CN115504991A - 一种雷公藤内酯醇衍生物及其在肿瘤靶向治疗领域的应用 - Google Patents

一种雷公藤内酯醇衍生物及其在肿瘤靶向治疗领域的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种雷公藤内酯醇衍生物及其在肿瘤靶向治疗领域的应用。本发明提供了一种式I所示的雷公藤内酯醇衍生物，
Figure DDA0003869356440000011
本发明所述的雷公藤内酯醇衍生物在保留了雷公藤内酯醇对肺癌细胞较强的杀伤作用的同时，减小了对正常肺部细胞的毒副作用，具有作为抗肿瘤药物的开发前景。

Description

一种雷公藤内酯醇衍生物及其在肿瘤靶向治疗领域的应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤活性成分技术领域，具体涉及一种雷公藤内酯醇衍生物、制备方法，包含所述衍生物的药物组合物及其在肿瘤靶向治疗领域的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
雷公藤最早记载于《神农百草经》，其化学成分主要包括二萜、三萜、倍半萜、生物碱等，早在民间就用于肿瘤治疗，另外，雷公藤还具有抗炎、免疫抑制、抗生育等生物活性。雷公藤内酯醇在二十世纪七十年代由Kupchan等从中国台湾产雷公藤中首次分离提出，是雷公藤抗肿瘤作用的主要活性成分。但雷公藤内酯醇同时具有较大的毒副作用，限制了其在抗肿瘤方面的临床应用。
肿瘤细胞与正常细胞对比，发生了较多变化，包括肿瘤酸性微环境，线粒体等。基于雷公藤内酯醇抗肿瘤作用机制的研究，发现与线粒体息息相关。因此，依据肿瘤细胞线粒体的变化，将药物特异性的靶向线粒体，减少对正常细胞的毒副作用，有望开发新的抗肿瘤候选药物。
发明内容
本发明通过对雷公藤内酯醇构效关系的研究，在对雷公藤内酯醇活性影响不大的修饰位点进行结构修饰，获得了一系列新型结构的雷公藤内酯醇衍生物，主要是在C14位通过酯键以及不同碳链长度与线粒体靶向分子相连接，依据肿瘤细胞线粒体较高的膜电位实现靶向治疗，提高该类药物抗肿瘤的选择性。
基于上述技术效果，本发明提供以下技术内容：
本发明第一方面，提供一种雷公藤内酯醇衍生物，所述衍生物选自式I所示化合物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物，所述式I结构如下：
Figure BDA0003869356420000021
其中，n为4-10的整数。
式I所示的化合物基于一类亲脂性阳离子，通过静电作用的介导，利用肿瘤细胞线粒体内膜电势差高于正常细胞而蓄积于肿瘤细胞线粒体，从而靶向肿瘤细胞线粒体，从而实现对肿瘤细胞线粒体的靶向毒性及杀伤作用。
本发明针对上述衍生物活性的研究中，考察了碳链长度变化对抗肿瘤活性的影响，结果发现，雷公藤内酯醇是抗肿瘤活性必须部分，而F16部分是靶向必须基团，连接它们的碳链过短时，即小于5时难以连接，当碳链长度过长即大于 11时，活性会降低。
本发明进一步优选的方案中，所述雷公藤内酯醇衍生物具体选自以下结构：
Figure BDA0003869356420000022
Figure BDA0003869356420000031
本发明第二方面，提供第一方面所述雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：以雷公藤内酯醇TP为起始原料，在其C-14β-OH上通过酯化反应得到中间体化合物，然后中间体化合物与F16发生成盐反应，得到式Ⅰ所示的雷公藤内酯醇衍生物；其合成路线如下：
Figure BDA0003869356420000032
优选的，上述反应步骤(1)所示的酯化反应中，还需要加入缩合剂及催化剂：所述缩合剂选自碳二亚胺(EDCI),N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC),N,N'- 二异丙基碳二亚胺(DIC)中的一种或几种的组合；
所述催化剂选自4-二甲氨基吡啶(DMAP)三乙胺(TEA)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)中的一种或几种的组合。
进一步的，上述反应(1)以EDCI为缩合剂,4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂，所述酯化反应的溶剂选自二氯甲烷，三氯甲烷，N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种的组合。
优选的，上述反应步骤(2)所示的成盐反应中，反应溶剂选自正丁醇，乙腈，N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种的组合；更优选为乙腈。
优选的，上述反应步骤(2)的反应条件如下：80～90℃加热回流，可通过薄层色谱检测等方式确定反应结束。
上述制备方法的一种实施方式中，具体步骤如下：以雷公藤内酯醇为起始原料，以EDCI/DMAP为缩合剂和催化剂，在二氯甲烷溶剂体系中与溴化酸在室温下发生成酯反应，检测反应完成后分离得到白色固体化合物，即中间体；将中间体与F16加入乙腈溶剂体系中，82～86℃下加热回流，检测反应结束后，得到式I所示结构的衍生物；其中，雷公藤内酯醇、EDCI、DMAP、溴化酸、二氯甲烷的加入量之比为1mol：4mol：2mol：3-5mol：150-200mL；中间体化合物、F16 和乙腈加入量之比为1mol：3mol：150-200mL。
