2-基)咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-7-基]-环己烷甲酸(OSI-027)。OSI-027可以通过与mTOR蛋白上的ATP竞争性结合位点结合来抑制mTORC1和mTORC2通路。OSI-027已被证明可完全阻断PI3K/Akt/mTOR通路，该通路广泛地影响蛋白质和脂质合成、细胞骨架组织和细胞存活。OSI-027还用于对雷帕霉素不敏感的癌症治疗。OSI-027(CAS号936890-98-1)的结构如下式I所示。OSI-027可从多个商业来源获得(例如，Sigma Aldrich公司，产品ID：COMH95E954DD-250MG)。
Figure BDA0003717664920000101
一些其它的可被笼锁的mTOR抑制剂包括但不限于Torin2和PI103，它们也是市售的针对mTORC1和mTORC2二者的抑制剂。
B.可光去除的(笼锁)部分
可光激活的mTOR抑制剂包括一个或多个通过可光裂解的保护基团使mTOR抑制剂去活化(笼锁)的部分，该保护基团阻断抑制剂对mTOR的抑制作用。
可光去除的(有时称为可光释放的、可光裂解的或可光激活的)保护基团(PPGs)对各种化学物质(例如生物制剂(酶、神经递质和细胞信号分子等)的释放提供空间和时间上的控制。(Barltrop等人，Tetahedron Lett.1962,16,697；Barton等人，TetrahedronLett.1962,23,1055；Barton等人，J.Chem.Soc.1965,Patchornik等人，Am.Chem.Soc.1970,92,6333；Sheehan等人，J.Am.Chem.Soc.1964,86,5277；and Engels等人，J.Med.Chem.1977,20,907)。术语“笼锁”用于表明受PPG保护的化合物。
一般而言，PPG应在远大于300nm的波长处具有强吸收，该波长下的照射不太可能被生物实体吸收(以及不太可能对生物实体造成损害)。光反应应该以高量子产率或高释放效率Φrel发生。量子产率Φrel等于释放的底物量nrel/mol除以照射波长λ下被笼锁化合物吸收的光子量np/mol＝np/einstein：Φrel＝nrel/np。衡量PPG功效的重要度量是量子产率和PPG的摩尔十进制吸收系数ε的乘积，Φrelε(λirr)，它与给定激发波长下的释放量成正比(Klán等人，Chemical Reviews 2013 113(1),119-191DOI:10.1021/cr300177k)。
在优选的形式中，mTOR抑制剂是OSI-027，并且OSI-027的药效团被可光裂解的保护基团去活化(笼锁)以阻断其mTOR抑制作用。因此，在某些形式中，可光去除的基团在光照射后裂解以释放活性OSI-027，从而抑制mTOR信号传导和癌细胞增殖。在优选的形式中，可光激活的mTOR抑制剂是笼锁OSI-027前药(cOSI-027)。
1.可光去除的7-(二乙氨基)-4-(羟甲基)-香豆素(DEACM)
在特定的形式中，笼锁OSI-027前药是通过用可光裂解的7-(二乙氨基)-4-(羟甲基)-香豆素(DEACM)掩蔽OSI-027的羧基而产生的。DEACM具有快速的光裂解反应，适用于可见光，例如波长约为420nm的光。在没有使用约420nm波长的光照射时，笼锁OSI-027前药不会对mTOR表现出抑制作用。在420nm的光照射后，光化学释放的OSI-027游离药物阻碍mTOR在ATP竞争性催化位点的活性，以抑制mTORC1和mTORC2通路的磷酸化，从而减少蛋白质合成代谢和诱导自噬以阻碍细胞的增殖。光化学控制的mTOR抑制和自噬诱导的示意图如图1所示。下式II提供了7-(二乙氨基)-4-(羟甲基)-香豆素(DEACM)的化学结构。
Figure BDA0003717664920000121
7-(二乙氨基)-4-(羟甲基)-香豆素(Cas号：54711-38-5)可从多个商业来源获得(例如，Sigma Aldrich公司，产品ID：AMBH58064576-100MG)。
其它可以使用的可光去除的基团包括但不限于：7-二乙氨基-4-羟甲基-硫代香豆素、7-[双(羧甲基)氨基]-4-(羟甲基)香豆素、4-溴-2-硝基苄基、4,5-二甲氧基-2-硝基苄基、1-(6-硝基苯并二氧杂环戊烷-5-基)乙醇、1-(3-硝基二苯并呋喃-2-基)-乙醇、1,3,5,7-四甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐，3-(4-甲氧基)苯乙烯基-1,5,7-三甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3-(4-二甲氨基)苯乙烯基-1,5,7-三甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3,5-双苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3,5-双(4-甲氧基)苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3,5-双(4-二甲基氨基)苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3,5-双(4-(1,4,7,10-四氧杂十一烷基)苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3,5-双(4-甲氧基)苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基二甲基硼酸盐、3,5-双(4-二甲氨基)苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基二甲基硼酸盐。
2.可光裂解的硼-二吡咯甲烷(BODIPY)
吸收可见光/近红外光的硼-二吡咯甲烷(BODIPY)PPG具有易于调节的光谱特性和低光毒性，可用于保护基团的非侵入式光释放。因此，在某些形式中，PPG是基于BODIPY的PPG。下式III至下式VIII提供了BODIPY或其衍生物的化学结构。
Figure BDA0003717664920000131
Figure BDA0003717664920000141
在特定的形式中，笼锁OSI-027前药通过与BODIPY或其衍生物缀合而产生。
C.可光激活的mTOR抑制剂前药
提供了可光激活的mTOR抑制剂前药的组合物。该抑制剂前药包括被可光去除的部分笼锁的mTOR抑制剂。
典型地，在去除可光去除的部分之前，笼锁的mTOR抑制剂前药在体内不会表现出与未笼锁的mTOR抑制剂相同的活性。例如，在一些形式中，当施用于受试者时，笼锁的mTOR抑制剂前药在受试者中不抑制或不降低mTOR、PI3K、mTORC1、mTORC2或PI3K/Akt/mTOR通路的一种或多种的活性；不抑制或不降低mTORC1和mTORC2的激酶依赖性功能；不减少或阻碍mTORC2或mTORC1或两者上的AKT磷酸化；不阻断PI3K/AKT信号传导的反馈激活；不减少蛋白质翻译、不减弱细胞周期进程、不抑制血管生成或其组合。典型地，笼锁的mTOR抑制剂前药在施用于患有癌症的受试者时没有细胞毒性和/或不会引起严重的不良副作用。
优选的可光激活的mTOR抑制剂是笼锁的OS1-027，其包括可光去除的部分DEACM。下式IX提供了笼锁的OSI-027(cOSI-027)的化学结构。
Figure BDA0003717664920000151
D.制剂
提供了包含具有与其结合的可光去除的基团的mTOR抑制剂的制剂和药物组合物。该制剂可以包含一种或多种与一个或多个可光去除的基团结合的mTOR抑制剂。在一些形式中，药物组合物包含一种或多种额外的活性剂。因此，在一些形式中，药物组合物包含两种、三种或更多种活性剂。药物组合物可以配制成药物剂量单位，称为单位剂型。
制剂通常包括有效量的一种或多种具有与其结合的可光去除的基团的mTOR抑制剂。下面更详细地讨论活性剂的有效量。应当理解，在一些形式中，具有与其结合的可光去除的基团的mTOR抑制剂在组合疗法中的有效量与其单独施用时能够达到相同效果的量不同。例如，在一些形式中，具有与其结合的可光去除的基团的mTOR抑制剂在组合疗法中的有效量是比其单独施用时的有效剂量更低的剂量。
1.递送媒介
