CN115521929A

CN115521929A - 高活性农药活化脂激活酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN115521929A
Application number: CN202110708570.6A
Authority: CN
Inventors: 姚建庄; 杨康; 李强
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2021-06-25
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2022-12-27

Abstract

本发明公开了一种高活性农药活化脂激活酶（水杨酸结合蛋白酶）突变体及其应用，属于植物基因工程和酶工程技术领域。本发明构建的水杨酸结合蛋白酶突变体A13S，其相对反应速度是野生型水杨酸结合蛋白酶的3.5倍；水杨酸结合蛋白酶突变体S81C相对反应速度是野生型水杨酸结合蛋白酶的149.5倍；突变体L82T相对反应速度是野生型的163.7倍；突变体L82S相对反应速度是野生型的681.5倍。因此本发明的水杨酸结合蛋白酶突变体能够提高ASM转化Acibenzolar的能力，加快Acibenzolar的积累，更有效的激活系统获得性抗性（SAR），提升植物抵抗病原体的能力，这对SABP2过表达转基因植物的农业化使用也具有积极的推动作用。

Description

高活性农药活化脂激活酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及水杨酸结合蛋白酶突变体及其应用，属于植物基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

水杨酸结合蛋白(SABP2)最初在烟草中发现，属于α/β水解酶折叠家族，能特异性地与水杨酸(SA)结合。当植物受到病原菌侵染，在侵染部位的SA含量会增加，水杨酸被水杨酸羧甲基转移酶转化为具有良好疏水性的水杨酸甲酯(MeSA)，MeSA作为一种分子信号在植物细胞间进行传递.当MeSA经植物的韧皮部位传输至植物的远端组织时，具有酯酶活性的SABP2催化无活性的MeSA脱甲基形成有活性的SA。SA含量的增加改变了细胞质的氧化还原状态，使NPR1转变为低聚体迁移到细胞核，在TGA等转录因子的帮助下使病程相关基因等防御相关基因表达，抵抗病情的扩大。

SABP2是SA信号途径中的重要组成部分。当SABP2被沉默后，对烟草花叶病毒(TMV)的防御及PR基因的表达均被阻碍。SABP2所具有的酯酶活性能使活化酯ASM脱甲基转变为Acibenzolar，当用ASM处理SABP2沉默的烟草植株，PR蛋白不能表达，正常的SAR也不能获得，当用Acibenzolar处理SABP2沉默的植株时，SAR能够被正常诱导，这表明SABP2在ASM介导的防御反应中是必须的。因此，提高SABP2的活性，从而也就提高催化ASM转化Acibenzolar的能力，加快Acibenzolar的积累，更有效的激活SAR，提升植物抵抗病原体的能力，这对SABP2过表达转基因植物的农业化使用也具有积极的推动作用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明通过对来源于烟草野生型水杨酸结合蛋白酶进行突变改造，获得了四株突变体A13S，S81C，L82T，L82S，该突变体具有高酶活，能够使酶活力明显提高，通过获得过表达SABP2突变体植物进而快速诱导系统获得抗性(SAR)，能够节省植株病虫害防御时间和提高经济效益。

本发明的第一个目的是提供一种水杨酸突变体，，所述突变体的氨基酸序列包括：在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第13位丙氨酸突变为丝氨酸后得到的氨基酸序列。

在一种实施方式中，所述突变体是A13S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述突变体是S81C，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述突变体是L82T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，所述突变体是L82S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体和细胞。

本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的基因工程植物。

本发明的第五个目的是提供一种切割底物中酯键的方法，是以所述突变体或含有突变体的全细胞为催化剂，切割底物中酯键和硫酯键。

在一种实施方式中，所述的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主。

在一种实施方式中，所述的基因工程菌，是以pET-21α(+)为表达载体。

本发明还提供所述的突变体或所述的基因工程菌在医药生产、农业等领域的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明构建的水杨酸结合蛋白酶突变体A13S，相对反应速度是野生型水杨酸结合蛋白酶的3.5倍。