本发明第三方面，提供一种药物组合物，所述组合物中包括第一方面所述雷公藤内酯醇衍生物。
上述药物组合物施用于受试者的主要目的在于改善或治疗肿瘤相关疾病症状，在药物组合中，所述雷公藤内酯醇衍生物作为活性成分，其应当是有效剂量，所述“有效剂量”表示在剂量和时间段上能够有效实现期望的治疗或疾病改善效果，该剂量可依据受试对象、施用方式等因素进行常规调整。以药物组合物的总质量计，所述衍生物的含量可以是大约0.01～99％、0.1～70％、1～30％、0.01～ 0.05％、0.05～0.1％、0.1～0.3％、0.3～0.5％、0.5～1％、1～3％、3～5％、5～10％、 10～20％、20～30％、30～50％、50～70％、或70～99％优选的方案中，所述受试者为哺乳动物，包括但不限于大鼠、小鼠、兔、猴、狗或人，最优选为人。
优选的，所述药物组合物中，还包括药学上所必须的辅料，具体为包括但不限于缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、杀菌剂、亲水性聚合物、氨基酸单糖、二糖和其它碳水化合物、螯合剂、张力调节剂、表面活性剂、成盐抗衡离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂。
本发明第四方面，提供第一方面所述雷公藤内酯醇衍生物、第三方面所述药物组合物在肿瘤靶向治疗领域的应用。
上述应用方式至少包括以下两种：
(1)将所述雷公藤内酯醇衍生物或药物组合物施用于有治疗需求的对象以改善肿瘤相关症状；
(2)将所述雷公藤内酯醇衍生物或药物组合物用于制备抗肿瘤药物、模型药剂或检测产品。
优选的，所述肿瘤为包括但不限于皮肤癌、头颈癌、肺癌、食道癌、宫颈癌、子宫癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、输尿管癌、膀胱癌、咽鳞状细胞癌、基底细胞癌或黑色素瘤、舌癌、咽鳞状细胞癌、恶性淋巴瘤、喉鳞状细胞癌，肺鳞状细胞、小细胞癌、食道鳞状细胞癌、宫颈癌、脑胶质瘤中的一种；进一步优选为肺癌或乳腺癌。
上述(1)方面中，所述施用方式包括但不限于口服、鼻腔给药、吸入给药、直肠给药、局部给药、注射给药或通过介入方式递送至病灶部位。
上述(2)方面更为优选的方案中，所述雷公藤内酯醇衍生物或药物组合物用于制备抗肿瘤药物。
本发明第五方面，提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物中，第一方面所述雷公藤内酯醇衍生物或第三方面所述药物组合物作为活性成分。
优选的，所述抗肿瘤药物用于治疗肺癌或乳腺癌，为口服制剂或注射剂。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例中靶向性验证结果；
其中，图1A为雷公藤内酯醇TP的标准曲线；
图1B为化合物F9的标准曲线；
图1C为雷公藤内酯醇TP、化合物F9在肿瘤细胞内的聚集情况。
图2为实施例中各化合物对斑马鱼发育的影响；
图3为雷公藤内酯醇(TP)及化合物F9对斑马鱼胚胎(72hpf)死亡率的影响；
图4为雷公藤内酯醇(TP)及化合物F9对斑马鱼(72hpf)孵化率的影响；
图5为雷公藤内酯醇(TP)及化合物F9对斑马鱼(72hpf)畸形率的影响；
其中，4μM TP组斑马鱼全部死亡；
图6为雷公藤内酯醇(TP)及化合物F9对斑马鱼(72hpf)体长的影响；
其中，1、2μM TP组斑马鱼未孵化，4μM TP组斑马鱼死亡。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1化合物F5的制备
本实施例中，提供化合物F5的制备方法，合成路线如下：
Figure BDA0003869356420000061
将雷公藤甲素(50mg，0.14mmol)、EDCI(106.4mg，0.55mmol)和DMAP (33.9mg，0.28mmol)溶于2ml二氯甲烷中，然后加入5-溴戊酸(75.4mg，0.42 mmol)，于室温下反应24小时，TLC检测反应基本完成，加水和二氯甲烷萃取，萃取三次合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后的粗产品经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2.5:1)得白色固体TP-5-Br45 mg，产率为62.0％。将TP-6-Br(45.0mg，0.09mmol)和F16(56.8mg，0.26mmol)溶于 4ml干燥乙腈中，于80℃油浴加热回流24小时，TLC检测反应基本结束，减压浓缩后的黄色固体经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝30:1～15:1)得黄色粉末34 mg，产率为53.2％。
波谱数据：