活性剂或其前药可以在有或没有递送媒介的辅助的情况下被施用并摄取进入受试者的细胞中。适合用于本发明公开的活性剂的递送媒介在本领域中是已知的并且可以选择用以适配特定的试剂。例如，在一些形式中，活性剂被加入纳米颗粒、微粒、胶束、合成脂蛋白颗粒或碳纳米管中或被这些材料包封。例如，可以将组合物加入媒介(例如聚合物微粒)中，提供活性剂的控制释放。在一些形式中，药物的释放通过活性剂扩散出微粒和/或通过水解和/或酶促降解进行的聚合物颗粒降解来控制。适合的聚合物包括乙基纤维素和其它天然或合成纤维素衍生物。缓慢溶解并在水性环境中形成凝胶的聚合物(例如羟丙基甲基纤维素或聚环氧乙烷)也可以适合作为载药微粒的材料。其它聚合物包括但不限于：聚酸酐、聚(酯酸酐)、多聚羟酸(例如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚3-羟基丁酸酯(PHB)及它们的共聚物、聚4-烃基丁酸酯(P4HB)及它们的共聚物)、聚己内酯及其共聚物，以及它们的组合。在一些形式中，将两种药剂加入相同的微粒并配制成用于在不同时间和/或在不同时间段内释放。例如，在一些形式中，其中一种药剂在第二种药剂开始释放之前从微粒中完全释放。在其它形式中，在第一种药剂开始释放至全部释放期间，释放第二药剂。在其它形式中，两种药剂在相同时间段内或在不同时间段内同时释放。
活性剂可以加入由不溶于水溶液或缓慢溶于水溶液但能够通过某些方式(包括酶促降解、胆汁酸的表面活性剂作用和/或机械性溶蚀)在胃肠道内消化的材料制备的递送媒介。如本文所用，术语“缓慢溶于水”是指材料在30分钟内不溶于水。优选的示例包括脂肪、脂肪性物质、蜡类、蜡状物质及其混合物。适合的脂肪和脂肪性物质包括：脂肪醇(例如月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇、鲸蜡醇或鲸蜡硬脂醇)和脂肪酸及衍生物(包括但不限于脂肪酸酯、脂肪酸甘油酯(单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯)和氢化脂肪)。具体示例包括但不限于：氢化植物油、氢化棉籽油、氢化蓖麻油、氢化油(通过商品名
Figure BDA0003717664920000171
的产品获得)、硬脂酸、可可脂和硬脂醇。适合的蜡类和蜡状材料包括：天然或合成蜡、烃和常规蜡。
蜡类的具体示例包括：蜂蜡、糖蜡、蓖麻蜡、巴西棕榈蜡、石蜡和小烛树蜡。如本文所用，蜡状材料定义为在室温下通常为固体并且具有约30至300℃的熔点的任何材料。释放点和/或释放期可以如上文所讨论的那样变化。
2.药物组合物
提供了递送媒介的包含具有与其结合的可光去除的基团的mTOR抑制剂的药物组合物。药物组合物可用于通过肠胃外(肌肉内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、肠内或经粘膜(鼻、阴道、直肠或舌下)的给药途径施用或使用生物溶蚀性的植入物施用，并可配制成适用于每种给药途径的剂量形式。
在某些形式中，组合物是局部施用的，例如，通过直接注射到待治疗的部位(例如，注射到肿瘤中)。在一些形式中，将组合物注射或以其它方式直接施用到预定治疗部位的血管组织的血管中。在一些形式中，将组合物注射或以其它方式直接施用到邻近预定治疗部位的血管组织的血管中。通常，局部施用导致组合物的局部浓度增加，该浓度大于全身性施用所能达到的浓度。分子或制剂的靶向可用于实现更具选择性的递送。
a.用于肠胃外施用的制剂
具有与其结合的可光去除的基团mTOR抑制剂及其药物组合物可以在水溶液中通过肠胃外注射给药。该制剂还可以是悬浮液或乳液的形式。通常地，所提供的药物组合物包括有效量的活性剂并且任选地包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载剂。这种组合物包括：稀释剂(无菌水)、各种缓冲物质(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的缓冲盐水；以及任选的添加剂，例如去污剂和增溶剂(例如，
Figure BDA0003717664920000172
20、
Figure BDA0003717664920000173
80，也称为聚山梨醇酯20或80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)和防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇)以及填充物质(例如，乳糖、甘露醇)。非水溶剂或媒介的示例为：丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油和玉米油)、明胶以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。制剂可以是冻干的并在使用前立即复溶/重悬。可以通过例如，细菌截留过滤器过滤、在组合物中加入灭菌剂、照射组合物或加热组合物对制剂进行消毒。
b.肠内制剂
适合口服的剂型包括片剂、胶囊剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和锭剂。片剂可以使用本领域熟知的压缩或模制技术制备。明胶或非明胶胶囊可以使用本领域公知的技术制备成硬胶囊壳或软胶囊壳，其可以包封液体、固体和半固体填充材料。可以使用药学上可接受的载剂制备制剂。本文通常使用的“载剂”包括但不限于：稀释剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、溶胀剂、填充剂、稳定剂及其组合。例如，在一些形式中，笼锁的mTOR抑制剂前药(例如式IX中列出的cOSI-027)是肠内施用的。
c.延长释放制剂和其它制剂
可选地，可以使用等渗系统或通过在剂型上施加半渗透包衣来制备延长释放制剂。在后一种情况中，可以通过以合适的比例组合低渗透性和高渗透性包衣材料来实现所需的药物释放曲线。
上述具有不同药物释放机制的方案可以组合在包含单个单元或多单元的最终剂型中。多单元的示例包括但不限于：多层片剂和含有片剂、球粒或颗粒的胶囊。可以通过使用包衣或压缩工艺将立即释放层施加到延长释放核心上或者添加到比如包含延长释放和立即释放球粒的胶囊等的多单元系统中来将立即释放部分添加到延长释放系统中。
含有亲水性聚合物的延长释放片剂是通过本领域公知的技术制备的，例如直接压片、湿法制粒或干法制粒。其制剂通常包含聚合物、稀释剂、粘合剂和润滑剂以及活性药物成分。常用的稀释剂包括惰性粉末物质，例如淀粉、粉状纤维素(尤其是结晶和微晶纤维素)、糖(例如果糖、甘露醇和蔗糖)、谷物粉以及类似的可食用粉末。例如，典型的稀释剂包括：各种类型的淀粉、乳糖、甘露醇、高岭土、磷酸钙或硫酸钙、无机盐(例如氯化钠)和糖粉。粉状纤维素衍生物也是可用的。典型的片剂粘合剂包括：淀粉、明胶和糖类(例如乳糖、果糖和葡萄糖)。也可以使用天然的和合成的胶类，包括：阿拉伯胶、海藻酸盐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。聚乙二醇、亲水聚合物、乙基纤维素和蜡类也可以用作粘合剂。片剂制剂中需要润滑剂以防止片剂和冲头粘在模具中。润滑剂选自滑性固体，例如滑石、硬脂酸镁和硬脂酸钙、硬脂酸和氢化植物油。
含有蜡质材料的延长释放片剂通常使用本领域已知的方法(例如直接混合法、凝固法和水分散法)制备。在凝固法中，将药物与蜡质材料混合，然后进行喷雾凝固或凝固后进行筛选和加工。
延迟释放制剂可以通过用不溶于胃的酸性环境但溶于小肠的中性环境的聚合物薄膜包衣固体剂型来制造。
例如，可以通过用选择的包衣材料来包被药物或含药组合物来制备延迟释放剂量单位。例如，含药组合物可以是例如用于加入到胶囊中的片剂、用作“包衣芯”剂型中的内核的片剂或用于加入到片剂或胶囊中多个含药球粒、微粒或颗粒。优选的包衣材料包括可生物溶蚀性的、逐渐水解的、逐渐水溶性的和/或酶促降解的聚合物，以及可以是常规的“肠溶”聚合物。如本领域技术人员所理解的，肠溶聚合物在下消化道的较高pH环境中变得可溶或随着剂型通过消化道而缓慢溶蚀，而酶促降解聚合物是被存在于下消化道中(尤其是结肠中)的细菌酶降解。适合用于实现延迟释放效果的包衣材料包括但不限于：纤维素聚合物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、偏苯三酸乙酸纤维素和羧甲基纤维素钠；丙烯酸聚合物和共聚物，优选由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或甲基丙烯酸乙酯以及其它甲基丙烯酸树脂形成丙烯酸聚合物和共聚物，这些可通过市售商品名
Figure BDA0003717664920000191
