CN115501202B - 一种递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子及其制备方法和应用，属于抗肿瘤药物技术领域。本发明将过渡态唾液酸转移酶抑制剂与Ca2+配位结合，通过Ca2+与磷酸根基团相互作用，避免了磷酸根基团难以跨膜的缺陷。本发明在配位聚合物外侧包裹二油酰基磷脂酸，二油酰基磷脂酸亲水端与配位聚合物结合，疏水端朝外；本发明以二油酰磷脂酰胆碱、DSPE‑PEG和胆固醇作为内核纳米粒的壳层，DSPE‑PEG起长循环的作用，用以增强纳米粒在体内的稳定性；胆固醇对于脂质体起着膜流动性调节剂的作用，可加固脂质双分子层膜，降低膜流动，从而减小渗漏率；DOPC作为膜材骨架，能够提高壳层稳定性。

Description

一种递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子及其制 备方法和应用
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，特别涉及一种递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤转移约占肿瘤相关死亡的90％。对于许多患者来说，在检测到肿瘤时就已经发生转移。由于转移瘤细胞体积小、多样性高、分散于多种组织器官，这为转移瘤的治疗带来了重大的挑战。传统抗肿瘤药物主要侧重于抑制肿瘤细胞生长或直接杀死肿瘤细胞，但很少能对肿瘤转移产生良好效果。目前对肿瘤转移的机制仍存在疑问，但一些线索表明，肿瘤细胞表面的唾液酸与转移形成和不良预后呈正相关。已有研究表明，通过细菌唾液酸苷酶或基因调控使肿瘤细胞去唾液酸化可以有效抑制肿瘤转移。然而，细菌唾液酸苷酶的产量和质量都难以满足临床需求，同时基因治疗仍具有不确定性。因此，迫切需要开发有效的小分子唾液酸转移酶(ST)抑制剂。
近年来，随着越来越多的证据表明唾液酸化在肿瘤发生、发展中起着关键作用，且已经涌现出许多ST抑制剂。然而，目前的ST抑制剂仍存在诸多缺陷，如细胞透膜性、合成实用性以及选择性等，这对于它们的临床应用带来了极大困难。简而言之，从天然产物分离出的ST抑制剂如soyasaponin I,isomalyngamide A和A-1难以大量获得，对它们进一步修饰所得到的化合物AL10和FCW34活性较低。代谢抑制剂如P-3Fax-Neu5Ac在体外具有中等活性，在体内直接使用时会引起严重的肝、肾功能损伤。
基于过渡态的ST抑制剂(具有式I所示结构)在酶水平上具有良好活性，但由于带负电荷的磷酸根基团，使得它们难以跨膜，限制了其在细胞和动物水平的应用。
Figure BDA0003885765640000011
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子及其制备方法和应用，本发明提供的递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子可以有效地将过渡态的ST抑制剂递送到肿瘤细胞中，有效地去除细胞表面的唾液酸，并抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子，包括内核纳米粒和壳层；
所述内核纳米粒包括配位聚合物以及包裹在所述配位聚合物表面的二油酰基磷脂酸，所述二油酰基磷脂酸的疏水端朝外；所述配位聚合物的有机配体为具有式I所示结构的过渡态唾液酸转移酶抑制剂，配位离子为Ca2+；
Figure BDA0003885765640000021
所述壳层的组成包括二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和胆固醇；所述内核纳米粒和壳层通过疏水-疏水相互作用结合。
优选的，所述过渡态唾液酸转移酶抑制剂与二油酰基磷脂酸的摩尔比为1:4～5.25。
优选的，所述二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和胆固醇的摩尔比为1.5～3:1:1。
优选的，所述内核纳米粒的粒径为23～28nm；
所述递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子的粒径为43～48nm。
本发明提供了上述递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
将可溶性钙源与第一油相分散体系混合，得到钙源微乳；
将具有式I所示结构的过渡态唾液酸转移酶抑制剂、二油酰基磷脂酸与第二油相分散体系混合，得到过渡态唾液酸转移酶抑制剂微乳；
将所述钙源微乳、过渡态唾液酸转移酶抑制剂微乳混合，进行配位聚合反应，破乳后得到内核纳米粒；
将所述内核纳米粒与二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、胆固醇、有机溶剂混合，得到核壳纳米粒子前驱体；