化合物F5：1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.57(d,J＝6.7Hz,2H,H-2′, H-6′),8.19(d,J＝16.0Hz,1H,H-8′),8.07(dd,J＝6.6,2.3Hz,1H,H-16′),8.03(d,J ＝6.6Hz,2H,H-13′,H-10′),7.84(m,1H,H-5′),7.48(m,1H,H-3′),7.21-7.31(m,3H, H-15′,H-14′,H-7′),5.06(s,1H,H-14),4.61-4.78(m,2H,H-19),4.47(t,J＝7.3Hz, 2H,H-25),3.92-3.95(m,1H,H-11),3.62(d,J＝3.0Hz,1H,H-7),3.46(t,J＝5.2Hz, 1H,H-12),2.71(d,J＝13.6Hz,1H,H-5),2.52-2.58(m,1H,H-15),2.46(m,1H, H-6a),2.22(dt,J＝14.9,5.9Hz,1H,H-2a),2.12(m,2H,H-6b,H-2b),1.80-1.87(m, 2H,H-22),1.74(m,2H,H-24),1.42-1.46(m,1H,H-1b),1.22-1.32(m,3H, H-23,H-1a),0.89-0.96(m,6H,H-20,H-17),0.84(d,J＝6.7Hz,3H,H-16).13C NMR (150MHz,Chloroform-d)δ178.44(C-18),176.33(C-21),166.15(C-4),159.86 (C-4′),146.75(C-6′,C-2′),142.06(C-12′),141.35(C-8′),136.14(C-10′),129.02(C-3), 128.07(C-17′),127.01(C-14′),125.88(C-5′,C-3′),125.32(C-15′),123.89(C-16′), 120.33(C-7′),118.13(C-9′),116.08(C-13′),75.51(C-25),74.41(C-19),67.49(C-9), 66.70(C-8),65.48(C-13),63.77(C-12),63.28(C-14),59.48(C-11),58.72(C-7), 43.90(C-5),39.32(C-10),36.93(C-22),33.78(C-24),33.33(C-15),32.27(C-6), 26.71(C-23),25.25(C-2),20.47(C-17),20.38(C-1),19.70(C-16),16.89(C-20). HR-ESI-MS m/z:663.3068(calcd for C40H43N2O7 +[M-Br]+,663.3065)。
实施例2化合物F6的制备
本实施例中，提供化合物F6的制备方法，所述化合物与实施例1中F5的制备方法相同，区别点在于溴化酸的选择，具体的合成路线如下：
Figure BDA0003869356420000071
波谱数据:
化合物F6：1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ12.50(s,1H,N-H),8.04(d,J ＝6.3Hz,2H,H-2′,H-6′),7.72-7.76(m,1H,H-8′),7.69(s,1H,H-16′),7.66(d,J＝ 15.9Hz,1H,H-13′),7.56-7.60(m,1H,H-10′),7.20(m,4H,H-5′,H-3′,H-14′,H-15′), 6.57(d,J＝15.8Hz,1H,H-7′),5.03-5.06(m,1H,H-14),4.63(s,2H,H-19),4.38(t,J ＝7.4Hz,2H,H-26),3.83(d,J＝3.3Hz,1H,H-11),3.53(d,J＝3.0Hz,1H,H-7), 3.43(d,J＝5.6Hz,1H,H-12),2.64(d,J＝13.2Hz,1H,H-5),2.45(dt,J＝14.5,7.0 Hz,1H,H-15),2.37(dt,J＝15.2,6.9Hz,1H,H-6a),2.29(d,J＝17.6Hz,1H,H-2a), 2.06-2.17(m,2H,H-6b,H-2b),1.82-1.91(m,4H,H-22,H-25),1.71(t,J＝7.3Hz, 2H,H-23),1.53(dd,J＝12.4,5.4Hz,1H,H-1b),1.42(m,2H,H-24),1.19(td,J＝ 12.1,5.8Hz,1H,H-1a),0.99(s,3H,H-20),0.94(d,J＝7.0Hz,3H,H-17),0.83(d,J ＝6.9Hz,3H,H-16).13C NMR(150MHz,Methanol-d4)δ174.37(C-18),172.96 (C-21),161.46(C-4),155.81(C-4′),142.55(C-6′,C-2′),138.11(C-12′),138.04(C-8′), 132.81(C-10′),124.99(C-3),124.88(C-17′),123.50(C-14′),122.05(C-5′,C-3′), 121.80(C-15′),120.07(C-16′),116.08(C-7′),114.22(C-9′),112.59(C-13′),71.29 (C-26),70.41(C-19),63.65(C-9),63.08(C-8),61.37(C-13),59.78(C-12),59.69 (C-14),55.56(C-11),54.85(C-7),40.16(C-5),35.55(C-10),33.57(C-25),30.50(C-22),29.59(C-6),28.30(C-15),24.97(C-24),23.85(C-23),23.13(C-2),17.12 (C-17),16.73(C-1),16.32(C-16),13.49(C-20).HR-ESI-MS m/z:677.3223(calcd forC41H45N2O7 +[M-Br]+,677.3221)。