(Rohm Pharma；Westerstadt，Germany)的产品获得，
Figure BDA0003717664920000192
的产品包括：
Figure BDA0003717664920000193
L30D-55和L100-55(在pH5.5及以上可溶于)，
Figure BDA0003717664920000194
L-100(在pH6.0及以上时可溶)、
Figure BDA0003717664920000195
S(由于酯化程度较高，在pH7.0及以上可溶)以及
Figure BDA0003717664920000196
NE、RL和RS(具有不同程度的渗透性和膨胀性的非水溶性聚合物)；乙烯基聚合物和共聚物，例如聚乙烯吡咯烷酮、乙酸乙烯酯、邻苯二甲酸乙酸乙烯酯、巴豆酸乙酸乙烯酯共聚物和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；酶促降解的聚合物，例如偶氮聚合物、果胶、壳聚糖、直链淀粉和瓜尔胶；玉米醇溶蛋白和虫胶。也可以使用不同包衣材料的组合。也可以应用使用不同聚合物的多层涂层。
特定包衣材料的优选包衣重量可由本领域技术人员通过评估具有不同用量的各种包衣材料制备的片剂、球粒和颗粒剂的个体释放曲线而容易地确定。其是产生所需释放特性的材料、方法和应用形式的组合，只能从临床研究中确定。
包衣组合物可包括常规的添加剂，例如增塑剂、色素、着色剂、稳定剂、助流剂等。增塑剂是通常存在的，以降低包衣的脆性，且通常相对于聚合物的干重约占10wt.％至50wt.％。代表性的增塑剂的示例包括：聚乙二醇、丙二醇、三乙酸甘油酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、蓖麻油和乙酰化单甘油酯。优选使用稳定剂来稳定分散体中的颗粒。代表性的稳定剂是非离子乳化剂，例如失水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯和聚乙烯吡咯烷酮。推荐使用助流剂减少成膜和干燥过程中的粘着效应，助流剂通常占包衣溶液中聚合物重量的约25wt.％至100wt.％。一种有效的助流剂是滑石粉。还可以使用其它助流剂，例如硬脂酸镁和单硬脂酸甘油酯。还可以使用色素，例如二氧化钛。还可以向包衣组合物中添加少量的消泡剂，例如硅氧烷(例如，二甲基硅油)。
优选地，水溶液是水、含有盐和/或缓冲剂的生理学上可接受的水溶液(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS))，或任何其它可施用于动物或人的水溶液。此类溶液是本领域技术人员熟知的，包括但不限于：蒸馏水、去离子水、纯水或超纯水、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)。其它适合的水性载剂包括但不限于林格氏溶液和等渗氯化钠。水性悬浮液可包括：悬浮剂(例如纤维素衍生物)、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和黄芪胶，以及润湿剂(例如卵磷脂)。适用于水性悬浮液的防腐剂包括：对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯。
在另一种形式中，属于低毒性有机(即非水性)第3类残留溶剂的溶剂(例如乙醇、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚和丙醇)可以用于制剂。溶剂的选择基于其容易使制剂雾化的能力。溶剂不应与化合物发生有害的反应。应使用合适的溶剂溶解化合物或形成化合物的悬浮液。溶剂应具有足够的挥发性以能够形成溶液或悬浮液的气溶胶。可以根据需要添加额外的溶剂或雾化剂(例如氟利昂)以增加溶液或悬浮液的挥发性。
在一种形式中，组合物可以包含少量的聚合物、表面活性剂或本领域技术人员熟知的其它赋形剂。在本文中，“少量”是指不存在可能影响或介导化合物在肺中的摄取的辅料，并且存在的辅料是以不会在肺中对化合物的摄取产生不利影响的量存在。
由于干燥脂质粉末的疏水特性，其可以直接分散在乙醇中。对于储存在有机溶剂(例如氯仿)中的脂质，将所需量的溶液放入小瓶中，并在氮气流下蒸发氯仿，在玻璃小瓶的表面形成干燥的薄膜。当用乙醇重构时，薄膜很容易溶胀。为了在有机溶剂中充分分散脂质分子，对悬浮液进行超声处理。也可以使用可重复使用的PARI LC Jet+雾化器(PARIRespiratory Equipment，Monterey，CA)在无水乙醇中制备脂质的非水悬浮液。
大粒径干粉制剂(“DPF”)具有更好的流动性特征，例如更少的聚集、更容易雾化以及潜在的更少的吞噬作用。尽管优选的空气动力学直径范围在1至10微米之间，但用于吸入疗法的干粉气雾剂通常主要以小于5微米范围内的平均直径生产。大“载剂”微粒(不含药物)与治疗性气雾剂共同递送，以帮助实现有效的雾化以及其它可能的益处。
可以使用单乳化和复乳化溶剂挥发、喷雾干燥、溶剂萃取、溶剂蒸发、相分离、简单和复杂凝聚、界面聚合以及本领域普通技术人员熟知的其它方法来制备聚合物微粒。可以使用本领域已知的制备微球或微胶囊的方法制备颗粒。优选的制造方法是喷雾干燥和冷冻干燥，这需要使用含有表面活性剂的溶液，喷雾形成所需大小的液滴，然后移除溶剂。
E.辅助疗法和附加疗法以及程序
笼锁的mTOR抑制剂前药的组合物可以与一种或多种辅助疗法或程序组合施用于受试者，或者可以作为一种或多种主要疗法或程序的辅助疗法。附加疗法或程序可以与具有与其结合的可光去除的基团mTOR抑制剂同时或依次施用。在一些形式中，附加疗法在药物周期之间或在药物假期期间进行，这是具有与其结合的可光去除的基团mTOR抑制剂的给药方案的一部分。在优选的形式中，附加疗法是癌症的常规治疗。例如，在某些形式中，附加疗法或程序是手术、移植手术、放疗或化疗。例如，在特定的形式中，将具有与其结合的可光去除的基团mTOR抑制剂与化疗剂的方案同时或依次施用于受试者，该化疗剂例如是吉西他滨(Gemzar)、奥沙利铂(Eloxatin)、顺铂、多柔比星(聚乙二醇化脂质体多柔比星)、卡培他滨(Xeloda)、米托蒽醌(Novantrone)、多西他赛或卡巴他赛。
代表性的化疗剂包括但不限于：安吖啶、博来霉素、白消安、喜树碱、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、克瑞他酶、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、表鬼臼毒素、表柔比星、依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊诺替康(innotecan)、亚叶酸、多柔比星脂质体、柔红霉素脂质体、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、喷司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、沙铂、链脲菌素、替尼泊苷、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、替尼泊苷、噻替派、硫鸟嘌呤、拓扑替康、曲奥舒凡、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、伏立诺他、紫杉醇、曲古抑菌素A及其衍生物、曲妥珠单抗
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西妥昔单抗和利妥昔单抗(
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或
Figure BDA0003717664920000222
）、贝伐单抗
Figure BDA0003717664920000224
及其组合。代表性的促凋亡剂包括但不限于：氟达拉滨牛磺孢子素(fludarabinetaurosporine)、环己酰亚胺、放线菌素D、乳糖神经酰胺、15d-PGJ(2)5及其组合。
在一些实施方案中，组合物和方法在免疫疗法之前或与免疫疗法结合使用，该免疫疗法例如是使用一种或多种免疫检查点调节剂(例如，PD-1拮抗剂、PD-1配体拮抗剂和CTLA4拮抗剂)抑制检查点蛋白(例如PD-1/PD-L1轴或CD28-CTLA-4轴的成分)、过继性T细胞疗法和/或癌症疫苗。免疫治疗中使用的示例性免疫检查点调节剂包括：帕博利珠单抗(抗PD1单抗)、度伐利尤单抗(抗PDL1单抗)、PDR001(抗PD1单抗)、阿替利珠单抗(抗PDL1单抗)、纳武利尤单抗(抗PD1单抗)、曲美木单抗(抗CTLA4单抗)、阿维鲁单抗(抗PDL1单抗)和RG7876(CD40激动剂单抗)。
