CN115521985A - 浸润性cd8+t细胞的标志物组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测生物学样本中CD8+T细胞浸润的标志物组合，包括用于判断生物学样本中是否有浸润性CD8+T细胞的第一标志物以及用于判断所述浸润性CD8+T细胞的衰竭模式的第二标志物。该标志物组合可用于评估结直肠癌患者对免疫治疗药物的响应性和/或评价免疫治疗药物对结直肠癌的治疗效果，其相比现有的标志物更准确有效。

Description

浸润性CD8+T细胞的标志物组合及其应用
技术领域
本发明涉及药物筛选技术领域，尤其涉及一种浸润性CD8+T细胞的标志物组合，及其在筛选免疫治疗结直肠癌药物中的应用。
背景技术
目前，免疫检查点抑制剂在一些微卫星不稳定(Microsatellite instability，MSI)结直肠癌患者中能产生持久响应，但是仍有约60％的MSI结直肠癌患者对单一免疫检查点抑制剂治疗(例如抗-PD1)无响应，并且约40％的MSI 结直肠癌患者对免疫检查点抑制剂联合治疗也无响应(1)。患者抗药性的机制尚不清楚。另一方面，一小部分微卫星稳定(Microsatellite stability，MSS) 结直肠癌患者中能从免疫检查点抑制剂获益(2)。因此，在结直肠癌中，传统的MSI/MSS并不是用作患者是否应接受免疫治疗的最优化指标。研究表明，直肠癌患者CD8+T细胞浸润和CD8+T细胞终端耗竭程度可以作为是否应接受免疫治疗的优选指标(3)。
但是，直肠癌患者通常在医院使用石蜡包埋标本(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded)。因为现有的直肠癌患者CD8+T细胞浸润和CD8+T 细胞终端耗竭程度的标志物来自肿瘤微环境，这些标志物的mRNA通常在结直肠癌石蜡包埋标本中严重降解。
对此，有必要进一步研究可以在结直肠癌患者石蜡包埋标本中有效使用的CD8+T细胞浸润和CD8+T细胞终端耗竭程度的标志物。
发明内容
本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种用于评估结直肠癌患者对免疫治疗药物的响应性和/或评价免疫治疗药物对结直肠癌的治疗效果的标志物组合，其相比现有的标志物更准确有效。
为了解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种用于检测生物学样本中CD8+T细胞浸润的标志物组合，所述标志物组合包括用于判断生物学样本中是否有浸润性CD8+T细胞的第一标志物，所述第一标志物为基因 ANKH、OSBPL2、RAB22A、ZNF217、ZSWIM1、CHMP4B、SUSD1、FARP1、 SERINC3、PCMTD2、RTF2、NOL4L、IYD、DDX27、CPNE1、ZDHHC9、 SDC4、SLC22A3、YAE1、FREM2、GJB1、SLC2A12、SGK2、NR1I2、PLCB4、 WFDC13、CYP2B6、PMEPA1、CYP4F2、MUC12、R3HDML、MAGEB17、 GRM8、CTC1、IKZF3、SMAP2、ALPK2、SLC25A37、GBP4、IRF1、RASGRP1、 TRGC1、CCL5、APOBEC3G、NLRC5、PTPRC、APOE、WARS、IKZF1、 FAS、STAT1、FYB1、PIK3CD、TYMP、GFI1、SAMD9L、GNLY、CIITA、 FUT8、UBE2L6、GBP5、PRF1、SH2D1A、PTGDR、BST2、DUSP4、MYRF、 CXCL13和TFAP2A中的至少三种。
优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少4个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少5个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少6个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少7个基因；更优选地，所述第一标志物为上述 69个基因中的至少8个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少9个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少 10个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少10个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少15个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少20个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少30个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少40个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少50个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少60个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因。