将所述核壳纳米粒子前驱体与复合溶剂混合，加热去除有机溶剂，得到递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子；所述复合溶剂为醇类溶剂与缓冲溶液的混合物。
优选的，所述第一油相分散体系、第二油相分散体系为己醇、聚乙二醇辛基苯基醚和环己烷的混合液。
优选的，所述配位聚合反应的温度为室温，时间为20～40min。
优选的，所述破乳的破乳剂为乙醇，所述破乳的时间为15～30min。
优选的，所述加热去除有机溶剂的温度为40～60℃。
本发明提供了上述递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供了一种递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子(简写为NCP/STI)，包括内核纳米粒和壳层；所述内核纳米粒包括配位聚合物以及包裹在所述配位聚合物表面的二油酰基磷脂酸，所述二油酰基磷脂酸的疏水端朝外；所述配位聚合物的有机配体为具有式I所示结构的过渡态唾液酸转移酶抑制剂，配位离子为Ca2+；所述壳层的组成包括二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和胆固醇；所述内核纳米粒和壳层通过疏水-疏水相互作用结合。本发明将过渡态唾液酸转移酶抑制剂与Ca2+配位结合，通过Ca2+与磷酸根基团相互作用，避免了磷酸根基团难以跨膜的缺陷。本发明在配位聚合物外侧包裹二油酰基磷脂酸(DOPA)，由于配位聚合物具有亲水性，二油酰基磷脂酸亲水的一端与配位聚合物结合，疏水端朝外；本发明以二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)和胆固醇作为壳层，其中DSPE-PEG起长循环的作用，用以增强纳米粒在体内的稳定性；胆固醇对于脂质体起着膜流动性调节剂的作用，可加固脂质双分子层膜，降低膜流动，从而减小渗漏率；DOPC作为膜材骨架，能够提高壳层稳定性。在本发明中，DOPC、DSPE-PEG和胆固醇为两亲性化合物，能够与疏水端朝外的核纳米粒发生自组装，通过疏水-疏水相互作用与内核纳米粒结合。本发明使用壳层包裹含有过渡态唾液酸转移酶抑制剂的内核纳米粒，可以有效地将过渡态的唾液酸转移酶抑制剂递送到肿瘤细胞中，有效地去除细胞表面的唾液酸，并抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭；相较于游离药物，本发明提供的NCP/STI具有良好的药代动力学特性，使得其能够在血液中长期存在，被肿瘤细胞所摄取，药物安全性高，不会像游离药物那样主要被肝、肾摄取代谢，引起系统毒性。
本发明提供了上述递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子的制备方法，本发明利用反相微乳法配合溶剂挥发法来构建核壳结构，操作简单，成本低廉，适合工业化批量生产。
附图说明
图1为递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子的合成过程和结构示意图；
图2为抑制剂的合成路线；
图3为内核纳米粒和NCP/STI的粒径；
图4为内核纳米粒的STEM图片和元素分析；
图5为NCP/STI的STEM图片；
图6为NCP/STI在37℃下的稳定性测试结果；
图7为NCP/STI的Zeta电位图；
图8为抑制剂在0.1M HCl中的标准曲线；
图9为NCP/STI对各种肿瘤细胞毒性测试结果；
图10为NCP/STI在4T1-Luc细胞中的摄取和释放行为；
图11为利用Fluo-4 AM对NCP/STI在细胞内的释放行为测试结果；
图12为各种肿瘤细胞内吞后NCP/STI介导的释放行为；
图13为NCP/STI抑制4T1-Luc细胞唾液酸化结果；
图14为NCP/STI抑制A549和B16-F10细胞唾液酸化结果；
图15为N-乙酰甘露糖胺对NCP/STI的抑制作用；
图16为体外抗转移试验测试结果；
图17为血浆中的抑制剂浓度随时间变化曲线；
图18为实验性肺转移实验结果；
图19为NCP/STI抑制B16-F10实验性肺转移形成测试结果；
图20为肺转移预防试验结果；
图21为小动物成像系统对肺组织进行成像结果；
图22为NCP/STI处理组的肺组织和肝脏中的肿瘤转移结果；
图23为NCP/STI在体内表现出良好的生物安全性测试结果
图24为B16-F10荷瘤小鼠上生物安全性评估测试结果。
具体实施方式
本发明提供了一种递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子，包括内核纳米粒和壳层；
所述内核纳米粒包括配位聚合物以及包裹在所述配位聚合物表面的二油酰基磷脂酸，所述二油酰基磷脂酸的疏水端朝外；所述配位聚合物的有机配体为具有式I所示结构的过渡态唾液酸转移酶抑制剂，配位离子为Ca2+；
Figure BDA0003885765640000051