在一些实施方案中，组合物和方法在过继性T细胞疗法之前或与过继性T细胞疗法结合使用。过继性T细胞疗法的方法是本领域已知的，并在临床实践中使用。通常地，过继性T细胞疗法涉及肿瘤特异性T细胞的分离和体外扩增，以获得比单独接种疫苗所能获得的更多数量的T细胞。然后将肿瘤特异性T细胞注入癌症患者体内，试图让他们的免疫系统能够通过T细胞(能够攻击和杀死癌症)压制剩余的肿瘤。多种形式的过继性T细胞疗法可用于癌症治疗，包括但不限于：培养肿瘤浸润淋巴细胞或TIL；分离和扩增一种特定的T细胞或克隆；以及使用经过工程改造以识别和攻击肿瘤的T细胞。在一些实施方案中，T细胞直接取自患者的血液。用于适应性T细胞癌症治疗的体外引发和激活T细胞的方法是本领域已知的。例如，参见Wang等人，Blood，109(11)：4865-4872(2007)和Hervas-Stubbs等人，J.Immunol.，189(7):3299-310(2012)。
在过去，过继性T细胞治疗策略主要集中在注入可以直接杀死肿瘤细胞的肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)。然而，也可以使用CD4+T辅助(Th)细胞，例如Th1、Th2、Tfh、Treg和Th17。Th可以激活抗原特异性效应细胞和募集先天免疫系统细胞(例如巨噬细胞和树突状细胞)以辅助抗原呈递(APC)，抗原致敏的Th细胞可以直接激活肿瘤抗原特异性CTL。作为激活APC的结果，抗原特异性Th1被认为是表位或决定基扩展(对肿瘤中其它抗原的免疫的扩大)的引发剂。引起表位扩展的能力扩大了对肿瘤中许多潜在抗原的免疫反应，并且由于能够产生异质性应答而导致更有效的肿瘤细胞杀伤。这样，过继性T细胞疗法就可以用来刺激内源性免疫。
在一些实施方案中，T细胞表达嵌合抗原受体(CAR、CAR T细胞或CART)。人工T细胞受体是工程化受体，可将特定的特异性移植到免疫效应细胞上。通常，这些受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上，并且可以被改造为靶向几乎任何肿瘤相关抗原。第一代CAR通常具有来自CD3ζ链的细胞内结构域，其是来自内源性TCR信号的主要传递器。第二代CAR将来自各种共刺激蛋白受体(例如，CD28、41BB、ICOS)的细胞内信号域添加到CAR的胞质尾区以向T细胞提供额外的信号，而第三代CAR结合了多个信号域(例如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40)以进一步提高有效性。
在一些实施方案中，组合物和方法在癌症疫苗(例如树突状细胞癌疫苗)之前使用或与癌症疫苗结合使用。疫苗接种通常包括向受试者一起施用抗原(例如，癌抗原)和佐剂以在体内引发治疗性T细胞。在一些实施方案中，癌症疫苗是树突状细胞癌症疫苗，其中由树突状细胞递送的抗原在体外引发以呈递癌症抗原。示例包括
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(sipuleucel-T)，其是一种用于治疗前列腺癌的基于树突细胞的疫苗(Ledford等人，Nature，519，17-18(05March2015)。这种疫苗和其它用于免疫疗法的组合物和方法综述于Palucka等人，Nature Reviews Cancer,12,265-277(April 2012)中。
在一些实施方案中，组合物和方法在手术切除肿瘤(例如，用于预防原发性肿瘤转移)之前或与肿瘤切除结合使用。
III.治疗方法
确定了光化学控制mTOR的抑制可以大幅提高mTOR抑制剂用于临床治疗癌症中的选择性和特异性。开发了涉及使用带有可光裂解的保护基团的去活化(笼锁)的mTOR抑制剂对肿瘤区域进行靶向mTOR抑制的疗法，以克服全身性的mTOR抑制剂相关的不良副作用。光化学控制疗法包括向有需要的受试者施用有效量的具有可光去除的保护基团的光激活mTOR前药，并将受试者暴露于具有能够裂解保护基团并释放活性药物的波长的光源。
提供了在有需要的受试者中治疗癌症或增殖性疾病的方法。该方法包括向受试者施用一种或多种笼锁的mTOR抑制剂前药，随后将癌症病灶暴露于具有能有效使笼锁部分从mTOR抑制剂光去除的波长的光下。该方法将mTOR抑制限制在光照部位，从而减少与全身性mTOR抑制相关的毒性和不良副作用。因此，本文所述的组合物和方法能够通过靶向mTOR抑制增强特异性，并且能够增加mTOR抑制剂的局部剂量以杀死癌细胞。
治疗性治疗涉及以笼锁的mTOR抑制剂前药的形式(包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂)向患有癌症的受试者施用治疗有效量的mTOR抑制剂，并随后照射受试者的癌症区域。在一些形式中，该方法包括以笼锁的mTOR抑制剂前药的形式(包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂)向有需要的受试者施用有效量的mTOR抑制剂，并结合光照以在受试者中启动局部mTOR抑制和/或自噬诱导。
还提供了用于在一个或多个癌细胞中诱导和/或增强自噬活性的方法。该方法包括以笼锁的mTOR抑制剂前药的形式(包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂)向患有癌症的受试者施用有效量的mTOR抑制剂，并照射癌症，以诱导和/或增强癌细胞中的自噬活性。在一些形式中，与未处理的对照癌细胞相比，该方法增强了自噬体形成、提高了自噬体和自溶酶体活性和/或促进了自噬细胞死亡。
提供了在受试者中治疗一种或多种癌症的症状的方法。在某些形式中，该方法包括以笼锁的mTOR抑制剂前药的形式(包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂)向患有癌症的受试者施用有效量的mTOR抑制剂，并照射癌症，以减轻或抑制癌症的一种或多种症状。在一些形式中，该方法以笼锁的mTOR抑制剂前药的形式(包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂)施用mTOR抑制剂，与一种或多种额外的活性剂组合以提供增强的癌症治疗。例如，在一些形式中，该方法在将癌症暴露于光源以在癌症中诱导mTOR抑制和/或自噬诱导之前，以笼锁的mTOR抑制剂前药的形式(包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂)施用mTOR抑制剂和一种或多种另外的化学治疗剂。在优选的形式中，该方法在将癌症暴露于具有约350nm和约500nm之间(或其间任意范围)的波长的光之前施用具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂OSI-027。在优选的形式中，笼锁的mTOR抑制剂是用可光去除的DEACM笼锁的OSI-027前药(cOSI-027)，如式IX所示。在进一步优选的形式中，笼锁的mTOR抑制剂是用式III至式VIII中任一个的基于可光去除的硼-二吡咯甲烷(BODIPY)的部分笼锁的OSI-027前药。典型地，与未处理的对照癌细胞相比，该方法降低或抑制癌细胞的增殖和/或活力。
还提供了通过减少不良副作用和/或增加mTOR抑制剂的剂量来加强癌症治疗的方法。例如，在一些形式中，该方法治疗患有癌症的受试者，其中，该受试者是先前已施用mTOR抑制剂的受试者，以及其中，在向受试者施用笼锁的mTOR抑制剂前药(包含具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂)并随后照射癌症后获得的疗效，大于单独施用mTOR抑制剂所获得的疗效。
