CN115496618A - 一种湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法 - Google Patents

一种湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法 Download PDF

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CN115496618A CN202211105406.7A CN202211105406A CN115496618A CN 115496618 A CN115496618 A CN 115496618A CN 202211105406 A CN202211105406 A CN 202211105406A CN 115496618 A CN115496618 A CN 115496618A
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Abstract

一种湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法，包括步骤1：获取各入湖/库支流氮磷污染物年输入总量；步骤2：构建各类ARGs丰度与氮磷排放之间的线性回归方程；步骤3：基于步骤1中获取的各入湖/库支流氮磷污染物年输入总量，利用反距离加权插值分析IDW计算湖库各地理位置待估算氮磷污染物年输入总量，代入步骤2构建的各类ARGs丰度与氮磷排放之间的线性回归方程以估算湖库对应地理位置各类ARGs丰度，分析湖库ARGs分布特征。本发明可简单、准确、快速的估算湖库表层沉积物中ARGs的污染浓度与分布特征，为湖库ARGs的污染控制与治理提供科学指导。

Description

一种湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算 方法
技术领域
本发明涉及河湖生态环境评价领域，尤其一种湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法。
背景技术
抗生素通过污水和医疗废弃物最终在水环境中循环，导致水生态环境中细菌的选择性压力增大，并诱导形成抗生素耐药菌(ARB)和抗生素耐药基因(ARGs)，转移到人类和动物病原体，成为了较为关注的新污染物。由于水流相对较慢，水交换周期较长，湖泊与水库往往是抗生素污染较为富集的地方，同时也是ARGs富集的地方，而湖泊、水库往往是我国最重要的饮用水资源。为克服这些问题，亟需调查掌握湖库ARGs污染现状，开发适宜的ARGs丰度预估方法，制定科学的防控策略。
湖库的富营养化为抗生素耐药菌生长繁殖以及ARGs富集提供了丰富的营养基础。研究表明淡水环境中ARGs与水体、沉积物氮磷营养盐富集等均具有显著的相关性。就湖库而言，其水体和沉积物中富集的营养盐大都来源于湖库周边点源与非点源污染排放，而水体和沉积物中的ARGs则部分直接来源于湖库流域环境，随周边点源与非点源污染汇入湖库。因此，理论上湖库水环境中ARGs丰度与分布特征与流域内的污染排放具有较好的相关性，可通过二者的回归模型构建，预测湖库水环境中ARGs丰度与分布特征。
目前，关于淡水环境中ARGs的估算方法尚未有报道。鉴于上述理论分析，如何构建二者的回归方程，预测湖库水环境中ARGs丰度与分布特征成为当前需要解决的技术问题。
发明内容
本发明提出的是一种湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法，目的在于填补当前淡水环境中抗生素抗性基因丰度与分布特征预算评估方法的空白，为淡水环境ARGs的预测和治理提供技术支持。
本发明采用的技术方案是，一种湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法，包括以下步骤：
步骤1：获取各入湖/库支流氮磷污染物年输入总量；
步骤2：调查实测下一年湖库表层0～10cm沉积物中各类ARGs 丰度，并利用地理加权回归模型分析ARGs丰度与周边氮磷污染物年输入总量的相关性，构建各类ARGs丰度与氮磷排放之间的线性回归方程；
步骤3：基于步骤1中获取的各入湖/库支流氮磷污染物年输入总量，利用反距离加权插值分析IDW计算湖库各地理位置待估算氮磷污染物年输入总量，代入步骤2构建的各类ARGs丰度与氮磷排放之间的线性回归方程以估算湖库对应地理位置各类ARGs丰度，分析湖库ARGs分布特征。
进一步的，所述步骤1获取各入湖/库支流氮磷等污染物年输入总量，包括：根据研究湖库流域内社会经济生产活动状况采用污染物年输入总量估算模型估算获取，或者利用入湖/库支流水质、水文监测数据计算获取。