所述壳层的组成包括二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和胆固醇；所述内核纳米粒和壳层通过疏水-疏水相互作用结合。
在本发明中，所述内核纳米粒中，所述过渡态唾液酸转移酶抑制剂与二油酰基磷脂酸的摩尔比优选为1:4～5.25，更优选为1:4.5～5。在本发明中，所述内核纳米粒的粒径优选为23～28nm，更优选为25～26nm。
在本发明中，所述二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和胆固醇的摩尔比优选为1.5～3:1:1，更优选为2～2.5:1:1。在本发明中，所述递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子的粒径优选为43～48nm，更优选为45～46nm。
在本发明中，所述递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子中，过渡态唾液酸转移酶抑制剂的负载量优选为9.2～9.4wt％。
本发明提供了上述递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
将可溶性钙源与第一油相分散体系混合，得到钙源微乳；
将具有式I所示结构的过渡态唾液酸转移酶抑制剂、二油酰基磷脂酸与第二油相分散体系混合，得到过渡态唾液酸转移酶抑制剂微乳；
将所述钙源微乳、过渡态唾液酸转移酶抑制剂微乳混合，进行配位聚合反应，破乳后得到内核纳米粒；
将所述内核纳米粒与二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、胆固醇、有机溶剂混合，得到核壳纳米粒子前驱体；
将所述核壳纳米粒子前驱体与复合溶剂混合，加热去除有机溶剂，得到递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子；所述复合溶剂为醇类溶剂与缓冲溶液的混合物。
本发明将可溶性钙源与第一油相分散体系混合，得到钙源微乳。在本发明中，所述可溶性钙源优选为CaCl2。在本发明中，所述第一油相分散体系优选为己醇、聚乙二醇辛基苯基醚和环己烷的混合液。在本发明中，所述第一油相分散体系以环己烷溶剂，所述第一油相分散体系中己醇的浓度优选为1～2mol/L，更优选为1.5mol/L；聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的浓度优选为0.4～0.8mol/L，更优选为0.6mol/L。
在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，所述混合的时间优选为20～40min，更优选为30min。
本发明将具有式I所示结构的过渡态唾液酸转移酶抑制剂、二油酰基磷脂酸与第二油相分散体系混合，得到过渡态唾液酸转移酶抑制剂微乳。在本发明中，所述过渡态唾液酸转移酶抑制剂、二油酰基磷脂酸的摩尔比优选为1:4～5.25，更优选为1:4.5～5。在本发明中，所述第二油相分散体系优选与第一油相体系相同，在此不再赘述。
在本发明中，所述二油酰基磷脂酸优选以溶液的形式加入，所述二油酰基磷脂酸的溶剂优选为氯仿。
在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，所述混合的时间优选为20～40min，更优选为30min。
本发明将所述钙源微乳、过渡态唾液酸转移酶抑制剂微乳混合，进行配位聚合反应，破乳后得到内核纳米粒。在本发明中，所述可溶性钙源与具有式I所示结构的过渡态唾液酸转移酶抑制剂的摩尔比优选为3～6:1，更优选为4～5:1。
在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合。在本发明中，所述配位聚合反应的温度优选为室温，时间优选为20～40min，更优选为30min。
在本发明中，所述破乳的方式优选为：将破乳剂加至所得配位聚合反应液中。在本发明中，所述破乳的破乳剂优选为乙醇，所述破乳的时间优选为15～30min，更优选为20～25min。
所述破乳后，本发明优选对所得破乳液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
对所得破乳液进行固液分离，所得固体进行洗涤。
在本发明中，所述固液分离的方式优选为离心。在本发明中，所述离心的速率优选为8000～12000rpm，更优选为10000rpm；时间优选为10～20min，更优选为15min。在本发明中，所述洗涤的方式优选为：先使用乙醇进行洗涤，再使用乙醇和氯仿的混合液进行洗涤。在本发明中，所述乙醇的洗涤次数优选为1次。在本发明中，所述乙醇和氯仿的混合液中，乙醇和氯仿的体积比优选为1:1；所述乙醇和氯仿的混合液洗涤的次数优选为2次。
本发明将所述内核纳米粒与二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、胆固醇、有机溶剂混合，得到核壳纳米粒子前驱体。在本发明中，所述有机溶剂优选为四氢呋喃。在本发明中，所述内核纳米粒与二油酰磷脂酰胆碱的质量比优选为1:1～3，更优选为1:2。