在一些形式中，由于副作用和毒性的影响，施用于受试者的mTOR抑制剂的最大剂量被限制在亚治疗量，对肿瘤治疗和预后具有显著的临床影响。因此，在某些形式中，该方法可在患有癌症的受试者中有效地提供治疗量的mTOR抑制剂以及在癌症部位的局部mTOR抑制而不存在全身毒性。典型地，该方法以笼锁的mTOR抑制剂前药的形式(包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂)施用有效量的mTOR抑制剂，以降低mTOR、PI3K、mTORC1、mTORC2的一种或多种的活性，或阻碍PI3K/Akt/mTOR通路。例如，在一些形式中，当mTOR抑制剂以笼锁的mTOR抑制剂前药的形式(包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂)以一定量施用，该用量能够在暴露于具有能从mTOR抑制剂前药中有效去除可光去除的笼锁部分的波长的光时，在受试者的肿瘤中有效抑制或减少mTORC1和mTORC2的部分或全部激酶依赖性功能；减少或阻碍mTORC2或mTORC1或两者上的AKT磷酸化和/或S6K磷酸化；阻断PI3K/AKT信号传导的反馈激活；减少蛋白质翻译、减弱细胞周期进程、抑制血管生成或其组合的有效量。
该方法包括以下步骤：(1)向受试者施用有效量的具有与其结合的可光去除的笼锁部分的笼锁的mTOR抑制剂前药，以及(2)将受试者的一个或多个部位暴露于具有能够导致mTOR抑制剂中的可光去除的笼锁部分被去除的波长的光。在优选的形式中，该方法以笼锁的OS1-027前药的形式(包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的OS1-027)施用mTOR抑制剂OS1-027。在特别优选的形式中，mTOR抑制剂是笼锁的OS1-027(包括具有与其结合的可光去除的DEACM笼锁部分的OS1-027)(cOSI-027)，如式IX所示。可光去除的笼锁部分DEACM所需的光应介于约400nm和约450nm之间，优选420nm的光照射。在进一步优选的形式中，mTOR抑制剂是笼锁的OS1-027，包括具有与其结合的式III至式VIII中任一个的基于可光去除的硼-二吡咯甲烷(BODIPY)的部分的OS1-027。去除基于可光去除的硼-二吡咯甲烷(BODIPY)的基团所需的光应在约600nm和约750nm之间，优选650nm的光照射。
A.选择进行组合疗法的患者
在一些形式中，该方法包括鉴定需要癌症治疗的受试者的一个或多个步骤。通常，待治疗的受试者是患有一种或多种实体瘤的受试者。实体瘤是组织的异常肿块，通常不包含囊肿或液体区域。实体瘤可能是良性的(不是癌症)或恶性的(癌症)。实体瘤的示例是肉瘤、癌和淋巴瘤。
在一些形式中，该方法在患有癌症的受试者中表征肿瘤和/或表征肿瘤微环境。例如，在一些形式中，该方法鉴定对mTOR抑制和/或自噬诱导的治疗敏感的肿瘤细胞和/或肿瘤浸润细胞或肿瘤相关细胞。适合的检测方法是本领域已知的。例如，在特定的形式中，该方法包括用免疫特异性或生理特异性结合参与PI3K/Akt/mTOR通路或与之相关的蛋白质的分子接触肿瘤的细胞的步骤。
还公开了评估mTOR抑制剂的抗癌功效的方法。在一些形式中，该方法包括在向受试者施用mTOR抑制剂之前和之后评估受试者中的肿瘤大小和活力的步骤。例如，在某些形式中，对来自癌症患者的肿瘤样本在用mTOR抑制剂治疗之前和之后进行表征，以监测肿瘤大小和活力的变化以及肿瘤微环境内的表型和/或遗传变化。
在一些形式中，受试者是患有癌症的受试者，并且其当前或以前被施用了mTOR抑制剂以治疗癌症，并且其中，在施用笼锁的mTOR抑制剂前药并随后照射肿瘤获得的抗癌疗效，大于单独施用相应的mTOR抑制剂所获得的疗效。在某些形式中，癌症可能已经对单独施用mTOR抑制剂的最大无毒剂量(即，当在没有笼锁的mTOR抑制剂前药的情况下施用，然后对肿瘤进行光照射时)产生了抗药性。因此，在某些形式中，被治疗的受试者群体被定义为被治疗的癌症对单独施用mTOR抑制剂的最大无毒剂量(即，当在没有笼锁的mTOR抑制剂前药的情况下施用，然后对肿瘤进行光照射时)具有抗药性或不敏感的人群。
B.施用方法和给药方案
该方法和治疗方案通常包括癌症的治疗，包括向动物(例如哺乳动物，尤其是人类)施用有效量的笼锁的mTOR抑制剂前药(包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂)，以及将受试者的一个或多个部位暴露于具有能够导致mTOR抑制剂中的可光去除的笼锁部分去除的波长的光以治疗癌症。
存在于药物剂量单元中或以其它方式施用于受试者的笼锁的mTOR抑制剂前药(包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂)的量可以是，当用具有能从抑制剂中有效去除可光去除的笼锁部分的波长的光照射时，能够有效减少癌细胞的增殖、降低癌细胞的活力、减小癌细胞群的大小、减少癌细胞的转移或其组合的量。可将能够有效降低或抑制癌细胞增殖和/或活力的活性剂的量与未处理的对照癌细胞进行比较。在一些形式中，活性剂的量能够在受体的一种或多种肿瘤中有效减少、减缓或阻止肿瘤进展，或减轻肿瘤负荷或其组合。肿瘤负荷(tumor load-TB)定义为分布在患者体内(包括骨髓)的肿瘤总量(细胞/块)。在实体瘤的疗效评价标准(RECIST)分析中，TB被认为是所有可测量病灶的最长直径的总和。在一些形式中，活性剂的量能够有效改变可测量的生化或生理标志物。例如，在一些形式中，施用笼所mTOR抑制剂前药(包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂)，在光照射癌细胞一段时间(例如，12小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时)后，癌细胞活力降低了多达10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或高达100％。在示例性的形式中，笼锁的mTOR抑制剂前药(包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂)的施用在光照射癌细胞48小时后将癌细胞活力降低了多达70％，如实施例中所示。示例性的笼锁的mTOR抑制剂前药(包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂)的剂量为约0.1mg/kg体重、约4mg/kg体重、约7mg/kg体重、约9mg/kg体重、约11mg/kg体重、约13mg/kg体重、约1,000mg/kg体重，或其间任意范围。
笼锁的mTOR抑制剂前药(包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的mTOR抑制剂)的治疗方案可包括笼锁的mTOR抑制剂前药的一次或多次施用，以及一次或多次光照射。在优选的形式中，笼锁的mTOR抑制剂前药与光照射/肿瘤暴露于光的施用依次施用。例如，在一些形式中，在对受试者的肿瘤区域施加光照射之前至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟或30分钟、数小时或数天，施用笼锁的mTOR抑制剂前药。
在某些形式中，该方法还包括监测治疗效果的步骤。例如，在某些形式中，该方法识别对癌症生长能力的抑制。癌症的抑制可以使用生化试验(例如，测量血液中癌症的一种或多种生物标志物的下降)或通过形态测量分析(例如，通过计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)或超声波)来测量。因此，在一些形式中，该方法包括测量受体血液中一种或多种生物标志物的浓度的步骤。可以在对受试者施用笼锁的mTOR抑制剂前药和光照射的组合之前和之后进行测量。
在一些形式中，该方法治疗在先前治疗后重新获得生长能力的癌症。例如，在某些形式中，该癌症已获得对一种或多种化学疗法的抗药性。癌症重新获得生长的能力可以是肿瘤生长的增加、症状的出现、再次出现或恶化，或新的转移部位。
在进一步的形式中，该方法用于预防性的用途，即预防、延迟发作、减轻、根除或延迟发作后的体征或症状的恶化，以及预防复发。对于预防性使用，治疗有效量的笼锁的mTOR抑制剂前药和随后的靶向光照射是在早期发病期间(例如，在癌症的初始体征和症状时)或在确定癌症的发展之后施用于受试者。例如，预防性给药可用于在受试者的化学预防治疗中呈现癌前病变和诊断早期恶性肿瘤。
C.待治疗的癌症
施用笼锁的mTOR抑制剂前药并随后靶向光照射的方法可有效治疗多种类型的癌症。
可以根据所述方法治疗的癌症的特征在于具有一种或多种基因的突变，包括特征为具有一种或多种KRAS突变、HRAS突变、NRAS-突变、EGFR突变、ALK突变、RBl突变、HIF突变、KEAP突变、NRF突变或其他代谢相关突变或其组合的癌症。
在优选的形式中，该组合物和方法能够有效治疗皮肤癌、肺癌、结肠癌和直肠癌、膀胱癌等的一种或多种症状。在特定的形式中，该方法能够在受试者中有效减小皮肤癌的大小、降低皮肤癌的活力、减轻皮肤癌的负荷、减少皮肤癌的转移，或减轻皮肤癌的一种或多种症状或其组合。该方法对所有类型的皮肤癌都有效，包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、Merkel细胞癌和黑色素瘤。