进一步的，所述污染物年输入总量估算模型应用输出系数法从产生、流失到入河，分三个阶段分别估算畜禽、农村城镇生活和水产养殖污染的总氮(TN)、总磷(TP)污染物指标负荷量，耦合SWAT 水文模型，模拟分析入湖/库支流氮磷污染物年输入总量。
进一步的，所述污染物年输入总量估算模型中耦合SWAT水文模型时运用SWAT模型的农田管理组件，引入湖库流域内的农业种植模式，包括农业管理措施，用于确定农田生产时间、施肥时间与施肥量，结合流域降雨时间与降雨量，估算农田土壤污染物入河量，所述农业管理措施包括种植、耕作、灌溉、施肥。
进一步的，所述污染物年输入总量估算模型进行氮磷污染物年输入总量估算时采用输出系数法，具体估算公式为：
Figure BDA0003841595460000031
p1＝cRQ
其中L为营养物质的量，即所述污染物年输入总量；Ei为第i类养分源的输出系数；Ai为第i类土地利用类型的面积或第i类牲畜或人口的数量；Ii为第i类养分源的养分输入，p1为降雨的养分输入，c 为雨水本身的养分浓度(g/m3)；R为流域年降雨量(m3)；Q为降雨径流系数。
进一步的，步骤2中利用地理加权回归GWR模型分析ARGs丰度与周边支流氮磷污染物年输入总量的相关性，构建湖库各类ARGs分布特征与污染输入的地理空间关系，即各类ARGs丰度与氮磷排放的线性回归方程，地理加权回归GWR始终从普通最小二乘法(OLS)回归开始回归分析，公式为：
Figure BDA0003841595460000041
Yi是响应变量，(ui，vi)表示空间位置i的坐标，β0(ui，vi)和βk(ui，vi)表示位置i的截距和(p2-1)个斜率参数，Xik表示在第i个位置的(p2-1)个预测变量(k＝1，2，...，p2-1)，p2是要估计的参数总数，εi是位置i的误差项。
进一步的，步骤2中采用实地调查湖库表层沉积物各类ARGs丰度数据，构建ARGs丰度与氮磷排放的线性回归方程后，利用实地调查的湖库表层沉积物各类ARGs丰度数据对线性回归方程进行反向验证，公式为：
yARGs＝axTN-bxTP+c
其中yARGs是待测点抗生素抗性基因ARGs丰度，xTN为年总氮输入污染负荷，xTP为年总磷输入污染负荷，a、b、c为线性回归方程截距。
进一步的，步骤3中首先利用反距离加权插值分析IDW计算湖库各地理位置待估算氮磷污染物年输入总量，然后代入步骤2构建的线性回归方程估算湖库对应地理位置的ARGs丰度，反距离加权插值分析IDW的公式为：
Figure BDA0003841595460000051
Figure BDA0003841595460000052
Figure BDA0003841595460000053
其中
Figure BDA0003841595460000054
为s0处的插值结果，Z(si)是在si处获得的年污染负荷值， N为参与插值的周围入湖/库支流的数量，λi为插值计算过程中使用的各入湖/库支流汇入口的权重，di0为插值点与各已知入湖/库支流汇入口si之间的距离，P为加权幂指数，各入湖/库支流对插值结果作用的权重λi大小之和为1。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：本发明基于湖库水环境中ARGs丰度、分布特征与流域内污染排放较好的相关性，通过流域内各支流氮磷污染年排放总量与实测ARGs丰度的地理加权回归模型构建，可简单、准确、快速的估算湖库表层沉积物中ARGs的污染浓度与分布特征，为湖库ARGs的污染控制与治理提供科学指导。
附图说明
图1是本发明一种湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法其中一个实施例的流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。
请参考图1，本发明实施例提供一种湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法，包括以下步骤：
步骤一、获取各入湖/库支流氮磷污染物年输入总量。
①直接测定法
对湖库周边所有支流汇入口采集每月水体，测定常规水质参数，同时开展对应流量、流速监测，通过流量与水质参数中总氮、总磷浓度的乘积计算各支流氮磷污染物年输入总量。
②模型估算法
通过统计年鉴、实际调查等方式对湖库流域污染状况进行分析，建立种植业、农村生活、分散畜禽养殖、城镇生活污染等数据库。采用输出系数法，分别估算畜禽、农村城镇生活和水产养殖等污染的氮磷污染物年输入总量，估算公式为：
Figure BDA0003841595460000061
p1＝cRQ
其中L为营养物质的量；Ei为第i类养分源的输出系数；Ai为第 i类土地利用类型的面积或第i类牲畜或人口的数量；Ii为第i类养分源的养分输入，p1为降雨的养分输入，c为雨水本身的养分浓度(g/m3)； R为流域年降雨量(m3)；Q为降雨径流系数。