更优选地，所述第一标志物为上述69个基因和CD8A基因。
优选地，所述第一标志物为基因ANKH、OSBPL2、RAB22A、ZNF217、 ZSWIM1、CHMP4B、SUSD1、FARP1、SERINC3、PCMTD2、RTF2、NOL4L、IYD、DDX27、CPNE1、SDC4、SLC22A3、YAE1、FREM2、GJB1、SLC2A12、 SGK2、NR1I2、PLCB4、WFDC13、CYP2B6、PMEPA1、CYP4F2、MUC12、R3HDML、MAGEB17、GRM8、CTC1、IKZF3、SMAP2、ALPK2、SLC25A37、 GBP4、IRF1、RASGRP1、TRGC1、CCL5、APOBEC3G、NLRC5、PTPRC、 APOE、WARS、IKZF1、FAS、STAT1、FYB1、PIK3CD、TYMP、GFI1、SAMD9L、 GNLY、CIITA、FUT8、UBE2L6、GBP5、PRF1、SH2D1A、PTGDR、BST2、 DUSP4、MYRF、和TFAP2A中的至少3种、4种、5种、6种、8种、10 种、15种、20种或更多种。
优选地，所述生物学样本为血液样本、血清样本、分离自外周血的单个核细胞样本、组织样本和体液样本中的至少一种。
优选地，所述生物学样本为结直肠癌患者的肿瘤。
优选地，所述生物学样本为石蜡包埋样本。
优选地，所述标志物组合还包括用于判断所述浸润性CD8+T细胞的衰竭模式的第二标志物。
优选地，所述第二标志物为基因ANKRD10、ARGLU1、CAST、DGKH、 EXOSC8、FBXL5、MAPK8、PCCA、SHLD2、AP5B1、CDK2AP2、DEDD2、 PACSIN3、PML、SETD1B、SLC4A2和TCF3P1中的至少三种。
优选地，所述第二标志物为上述17个基因中的至少5个基因；更优选地，所述第二标志物为上述17个基因中的至少6个基因；更优选地，所述第二标志物为上述17个基因中的至少7个基因；更优选地，所述第二标志物为上述17个基因中的至少8个基因；更优选地，所述第二标志物为上述 17个基因中的至少9个基因；更优选地，所述第二标志物为上述17个基因中的至少10个基因；更优选地，所述第二标志物为上述17个基因中的至少12个基因；更优选地，所述第二标志物为上述17个基因中的至少15个基因；更优选地，所述第二标志物为上述17个基因。
更优选地，所述第二标志物为上述17个基因、PDCD1和HAVCR2基因。由此，上述标志物组合可以在医院实际操作中使用。通过该标志物组合可以在医院直肠癌患者石蜡标本中稳定地检测CD8+T细胞浸润和 CD8+T细胞终端耗竭程度，以预测直肠癌患者对免疫治疗药物的响应性，使免疫治疗药物更针对性地治疗结直肠癌患者，从而提高对结直肠癌患者的治疗效果。
作为本发明的另一个方面，本发明还提供了用于评估结直肠癌患者对免疫治疗药物响应性的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测所述第一标志物以及第二标志物在所述结直肠癌患者的生物学样本中含量的试剂。
优选地，所述生物学样本为血液样本、血清样本、分离自外周血的单个核细胞样本、组织样本和体液样本中的至少一种。
优选地，所述试剂盒还包括用于检测所述基因的探针，或/和用于检测所述基因相应的mRNA、cDNA或/和蛋白质的含量的试剂。
优选地，所述免疫治疗药物为抗-PD1、抗-PDL1、抗-CTLA4、抗-TIM3、抗-BTLA、抗-VISTA和抗-LAG3中的一种。
优选地，所述生物学样本为石蜡包埋样本。
作为本发明的又一个方面，本发明还提供了一种用于评估结直肠癌患者对单一免疫治疗药物响应性的方法，包括以下步骤：
1)提供结直肠癌患者的生物学样本；
2)检测所述生物学样本中第一标志物含量，以判断所述结直肠癌患者肿瘤内是否有浸润性CD8+T细胞；以及
3)若步骤2)的判断结果为否，则所述结直肠癌患者对所述的单一免疫治疗药物无响应性，评估结束；
若步骤2)的判断结果为是，则需检测所述生物学样本中第二标志物含量，以判断所述浸润性CD8+T细胞的衰竭模式，
当衰竭模式为前体衰竭模式时，则判断所述结直肠癌患者是所述单一免疫治疗药物的响应者；
当衰竭模式是终末衰竭模式时，则判断结所述直肠癌患者是所述单一免疫治疗药物的无响应者。
由此，当判断结所述直肠癌患者是所述单一免疫治疗药物的无响应者后，则需要为该直肠癌患者提供组合免疫治疗药物，例如需要考虑抗-PD1 和其它单一免疫治疗药物联合用药，或者抗-PD1和其它针对肿瘤微环境药物的组合疗法。
优选地，所述生物学样本选自血液样本、血清样本、分离自外周血的单个核细胞样本、组织样本和体液样本中的至少一种。
优选地，所述免疫治疗药物为抗-PD1、抗-PDL1、抗-CTLA4、抗-TIM3、抗-BTLA、抗-VISTA和抗-LAG3中的一种。
优选地，所述结直肠癌患者处于结直肠癌I期、II期、III期或IV期。
优选地，所述生物学样本为石蜡包埋样本。