在本发明中，所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇优选为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
在本发明中，所述二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和胆固醇的摩尔比优选为1.5～3:1:1，更优选为2～2.5:1:1。
在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合。
本发明将所述核壳纳米粒子前驱体与复合溶剂混合，加热去除有机溶剂，得到递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子。
在本发明中，所述复合溶剂为醇类溶剂与缓冲溶液的混合物。在本发拿命中，所述醇类溶剂优选为乙醇；所述缓冲溶液优选为PBS缓冲溶液。在本发明中，所述醇类溶剂与缓冲溶液的体积比优选为3～5:5～7，更优选为3:7。
本发明优选将核壳纳米粒子前驱体滴加至所述复合溶剂中；在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合。在本发明中，所述加热去除有机溶剂的温度优选为40～60℃，更优选为50℃。
本发明对所述加热的时间没有特殊的要求，能够挥发有机溶剂即可。
本发明将所述核壳纳米粒子前驱体与复合溶剂混合，能够形成水包油包水的结构，通过加热去除有机溶剂，使得脂材疏水末端和内核疏水末端相互之间紧密结合，形成核壳纳米粒。
在本发明中，所述递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子的合成过程和结构示意图如图1所示。
本发明提供了上述递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。在本发明中，所述抗肿瘤药物优选为抗乳腺癌、肝癌、黑色素瘤药物。在本发明中，所述抗肿瘤药物的剂型优选为针剂。
下面结合实施例对本发明提供的递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子的制备
(1)将己醇、TritonX-100分散于环己烷中，己醇浓度为1.5M，Triton X-100浓度为0.6M，得到油相分散体系；
(2)将50μL 500mM CaCl2·2H2O添加到4mL上述油相分散体系中，得到CaCl2微乳；
(3)将50μL 25mM抑制剂添加到4mL上述油相分散体系中，然后加入160μL 20mM的DOPA(溶于氯仿)，得到抑制剂微乳；其中，抑制剂具有式I所示结构，抑制剂的合成路线如图2所示。
Figure BDA0003885765640000081
(4)将CaCl2微乳和抑制剂微乳分别室温搅拌30分钟，并将抑制剂微乳滴加到CaCl2微乳中，将混合物再搅拌30分钟进行配位聚合反应，然后加入16mL乙醇并搅拌20分钟，破乳，得到内核纳米粒；
(5)将内核纳米粒用乙醇清洗沉淀一次，用氯仿/乙醇(V/V＝1:1)清洗两次，并将其重新分散在80μL含有DOPC、DSPE-PEG 2000和胆固醇(摩尔比为2:1:1)的四氢呋喃(THF)中，得到核壳纳米粒子前驱体；
(6)将核壳纳米粒子前驱体滴加到500μL乙醇/PBS体系(V/V＝3:7)中，并在50℃下搅拌，直到乙醇和THF完全挥发，得到递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子，记为NCP/STI。
利用动态光散射(DLS)确定内核纳米粒和NCP/STI的粒径，所得结果如图3所示。由图3可以看出，内核的粒径为25.6±1.8nm，NCP/STI的粒径相较于内核增加了近20nm。
内核纳米粒的STEM图片和元素分析如图4所示，图4中a为内核纳米粒的STEM图片；b为能量色散X射线光谱下的内核纳米粒的元素分析。由图4可以看出，钙和磷在NCP/STI的核心中很好地共定位。
NCP/STI的STEM图片如图5所示。由图4、5可以看出通过STEM检测发现NCP/STI以及内核的大小与DLS测量基本一致。NCP/STI在37℃下的稳定性测试结果如图6所示。由图6可以看出，NCP/STI在37℃条件下至少保持72小时稳定。
NCP/STI的Zeta电位图如图7所示。由图7可以看出，NCP/STI的Zeta电位为-16.5±0.4mV。
抑制剂在0.1M HCl中的标准曲线如图8所示，图8中，a为不同浓度抑制剂在0.1MHCl中的紫外-可见光谱。b为0.1M HCl中的抑制剂在280nm处的标准曲线。根据抑制剂在280nm处的吸光值计算出的标准曲线，可以确定NCP/STI中抑制剂负载率为9.2±0.2wt％。
性能测试
(1)细胞毒性试验