实施例3化合物F7的制备
本实施例中，提供化合物F7的制备方法，所述化合物与实施例1中F5的制备方法相同，区别点在于溴化酸的选择，具体的合成路线如下：
Figure BDA0003869356420000081
波谱数据：
化合物F7：1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ12.02(s,1H,N-H),8.01(s,2H, H-2′,H-6′),7.75(s,1H,H-8′),7.58(m,3H,H-16′,H-13′,H-10′),7.21(m,4H,H-5′, H-3′,H-15′,H-14′),6.58(s,1H,H-7′),5.07(s,1H,H-14),4.67(s,2H,H-19),4.32(s, 2H,H-27),3.83(d,J＝3.0Hz,1H,H-11),3.53(s,1H,H-12),3.46(d,J＝5.6Hz,1H, H-7),2.65(s,1H,H-5),2.41-2.48(m,1H,H-15),2.32-2.39(m,1H,H-6a),2.29(d,J ＝17.9Hz,1H,H-2a),2.06-2.19(m,2H,H-6b,H-2b),1.84-1.89(m,2H,H-22), 1.65(m,2H,H-26),1.53(s,3H,H-23,H-1b),1.42(s,2H,H-24),1.34(s,2H,H-25), 1.17-1.22(m,1H,H-1a),1.01(s,3H,H-20),0.95(d,J＝6.9Hz,3H,H-17),0.84(d,J ＝6.9Hz,3H,H-16).13C NMR(150MHz,Chloroform-d)δ173.31(C-18),172.83 (C-21),160.22(C-4),154.39(C-4′),141.82(C-6′,C-2′),137.60(C-12′),137.31(C-8′), 132.98(C-10′),125.45(C-3),125.04(C-17′),123.22(C-14′),121.79(C-15′),121.53 (C-5′,C-3′),120.30(C-16′),116.68(C-7′),114.02(C-9′),113.15(C-13′),70.97 (C-27),70.12(C-19),63.64(C-9),63.29(C-8),61.25(C-13),60.10(C-12),59.85 (C-14),55.48(C-11),54.96(C-7),40.35(C-5),35.69(C-10),34.03(C-22),30.93 (C-26),29.68(C-6),28.27(C-15),28.03(C-24),25.66(C-25),24.54(C-23),23.46 (C-2),17.57(C-17),17.08(C-1),16.79(C-16),13.86(C-20).HR-ESI-MS m/z: 691.3378(calcd for C42H47N2O7+[M-Br]+,691.3378)。
实施例4化合物F8的制备
本实施例中，提供化合物F8的制备方法，所述化合物与实施例1中F5的制备方法相同，区别点在于溴化酸的选择，具体的合成路线如下：
Figure BDA0003869356420000091
波谱数据：
化合物F8：1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ11.64(s,1H,N-H),8.15(d,J ＝6.0Hz,2H,H-2′,H-6′),7.76(d,J＝6.0Hz,1H,H-8′),7.73(m,2H,H-16′,H-13′), 7.56-7.62(m,1H,H-10′),7.34(m,2H,H-5′,H-3′),7.14-7.21(m,2H,H-15′,H-14′), 6.64(d,J＝15.8Hz,1H,H-7′),5.06(d,J＝0.9Hz,1H,H-14),4.69(m,2H,H-19), 4.41(s,2H,H-28),3.82(d,J＝3.3Hz,1H,H-11),3.53(d,J＝3.0Hz,1H,H-7),3.45 (d,J＝5.6Hz,1H,H-12),2.66(d,J＝13.2Hz,1H,H-5),2.43(dt,J＝14.8,7.2Hz, 1H,H-15),2.32-2.37(m,1H,H-6a),2.29(d,J＝18.1Hz,1H,H-2a),2.07-2.19(m, 2H,H-6b,H-2b),1.89-1.95(m,2H,H-22),1.86(m,J＝6.9Hz,3H,H-27,H-23a), 1.64(s,2H,H-24),1.54(dd,J＝12.3,5.4Hz,1H,H-1b),1.33(m,5H,H-23b,H-25, H-26),1.19(td,J＝12.0,5.7Hz,1H,H-1a),1.02(s,3H,H-20),0.95(d,J＝7.0Hz, 