优选地，所述第一标志物为基因ANKH、OSBPL2、RAB22A、ZNF217、 ZSWIM1、CHMP4B、SUSD1、FARP1、SERINC3、PCMTD2、RTF2、NOL4L、 IYD、DDX27、CPNE1、ZDHHC9、SDC4、SLC22A3、YAE1、FREM2、GJB1、 SLC2A12、SGK2、NR1I2、PLCB4、WFDC13、CYP2B6、PMEPA1、CYP4F2、 MUC12、R3HDML、MAGEB17、GRM8、CTC1、IKZF3、SMAP2、ALPK2、 SLC25A37、GBP4、IRF1、RASGRP1、TRGC1、CCL5、APOBEC3G、NLRC5、 PTPRC、APOE、WARS、IKZF1、FAS、STAT1、FYB1、PIK3CD、TYMP、 GFI1、SAMD9L、GNLY、CIITA、FUT8、UBE2L6、GBP5、PRF1、SH2D1A、 PTGDR、BST2、DUSP4、MYRF、CXCL13和TFAP2A中的至少三种。
优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少4个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少5个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少6个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少7个基因；更优选地，所述第一标志物为上述 69个基因中的至少8个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少9个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少 10个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少10个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少15个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少20个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少30个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少40个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少50个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因中的至少60个基因；更优选地，所述第一标志物为上述69个基因。
更优选地，所述第一标志物为上述69个基因和CD8A基因。
优选地，所述第一标志物为基因ANKH、OSBPL2、RAB22A、ZNF217、 ZSWIM1、CHMP4B、SUSD1、FARP1、SERINC3、PCMTD2、RTF2、NOL4L、 IYD、DDX27、CPNE1、SDC4、SLC22A3、YAE1、FREM2、GJB1、SLC2A12、 SGK2、NR1I2、PLCB4、WFDC13、CYP2B6、PMEPA1、CYP4F2、MUC12、R3HDML、MAGEB17、GRM8、CTC1、IKZF3、SMAP2、ALPK2、SLC25A37、 GBP4、IRF1、RASGRP1、TRGC1、CCL5、APOBEC3G、NLRC5、PTPRC、 APOE、WARS、IKZF1、FAS、STAT1、FYB1、PIK3CD、TYMP、GFI1、SAMD9L、 GNLY、CIITA、FUT8、UBE2L6、GBP5、PRF1、SH2D1A、PTGDR、BST2、 DUSP4、MYRF、和TFAP2A中的至少3种、4种、5种、6种、8种、10 种、15种、20种或更多种。
优选地，所述第二标志物为基因ANKRD10、ARGLU1、CAST、DGKH、 EXOSC8、FBXL5、MAPK8、PCCA、SHLD2、AP5B1、CDK2AP2、DEDD2、 PACSIN3、PML、SETD1B、SLC4A2和TCF3P1中的至少三种。
优选地，所述第二标志物为上述17个基因中的至少5个基因；更优选地，所述第二标志物为上述17个基因中的至少6个基因；更优选地，所述第二标志物为上述17个基因中的至少7个基因；更优选地，所述第二标志物为上述17个基因中的至少8个基因；更优选地，所述第二标志物为上述 17个基因中的至少9个基因；更优选地，所述第二标志物为上述17个基因中的至少10个基因；更优选地，所述第二标志物为上述17个基因中的至少12个基因；更优选地，所述第二标志物为上述17个基因中的至少15个基因；更优选地，所述第二标志物为上述17个基因。
更优选地，所述第二标志物为上述17个基因、PDCD1和HAVCR2基因。
优选地，所述生物学样本为石蜡包埋肿瘤样品。更优选地，所述方法还包括对石蜡包埋肿瘤样品的优化。最优选地，针对石蜡包埋肿瘤样品优化的方法采用FFPE.ImmuneCRC模型。本发明的实施例的结果表明，在石蜡包埋肿瘤样品中，针对石蜡包埋肿瘤样品优化的方法FFPE.ImmuneCRC 优于针对冷冻肿瘤样品优化的方法TMEPRE。
本发明还提供了一种筛选结直肠癌的免疫治疗药物的方法，包括采用上述任一项的标志物组合、上述任一项的试剂盒、和/或上述任一项的方法筛选所述免疫治疗药物。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明中提供的标志物组合可以有效地在医院实际操作中使用，用于在医院直肠癌患者石蜡标本中稳定地检测CD8+T细胞浸润和CD8+T细胞终端耗竭程度，以预测直肠癌患者对免疫治疗药物的响应性，使免疫治疗药物更针对性地治疗结直肠癌患者，从而提高对结直肠癌患者的治疗效果；相比现有的CD8+T细胞浸润标志物，本发明的标志物组合更准确有效。