在4T1-Luc、A549和B16-F10细胞中对NCP/STI的毒性进行测试。各种细胞以每孔4×103个接种在96孔板上。在37℃培养24小时后，用梯度浓度的NCP/STI处理肿瘤细胞3天。以未经任何处理的肿瘤细胞作为空白对照，用CCK-8法检测细胞活力。
NCP/STI对各种肿瘤细胞毒性测试结果如图9所示。由图9可以看出，NCP/STI对多种肿瘤细胞均没有毒性。
(2)细胞摄取和释放实验
细胞摄取和释放实验方法如下：
使用4T1-Luc细胞作为模型来研究NCP/STI的体外摄取行为。对于时间依赖性研究，4T1-Luc细胞以每孔2×104密度接种在24孔板上，并在37℃下培养24小时。添加200μg/mL尼罗红标记的NCP/STI，并培养2小时、6小时和24小时。对于浓度依赖性研究，4T1-Luc细胞以每孔2×104密度接种在24孔板上，并在37℃下培养24小时。0、20、200、500和1000μg/mL尼罗红标记的NCP/STI加入其中并培养6小时。对于能量依赖性研究，将4T1-Luc细胞以每孔2×104密度接种在两个24孔板上，并在37℃下培养24小时。对于低温组，将24孔板在4℃下预冷30分钟。之后，添加500μg/mL尼罗红标记的NCP/STI。对于正常组，添加500μg/mL尼罗红标记的NCP/STI。两组均培养6小时。对于NCP/STI内吞途径研究，将4T1-Luc细胞以每孔5×104密度接种在24孔板上，并在37℃下培养24小时。在添加尼罗红标记的NCP/STI之前，将细胞与不同的内吞抑制剂(3mMβCD、500μM Amiloride、32μM Ly294002、20μM CPZ和0.5μg/mLFilipin)预培养30分钟。随后，将200μg/mL尼罗红标记的NCP/STI加入其中并培养6小时。培养结束后，用PBS洗涤细胞，胰酶消化并离心收集细胞。用流式细胞仪测定细胞中尼罗红的平均荧光强度。
利用流式细胞术和激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)研究NCP/STI在4T1-Luc细胞中的内吞和细胞内释放行为。NCP/STI在4T1-Luc细胞中的摄取和释放行为如图10所示。图10中，a为不同浓度的NCP/STI与4T1-Luc细胞共孵育；b为NCP/STI与4T1-Luc细胞共孵育2、6和24h；c为低温条件下NCP/STI与4T1-Luc细胞共孵育；d为不同内吞抑制剂处理细胞后对NCP/STI的摄取。
由图10可以看出，4T1-Luc细胞对NCP/STI的内吞作用具有浓度和时间依赖性(参见图10中a、b)。4T1-Luc细胞对NCP/STI的摄取在4℃时减少，表明具有能量依赖性的特征(参见图10中c)。MβCD处理4T1-Luc细胞后使得NCP/STI内吞减少约60％，而Amiloride和Ly294002处理后使得NCP/STI内吞减少约30％(参见图10中d)。MβCD是脂筏/小窝依赖性内吞的有效抑制剂。Ly294002和Amiloride是大胞饮作用的有效抑制剂。因此，NCP/STI的摄取主要基于脂筏/小窝依赖性途径，部分通过大胞饮作用。
使用商业性的钙离子荧光探针Fluo-4 AM来研究NCP/STI在细胞内的释放行为，方法如下：
将5×104个肿瘤细胞接种在共聚焦小皿中，37℃下培养24小时。往培养基中加入500μg/mL NCP/STI并培养3小时。PBS洗涤细胞，然后加入Fluo-4AM并培养20分钟。之后，用PBS冲洗细胞，4％多聚甲醛固定15分钟，然后用DAPI对细胞核染色。使用激光共焦显微镜(CLSM)观察细胞。Image J(NIH)对Fluo-4荧光强度进行量化。
利用Fluo-4 AM对NCP/STI在细胞内的释放行为测试结果如图11所示。图11中，a为利用Fluo-4 AM对NCP/STI在细胞内释放行为进行检测；b为细胞内Fluo-4平均荧光强度的统计。
由图11可以看出，与对照组相比，4T1-Luc细胞与500μg/mL NCP/STI共孵育3小时后，Ca2+水平显著升高。
各种肿瘤细胞内吞后NCP/STI介导的释放行为如图12所示。图12中，a为利用Fluo-4 AM对NCP/STI在A549和B16-F10细胞内释放行为进行检测；b为细胞内Fluo-4平均荧光强度的统计。
由图12可以看出，NCP/STI通过内吞作用进入肿瘤细胞后，主动释放Ca2+和抑制剂。
(3)凝集素检测肿瘤细胞唾液酸化
在确认了NCP/STI在细胞中的摄取和释放行为后，接下来进一步探究NCP/STI是否可以有效抑制肿瘤细胞表面的唾液酸化。将各种肿瘤细胞与500μg/mL NCP/STI或PBS共孵育3天，通过凝集素染色评估其上唾液酸化水平。具体方法如下：