3H,H-17),0.84(d,J＝6.9Hz,3H,H-16).13C NMR(150MHz,Chloroform-d)δ 173.36(C-18),172.97(C-21),160.33(C-4),154.41(C-4′),141.76(C-6′,C-2′), 137.53(C-12′),137.26(C-8′),132.92(C-10′),125.40(C-3),125.04(C-17′),123.20 (C-14′),121.77(C-15′),121.51(C-5′,C-3′),120.34(C-16′),116.31(C-7′),114.03 (C-9′),113.06(C-13′),70.91(C-28),70.16(C-19),63.64(C-9),63.30(C-8),61.19 (C-13),60.17(C-12),59.82(C-14),55.43(C-11),54.98(C-7),40.36(C-5),35.69(C-10),34.21(C-22),31.08(C-27),29.81(C-6),28.58(C-24),28.47(C-25),28.26 (C-15),25.88(C-26),24.75(C-23),23.46(C-2),17.56(C-17),17.09(C-1),16.79 (C-16),13.83(C-20).HR-ESI-MS m/z:705.3537(calcd for C43H49N2O7 +[M-Br]+, 705.3534)。
实施例5化合物F9制备
本实施例中，提供化合物F9的制备方法，所述化合物与实施例1中F5的制备方法相同，区别点在于溴化酸的选择，具体的合成路线如下：
Figure BDA0003869356420000101
波谱数据：
化合物F9：1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ13.64(s,1H,N-H),8.93(s,1H, H-6′),7.91(s,2H,H-2′,H-8′),7.69(s,1H,H-10′),7.54(s,2H,H-16′,H-13′),7.16(m, 2H,H-5′,H-3′),7.04(s,2H,H-15′,H-14′),6.50(s,1H,H-7′),5.07(s,1H,H-14),4.67 (s,2H,H-19),4.22(s,2H,H-29),3.81(d,J＝3.1Hz,1H,H-11),3.52(d,J＝3.1Hz, 1H,H-7),3.44(d,J＝5.5Hz,1H,H-12),2.66(d,J＝13.1Hz,1H,H-5),2.45(dt,J＝ 15.0,7.2Hz,1H,H-15),2.36(q,J＝7.8Hz,1H,H-6a),2.29(d,J＝17.9Hz,1H, H-2a),2.14(m,2H,H-6b,H-2b),1.87(m,2H,H-22),1.77(s,2H,H-28),1.65(s,2H, H-23),1.52-1.56(m,1H,H-1b),1.32(m,8H,H-24,H-25,H-26,H-27),1.19(td,J＝ 12.1,5.7Hz,1H,H-1a),1.02(s,3H,H-20),0.95(d,J＝7.0Hz,3H,H-17),0.83(d,J ＝6.9Hz,3H,H-16).13C NMR(150MHz,Chloroform-d)δ173.22(C-18),173.04 (C-21),160.08(C-4),154.13(C-4′),141.44(C-2′,C-6′),138.42(C-12′),137.02(C-8′), 132.55(C-10′),125.55(C-3),125.27(C-17′),122.88(C-14′),121.50(C-15′),120.72 (C-5′,C-3′),119.99(C-16′),115.40(C-7′),113.82(C-9′),113.49(C-13′),70.80 (C-29),69.99(C-19),63.61(C-9),63.33(C-8),61.09(C-13),59.99(C-12),59.79 (C-14),55.38(C-11),54.98(C-7),40.37(C-5),35.70(C-10),34.27(C-22),31.14 (C-28),29.82(C-6),28.95(C-26),28.74(C-25),28.69(C-24),28.24(C-15),26.06 (C-27),24.85(C-23),23.46(C-2),17.54(C-17),17.08(C-1),16.77(C-16),13.72 (C-20).HR-ESI-MS m/z:719.3691(calcd for C44H51N2O7 +[M-Br]+,719.3691)。
实施例6化合物F10制备
本实施例中，提供化合物F10的制备方法，所述化合物与实施例1中F5的制备方法相同，区别点在于溴化酸的选择，具体的合成路线如下：
Figure BDA0003869356420000111
波谱数据：