附图说明
图1A是使用接受抗-PD1治疗的患者在药物治疗第1周期第0天之前的预处理时间点的样本中FFPE.ImmuneCRC响应者的总存活数和 FFPE.ImmuneCRC无响应者的总存活数分别与时间的关系图；
图1B是使用接受抗-PD1治疗的患者在药物治疗第1周期第29天之前的早期治疗时间点的样本中FFPE.ImmuneCRC响应者的总存活数和 FFPE.ImmuneCRC无响应者的总存活数分别与时间的关系图；
图2A显示在147个石蜡包埋样本中(有浸润性CD8+T细胞的肿瘤＝39，无浸润性CD8+T细胞的肿瘤＝108)，针对石蜡包埋(FFPE)肿瘤样品优化的方法FFPE.ImmuneCRC的接收者操作特征曲线下面积；
图2B显示在147个石蜡包埋样本中(有浸润性CD8+T细胞的肿瘤＝39，无浸润性CD8+T细胞的肿瘤＝108)，针对冷冻(Fresh frozen)肿瘤样品优化的方法的接收者操作特征曲线下面积；
图3A显示在25个MSI石蜡包埋样本中(浸润性CD8+T细胞终末衰竭 n＝13,浸润性CD8+T细胞但PD1和TIM3表达水平均低于临界值＝12)，针对石蜡包埋(FFPE)肿瘤样品优化的方法FFPE.ImmuneCRC的接收者操作特征曲线下面积；
图3B显示在25个MSI石蜡包埋样本中(浸润性CD8+T细胞终末衰竭 n＝13,浸润性CD8+T细胞但PD1和TIM3表达水平均低于临界值＝12)，针对冷冻(Fresh frozen)肿瘤样品优化的方法的接收者操作特征曲线下面积。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
在一些实施例中，本发明提供了用于检测生物学样本中CD8+T细胞浸润的标志物组合，包括用于判断生物学样本中是否有浸润性CD8+T细胞的第一标志物以及用于判断所述浸润性CD8+T细胞的衰竭模式的第二标志物，该标志物组合尤其适用于石蜡包埋标本(石蜡包埋标本是医院使用的标准标本，可以在室温下长期保持)，其准确度和灵敏度数据要远远超过现有的(适用于冷冻标本)标志物。优选地，所述生物学样本为肿瘤样本，由此，CD8+T细胞浸润的信号主要来自肿瘤细胞，即来自肿瘤细胞的基因；由于肿瘤细胞造成了肿瘤微环境中免疫细胞特性的改变，相比现有的冷冻标本的CD8+T细胞浸润的信号主要来自免疫细胞的基因，肿瘤细胞信号可看作免疫细胞信号的原因。另一方面，在医院中，所有病人的石蜡包埋标本切片都要求保证有>25％的肿瘤细胞，这是一种质量控制；这样，本发明的肿瘤石蜡包埋标本中主要来自肿瘤细胞的信号相比冷冻标本的主要来自免疫细胞的信号更稳定。
实施例1预测肿瘤微环境(FFPE.ImmuneCRC)的方法的设计
数据来源
共使用了中山大学肿瘤医院269个结直肠癌肿瘤样本的RNAseq数据。 MSI样本为65个，MSS样本为204个。通过病理实验室的标准程序从石蜡包埋(FFPE)肿瘤样品制备肿瘤切片。为每个肿瘤样品制备十张载玻片。所有样品都含有至少20％的肿瘤细胞。根据FFPE样品的标准方案进行RNA 分离和RNA测序。使用Qiagen FFPE RNA Kit进行RNA分离。去除核糖体RNA。所有样品的分离RNA的DV100(percentage of RNA fragments> 100，nucleotides/RNA片段大于100核苷酸的百分比)>40％，95％样品分离RNA的DV100>60％。使用NEBNextUltra II定向RNA文库制备和样品纯化珠进行文库制备。RNAseq使用IlluminaNovaSeq6000进行150bp双端测序进行。每个样品进行18G数据测序，所有样品的fastq数据Q30值均大于80％。测序数据使用Kallisto对照在Ensembl人类参考转录组 Homo_sapiens.GRCh38.v96(4)。使用tximport软件包汇总估计基因的计数，并使用scaledTPM方法对所述计数进行归一化处理(5)。
FFPE.ImmuneCRC模型的设计
FFPE.ImmuneCRC模型有两个部分的评分，第一部分是CD8+T细胞是否有浸润性(以下简称FFPE.ImmuneCRC.1)的评分，第二部分是浸润性 CD8+T细胞的衰竭模式(以下简称FFPE.ImmuneCRC.2)的评分。
关于FFPE.ImmuneCRC.1的评分，具体地：采用CD8A的表达水平来初步估计CD8+T细胞的丰度。CD8A表达水平的临界值定义为65个MSI 肿瘤的CD8A表达水平的40％；其中，CD8A表达水平高于临界值的MSI 肿瘤定义为具有浸润性CD8+T细胞的肿瘤(n＝39，n为样本数量,下同)； CD8A表达水平低于临界值的MSS肿瘤定义为无浸润性CD8+T细胞的肿瘤(n＝108)。在这些两组(即有浸润性CD8+T细胞的肿瘤和无浸润性CD8+T 细胞的肿瘤)之间进行了200轮10折交叉验证。在每个交叉验证回合中，对每个基因Wilcoxon rank sum test检验的p值排列。CD8A基因排除在交叉验证过程之外。在200轮交叉验证中，在至少有80％的交叉验证过程中p 值排在前150的基因被选为FFPE.ImmuneCRC.1的标志物，详见如下的表1。
表1 FFPE.ImmuneCRC.1的标志物
Figure BDA0003799855120000091