对于流式细胞检测，肿瘤细胞以每孔2×105个接种在6孔板中，37℃下培养24小时。用PBS或500μg/mL NCP/STI处理3天。收集细胞并用无糖封闭液清洗细胞以去除游离糖蛋白，接着用生物素化的凝集素(MAL II或SNA)与细胞孵育45分钟，分别检测α-2,3-连接或α-2,6-连接的唾液酸。利用无糖封闭液清洗细胞以去除游离凝集素，然后将细胞与FITC-链霉亲和素孵育30分钟。洗涤细胞并将其重新悬浮在PBS中。仅用FITC-链霉亲和素染色的细胞作为背景对照。流式细胞仪测定FITC的平均荧光强度。对于激光共焦显微镜检测，肿瘤细胞以每孔5×104个接种在共聚焦小皿中，37℃下培养24小时。然后，用与上述相同的程序处理细胞。之后，4％多聚甲醛固定15分钟，用DAPI对细胞核染色。使用激光共焦显微镜(CLSM)观察细胞。
NCP/STI抑制4T1-Luc细胞唾液酸化结果如图13所示。图13中，a、b代表性的直方图显示凝集素MAL II(a)、SNA(b)分别识别4T1-Luc细胞上α-2,3-连接和α-2,6-连接唾液酸。c、d，对α-2,3-唾液酸化(c)和α-2,6-唾液酸化(d)的存在进行量化。e、f，利用CLSM对细胞膜上的唾液酸水平进行可视化探究。
结果显示，对于4T1-Luc细胞，NCP/STI处理组的α-2,3-唾液酸化(图13中a，c)和α-2,6-唾液酸化(图13中b，d)水平相较于对照组均减少约90％。接下来，使用CLSM对肿瘤细胞膜上的唾液酸水平进行可视化探究。与对照组相比，经NCP/STI处理的细胞显示出明显低的绿色荧光强度，这意味着细胞膜上的α-2,3-连接和α-2,6-连接唾液酸表达量显著下降(图13中e，f)。
NCP/STI抑制A549和B16-F10细胞唾液酸化结果如图14所示。图14中，a、b代表性的直方图显示凝集素MAL II(a)、SNA(b)分别识别A549和B16-F10细胞上α-2,3-连接和α-2,6-连接唾液酸。c、d为对α-2,3-唾液酸化(c)和α-2,6-唾液酸化(d)的存在进行量化。e、f为利用CLSM对细胞膜上的唾液酸水平进行可视化探究。
由图14可以看出，A549和B16-F10细胞中也发现了与图13类似的结果。
有证据表明，唾液酸前体水平的增加会导致肿瘤细胞的高唾液酸化，进而引起肿瘤细胞转移潜能的增加。因此，本发明研究了高浓度的唾液酸前体，N-乙酰甘露糖胺是否可以抵消NCP/STI的抑制作用。利用500μg/mL NCP/STI与2mM N-乙酰甘露糖胺或PBS处理肿瘤细胞3天，通过流式细胞术分析肿瘤细胞表面唾液酸化情况。所得结果如图15所示。图15中，a为α-2,3-唾液酸化情况，b为α-2,6-唾液酸化情况。
由图15可以看出，大过量(>23倍)的N-乙酰甘露糖胺与NCP/STI共孵育只能部分抑制α-2,3-连接和α-2,6-连接唾液酸的丢失。
总之，以上测试表明，NCP/STI能够强效地抑制肿瘤细胞表面的唾液酸化。
(4)体外抗转移试验
细胞迁移和侵袭是肿瘤转移的必要步骤。在使用500μg/mL NCP/STI对肿瘤细胞处理后，进行了wound-healing试验，以评估肿瘤细胞的体外迁移能力。具体方法如下：
肿瘤细胞用500μg/mL NCP/STI或PBS作为对照预处理3天。对于wound-healing试验，在500μg/mL NCP/STI或PBS存在下，将肿瘤细胞以每孔2×105个接种在6孔板上。12小时后，用10μL枪头尖端对融合细胞单层进行划痕，并用PBS冲洗。在指定时间，通过倒置荧光显微镜进行拍照。对于transwell侵袭试验，收集肿瘤细胞，并用无血清的培养基按1×106细胞/毫升的密度重悬。在500μg/mL NCP/STI或PBS存在下，将100μL细胞悬液接种在涂有基质胶的transwell膜上方。transwell外室含有500μL完全培养基。在37℃下培养24小时，用湿润的棉球擦掉膜上方的细胞，而后用70％的乙醇固定膜下方的细胞，用0.1％结晶紫染色30分钟，并通过倒置荧光显微镜观察并拍照。
体外抗转移试验测试结果如图16所示。图16中，a、b为使用倒置荧光显微镜拍摄的PBS或NCP/STI处理后各种肿瘤细胞的划痕愈合能力(a)和划痕闭合率的定量分析(b)。c、d为PBS或NCP/STI处理后穿过transwell膜的各种肿瘤细胞倒置荧光显微镜图像(c)和穿过细胞的定量分析(d)。
结果表明，NCP/STI处理后显著减少了肿瘤细胞在12小时内的迁移能力(图16中a，b)。接下来，进行transwell侵袭试验，以探究NCP/STI处理后肿瘤细胞的侵袭能力。与迁移试验的趋势类似，与对照组相比，NCP/STI处理后显著降低了肿瘤细胞的侵袭能力(图16中c，d)。
(5)NCP/STI改善抑制剂的药代动力学特性
本发明评估游离抑制剂和NCP/STI的药代动力学特性。主要药代动力学参数包括药时曲线下面积(AUC0-24h)、血液循环半衰期(t1/2)、清除率(CL)和平均停留时间(MRT0-24h)。具体方法如下：
Sprague-Dawley大鼠静脉注射游离抑制剂或NCP/STI(抑制剂量为4mg/kg)。定时取血、离心以获得血浆。沉淀蛋白后，利用质谱仪对抑制剂浓度进行测定。相应的药代动力学参数通过DAS软件进行计算。静脉注射NCP/STI和游离抑制剂后，血浆中的抑制剂浓度随时间变化曲线如图17所示。
主要药代动力学参数如表1所示。
