CN115490739B - 一种糖脂化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种糖脂化合物及其制备方法和用途，属于医药生物技术领域，具体涉及一种式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐，及其制备方法和用途，式I所示的化合物相比KRN7000、铝佐剂以及C34，可以产生更多的抗体，从而显示出出色的佐剂效果。
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Description

一种糖脂化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种糖脂类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
基于单一抗原的现代亚单位疫苗与传统病毒疫苗相比，具有更精确的靶向作用和更高的安全性。然而，抗原自身一般表现低免疫原性，需要佐剂分子来增加免疫原性并增强免疫反应。佐剂应该具备高效力，且低毒性才可以应用到临床。
KRN7000是一种海洋海绵衍生化的合成糖脂，具有抗肿瘤和免疫激活特性。结构上，它由半乳糖通过α-O-糖苷键连接到C18植物鞘氨醇与酰胺键连接的饱和C26脂肪链。KRN7000嵌入到树突细胞上的非多态性MHC-1样抗原呈递分子CD1d上，其疏水烷基链埋在CD1d结合沟中，极性部分处在CD1的外表面，暴露在溶剂中以便T细胞受体能够识别，极性部位与确定CD1d残基接触决定了识别方向。KRN7000与树突细胞上CD1d结合呈递给恒定自然杀伤性T细胞(iNKT)上的T细胞受体，激活iNKT细胞。iNKT细胞是一类T细胞亚群，这些激活的iNKT细胞迅速产生TH1-型(IFNγ)和TH2-型(IL-4)细胞因子，活化其它免疫细胞参与先天性免疫和获得性免疫，起到免疫监视的功能。KRN7000作为最早的合成糖脂应用到NKT激动剂的研究，已经进入了一二期临床，KRN7000可以诱导较高水平的促炎和抗炎细胞因子，单个的NKT细胞在体内受到刺激后可以同时分泌TH1-型、TH2-型细胞因子，两种细胞因子拮抗作用阻碍了它的临床效力，因为TH1型和TH2型细胞因子会相互拮抗彼此的分泌。虽然NKT细胞有两种方式的调节，但是NKT细胞激活后可以在某些条件下是以Th1型方式活化，在其他条件下是以TH2型方式活化的。在免疫系统中NKT细胞可以通过分泌Th2型细胞因子IL-10发挥免疫抑制细胞的作用，在另一些免疫应答中它们可以通过Th1型细胞因子的产生加强细胞介导的免疫反应；因此偏向激活TH1-型NKT细胞激动剂具有更好的免疫治疗潜力。我们一般认为KRN7000是TH0-型。但是，还不清楚影响这些细胞因子分泌的偏向机制。
细胞偏向诱导细胞因子是复杂的，可能的影响因素有CD1d-糖脂复合物稳定性强弱，脂类递呈机制，酯筏协助等。药化学家大量的工作去确定一些单个的同系物对这些细胞因子分泌的影响。得出的结论有一般增加糖脂水溶性修饰可以产生抗炎作用或Th2-型偏向的响应。如PBS-57和ABX196等。一些在脂肪链尾部用一个或多个芳香环修饰，同样或诱导偏向Th2-型的响应，如7DW8-5、C34等。
发明内容
发明要解决的问题
KRN7000来源有限且价格昂贵，且人工合成较为困难迫使发展了不同的合成方法。早期主要集中于合成方法的开发，产业化工艺开发几乎没有。除了KRN7000，现有技术中并没有安全、有效、适于工业化生产的疫苗佐剂。
用于解决问题的方案
第一方面，本发明提供一种式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐：
。
第二方面，本发明提供一种制备式I所示的化合物的方法，所述方法包括如下步骤：
；
其中R1、R2、R3、R4选自羟基保护基；
步骤S1：化合物1与化合物S反应得到化合物2；
步骤S2：化合物2脱除硅叉保护基得到化合物3；
步骤S3：化合物3脱除保护基得到化合物I。
优选地，所述R1、R2、R3、R4各自独立地选自甲基、叔丁基、烯丙基、苄基、甲氧基甲基、乙氧基乙基、2-四氢吡喃基、甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、三乙基硅基、三异丙基硅基、叔丁基二甲基硅基和叔丁基二苯基硅基。
优选地，所述R1、R2、R3、R4各自独立地选自苯甲酰基。
优选地，所述步骤S1是在缩合剂存在下进行的。
优选地，所述缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI）、N,N'-二环己基碳化二亚胺（DCC）、N,N'-二异丙基碳二酰亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羟基苯并三唑（HOBT）、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲脲六氟磷酸酯、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷。
优选地，所述缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI）和/或1-羟基苯并三唑（HOBT）。
优选地，所述步骤S2是在氢氟酸吡啶存在下进行的。
优选地，所述化合物S是由化合物S-4制备得到，反应步骤如下：
步骤S-d：化合物S-4通过还原反应得到化合物S；
优选地，所述步骤S-d的还原剂为氢气；