Figure BDA0003799855120000101
Figure BDA0003799855120000111
Figure BDA0003799855120000121
关于FFPE.ImmuneCRC.2的评分，具体地：对有浸润性的CD8+T细胞的肿瘤微环境评分,从而判断细胞衰竭模式，进而判断结直肠癌患者对免疫治疗药物的响应性。
由于TIM3是所有共表达抑制受体中的一种早期获得的共表达的抑制剂受体，采用PD1和TIM3的多种抑制受体的共表达模式，以用于定义终末衰竭模式(6)。在上述CD8+T细胞浸润高的MSI肿瘤中(n＝39)，PD1表达水平的中位数用作PD1的临界值，TIM3表达水平的中位数用作TIM3的临界值。浸润性CD8+T细胞且PD1和TIM3表达水平均高于临界值的MSI 肿瘤(第一组)定义为多种早期抑制受体的共表达的肿瘤微环境。存在这种肿瘤微环境的CD8+T细胞开始逐渐变为终末衰竭，并抵抗抗-PD1治疗 (n＝13)。浸润性CD8+T细胞但PD1和TIM3表达水平均低于临界值的MSI 肿瘤(第二组)定义为CD8+T细胞仍可对抗-PD1治疗(n＝12)产生响应的肿瘤微环境。两组(即第一组和第二组)之间进行了200轮10折交叉验证。在每个交叉验证回合中，对每个基因Wilcoxon rank sum test检验的p值排列。在200轮交叉验证中，在至少有80％的交叉验证过程中p值排在前150 的基因被选择作为FFPE.ImmuneCRC.2的标志物，详见表2。
表2 FFPE.ImmuneCRC.2的标志物
Figure BDA0003799855120000122
Figure BDA0003799855120000131
由上述结果可见，若浸润性CD8+T细胞不是终末衰竭模式，则表示结直肠癌患者仍能对检查点抑制剂响应，若浸润性CD8+T细胞具有终末衰竭模式，则表示结直肠癌患者对检查点抑制剂无响应。
经过第一部分FFPE.ImmuneCRC.1评分和第二部分 FFPE.ImmuneCRC.2评分，总结出评价结直肠癌患者对免疫治疗药物是否有响应性的判断条件：当第一部分FFPE.ImmuneCRC.1低分时(表示肿瘤无浸润性CD8+T细胞)，则可决定结直肠癌患者对单一免疫治疗药物无响应；当第一部分FFPE.ImmuneCRC.1高分时(表示肿瘤有浸润性CD8+T细胞)，需进一步对FFPE.ImmuneCRC.2评分，若FFPE.ImmuneCRC.2高分(表示肿瘤高浸润CD8+T细胞不是终末衰竭模式)，则可决定结直肠癌患者对单一免疫治疗药物有响应性，若FFPE.ImmuneCRC.2低分(表示肿瘤高浸润 CD8+T细胞是终末衰竭模式)，则可决定结直肠癌患者对单一免疫治疗药物无响应性。该无响应的癌症患者需要组合免疫治疗药物治疗，例如需要考虑抗-PD1和其它针对肿瘤微环境药物的组合疗法，或更换其他单一免疫治疗药物治疗。
本实施例不但依据肿瘤具有CD8+T细胞浸润性，还依据肿瘤浸润CD8+T细胞的子集表现出对抗-PD1反应的特性来决定结直肠癌患者对免疫治疗药物是否有响应性。
实施例2检验标志物在癌症免疫治疗响应中的表现
以抗-PD1为例，从而检验抗-PD1响应的预测价值。本实施例的生物标志物是实施例1的FFPE.ImmuneCRC方法获得的生物标志物。
数据来源
验证数据集包括标准化RNAseq数据和接受纳武单抗(nivolumab)的黑色素瘤患者样本的临床数据，分别分析第1周期第0天之前的预处理时间点的样本和第1周期第29天之前的早期治疗时间点的样本，剔除接受了先验的伊匹单抗(ipilimumab)治疗或总存活数据不完整的患者(n＝21)(7)；
采用FFPE.ImmuneCRC模型来预测抗-PD1的治疗响应
黑色素瘤是广泛用于验证CD8+T细胞和免疫治疗反应的模型肿瘤，本发明采用黑色素瘤作为模型以进行验证，FFPE.ImmuneCRC模型在接受抗 -PD1治疗的黑色素瘤患者的2个数据集上得到了验证，具体为：
(1)药物治疗第1周期第0天之前的预处理时间点的样本
使用表1和表2的基因标志物，FFPE.ImmuneCRC方法可以观察到 FFPE.ImmuneCRC预测的响应组与FFPE.ImmuneCRC预测的无响应组之间的存活分离(图1A，HR＝3.49，p＝0.016)。
(2)药物治疗第1周期第29天之前的早期治疗时间点的样本
使用表1和表2的基因标志物，FFPE.ImmuneCRC方法可以观察到 FFPE.ImmuneCRC预测的响应组与FFPE.ImmuneCRC预测的无响应组之间的存活分离(图1B，HR＝5.39，p＝0.002)。
实施例3关于检测至少三个标志物的结直肠癌患者分型方法
本实施例的结直肠癌分型的方法主要包括以下步骤：
(1)获得某一检测对象的表1中至少三个标志物在所述样品中的mRNA 基因表达水平，优选地，mRNA基因表达水平通过选自下组的技术获得： microarray，RNAseq，PCR。
(2)归一化表1中至少三个标志物的基因表达值，优选地，采用选自以下方法进行归一化处理：fRMA，RMA，RNAseq CPM，RNAseq FPKM。
(3)分别获取多个响应者中的上述表1中至少三个标志物的基因表达值，然后计算所有浸润性CD8+T细胞的肿瘤的相同标志物的平均基因表达值，其中，多个已知有浸润性CD8+T细胞的肿瘤的基因表达值可从石蜡包埋标本数据中获取；同理计算无浸润性CD8+T细胞的肿瘤无响应者的相同标志物的平均基因表达值，即，分别获取多个无浸润性CD8+T细胞的肿瘤中的上述表1中至少三个标志物的基因表达值，然后计算所有无浸润性 CD8+T细胞的肿瘤的相同标志物的平均基因表达值，其中，多个已知无浸润性CD8+T细胞的肿瘤的基因表达值可从石蜡包埋标本数据中获取。