化合物F10：1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ11.70(s,1H,N-H),8.09(d,J ＝6.3Hz,2H,H-2′,H-6′),7.76(dd,J＝6.0,3.2Hz,1H,H-8′),7.69(d,J＝16.1Hz, 2H,H-16′,H-13′),7.60(dd,J＝6.0,3.2Hz,1H,H-10′),7.17-7.24(m,4H,H-5′,H-3′, H-15′,H-14′),6.60(d,J＝15.9Hz,1H,H-7′),5.07(s,1H,H-14),4.69(s,2H,H-19), 4.42(s,2H,H-30),3.82(d,J＝3.1Hz,1H,H-11),3.53(d,J＝3.0Hz,1H,H-7),3.45 (d,J＝5.5Hz,1H,H-12),2.67(d,J＝13.5Hz,1H,H-5),2.45(dt,J＝15.0,7.3Hz, 1H,H-15),2.36(q,J＝7.7Hz,1H,H-6a),2.30(d,J＝18.6Hz,1H,H-2a),2.07-2.19 (m,2H,H-6b,H-2b),1.80-1.86(m,2H,H-22),1.65(m,8H,H-23,H-24,H-28,H-29), 1.55(dd,J＝12.3,5.4Hz,1H,H-1b),1.34(s,2H,H-25),1.29(m,4H,H-26,H-27), 1.20(td,J＝12.2,5.9Hz,1H,H-1a),1.03(s,3H,H-20),0.95(d,J＝6.9Hz,3H, H-17),0.84(d,J＝6.8Hz,3H,H-16).13C NMR(150MHz,Chloroform-d)δ173.32 (C-18),173.13(C-21),160.25(C-4),154.35(C-4′),141.69(C-6′,C-2′),137.55 (C-12′),137.27(C-8′),132.86(C-10′),125.48(C-3),125.06(C-17′),123.16(C-14′), 121.74(C-15′),121.36(C-5′,C-3′),120.29(C-16′),116.23(C-7′),114.01(C-9′), 113.10(C-13′),70.81(C-30),70.11(C-19),63.62(C-9),63.33(C-8),61.10(C-13),60.28(C-12),59.79(C-14),55.38(C-11),54.99(C-7),40.38(C-5),35.70(C-10), 34.34(C-22),31.21(C-29),29.81(C-6),29.11(C-26),29.09(C-25),28.93(C-27), 28.80(C-24),28.24(C-15),26.10(C-28),24.94(C-23),23.49(C-2),17.55(C-17), 17.09(C-1),16.78(C-16),13.75(C-20).HR-ESI-MS m/z:738.3844(calcd for C45H53N2O7 +[M-Br]+,733.3847)。
实施例7化合物F11制备
本实施例中，提供化合物F11的制备方法，所述化合物与实施例1中F5的制备方法相同，区别点在于溴化酸的选择，具体的合成路线如下：
Figure BDA0003869356420000131
波谱数据：
化合物F11：1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ11.70(s,1H,N-H),8.08(d,J ＝6.4Hz,2H,H-2′,H-6′),7.75(dd,J＝6.1,3.1Hz,1H,H-8′),7.65-7.72(m,2H, H-16′,H-13′),7.59(dd,J＝6.1,3.1Hz,1H,H-10′),7.17-7.25(m,4H,H-5′,H-3′, H-15′,H-14′),6.59(d,J＝15.9Hz,1H,H-7′),5.06-5.08(m,1H,H-14),4.69(m,J＝ 2.2Hz,2H,H-19),4.37-4.44(m,2H,H-31),3.81(d,J＝3.1Hz,1H,H-11),3.52-3.54 (m,1H,H-7),3.45(d,J＝5.6Hz,1H,H-12),2.68(d,J＝11.9Hz,1H,H-5),2.45(dt, J＝15.0,7.3Hz,1H,H-15),2.36(dt,J＝15.4,7.5Hz,1H,H-6a),2.30(d,J＝18.3 Hz,1H,H-2a),2.06-2.20(m,2H,H-6b,H-2b),1.80-1.93(m,4H,H-22,H-30), 1.61-1.67(m,6H,H-23,H-24,H-29),1.53-1.56(m,1H,H-1b),1.35(t,J＝7.2Hz, 2H,H-28),1.27(m,6H,H-25,H-26,H-27),1.20(m,1H,H-1a),1.04(s,3H,H-20), 0.95(d,J＝7.0Hz,3H,H-17),0.83(d,J＝6.9Hz,3H,H-16).13C NMR(150MHz, Chloroform-d)δ173.31(C-18),173.17(C-21),160.23(C-4),154.41(C-4′),141.76 (C-6′,C-2′),137.61(C-12′),137.57(C-8′),132.95(C-10′),125.50(C-3),125.05 (C-17′),123.20(C-14′),121.77(C-15′),121.42(C-5′,C-3′),120.28(C-16′),116.24 (C-7′),114.00(C-9′),113.15(C-13′),70.79(C-31),70.10(C-19),63.62(C-9),63.35 (C-8),61.08(C-13),60.33(C-12),59.79(C-14),55.37(C-11),55.00(C-7),40.39(C-5),35.70(C-10),34.37(C-22),31.26(C-30),29.82(C-6),29.68(C-26),29.24 (C-27),29.19(C-25),28.99(C-28),28.87(C-24),28.23(C-15),26.13(C-29),24.98 (C-23),23.49(C-2),17.55(C-17),17.09(C-1),16.77(C-16),13.73(C-20). HR-ESI-MS m/z:747.4005(calcd for C46H55N2O7 +[M-Br]+,747.4004)。
雷公藤内酯醇与雷公藤内酯醇衍生物抗肿瘤活性研究
一、抗肿瘤活性考察
以下实施例中，受试化合物为上述实施例1-7合成。
1、实验材料
NCI-H1975人肺腺癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞、NCI-H460人大细胞肺癌细胞和BEAS-2B人正常肺上皮细胞。
2、方法
肿瘤细胞及正常细胞均由含有10％胎牛血清的RPMI1640培养，培养条件为 37℃，5％CO2的孵箱中。将肿瘤细胞及正常细胞按4.5*104/ml的密度接种于96 孔板中，待生长至对数生长期时，加入受试化合物及雷公藤内酯醇(TP)以及阳性药柔红霉素(DOX)，药物由细胞用二甲基亚砜溶解，在细胞中的浓度设置为0.001-100μM。每个浓度设三个复孔，并设相应浓度的溶媒对照。药物作用48 小时后，每个孔加入10μL，5mg/ml的MTT溶液，作用4h后吸走带有MTT的培养基，每孔加100μL的二甲基亚砜溶解水不溶性蓝紫色结晶甲瓒，并于酶标仪570nm波长下检测，通过吸光度OD值，通过软件GraphPad Prism计算细胞生长抑制率：
根据各浓度对肿瘤细胞及正常细胞的抑制率，利用软件GraphPad Prism,通过曲线拟合计算各化合物对不同细胞的IC50。
表1雷公藤内酯醇及其衍生物对体外培养的肿瘤细胞及正常细胞的毒性作用
Figure BDA0003869356420000141
Figure BDA0003869356420000151
注：IC50指药物作用于细胞后，待药物对细胞的生长抑制率达到50％时所对应的药物浓度。
在药物作用于以下四种细胞48h后，包括三株肿瘤细胞NCI-H1975，MCF-7 和NCI-H460和一株人正常肺上皮细胞BEAS-2B后，表现出不同的细胞活性：在肿瘤细胞中普遍表现出F9较TP具有更好的杀伤效果，但F9在正常细胞中却表现出较低的杀伤力，体现出修饰后产物F9对肿瘤细胞及正常细胞具有一定的作用选择性。
二、靶向性验证
选择活性最好的衍生物F9进行肿瘤细胞线粒体靶向聚集性实验：通过HPLC 首先建立TP及F9的不同浓度梯度与紫外吸收下峰面积的线性关系，然后分别检测10μM的TP及F9在NCI-H1975细胞上同样作用时间下在线粒体内的吸收量，检测到它们的吸收量分别为24.04nM和100.24nM，F9在肿瘤细胞线粒体内的聚集量是TP的4倍多，结果如图1所示。
三、毒性考察
1材料与仪器
1.1材料
野生型斑马鱼AB品系为山东省科学院生物研究所斑马鱼药物筛选平台提供；药物均由山东大学提供。
1.2仪器
荧光倒置显微镜购自德国Zeiss公司；Forma 3111型水套式CO2培养箱(美国Forma公司)；斑马鱼养殖饲养设备(北京爱生科技公司)。
1.3方法
1.3.1斑马鱼胚胎获取
♀♂斑马鱼分开喂养，照明14h/黑暗10h交替进行，定时喂以人工颗粒状饵料和刚孵出的卤虫无节幼体(Artemia nauplii)。采卵时取健康性成熟的斑马鱼按♀♂1:1的比例放入交配缸内，次日9-10时获得受精卵。对受精卵进行消毒和洗涤后移入斑马鱼胚胎培养用水(含5.0mM NaCl，0.17mM KCl，0.4mM CaCl2，0.16mM MgSO4)中，28℃下控光培养。
1.3.2药物对斑马鱼胚胎发育的影响
受精卵发育6h时，在体视显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，移入24孔培养板中，并加药处理，每孔10枚，每组三个重复孔。设置不同浓度药物组(0.25、 0.5、1、2、4μM)，每孔溶液体积2mL。然后加盖，置于光照培养箱(28℃) 让胚胎继续发育，处理到受精后72小时。每隔24小时换液一次，观察胚胎死亡或畸形情况、统计、并拍照。
统计学分析：采用GraphPad Prism 9软件，分别对各部分数据进行ANOVA 统计学分析。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001vs.对照组。
1.4实验结果