这些方法还能够有效用于治疗其它形式的癌症。根据所描述的方法可以治疗的示例性肿瘤细胞包括但不限于：癌症的肿瘤细胞，包括：白血病，包括但不限于急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞白血病(例如成髓细胞白血病、前髓细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病和骨髓增生异常综合征)、慢性白血病(例如但不限于慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、毛细胞白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金病、非霍奇金病；多发性骨髓瘤，例如但不限于郁积型多发性骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；华氏
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巨球蛋白血症；意义未明的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨骼和结缔组织肉瘤，例如但不限于骨骼肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑肿瘤，包括但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非神经胶质性肿瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤、原发性脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于腺癌，小叶(小细胞)癌、导管内癌、骨髓性乳腺癌、粘液性乳腺癌、管状乳腺癌、乳头状乳腺癌、派杰氏(Paget’s)病和炎性乳腺癌；肾上腺癌，包括但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于乳头状或滤泡状甲状腺癌、骨髓性甲状腺癌和间变性甲状腺癌；胰腺癌，包括但不限于胰岛素瘤、胃泌素瘤、胰升糖素瘤、舒血管肠肽瘤、生长抑素分泌肿瘤(somatostatin-secretingtumor)和类癌或胰岛细胞瘤；垂体癌，包括但不限于库欣氏病、催乳素分泌肿瘤(prolactin-secreting tumor)、肢端肥大症和尿崩症；眼癌，包括但不限于眼部黑色素瘤，例如虹膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤和视网膜母细胞瘤；阴道癌，包括但不限于鳞状细胞癌、腺癌和黑色素瘤；外阴癌，包括但不限于鳞状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和派杰氏病；宫颈癌，包括但不限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，包括但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，包括但不限于卵巢上皮癌、交界性肿瘤、生殖细胞肿瘤和间质瘤；食道癌，包括但不限于鳞状癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞状癌、肉瘤、黑色素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌，包括但不限于腺癌、蕈样(息肉样)癌、溃疡型癌、浅表扩散型癌、弥漫扩散型癌、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌，包括但不限于肝细胞癌和肝母细胞瘤；胆囊癌，包括但不限于腺癌；胆管上皮癌，包括但不限于乳头状癌、结节型癌和弥漫性癌；肺癌，包括但不限于非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；睾丸癌，包括但不限于胚组织瘤、精原细胞瘤、间变性癌、经典型(典型)癌、精母细胞性肿瘤、非精原细胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤癌、绒毛膜癌(卵黄囊瘤)；前列腺癌，包括但不限于腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；阴茎癌(penal cancers)；口腔癌，包括但不限于鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌，包括但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌；咽癌，包括但不限于鳞状细胞癌和疣状癌；皮肤癌，包括但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤、浅表扩散型黑色素瘤、结节型黑色素瘤、恶性雀斑样黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤；肾癌，包括但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或输尿管)；维尔姆斯瘤；膀胱癌，包括但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。可以通过组合物预防、治疗或以其它方式减轻的癌症包括粘液肉瘤、成骨性肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、血管母细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌和胃癌(有关此类疾病的综述，参见Fishman等人，1985,Medicine，第2版，J.B.Lippincott Co.,Philadelphia和Murphy等人，1997,Informed Decisions:The Complete Book of Cancer Diagnosis,Treatment,and Recovery,Viking Penguin,Penguin Books USA,Inc.,United States)。
可以通过将LED光或激光直接照射到肿瘤组织顶部的皮肤来进行光照射。通过将来自光纤或其它可能的装置的光照射到组织中，光照射还可适用于深部肿瘤组织。
IV.试剂盒
还公开了医用试剂盒。例如，医用试剂盒可以包括笼锁的mTOR抑制剂前药的剂量供给(单独供给(例如，冻干)或以药物组合物的形式供给)。活性剂可以为单位剂量，或在施用前需稀释的原液中。在一些形式中，试剂盒包括药学上可接受的载剂的供给。试剂盒还可以包括用于施用活性剂或组合物的装置，例如注射器。试剂盒可以包括以上述方法施用化合物的印刷的说明书。
通过以下编号的段落可以进一步理解本发明公开的组合物和方法。
1.一种用于在受试者中治疗癌症的药物组合物，包含有效量的笼锁的mTOR抑制剂前药，
其中，该前药包括
(a)mTOR抑制剂；和
(b)可光去除的笼锁部分，
其中，笼锁部分可逆地结合至抑制剂，以及
其中，笼锁部分阻碍抑制剂的活性，
其中，笼锁部分可通过暴露于光照射而在体内去除。
2.段落1的药物组合物，其中，mTOR抑制剂选自OSI-027、Torin2和PI103。