(3)计算待检测对象的上述表1中的至少三个标志物归一化值与该至少三个标志物在有浸润性CD8+T细胞的肿瘤中的平均基因表达值的第一相似度；以及计算待检测对象的上述表1中至少三个标志物归一化值与至少三个标志物在无浸润性CD8+T细胞的肿瘤中的平均基因表达值的第二相似度，优选地，采用以下方法计算相似度：欧氏距离、曼哈顿距离、明可夫斯基距离、切比雪夫距离、雅卡德距离、皮尔逊相关性、余弦相关性或回归值。
(4)计算第一相似度与第二相似度的差值，当差值为小于第一阈值，表明对象为免疫治疗药物的无响应者；这里，通过计算可以区分石蜡包埋标本数据中有浸润性CD8+T细胞的肿瘤和无浸润性CD8+T细胞的肿瘤的最佳灵敏度得到第一阈值。当差值大于第一阈值，继续以下步骤：
(5)获得上述检测对象的表2中至少三个标志物在所述样品中的mRNA 基因表达水平，优选地，mRNA基因表达水平采用选自以下的技术获得： microarray，RNAseq，PCR。
(6)归一化表2中至少三个标志物的基因表达值，优选地，选自下组的方法进行归一化处理：fRMA、RMA、RNAseq CPM、RNAseq FPKM。
(7)分别获取多个响应者中的上述表2中至少三个标志物的基因表达值，然后计算所有有前体衰竭肿瘤浸润CD8+T细胞响应者的相同标志物的平均基因表达值，其中，多个有前体衰竭肿瘤浸润CD8+T细胞响应者的基因表达值可从石蜡包埋标本数据中获取；同理计算有终末衰竭肿瘤浸润 CD8+T细胞无响应者的相同标志物的平均基因表达值，即，分别获取多个有终末衰竭肿瘤浸润CD8+T细胞无响应者中的上述表2中至少三个标志物的基因表达值，然后计算所有有终末衰竭肿瘤浸润CD8+T细胞无响应者的相同标志物的平均基因表达值，其中，多个已知有终末衰竭肿瘤浸润CD8+T 细胞无响应者的基因表达值可从石蜡包埋标本数据中获取。
(8)计算待检测对象表2中所述至少三个标志物的归一化值与该至少三个标志物在有前体衰竭肿瘤浸润CD8+T细胞响应者中的平均基因表达值的第三相似度；以及计算待检测对象表2中至少三个标志物的归一化与该至少三个标志物在有终末衰竭肿瘤浸润CD8+T细胞无响应者中的平均基因表达值的第四相似度；优选地，用选自下组的方法计算相似性：欧氏距离、曼哈顿距离、明可夫斯基距离、切比雪夫距离、雅卡德距离、皮尔逊相关性、余弦相关性或回归值。
(9)计算第三相似度与第四相似度的差值，当差值大于第二阈值，表明对象为免疫治疗药物的响应者，可采用单一免疫治疗药物对分型为免疫治疗药物响应者进行结直肠癌治疗。这里，通过计算可以区分石蜡包埋标本数据中有前体衰竭肿瘤浸润CD8+T细胞响应者和有终末衰竭肿瘤浸润 CD8+T细胞无响应者的最佳灵敏度得到第二阈值。当差值为小于第二阈值，表明对象为单一免疫治疗药物的无响应者，需考虑采用组合免疫药物对无响应者进行结直肠癌治疗。
本实施例适用于检测三个以上的基因标志物，但是并不限制本发明检测一个基因标志物。
当检测表1中标志物时，本实施例检测选自表1基因中的至少3种；更优选地，所述标志物选自该69个基因中的至少5个基因；更优选地，所述标志物选自该69个基因中的至少6个基因；更优选地，所述标志物选自该69个基因中的至少7个基因；更优选地，所述标志物选自该69个基因中的至少8个基因；更优选地，所述标志物选自该69个基因中的至少9个基因；更优选地，所述标志物选自该69个基因中的至少10个基因；更优选地，所述标志物选自该69个基因中的至少15个基因；更优选地，所述标志物选自该69个基因中的至少20个基因；更优选地，所述标志物选自该69个基因中的至少30个基因；更优选地，所述标志物选自该69个基因中的至少40个基因；更优选地，所述标志物选自该69个基因中的至少50 个基因；更优选地，所述标志物为该69个基因。
当检测表2标志物时，本实施例检测选自表2基因中的至少3种。更优选地，所述标志物选自该17个基因中的至少5个基因；更优选地，所述标志物选自该17个基因中的至少6个基因；更优选地，所述标志物选自该 17个基因中的至少7个基因；更优选地，所述标志物选自该17个基因中的至少8个基因；更优选地，所述标志物选自该17个基因中的至少9个基因；更优选地，所述标志物选自该17个基因中的至少10个基因；更优选地，所述标志物为该17个基因。
癌症免疫药物治疗包括：anti-PD1药物、anti-PDL1药物、anti-CTLA4 药物、anti-TIM3药物、anti-BTLA药物、anti-VISTA药物或anti-LAG3药物中的任一种或两种以上药物组合的治疗。
作为本发明所述标志物的优选实施方式，所述结直肠癌标本为石蜡包埋标本。
实施例4肿瘤样品优化方法性能比较
本实施例涉及在石蜡包埋(FFPE)肿瘤样品数据中，针对石蜡包埋(FFPE) 肿瘤样品优化的方法FFPE.ImmuneCRC的性能和针对冷冻(Fresh frozen)肿瘤样品优化的方法TMEPRE(3)的性能的对比。
数据来源