表1主要药代动力学参数
Figure BDA0003885765640000131
表1中，a)为药时曲线下面积(μg/L·h)。b)为血液循环半衰期(h)。c)为平均停留时间(h)。d)为清除率(L/h/kg)
由图17和表1可以看出，静脉注射后，游离抑制剂迅速被清除。令人惊讶的是，与游离抑制剂相比，NCP/STI的AUC0-24h增加了约77倍，CL显著变慢、t1/2和MRT0-24h显著提升。这些数据表明NCP/STI显著改善了抑制剂的药代动力学特性。
(6)实验性肺转移试验
唾液酸在肿瘤转移的发生发展中起着重要作用。上文研究表明NCP/STI可以有效抑制肿瘤细胞表面唾液酸的表达，降低其迁移和侵袭能力。为了进一步评估NCP/STI在体内的抗转移作用，本发明首先进行了实验性肺转移实验，具体方法如下：
4T1-Luc或B16-F10细胞用PBS或500μg/mL NCP/STI预处理3天。细胞用PBS清洗并重悬在其中。将含有2×105个4T1-Luc细胞或5×105个B16-F10细胞的100μL PBS尾静脉注射到小鼠中。14天后，通过生物发光成像或直接剖检对肺转移情况进行评价。对于组织病理学分析，将肺组织固定在4％甲醛中，包埋在石蜡中，切片，并用苏木精和伊红染色。
实验性肺转移实验结果如图18所示。图18中，a为实验性肺转移实验的设计说明。b、c为实验性肺转移模型小鼠第14天的生物发光图像(b)和生物发光强度的定量分析(c)。d为不同组小鼠代表性的肺组织H&E染色切片。
图18中a阐述了动物实验的过程。4T1-Luc细胞用500μg/mL的NCP/STI或PBS预处理3天，然后尾静脉注入到Balb/c小鼠。实验期间，每3-4天通过小动物成像仪监测4T1-Luc细胞的荧光素酶信号，以评估肿瘤肺转移情况。各组小鼠第14天的生物发光图像和荧光强度的定量分析如图18中b、c所示。很明显，与对照组相比，NCP/STI预处理后对实验性肺转移的抑制率约为92.4％，几乎观察不到荧光信号。随后，通过H&E染色进行组织病理学检查，以进一步观察肺组织中的肿瘤转移灶。对照组中观察到大量肺转移灶，但NCP/STI预处理组中很少观察到(图18中d)。
将B16-F10细胞与500μg/mL NCP/STI或PBS共孵育3天，然后尾静脉注射到小鼠体内。14天后，处死小鼠并对肺组织拍照。NCP/STI抑制B16-F10实验性肺转移形成测试结果如图19所示。图19中，a为肺组织拍照图片，b为肺组织上转移结节统计结果，c为同组小鼠代表性的肺组织H&E染色切片。由图19可以看出，NCP/STI预处理可减少84.9％的肺结节，同时，通过组织病理学检查，NCP/STI预处理组几乎观察不到肺转移灶。
以上结果表明，NCP/STI在抑制实验性肺转移方面具有良好的潜力。
(7)肺转移预防试验
由于用NCP/STI预处理肿瘤细胞对实验性肺转移抑制有显著效果，我们进一步评估了直接应用NCP/STI是否会抑制肿瘤在体内转移。具体方法如下：
将含有2×105个4T1-Luc细胞或5×105个B16-F10细胞的100μL PBS尾静脉注射到小鼠中。第二天，静脉注射相同体积的PBS或NCP/STI，抑制剂的量为8mg/kg，每隔四天一次，共计三次。14天后，如上所述对小鼠肺转移情况进行评价。
肺转移预防试验结果如图20所示。图20中，a为NCP/STI抑制乳腺癌肺转移的实验示意图。b、c为第14天小鼠肺转移的体内生物发光成像(b)和相应的肺部生物发光强度定量分析(c)。d为各组小鼠肺组织的代表性照片和平均转移结节数。e为肺组织H&E染色切片。
由图20可以看出，与对照组相比，NCP/STI可以很好地控制肺转移，肺部荧光强度降低了94.2％。
实验结束时，处死小鼠并将其主要脏器取出，使用小动物成像系统对肺组织进行成像。所得结果如图21所示。图21中，a、b为对不同组离体肺组织进行生物发光成像(a)和定量分析(b)。c为不同组离体肺组织重量统计。D为不同组肝脏组织H&E染色切片。黑箭头：转移灶。
结合图20和图21可以看出，与对照组相比，NCP/STI治疗组的肺组织显示出较低的生物发光信号(图21中a，b)。将肺组织固定在Bouin's固定液中，以量化肺转移结节。与对照组相比，NCP/STI治疗组明显减少了转移结节的数量(图20中d)。由于肿瘤转移的增加和肺组织的恶性水肿，对照组的肺组织平均重量比NCP/STI治疗组重得多(图21中c)。肺组织的H&E切片显示，在接受NCP/STI处理后的小鼠几乎无法检测到转移病灶(图20中e)，这表明NCP/STI具有良好的抗转移能力。与此同时，在对照组小鼠的肝脏中发现肿瘤微转移。然而，在NCP/STI处理组中几乎没有观察到肝脏转移灶(图21中d)，这表明NCP/STI在抑制肿瘤远端转移方面的潜力。
在B16-F10荷瘤小鼠中进行相同处理后，NCP/STI处理组的肺组织和肝脏中的肿瘤转移结果如图22所示。图22中，a、b为不同组离体肺组织照片(a)和肿瘤转移灶定量分析(b)。c为不同组肺组织H&E染色切片。D为不同组肝脏组织H&E染色切片。黑箭头：转移灶。