进一步的，将畜禽、农村城镇生活和水产养殖等通过输出系数法估算产生的入湖/库总氮(TN)、总磷(TP)年负荷总量耦合SWAT 水文模型，运用SWAT模型的农田管理组件，引入湖库流域内的农业种植模式，包括种植、耕作、灌溉、施肥等农业管理措施，加载农业管理措施及点源污染，构建湖库流域非点源污染模型。在参数敏感性分析的基础上，利用实测水质数据对模型进行校准验证。利用校准验证后的模型，以月为单位，模拟非点源污染物年输入总量，得到各水文响应单元(HRU)总氮、总磷月输出量，并经流域汇总及面积转化，得到子流域总氮、总磷年均单位面积输出量，计算分析入湖/库支流氮磷污染物年输入特征。
步骤二、调查实测下一年湖库表层0～10cm沉积物中各类ARGs 丰度，并利用地理加权回归模型分析ARGs丰度与周边氮磷污染物年输入总量的相关性，构建各类ARGs丰度与氮磷排放之间的线性回归方程。
通过随机均匀布点法采集湖库表层0～10cm沉积物，提取沉积物微生物总DNA，利用各ARGs基因特异性引物结合荧光定量PCR (qPCR)测定各采样点表层沉积物各类ARGs丰度，结合步骤一获取的采样点周边支流汇入口氮磷污染物年输入总量，利用地理加权回归模型分析ARGs丰度与周边氮磷污染汇入的相关性，构建湖库各类 ARGs丰度与支流污染输入的地理空间关系。GWR应该始终从普通最小二乘法(OLS)回归开始回归分析，公式为：
Figure BDA0003841595460000071
Yi是响应变量，(ui,vi)表示空间位置i的坐标，β0(ui,vi)和βk(ui,vi)表示位置i的截距和(p2-1)个斜率参数。Xik表示在第i个位置的(p2-1)个预测变量(k＝1,2,…,p2-1)，p2是要估计的参数总数，εi是位置i的误差项。
根据地理加权回归分析结果，构建各类ARGs丰度与氮磷排放的线性回归方程，并利用实地调查数据对线性回归方程反向验证，公式为：
yARGs＝axTN-bxTP+c
其中yARGs是待测点抗生素抗性基因ARGs丰度，xTN为年总氮输入污染负荷，xTP为年总磷输入污染负荷，a、b、c为线性回归方程截距。
步骤三、基于步骤一中获取的各入湖/库支流氮磷污染物年输入总量，利用反距离加权插值分析IDW计算湖库各地理位置待估算氮磷污染物年输入总量，代入步骤二构建的各类ARGs丰度与氮磷排放之间的线性回归方程以估算湖库对应地理位置各类ARGs丰度，分析湖库ARGs分布特征。
在具体的ARGs丰度与分布特征估算过程中，根据步骤一中方法计算上一年的各入湖/库支流氮磷污染物年输入总量。在此基础上，利用反距离加权插值分析计算湖库全湖/库水域内各地理坐标点虚拟入湖/库氮磷污染物年输入总量，反距离加权插值分析公式为：
Figure BDA0003841595460000081
Figure BDA0003841595460000082
Figure BDA0003841595460000083
其中
Figure BDA0003841595460000091
为s0处的插值结果，Z(si)是在si处获得的年污染负荷值，N为参与插值的周围入湖/库支流的数量，λi为插值计算过程中使用的各入湖/库支流汇入口的权重，di0为插值点与各已知入湖/库支流汇入口si之间的距离，P为加权幂指数，各入湖/库支流对插值结果作用的权重λi大小之和为1。
进一步，将湖库全湖/库水域内各地理坐标点虚拟氮磷入湖/库污染物年输入总量代入构建的线性回归方程估算湖库各地理坐标点各类ARGs丰度，分析湖库ARGs分布特征。
步骤一计算的整个湖库一年的污染物输入总量，这个总量分散到湖区，然后湖区某一个具体的点就有这个点一年接受的污染物总量，湖区所有的点的污染物输入总量之和就是步骤一中的总量；根据某一个具体的点中具体一年污染物输入总量能够根据线性回归方程估算这个点的抗性基因丰度，湖区所有点的抗性基因丰度已知，便能知道湖区抗性基因的分布特征。
实施例
下面以洱海为例进行洱海表层沉积物ARGs丰度和分布特征的估算。
洱海地理生态环境概况：
洱海(北纬25°36′-25°58′，东经100°06′-100°18′)是云南省第二大高原淡水湖，位于南北走向的山间盆地内，海拔1974m。水域面积 252平方公里，平均水深10.8m。北部为洱源盆地和邓川盆地，主要入湖河流有弥苴河、罗时江、永安江。西部为藏滇褶皱系，点苍山屏列于洱海西岸，主要入湖河流有苍山十八溪，东南部入湖河流波罗江、玉龙河、白塔河、凤尾箐等。它既是大理市主要饮用水源地，也是生活用水、工农业生产用水的重要来源，是调节大理市气候、推动整个流域农业发展乃至整个经济社会可持续发展的重要力量，被称为大理人民的“母亲湖”。近年来洱海水环境问题日益突出，随着流域农业产业的迅猛发展，尤其是经济作物种植面积和畜禽养殖规模的迅速增长，化肥施用量增加、施肥结构不合理等，畜禽粪尿没有得到有效的利用和处理，对洱海水质造成威胁。其中，氮、磷是洱海首要污染物，农村与农田非点源污染是洱海富营养化的重要原因，流域每年生产猪、牛、羊数十万头，家禽数百万只。