(2)本发明构建的水杨酸结合蛋白酶突变体S81C，相对反应速度是野生型水杨酸结合蛋白酶的149.5倍。

(3)本发明构建的水杨酸结合蛋白酶突变体L82T，相对反应速度是野生型水杨酸结合蛋白酶的163.7倍。

(4)本发明构建的水杨酸结合蛋白酶突变体L82S，相对反应速度是野生型水杨酸结合蛋白酶的681.5倍。

附图说明

图1：pET-21α(+)定点突变全质粒PCR结果，其中1表示DNA Marker；2表示pET-21α(+)定点突变全质粒PCR结果。

图2：水杨酸结合蛋白酶的纯化结果，其中M表示Marker，1表示纯化后的野生型水杨酸结合蛋白酶；2表示纯化后的水杨酸结合蛋白酶突变体A13S；3表示纯化后的水杨酸结合蛋白酶突变体S81C；4表示纯化后的水杨酸结合蛋白酶突变体L82T，5表示纯化后的水杨酸结合蛋白酶突变体L82S

图3：水杨酸结合蛋白酶野生型蛋白浓度标准曲线图。

图4：水杨酸结合蛋白酶突变体A13S蛋白浓度标准曲线图。

图5：水杨酸结合蛋白酶突变体S81C蛋白浓度标准曲线图。

图6：水杨酸结合蛋白酶突变体L82T蛋白浓度标准曲线图。

图7：水杨酸结合蛋白酶突变体L82S蛋白浓度标准曲线图。

图8：CYS-DTNB标准曲线图。

图9：野生型、A13S、S81C、L82T、L82S四种酶催化ASM的相对反应速度图。

图10：HPLC法检测SA的标准曲线图。

图11：野生型、S81C、L82S酶60min催化MeSA生成SA含量的相对平均值及标准偏差。

具体实施方式

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L。

LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。

磷酸盐缓冲液：100mmol/L Na₂HPO₄、100mmol/L NaH₂PO₄，PH 7.4。

实施实例1

从基因数据库NCBI中，检索到野生型水杨酸结合蛋白酶基因(Sequence ID: NP_001312442.1Length:260，SEQ ID NO.6所示)，送往公司进行合成，并通过一步法将该序列克隆至pET-21α(+)上构建重组载体，后将该载体转染至大肠杆菌BL21(DE3)中，通过添加IPTG进行诱导表达及鉴定。

实施实例2：水杨酸结合蛋白酶突变体的制备

(1)突变体A13S

根据如SEQ ID NO.2所示的水杨酸结合蛋白酶的基因序列，设计并合成引入突变体 A13S引物，利用快速PCR技术，以实例1中得到的携带编码野生型水杨酸结合蛋白酶的基因的重组质粒pET-21α(+)为模板，对水杨酸结合蛋白酶基因进行定点突变，测定DNA编码序列，鉴别出第13位丙氨酸密码子突变为丝氨酸密码子，得到单突变体水杨酸结合蛋白酶A13S，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

表2引入A13S突变的定点突变引物

注：下划线为突变碱基。

PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1.将验证正确的PCR产物经DpnI消化，转化大肠杆菌DMT感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素) 过夜培养后提取质粒，突变质粒测序正确，得到的重组菌命名为A13S。

(2)突变体S81C

根据如SEQ ID NO.2所示的水杨酸结合蛋白酶的基因序列，设计并合成引入突变体 S81C引物，利用快速PCR技术，以实例1中得到的携带编码野生型水杨酸结合蛋白酶的基因的重组质粒pET-21α(+)为模板，对水杨酸结合蛋白酶基因进行定点突变，测定DNA编码序列，鉴别出第81位丝氨酸密码子突变为半胱氨酸密码子，得到单突变体水杨酸结合蛋白酶S81C，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

表3引入S81C突变的定点突变引物

注：下划线为突变碱基。

将验证正确的PCR产物经DpnI消化，转化大肠杆菌DMT感受态，感受态细胞在 LB固体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)过夜培养，挑取阳性克隆于LB液体培养基(含 100μg/ml氨苄青霉素)中培养后提取质粒，突变质粒测序正确，得到的重组菌命名为S81C。

(3)突变体L82T

根据如SEQ ID NO.2所示的水杨酸结合蛋白酶的基因序列，设计并合成引入突变体 L82T引物，利用快速PCR技术，以实例1中得到的携带编码野生型水杨酸结合蛋白酶的基因的重组质粒pET-21α(+)为模板，对水杨酸结合蛋白酶基因进行定点突变，测定DNA编码序列，鉴别出第82位丙亮氨酸密码子突变为苏氨酸密码子，得到单突变体水杨酸结合蛋白酶L82T，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