共使用了中山大学肿瘤医院269结直肠癌肿瘤样本的RNAseq数据。 MSI样本为65个，MSS样本为204个。通过病理实验室的标准程序从石蜡包埋(FFPE)肿瘤样品制备肿瘤切片。为每个肿瘤样品制备十张载玻片。所有样品都含有至少20％的肿瘤细胞。根据FFPE样品的标准方案进行RNA 分离和RNA测序。使用Qiagen FFPE RNA Kit进行RNA分离。去除核糖体RNA。所有样品的分离RNA的DV100>40％，95％样品分离RNA的 DV100>60％。使用NEBNextUltra II定向RNA文库制备和样品纯化珠进行文库制备。RNAseq使用IlluminaNovaSeq6000进行150bp双端测序进行。每个样品进行18G数据测序，所有样品的fastq数据Q30值均大于80％。测序数据使用Kallisto对照在Ensembl人类参考转录组 Homo_sapiens.GRCh38.v96(4)。使用tximport软件包汇总估计基因的计数，并使用scaledTPM方法对所述计数进行归一化处理(5)。
比较CD8+T细胞是否有浸润性(FFPE.ImmuneCRC.1)的评分，采用 CD8A的表达水平来估计CD8+T细胞的丰度。CD8A表达水平的临界值定义为65个MSI肿瘤的CD8A表达水平的40％；其中，CD8A表达水平高于临界值的MSI肿瘤定义为具有浸润性CD8+T细胞的肿瘤(n＝39)；CD8A 表达水平低于临界值的MSS肿瘤定义为无浸润性CD8+T细胞的肿瘤 (n＝108)。在这147个石蜡包埋样本中，读取针对石蜡包埋(FFPE)肿瘤样品优化的方法FFPE.ImmuneCRC.1的评分，计算接收者操作特征曲线下面积 (如图2A所示，ROC曲线下面积.1＝0.977)。在这147个石蜡包埋样本中，读取针对冷冻(Fresh frozen)肿瘤样品优化的方法TMEPRE.TcellInfiltration 的评分(3)，计算接收者操作特征曲线下面积(如图2B所示，ROC曲线下面积.2＝0.954)。ROC曲线下面积.1大于ROC曲线下面积.2，这表明在石蜡包埋肿瘤样品中，针对石蜡包埋(FFPE)肿瘤样品优化的方法 FFPE.ImmuneCRC优于针对冷冻肿瘤样品优化的方法TMEPRE。
比较对有浸润性的CD8+T细胞的肿瘤微环境评分 (FFPE.ImmuneCRC.2),从而判断细胞衰竭模式。在上述CD8+T细胞浸润高的MSI肿瘤中(n＝39)，PD1表达水平的中位数用作PD1的临界值，TIM3 表达水平的中位数用作TIM3的临界值。浸润性CD8+T细胞且PD1和TIM3表达水平均高于临界值的MSI肿瘤定义为多种早期抑制受体的共表达的肿瘤微环境。存在这种肿瘤微环境的CD8+T细胞开始逐渐变为终末衰竭，并抵抗抗-PD1治疗(n＝13)。浸润性CD8+T细胞但PD1和TIM3表达水平均低于临界值的MSI肿瘤定义为CD8+T细胞仍可对抗-PD1治疗(n＝12)产生响应的肿瘤微环境。在这25个石蜡包埋样本中，读取针对石蜡包埋肿瘤样品优化的方法FFPE.ImmuneCRC.2的评分，计算接收者操作特征曲线下面积 (如图3A所示，ROC曲线下面积.3＝0.987)。在这25个石蜡包埋样本中，读取针对冷冻肿瘤样品优化的方法TMEPRE.TcellResponse的评分(3)，计算接收者操作特征曲线下面积(如图3B所示，ROC曲线下面积.4＝0.609)。 ROC曲线下面积.3大于ROC曲线下面积.4，这表明在石蜡包埋肿瘤样品中，针对石蜡包埋肿瘤样品优化的方法FFPE.ImmuneCRC优于针对冷冻肿瘤样品优化的方法TMEPRE。
综合比较上述这些结果，在石蜡包埋肿瘤样品中，针对石蜡包埋肿瘤样品优化的方法FFPE.ImmuneCRC优于针对冷冻肿瘤样品优化的方法。可能的原因是因为石蜡包埋肿瘤样品中，mRNA会有更多的降解，针对冷冻肿瘤样品优化的方法使用的一部分基因，可能在石蜡包埋肿瘤样品中降解。因此，在石蜡包埋肿瘤样品中，针对冷冻肿瘤样品优化的方法，虽然依旧有显著的预测性能可以测试到肿瘤微环境的信号，但是性能会低于针对石蜡包埋肿瘤样品优化的方法。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
参考文献
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Claims (19)

1.用于检测生物学样本中CD8+T细胞浸润的标志物组合，其特征在于，所述标志物组合包括用于判断生物学样本中是否有浸润性CD8+T细胞的第一标志物，所述第一标志物为基因ANKH、OSBPL2、RAB22A、ZNF217、ZSWIM1、CHMP4B、SUSD1、FARP1、SERINC3、PCMTD2、RTF2、NOL4L、IYD、DDX27、CPNE1、ZDHHC9、SDC4、SLC22A3、YAE1、FREM2、GJB1、SLC2A12、SGK2、NR1I2、PLCB4、WFDC13、CYP2B6、PMEPA1、CYP4F2、MUC12、R3HDML、MAGEB17、GRM8、CTC1、IKZF3、SMAP2、ALPK2、SLC25A37、GBP4、IRF1、RASGRP1、TRGC1、CCL5、APOBEC3G、NLRC5、PTPRC、APOE、WARS、IKZF1、FAS、STAT1、FYB1、PIK3CD、TYMP、GFI1、SAMD9L、GNLY、CIITA、FUT8、UBE2L6、GBP5、PRF1、SH2D1A、PTGDR、BST2、DUSP4、MYRF、CXCL13和TFAP2A中的至少三种。
2.根据权利要求1所述的标志物组合，其特征在于，所述生物学样本为血液样本、血清样本、分离自外周血的单个核细胞样本、组织样本和体液样本中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的标志物组合，其特征在于，所述生物学样本为结直肠癌患者的肿瘤。