3.段落1或2的药物组合物，其中，可光去除的笼锁部分选自7-(二乙氨基)-4-(羟甲基)-香豆素(DEACM)、7-二乙氨基-4-羟甲基-硫代香豆素、7-[双(羧甲基)氨基]-4-(羟甲基)香豆素、4-溴-2-硝基苄基、4,5-二甲氧基-2-硝基苄基、1-(6-硝基苯并二氧杂环戊烷-5-基)乙醇、1-(3-硝基二苯并呋喃-2-基)-乙醇、1,3,5,7-四甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐，3-(4-甲氧基)苯乙烯基-1,5,7-三甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3-(4-二甲氨基)苯乙烯基-1,5,7-三甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3,5-双苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3,5-双(4-甲氧基)苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3,5-双(4-二甲基氨基)苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3,5-双(4-(1,4,7,10-四氧杂十一烷基)苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3,5-双(4-甲氧基)苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基二甲基硼酸盐、3,5-双(4-二甲氨基)苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基二甲基硼酸盐。
4.段落1或2的药物组合物，其中，可光去除的笼锁部分具有式III至式VIII之一的结构：
Figure BDA0003717664920000321
Figure BDA0003717664920000331
5.段落3或4的药物组合物，其中，前药的剂量在约0.1mg/kg体重和约1,000mg/kg体重之间，包含约0.1mg/kg体重和约1,000mg/kg体重。
6.一种在受试者中治疗癌症的方法，包括
(a)向受试者施用有效量的段落1-5中任一个的药物组合物，以及
(b)用光照射癌症，
其中，光的施用有效地将可光去除的笼锁部分从mTOR抑制剂中去除。
7.段落6的方法，其中，用光照射癌症包括将受试者中的一个或多个癌细胞暴露于光，其中，光与前药相互作用以在受试者的一个或多个癌细胞中抑制mTOR和/或增强自噬。
8.段落6或7的方法，其中，光具有约420nm的波长。
9.段落6至8中任一个的方法，其中，在向受试者施用前药后立即或至多1小时，至多2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时或60小时，或者至多1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，或其任何组合，向受试者施加光照。
10.段落6-9中任一个的方法，进一步包括向受试者施用一种或多种额外的活性剂。
11.段落6-10中任一个的方法，进一步包括对受试者执行手术或放疗。
12.段落6-11中任一个的方法，其中，待治疗的癌症的特征在于PI3K/AKT/mTOR通路失调。
13.段落6-12中任一个的方法，其中，癌症选自皮肤癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、脑癌、胃癌、食道癌、肺癌、肝癌和结肠癌。
14.段落6-13中任一个的方法，其中，mTOR抑制剂在癌症中增强自噬活性。
15.段落6-14中任一个的方法，其中，有效量在受试者中有效地减少肿瘤大小、减轻肿瘤负荷、降低肿瘤活力、防止转移或其组合。
16.段落6-15中任一个的方法，其中，以笼锁的mTOR抑制剂前药的形式施用的mTOR抑制剂的量是如果在不存在笼锁部分的情况下全身性施用则对受试者有毒的量。
17.段落6-16中任一个的方法，进一步包括在施用笼锁mTOR抑制剂前药之前、或在施用笼锁mTOR抑制剂前药之后、或在这两种情况下识别或监测癌症的一个或多个步骤。
18.段落17的方法，其进一步包括在受试者中的相同或不同部位重复施用笼锁mTOR抑制剂前药并用光照射癌症一次或多次，以减少肿瘤大小、减轻肿瘤负荷、降低肿瘤活力、防止转移或其组合。
19.一种治疗癌症的方法，包括
(a)向患有癌症的受试者施用有效量的OSI-027前药，
其中，前药包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的OSI-027，该可光去除的笼锁部分阻碍OSI-027的抗mTOR活性，以及
其中，可光去除的笼锁部分是7-(二乙氨基)-4-(羟甲基)-香豆素(DEACM)；和
(b)用光照射癌症，
其中，光具有约420nm的波长，以及
其中，有效量在受试者中有效减少肿瘤大小、减轻肿瘤负荷、降低肿瘤活力、防止转移、减轻或预防癌症的一种或多种症状或其组合。
20.一种治疗癌症的方法，包括
(a)向患有癌症的受试者施用有效量的OSI-027前药，
其中，前药包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的OSI-027，该可光去除的笼锁部分阻碍OSI-027的抗mTOR活性，以及
其中，可光去除的笼锁部分是基于硼-二吡咯甲烷(BODIPY)的基团；和
(b)用光照射癌症，
其中，光具有约650nm的波长，以及
其中，有效量在受试者中有效减少肿瘤大小、减轻肿瘤负荷、降低肿瘤活力、防止转移、减轻或预防癌症的一种或多种症状或其组合。
21.段落6-20中任一个的方法，其中，癌症是皮肤癌，该皮肤癌选自基底细胞皮肤癌和鳞状细胞皮肤癌、Merkel细胞癌和黑色素瘤。
22.段落6-21中任一个的方法，其中，癌症对雷帕霉素不敏感。
23.段落6-22中任一个的方法，其中，前药是全身性施用的。
通过以下实施例可以进一步理解本发明公开的组合物和方法。
实施例
实施例1：可光激活的笼锁的OSI-027前药的合成
可光激活的mTOR抑制剂(笼锁的OSI-027前药(cOSI-027))是由可光裂解的7-(二乙氨基)-4-(羟甲基)-香豆素(DEACM)(考虑到它的快速光裂解反应及其在可见光(420nm)下的适用性)掩蔽OSI-027的羧基而形成。在没有光照射时，前药不会表现对mTOR通路的抑制作用。
在420nm光照射后，光化学释放的OSI-027游离药物可以阻碍ATP竞争性催化位点的mTOR活性，以抑制mTORC1和mTORC2通路的磷酸化，从而减少蛋白质合成代谢和诱导自噬以阻碍细胞的增殖。光化学控制的mTOR抑制和自噬如图1所示。
前药的合成路线如图2A所示。OSI-027和最终产物cOSI-027通过核磁共振氢谱(1H-NMR)谱图进行表征(图2B和图2C)。
实施例2：笼锁OSI-027前药在光照射后裂解为OSI-027
已证明笼锁的OSI-027前药在光照射后裂解为OSI-027。通过光谱学分析了笼锁的OSI-027前药的光化学特性(图3A-3C)。前药的吸收峰位于300nm和380nm。在380nm激发下，发射峰位于460nm。420nm光照射后，前药的吸光度和发射光谱均发生变化。为了进一步验证光照射后的光裂解反应，采用高效液相色谱(HPLC)监测光照射后OSI-027的裂解和释放。如图4A-4B所示，在420nm光照射1分钟后，OSI-027的生成被表征为在约8分钟处出现新峰。以及照射3分钟后裂解基本完成。
实施例3：cOSI-027的mTOR抑制作用依赖于光照射
为了进一步研究OSI-027和cOSI-027在有或没有光照射的情况下对mTOR的抑制作用，进行Western免疫印迹以分析mTOR通路的蛋白质表达水平(图5)。选择S6K和Akt的磷酸化比率分别作为mTORC1和mTORC2信号传导通路研究的标志物。Western免疫印迹结果显示，与对照组相比，OSI-027减少了S6K和Akt蛋白的磷酸化，表明其分别对mTORC1和mTORC2信号通路均有抑制作用。cOSI-027仅在光照后对mTORC1和mTORC2通路表现出显著的抑制作用。
实施例4：cOSI-027的自噬增强作用依赖于光照射
mTORC1抑制导致更高的自噬活性，结果是溶酶体中的蛋白质降解能力增强。因此，研究了光化学控制的mTOR抑制策略是否可用于控制自噬活性。通过Western免疫印迹分析，以LC3-II/LC3-I的比值表征自噬水平(图6A-6B)。在药物治疗后24h，OSI-027与对照组相比增加了LC3-II/LC-I的比值，表明自噬活性更高。并且与未照射组相比，cOSI-027处理导致光照后LC3-II/LC3-I的比值更高。
为了进一步验证光激活对自噬的影响，建立了转染mCherry-GFP-LC3的HeLa细胞系，以准确监测LC3的表达和亚细胞定位。如共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像和定量结果(图7A-7B)所示，与对照组相比，OSI-027显著增加细胞中红色和黄色斑点的数量和面积，这表明细胞内自噬体和自溶酶体的活性更高。类似地，cOSI-027的处理增加了光照射后的斑点数。这些结果表明，这种光激活系统可用于通过mTOR依赖性方式触发自噬过程。