表四引入L82T突变的定点突变引物

注：下划线为突变碱基。

将验证正确的PCR产物经DpnI消化，转化大肠杆菌DMT感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)过夜培养，挑取阳性克隆于LB液体培养基(含 100μg/ml氨苄青霉素)中培养后提取质粒，突变质粒测序正确，得到的重组菌命名为L82T。

(4)突变体L82S

根据如SEQ ID NO.2所示的水杨酸结合蛋白酶的基因序列，设计并合成引入突变体 L82T引物，利用快速PCR技术，以实例1中得到的携带编码野生型水杨酸结合蛋白酶的基因的重组质粒pET-21α(+)为模板，对水杨酸结合蛋白酶基因进行定点突变，测定DNA编码序列，鉴别出第82位丙亮氨酸密码子突变为苏氨酸密码子，得到单突变体水杨酸结合蛋白酶L82T，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

表4引入L82S突变的定点突变引物。

注：下划线为突变碱基。

将验证正确的PCR产物经DpnI消化，转化大肠杆菌DMT感受态，感受态细胞在 LB固体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)过夜培养，挑取阳性克隆于LB液体培养基(含 100μg/ml氨苄青霉素)中培养后提取质粒，突变质粒测序正确，得到的重组菌命名为L82S。

分别将实例1中得到的重组菌以及步骤(1)、(2)、(3)、(4)中得到的重组菌接种至LB培养基，过夜培养，提取得到质粒，将质粒分别转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞，得到的重组菌的名字分别命名为野生型(WT)、A13S、S81C、L82T、L82S。

实施实例3：水杨酸结合蛋白酶的纯化。

分别挑取实施实例2中得到的重组菌野生型(WT)、A13S、S81C、L82T、L82S 接种于5ml的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃、250rpm震荡培养至OD600 至1.6-1.8左右，加入10μM诱导剂IPTG，17℃诱导20h得到菌体。诱导结束后，取诱导表达的的菌液于50mL离心管中，在4℃条件下，以3000rpm的转速，离心20min收集菌体。用5mL体系，超声裂解缓冲液4.45mL，1mM PMSF 50μL，1mg/mL溶菌酶500μL悬浮菌体, 吹打混匀，冰浴超声波破碎菌体，然后10000rpm离心20min收集上清，得到粗酶液。

利用Ni-琼脂糖凝胶6FF(His标签纯化树脂)纯化蛋白。

配制纯化蛋白结合缓冲液：磷酸缓冲液(Lysis Buffer)300mmol/L NaCl，50mmol/L NaH2PO3，10mmol/L咪唑；磷酸盐缓冲液(wash Buffer)：50mmol/L NaH2PO4、300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑。磷酸盐缓冲液(Elution Buffer)：50mmol/L NaH2PO4、300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑。

先用3-5倍柱体积去离子水冲洗出储存缓冲液，然后用至少5倍柱床体积LysisBuffer平衡色谱柱。将上述离心收集的的重组菌体溶于色谱柱中，上样结合1h。然后用10-15 倍柱床体积的wash Buffer洗去非特异性吸附的蛋白，直到紫外吸收达到一个稳定的基线，最后使用5倍柱床体积的Elution Buffer洗脱蛋白，收集样品。4℃、1L 0.1M磷酸缓冲液透析蛋白三次。即得到野生型的纯化水杨酸结合蛋白酶WT以及水杨酸结合蛋白酶突变体A13S、 S81C、L82T、L82S。SDS-PAGE分析鉴定结果如图2所示。

实施实例4：水杨酸结合蛋白酶蛋白浓度测定

采用Bradford法测定实施实例3中得到的野生型(WT)、A13S、S81C、L82T、L82S 水杨酸结合蛋白酶浓度。

配制0、0.0625、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5mg/mL蛋白标准，每次稀释时注意充分混合。

(1)取5μL不同浓度蛋白标准加到96的蛋白标准孔中。

(2)取5μL样品到96孔板的样品孔中。

(3)各孔加入250μL G250染色液。

(4)用酶标仪测定A595，可以立即测定吸光度，也可以在2小时内测定，2小时内测量数据无显著变化。

(5)根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品中的蛋白浓度，得到野生蛋白浓度1.29mg/mL，A13S蛋白浓度0.66mg/mL，S81C蛋白浓度1.74mg/mL，L82T蛋白浓度 1.14mg/mL，L82S蛋白浓度1.2mg/mL。