由图22可以看出，NCP/STI处理组的肺组织和肝脏中的肿瘤转移结节显著减少，表明NCP/STI可以很好地控制肿瘤转移。总的来说，这些发现表明NCP/STI具有良好的抗肿瘤转移潜力。
(8)NCP/STI生物安全性评价
在上述转移预防试验过程中，通过体重变化、血液生化试验和主要脏器的病理学检查来评估NCP/STI的生物安全性。对于上述肺转移预防实验，每隔三天对小鼠体重进行称量。14天后，收集血液、离心以获得血清，采用全自动生化分析仪对血清中ALT、TP、ALB、UA、UREA和CK水平进行测定。同时，收集心、肝、脾和肾，进行H&E染色切片。NCP/STI在体内表现出良好的生物安全性测试结果如图23所示。图23中，a为不同组小鼠的体重变化。B为静脉注射PBS和NCP/STI后第14天对小鼠进行血液生化测试。c为不同处理组主要脏器的H&E染色切片。
由图23可以看出，相较于对照组，NCP/STI处理组未发现体重减轻，表明没有严重的全身毒性(图23中a)。两组之间的血液生化参数没有显著差异(图23中b)，表明实验期间小鼠的肝、肾和心功能正常。此外，病理学检查表明，主要器官(心、肝、脾和肾)均保持正常的组织结构，没有明显的炎性病变或损伤(图23中c)。
在B16-F10荷瘤小鼠上进行类似的生物安全性评估，所得结果如图24所示。图24中，a为B16-F10转移预防模型不同组小鼠的体重变化。B为静脉注射PBS和NCP/STI后第14天对小鼠进行血液生化测试。C为不同处理组主要脏器的H&E染色切片。由图24可以看出，NCP/STI在B16-F10荷瘤小鼠上并未发现明显的毒性。
以上结果表明NCP/STI在体内具有良好的生物安全性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子，包括内核纳米粒和壳层；
所述内核纳米粒包括配位聚合物以及包裹在所述配位聚合物表面的二油酰基磷脂酸，所述二油酰基磷脂酸的疏水端朝外；所述配位聚合物的有机配体为具有式I所示结构的过渡态唾液酸转移酶抑制剂，配位离子为Ca2+；
Figure FDA0004147694750000011
所述壳层的组成包括二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和胆固醇；所述内核纳米粒和壳层通过疏水-疏水相互作用结合；
所述内核纳米粒的粒径为23～28nm；
所述递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子的粒径为43～48nm。
2.根据权利要求1所述的递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子，其特征在于，所述二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和胆固醇的摩尔比为1.5～3:1:1。
3.权利要求1或2所述的递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
将可溶性钙源与第一油相分散体系混合，得到钙源微乳；
将具有式I所示结构的过渡态唾液酸转移酶抑制剂、二油酰基磷脂酸与第二油相分散体系混合，得到过渡态唾液酸转移酶抑制剂微乳；
将所述钙源微乳、过渡态唾液酸转移酶抑制剂微乳混合，进行配位聚合反应，破乳后得到内核纳米粒；
将所述内核纳米粒与二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、胆固醇、有机溶剂混合，得到核壳纳米粒子前驱体；
将所述核壳纳米粒子前驱体与复合溶剂混合，加热去除有机溶剂，得到递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子；所述复合溶剂为醇类溶剂与缓冲溶液的混合物；
所述第一油相分散体系、第二油相分散体系为己醇、聚乙二醇辛基苯基醚和环己烷的混合液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述配位聚合反应的温度为室温，时间为20～40min。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述破乳的破乳剂为乙醇，所述破乳的时间为15～30min。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述加热去除有机溶剂的温度为40～60℃。
7.权利要求1或2所述递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子或权利要求3～6任意一项所述制备方法制备得到的递送过渡态唾液酸转移酶抑制剂的核壳纳米粒子在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
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