1)洱海流域2018年入湖污染负荷的确定
通过统计年鉴、实际调查等方式对洱海流域污染状况进行分析，建立种植业、农村生活、分散畜禽养殖、城镇生活污染等数据库。调査范围覆盖大理市和洱源县的17个乡镇，数据资料来源于大理市统计年鉴、洱源县统计年鉴、环保统计年鉴、中国自然资源数据库以及各乡镇的调查资料等，调查数据2014年为基准年。采用输出系数法，估算分别估算了畜禽、农村城镇生活和水产养殖等污染的总氮(TN)、总磷(TP)等污染物指标的负荷量。
基于洱海流域SWAT水文模型，设置临界集水面积阈值5km2，生成545个子流域；设置土地利用、土壤类型面积阈值为10％，坡度为20％，生成1977个水文响应单元。加载农业管理措施及点源污染 (畜禽养殖和生活污染)，构建洱海流域面源污染模型。统计了洱海流域500户农户的农业生产方式和施肥方式，根据统计结果在洱海流域各镇选择一种有代表性的主流农业生产方式进行情景模拟，共4种轮作方式：蚕豆-水稻、大蒜-水稻、大蒜-玉米和油菜-水稻。将2014 年作为模型预热期，2015-2016年作为校准期和验证期。选取弥苴河入湖口作为水质校核验证站点，2015年1月-12月弥苴河入湖水量、总氮、总磷数据用于模型校准阶段，2016年1月-12月相应数据用于模型验证阶段。在水文参数率定验证的基础上，率定河流总氮、总磷浓度。
根据环湖截污工程的特点，在洱海流域面源污染模型中减去农村生活与畜禽养殖污染，增加6座污水处理厂(点源污染)，利用校准验证后的模型，以月为单位，模拟2018年面源污染负荷，得到各水文响应单元(HRU)总氮、总磷月输出量，并经流域汇总及面积转化，得到子流域总氮、总磷年均单位面积输出量。2018年洱海流域降雨量1000.7mm，降雨集中分布在7-10月份；因各入湖河流集水面积相对较小，径流量与降雨量波动规律几乎一致。模拟2018年洱海各入湖河流TN、TP模拟结果见表1。
表1 2018年洱海各入湖河流TN、TP年输入量
Figure BDA0003841595460000111
Figure BDA0003841595460000121
2)洱海入湖氮磷污染负荷与湖区表层沉积物抗生素抗性基因 (ARGs)丰度地理加权回归关系分析
①洱海表层沉积物ARGs分布特征调查
在洱海随机均匀布设10个采样点，各采样点坐标如表2所示，2019 年3月采集各点表层0～10cm沉积物，提取沉积物微生物总DNA，利用各ARGs基因特异性引物结合荧光定量PCR(qPCR)测定各采样点表层沉积物各类ARGs丰度，结果如下表2所示。
表2 2019年洱海表层沉积物ARGs丰度(copies/16S rRNA copy)实地调查结果
Figure BDA0003841595460000122
Figure BDA0003841595460000131
②地理加权回归分析
结合洱海10个采样点周边26条支流汇入口的氮磷污染负荷年负荷量，利用地理加权回归模型分析表2中ARGs丰度与表1洱海26条支流氮磷污染汇入负荷的相关性，构建了湖库各类ARGs丰度与支流污染输入的地理空间关系，并根据地理加权回归分析结果，构建各类 ARGs丰度与氮磷排放的线性回归方程，结果见表3。
表3洱海表层沉积物ARGs丰度与其支流氮磷排放的线性回归分析
Figure BDA0003841595460000132
其中x单位为吨，y单位为copies/16S rRNA copy。
③洱海表层沉积物ARGs丰度与分布特征预测
在洱海具体的ARGs丰度与分布特征估算过程中，根据步骤一中方法计算上一年的洱海各入湖支流氮磷污染负荷总量。在此基础上，利用反距离加权插值分析计算洱海全湖水域内各地理坐标点虚拟氮磷污染入湖/库负荷量，并将计算的TN、TP代入表3中对应基因的线性回归方程中计算得到洱海湖区各处ARGs丰度，进而判断ARGs分布特征。
以上对本发明的实例进行了详细说明，但内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。任何属于本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的修改或者替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：获取各入湖/库支流氮磷污染物年输入总量；
步骤2：调查实测下一年湖库表层0～10cm沉积物中各类ARGs丰度，并利用地理加权回归模型分析ARGs丰度与周边氮磷污染物年输入总量的相关性，构建各类ARGs丰度与氮磷排放之间的线性回归方程；