实施例5：可光激活的OSI-027具有抗癌活性
为了研究这种可光激活的前药系统的抗癌作用，进一步进行MTT测定以分析用不同制剂处理后的细胞活力。如图8所示，在孵育48小时后OSI-027将细胞活力降低至约30％。以及在光照射后cOSI-027也表现出显著降低细胞活力，这意味着这种光控策略可用于抗癌治疗。
总之，可光激活的前药cOSI-027能够通过可见光照射实现光化学控制的mTOR抑制，可以调节mTORC1和mTORC2通路，诱导mTOR依赖性自噬，并导致癌细胞死亡。本研究证明了第一个直接控制mTORC1和mTORC2信号通路并刺激自噬的光响应系统，这既可以为mTOR靶向癌症治疗提供新的策略，也可以作为进一步研究mTOR信号传导及其相关生物学过程的新研究工具。
实施例6：被基于BODIPY的可光去除的保护基团笼锁的OSI-027
为了进一步改善前药的临床翻译，我们设计并合成了另一种光笼锁的OSI-027(图9)。在该化合物中，OSI-027被红光响应性的、基于BODIPY的、可光去除的保护基团(PPG)笼锁。通过高效液相色谱(HPLC)表征光解性质。结果表明，在656nm下光照射(100mW/cm2)5min后，笼锁的OSI-027前药的峰显著下降，而游离OSI-027释放(图10A-10C)。因此，除了我们之前展示的蓝光响应性前药之外，还可以设计红光响应性OSI-027前药，在红光照射下释放游离OSI-027，这可以进一步促进临床应用。

Claims (23)

1.一种用于在受试者中治疗癌症的药物组合物，包含有效量的笼锁的mTOR抑制剂前药，
其中，所述前药包括
(a)mTOR抑制剂；和
(b)可光去除的笼锁部分，
其中，所述笼锁部分可逆地结合至所述抑制剂，以及
其中，所述笼锁部分阻碍所述抑制剂的活性，
其中，所述笼锁部分可通过暴露于光照射而在体内去除。
2.权利要求1的药物组合物，其中，所述mTOR抑制剂选自OSI-027、Torin2和PI103。
3.权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述可光去除的笼锁部分选自7-(二乙氨基)-4-(羟甲基)-香豆素(DEACM)、7-二乙氨基-4-羟甲基-硫代香豆素、7-[双(羧甲基)氨基]-4-(羟甲基)香豆素、4-溴-2-硝基苄基、4,5-二甲氧基-2-硝基苄基、1-(6-硝基苯并二氧杂环戊烷-5-基)乙醇、1-(3-硝基二苯并呋喃-2-基)-乙醇、1,3,5,7-四甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3-(4-甲氧基)苯乙烯基-1,5,7-三甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3-(4-二甲氨基)苯乙烯基-1,5,7-三甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3,5-双苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3,5-双(4-甲氧基)苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3,5-双(4-二甲基氨基)苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3,5-双(4-(1,4,7,10-四氧杂十一烷基)苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基氟硼酸盐、3,5-双(4-甲氧基)苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基二甲基硼酸盐、3,5-双(4-二甲氨基)苯乙烯基-1,7-二甲基-8-羟甲基吡咯亚甲基二甲基硼酸盐。
4.权利要求1或2的药物组合物，其中，所述可光去除的笼锁部分具有式III至式VIII之一的结构：
Figure FDA0003717664910000021
Figure FDA0003717664910000031
5.权利要求3或4的药物组合物，其中，所述前药的剂量在约0.1mg/kg体重和约1,000mg/kg体重之间，包含约0.1mg/kg体重和约1,000mg/kg体重。
6.一种在受试者中治疗癌症的方法，包括
(a)向所述受试者施用有效量的权利要求1-5中任一项的药物组合物，以及
(b)用光照射所述癌症，
其中，所述光的施用有效地将所述可光去除的笼锁部分从所述mTOR抑制剂上去除。
7.权利要求6的方法，其中，用光照射所述癌症包括将所述受试者中的一个或多个癌细胞暴露于光，其中，所述光与所述前药相互作用以在所述受试者的一个或多个癌细胞中抑制mTOR和/或增强自噬。
8.权利要求6或7所述的方法，其中，所述光具有约420nm的波长。
9.权利要求6至8中任一项的方法，其中，在向所述受试者施用所述前药后立即或至多1小时，至多2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时或60小时，或者至多1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，或其任何组合，向所述受试者施用所述光。
10.权利要求6-9中任一项的方法，进一步包括向所述受试者施用一种或多种额外的活性剂。
11.权利要求6-10中任一项的方法，进一步包括对所述受试者执行手术或放射疗法。
12.权利要求6-11中任一项的方法，其中，待治疗的癌症的特征在于PI3K/AKT/mTOR通路失调。
13.权利要求6-12中任一项的方法，其中，所述癌症选自皮肤癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、脑癌、胃癌、食道癌、肺癌、肝癌和结肠癌。
14.权利要求6-13中任一项的方法，其中，所述mTOR抑制剂在所述癌症中增强自噬活性。
15.权利要求6-14中任一项的方法，其中，所述有效量在所述受试者中有效地减小肿瘤大小、减轻肿瘤负荷、降低肿瘤活力、防止转移或其组合。
16.权利要求6-15中任一项的方法，其中，以笼锁的mTOR抑制剂前药形式施用的所述mTOR抑制剂的量是如果在不存在所述笼锁部分的情况下全身性施用则对所述受试者有毒的量。
17.权利要求6-16中任一项的方法，进一步包括在施用所述笼锁的mTOR抑制剂前药之前、或在施用所述笼锁的mTOR抑制剂前药之后、或在这两种情况下识别或监测所述癌症的一个或多个步骤。
18.权利要求17的方法，进一步包括在所述受试者中的相同或不同部位重复施用所述笼锁的mTOR抑制剂前药并用光照射所述癌症一次或多次，以减少肿瘤大小、减轻肿瘤负荷、降低肿瘤活力、防止转移或其组合。
19.一种治疗癌症的方法，包括
(a)向患有癌症的受试者施用有效量的OSI-027前药，
其中，所述前药包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的OSI-027，所述可光去除的笼锁部分阻碍OSI-027的抗mTOR活性，以及
其中，所述可光去除的笼锁部分是7-(二乙氨基)-4-(羟甲基)-香豆素(DEACM)；和
(b)用光照射所述癌症，
其中，所述光具有约420nm的波长，以及
其中，所述有效量在所述受试者中有效减少肿瘤大小、减轻肿瘤负荷、降低肿瘤活力、防止转移、减轻或预防癌症的一种或多种症状或其组合。
20.一种治疗癌症的方法，包括
(a)向患有癌症的受试者施用有效量的OSI-027前药，
其中，所述前药包括具有与其结合的可光去除的笼锁部分的OSI-027，所述可光去除的笼锁部分阻碍OSI-027的抗mTOR活性，以及
其中，所述可光去除的笼锁部分是基于硼-二吡咯甲烷(BODIPY)的部分；和
(b)用光照射所述癌症，
其中，所述光具有约650nm的波长，以及
其中，所述有效量在所述受试者中有效地减少肿瘤大小、减轻肿瘤负荷、降低肿瘤活力、防止转移、减轻或预防癌症的一种或多种症状或其组合。
21.权利要求6-20中任一项的方法，其中，所述癌症是选自基底细胞皮肤癌和鳞状细胞皮肤癌、Merkel细胞癌和黑色素瘤的皮肤癌。
22.权利要求6-21中任一项的方法，其中，所述癌症对雷帕霉素不敏感。
23.权利要求6-22中任一项的方法，其中，所述前药是全身性施用的。
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