实施实例5：CYS-DTNB标准曲线的测定

DTNB可与半胱氨酸(CYS)发生显色反应，半胱氨酸作为巯基集团的标准品，在由磷酸缓冲液与EDTA组成的不同体积反应缓冲液中溶解一系列不同浓度的半胱氨酸，标准品浓度如下表。

取若干离心管，每个离心管中包含2.0mL的ELLman试剂液(DTNB)，将2.0mL 各浓度的标准工作液添加至每个离心管中，室温下反应15min，测试412nm紫外吸收，根据得到的数值生成标准曲线，标准曲线如图八所示。

测定待测样品，对照标准曲线的酶浓度，由公式计算巯基(-SH)含量。

表5引入半胱氨酸各浓度配制方法

实施实例6：水杨酸结合蛋白酶酶活的测定

测定实施实例3中得到的野生型、A13S、S81C、L82T、L82S水杨酸结合蛋白酶酶活。

酶活测定原理：以ASM为底物在水杨酸结合蛋白酶的催化下，会产生水杨酸类似物和CH3SH。利用Ellman试剂即DTNB与含巯基化合物的颜色反应，测定巯基的生成量。

配制底物20μM ASM：称取1.0mg ASM溶于100mL PH7.4PB缓冲液中，配成试剂一。

取10mL试剂一加入5.8mg EDTA和1.0mg DTNB混匀，配成试剂二。

取10mL PH7.4 PB缓冲液加入5.8mg EDTA和1.0mg DTNB混匀，配成试剂三。

由实例4得到的标准曲线，分别计算WT、A13S、S81C、L82T、L82S的蛋白浓度。

表6引入酶活测定反应的具体浓度及所加的量

表7野生型和突变型水杨酸结合蛋白酶相对反应速度

实施实例7：采用高效液相色谱(HPLC)测定突变体酶促反应水解MeSA的活性，以野生型的反应作为对照，以测定突变酶的催化效果。

方法：配制PH7.4的0.1M PB缓冲液，加入1mM MeSA作为反应底物溶液。SABP2 活力检测的标准反应体系为500μL的反应底物溶液(指定PH下)，再加入酶液，最终浓度为 10μM。衍生化反应在25℃条件下分别进行30min、60min后上柱检测。

采用HPLC法测定条件如下：色谱分离为Hyper ODS2 C18(填料粒径为5μm，规格为250mm×4.6mm)，紫外检测波长为220nm，进样量为20μL，柱温为25℃，流动相为PB 缓冲液(20mM，用磷酸调PH至PH2.5)、甲醇混合物(体积比为45：55)。流动性流速为 1.0mL/min。

标曲的绘制按照上述检测方法进行，配制不同浓度梯度的SA标准溶液，每个浓度做三个平行，然后将检测结果峰面积和浓度进行线性回归，可得到产物SA的标准曲线，其标准曲线如图10。

通过HPLC法检测底物MeSA转化生成的SA含量，可计算出野生型与突变体酶之间酶反应的相对速度。如图11，WT、S81C、L82S酶60min催化MeSA生成SA含量的相对平均值及标准偏差。

Claims

1.一种水杨酸结合蛋白酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包括：在SEQID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第13位的丙氨酸突变为丝氨酸后得到的氨基酸序列。

2.一种水杨酸结合蛋白酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包括：在SEQID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第81位的丝氨酸突变为半胱氨酸后得到的氨基酸序列。

3.一种水杨酸结合蛋白酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包括：在SEQID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第82位的亮氨酸突变为苏氨酸后得到的氨基酸序列。

4.一种水杨酸结合蛋白酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包括：在SEQID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第82位的亮氨酸突变为丝氨酸后得到的氨基酸序列。

5.编码权利要求1～4任一所述突变体的基因。

6.携带权利要求5所述基因的载体或细胞。

7.表达权利要求1～4任一所述突变体的基因工程植物。

8.一种切割底物中酯键的方法，其特征在于，以权利要求1～4任一所述突变体或含有所述突变体的全细胞为催化剂，切割底物中的酯键和硫酯键。

9.权利要求1～4任一所述的突变体或权利要求7所述的基因工程植物在农业生产、化工或植物抗病原菌领域的应用。