4.根据权利要求1所述的标志物组合，其特征在于，所述生物学样本为石蜡包埋样本。
5.根据权利要求1所述的标志物组合，其特征在于，所述标志物组合还包括用于判断所述浸润性CD8+T细胞的衰竭模式的第二标志物。
6.根据权利要求5所述的标志物组合，其特征在于，所述第二标志物为基因ANKRD10、ARGLU1、CAST、DGKH、EXOSC8、FBXL5、MAPK8、PCCA、SHLD2、AP5B1、CDK2AP2、DEDD2、PACSIN3、PML、SETD1B、SLC4A2和TCF3P1中的至少三种。
7.用于评估结直肠癌患者对免疫治疗药物响应性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测权利要求1中第一标志物以及权利要求5或6中第二标志物在所述结直肠癌患者的生物学样本中含量的试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述生物学样本为血液样本、血清样本、分离自外周血的单个核细胞样本、组织样本和体液样本中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测所述基因的探针，或/和用于检测所述基因相应的mRNA、cDNA或/和蛋白质的含量的试剂。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫治疗药物为抗-PD1、抗-PDL1、抗-CTLA4、抗-TIM3、抗-BTLA、抗-VISTA和抗-LAG3中的一种。
11.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述生物学样本为石蜡包埋样本。
12.用于评估结直肠癌患者对单一免疫治疗药物响应性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提供结直肠癌患者的生物学样本；
2)检测所述生物学样本中第一标志物含量，以判断所述结直肠癌患者肿瘤内是否有浸润性CD8+T细胞；以及
3)若步骤2)的判断结果为否，则所述结直肠癌患者对所述的单一免疫治疗药物无响应性，评估结束；
若步骤2)的判断结果为是，则需检测所述生物学样本中第二标志物含量，以判断所述浸润性CD8+T细胞的衰竭模式，
当衰竭模式为前体衰竭模式时，则判断所述结直肠癌患者是所述单一免疫治疗药物的响应者；
当衰竭模式是终末衰竭模式时，则判断结所述直肠癌患者是所述单一免疫治疗药物的无响应者。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述生物学样本选自血液样本、血清样本、分离自外周血的单个核细胞样本、组织样本和体液样本中的至少一种。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述免疫治疗药物为抗-PD1、抗-PDL1、抗-CTLA4、抗-TIM3、抗-BTLA、抗-VISTA和抗-LAG3中的一种。
15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述结直肠癌患者处于结直肠癌I期、II期、III期或IV期。
16.根据权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述生物学样本为石蜡包埋样本。
17.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一标志物为基因ANKH、OSBPL2、RAB22A、ZNF217、ZSWIM1、CHMP4B、SUSD1、FARP1、SERINC3、PCMTD2、RTF2、NOL4L、IYD、DDX27、CPNE1、ZDHHC9、SDC4、SLC22A3、YAE1、FREM2、GJB1、SLC2A12、SGK2、NR1I2、PLCB4、WFDC13、CYP2B6、PMEPA1、CYP4F2、MUC12、R3HDML、MAGEB17、GRM8、CTC1、IKZF3、SMAP2、ALPK2、SLC25A37、GBP4、IRF1、RASGRP1、TRGC1、CCL5、APOBEC3G、NLRC5、PTPRC、APOE、WARS、IKZF1、FAS、STAT1、FYB1、PIK3CD、TYMP、GFI1、SAMD9L、GNLY、CIITA、FUT8、UBE2L6、GBP5、PRF1、SH2D1A、PTGDR、BST2、DUSP4、MYRF、CXCL13和TFAP2A中的至少三种。
18.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第二标志物为基因ANKRD10、ARGLU1、CAST、DGKH、EXOSC8、FBXL5、MAPK8、PCCA、SHLD2、AP5B1、CDK2AP2、DEDD2、PACSIN3、PML、SETD1B、SLC4A2和TCF3P1中的至少三种。
19.一种筛选结直肠癌的免疫治疗药物的方法，其特征在于，包括采用权利要求1～6中任一项的标志物组合、权利要求7～11中任一项的试剂盒、和/或权利要求12～18中任一项的方法筛选所述免疫治疗药物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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