实验结果如图2-6所示，受精后72hpf时，2、4μM TP对斑马鱼表现出明显致死性，4μM TP组斑马鱼全部死亡，F9组斑马鱼的死亡率与对照组相比没有显著影响；0.5、1、2μM TP组斑马鱼表现出明显致畸毒性，且胚胎畸形率不断升高，而F9在2、4μM浓度下表现出明显致畸毒性，斑马鱼胚胎部分畸形； TP组斑马鱼随浓度升高，孵化率逐渐降低(其中1、2、4μM浓度组不孵化)，且已孵化斑马鱼体长逐渐减少；F9组斑马鱼体长随浓度升高逐渐减少，且低浓度下(0.25、5、1μM)与对照组相比，孵化率无明显影响，高浓度(2、4μM) 下孵化率逐渐降低。总体来说，TP的发育毒性大于F9。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种雷公藤内酯醇衍生物，其特征在于，所述衍生物选自式I所示化合物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物，所述式I结构如下：
Figure FDA0003869356410000011
其中，n为4-10的整数。
2.如权利要求1所述雷公藤内酯醇衍生物，其特征在于，所述雷公藤内酯醇衍生物具体选自以下结构：
Figure FDA0003869356410000012
3.权利要求1或2所述雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：以雷公藤内酯醇TP为起始原料，在其C-14β-OH上通过酯化反应得到中间体化合物，然后中间体化合物与F16发生成盐反应，得到式Ⅰ所示的雷公藤内酯醇衍生物；其合成路线如下：
Figure FDA0003869356410000021
4.如权利要求3所述雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于，反应步骤(1)所示的酯化反应中，还需要加入缩合剂及催化剂：所述缩合剂选自EDCI,DCC,NDIC中的一种或几种的组合；
所述催化剂选自DMAP，TEA和DIPEA中的一种或几种的组合。
所述酯化反应的溶剂选自二氯甲烷，三氯甲烷，N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种的组合。
5.如权利要求3所述雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于，反应步骤(2)所示的成盐反应中，反应溶剂选自正丁醇，乙腈，N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种的组合；
或上述反应步骤(2)的反应条件如下：80～90℃加热回流，可通过薄层色谱检测等方式确定反应结束。
6.如权利要求3-5任一项所述雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体步骤如下：以雷公藤内酯醇为起始原料，以EDCI/DMAP为缩合剂和催化剂，在二氯甲烷溶剂体系中与溴化酸在室温下发生成酯反应，检测反应完成后分离得到白色固体化合物，即中间体；将中间体与F16加入乙腈溶剂体系中，82～86℃下加热回流，检测反应结束后，得到式I所示结构的衍生物；其中，雷公藤内酯醇、EDCI、DMAP、溴化酸、二氯甲烷的加入量之比为1mol：4mol：2mol：3-5mol：150-200mL；中间体化合物、F16和乙腈加入量之比为1mol：3mol：150-200mL。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物中包括权利要求1或2所述雷公藤内酯醇衍生物。
8.如权利要求7所述药物组合物，其特征在于，以药物组合物的总质量计，所述衍生物的含量选自0.01～99％、0.1～70％、1～30％、0.01～0.05％、0.05～0.1％、0.1～0.3％、0.3～0.5％、0.5～1％、1～3％、3～5％、5～10％、10～20％、20～30％、30～50％、50～70％、或70～99％；所述药物组合物的受试者为哺乳动物，包括但不限于大鼠、小鼠、兔、猴、狗或人；
或，所述药物组合物中，还包括药学上所必须的辅料，具体为包括但不限于缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、杀菌剂、亲水性聚合物、氨基酸单糖、二糖和其它碳水化合物、螯合剂、张力调节剂、表面活性剂、成盐抗衡离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂。
9.权利要求1或2所述雷公藤内酯醇衍生物、权利要求7或8所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为包括但不限于皮肤癌、头颈癌、肺癌、食道癌、宫颈癌、子宫癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、输尿管癌、膀胱癌、咽鳞状细胞癌、基底细胞癌或黑色素瘤、舌癌、咽鳞状细胞癌、恶性淋巴瘤、喉鳞状细胞癌，肺鳞状细胞、小细胞癌、食道鳞状细胞癌、宫颈癌、脑胶质瘤中的一种。
10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物中，权利要求1或2所述雷公藤内酯醇衍生物或权利要求7或8所述药物组合物作为活性成分。
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