步骤3：基于步骤1中获取的各入湖/库支流氮磷污染物年输入总量，利用反距离加权插值分析IDW计算湖库各地理位置待估算氮磷污染物年输入总量，代入步骤2构建的各类ARGs丰度与氮磷排放之间的线性回归方程以估算湖库对应地理位置各类ARGs丰度，分析湖库ARGs分布特征。
2.如权利要求1所述的湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法，其特征在于，所述步骤1获取各入湖/库支流氮磷等污染物年输入总量，包括：根据研究湖库流域内社会经济生产活动状况采用污染物年输入总量估算模型估算获取，或者利用入湖/库支流水质、水文监测数据计算获取。
3.如权利要求2所述的湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法，其特征在于，所述污染物年输入总量估算模型应用输出系数法从产生、流失到入河，分三个阶段分别估算畜禽、农村城镇生活和水产养殖污染的总氮(TN)、总磷(TP)污染物指标负荷量，耦合SWAT水文模型，模拟分析入湖/库支流氮磷污染物年输入总量。
4.如权利要求2所述的湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法，其特征在于，所述污染物年输入总量估算模型中耦合SWAT水文模型时运用SWAT模型的农田管理组件，引入湖库流域内的农业种植模式，包括农业管理措施，用于确定农田生产时间、施肥时间与施肥量，结合流域降雨时间与降雨量，估算农田土壤污染物入河量，所述农业管理措施包括种植、耕作、灌溉、施肥。
5.如权利要求2所述的湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法，其特征在于，所述污染物年输入总量估算模型进行氮磷污染物年输入总量估算时采用输出系数法，具体估算公式为：
Figure FDA0003841595450000021
p1＝cRQ
其中L为营养物质的量，即所述污染物年输入总量；Ei为第i类养分源的输出系数；Ai为第i类土地利用类型的面积或第i类牲畜或人口的数量；Ii为第i类养分源的养分输入，p1为降雨的养分输入，c为雨水本身的养分浓度(g/m3)；R为流域年降雨量(m3)；Q为降雨径流系数。
6.如权利要求1所述的湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法，其特征在于，步骤2中利用地理加权回归GWR模型分析ARGs丰度与周边支流氮磷污染物年输入总量的相关性，构建湖库各类ARGs分布特征与污染输入的地理空间关系，即各类ARGs丰度与氮磷排放的线性回归方程，地理加权回归GWR始终从普通最小二乘法(OLS)回归开始回归分析，公式为：
Figure FDA0003841595450000031
Yi是响应变量，(ui,vi)表示空间位置i的坐标，β0(ui,vi)和βk(ui,vi)表示位置i的截距和(p2-1)个斜率参数，Xik表示在第i个位置的(p2-1)个预测变量(k＝1,2,…,p2-1)，p2是要估计的参数总数，εi是位置i的误差项。
7.如权利要求1所述的湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法，其特征在于，步骤2中采用实地调查湖库表层沉积物各类ARGs丰度数据，构建ARGs丰度与氮磷排放的线性回归方程后，利用实地调查的湖库表层沉积物各类ARGs丰度数据对线性回归方程进行反向验证，公式为：
yARGs＝axTN-bxTP+c
其中yARGs是待测点抗生素抗性基因ARGs丰度，xTN为年总氮输入污染负荷，xTP为年总磷输入污染负荷，a、b、c为线性回归方程截距。
8.如权利要求1所述的湖库表层沉积物抗生素抗性基因丰度与分布特征的估算方法，其特征在于，步骤3中首先利用反距离加权插值分析IDW计算湖库各地理位置待估算氮磷污染物年输入总量，然后代入步骤2构建的线性回归方程估算湖库对应地理位置的ARGs丰度，反距离加权插值分析IDW的公式为：
Figure FDA0003841595450000032
Figure FDA0003841595450000041
Figure FDA0003841595450000042
其中
Figure FDA0003841595450000043
为s0处的插值结果，Z(si)是在si处获得的年污染负荷值，N为参与插值的周围入湖/库支流的数量，λi为插值计算过程中使用的各入湖/库支流汇入口的权重，di0为插值点与各已知入湖/库支流汇入口si之间的距离，P为加权幂指数，各入湖/库支流对插值结果作用的权重λi大小之和为1。
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