优选地，所述步骤S-d是在钯碳存在下进行的。
优选地，所述化合物S-4是由化合物S-2和S-3反应得到，反应步骤如下：
步骤S-c：化合物S-2和S-3反应得到化合物S-4；
优选地，所述化合物S-2是由化合物S-1制备得到，反应步骤如下：
步骤S-a：化合物S-1和三苯基膦反应得到化合物S-2；
优选地，所述步骤S-a和S-c一锅法完成。
优选地，所述化合物S-3是由对氟苯硫酚和对氯苯甲醛反应得到，反应步骤如下：
步骤S-b：化合物对氟苯硫酚和对氯苯甲醛反应得到化合物S-3。
第三方面，本发明提供一种药物组合物，其包含式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐。
优选地，所述组合物包含疫苗。
第四方面，本发明提供一种式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐，或者上述药物组合物，其用作制备疫苗佐剂。
第五方面，本发明提供一种式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐，或者上述药物组合物在制备疫苗佐剂中的应用。
发明的效果
本发明提供一种新型的TH1-型糖脂类免疫佐剂，将新冠抗原RBD蛋白抗原和佐剂制成疫苗， Balb/C小鼠皮下注射两次（相隔三周）；证明了式I所示的化合物相比KRN7000，类似物C34，以及铝佐剂，可以产生更多的IgG，从而显示出出色的佐剂效果。
附图说明
图1为式I所示的化合物的核磁表征数据。
图2为铝佐剂，KRN7000脂质体，类似物C34，式I所示的化合物与RBD蛋白制成的疫苗免疫小鼠后抗体滴度水平图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。其中，附图不一定是按比例绘制的，局部特征可以被放大或缩小，以更加清楚的显示局部特征的细节；除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。
第一方面，本发明提供一种式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐：
。
第二方面，本发明提供一种制备式I所示的化合物的方法，所述方法包括如下步骤：
；
其中R1、R2、R3、R4选自羟基保护基；
步骤S1：化合物1与化合物S反应得到化合物2；
步骤S2：化合物2脱除硅叉保护基得到化合物3；
步骤S3：化合物3脱除保护基得到化合物I。
在某些实施方案中，所述R1、R2、R3、R4各自独立地选自甲基、叔丁基、烯丙基、苄基、甲氧基甲基、乙氧基乙基、2-四氢吡喃基、甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、三乙基硅基、三异丙基硅基、叔丁基二甲基硅基和叔丁基二苯基硅基。
在某些实施方案中，所述R1、R2、R3、R4各自独立地选自苯甲酰基。
在某些实施方案中，所述步骤S1是在缩合剂存在下进行的。
在某些实施方案中，所述缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI）、N,N'-二环己基碳化二亚胺（DCC）、N,N'-二异丙基碳二酰亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羟基苯并三唑（HOBT）、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲脲六氟磷酸酯、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷。
在某些实施方案中，所述缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI）和/或1-羟基苯并三唑（HOBT）。
在某些实施方案中，所述步骤S1是在蜡酸存在下进行的。
在某些实施方案中，所述步骤S1是在DIPEA存在下进行的。
在某些实施方案中，所述步骤S1中蜡酸、EDCI、HOBT 、化合物1、DIPEA的摩尔比为3:20:20:2:6。
在某些实施方案中，所述步骤S1的反应温度为0-5℃。
在某些实施方案中，所述步骤S2是在氢氟酸吡啶存在下进行的。
在某些实施方案中，所述R1、R2、R3、R4各自独立地选自苯甲酰基时，步骤S3是在甲醇钠存在下进行的。
在某些实施方案中，所述化合物S是由化合物S-4制备得到，反应步骤如下：
步骤S-d：化合物S-4通过还原反应得到化合物S。
在某些实施方案中，所述步骤S-d的还原剂为氢气。
在某些实施方案中，所述步骤S-d是在钯碳存在下进行的。
在某些实施方案中，所述步骤S-d中化合物S-4与钯碳的质量比为1:0.1。
在某些实施方案中，所述化合物S-4是由化合物S-2和S-3反应得到，反应步骤如下：
步骤S-c：化合物S-2和S-3反应得到化合物S-4。
在某些实施方案中，所述化合物S-2是由化合物S-1制备得到，反应步骤如下：
步骤S-a：化合物S-1和三苯基膦反应得到化合物S-2。
在某些实施方案中，所述步骤S-a和S-c一锅法完成，化合物S-1与三苯基膦反应得到化合物S-2，加入S-3反应得到化合物S-4。
在某些实施方案中，化合物S-3与S-1、三苯基磷的摩尔比为1:1:1.05。
在某些实施方案中，所述化合物S-3是由对氟苯硫酚和对氯苯甲醛反应得到，反应步骤如下：
步骤S-b：化合物对氟苯硫酚和对氯苯甲醛反应得到化合物S-3。
在某些实施方案中，所述步骤S-b是在碘化亚铜存在下进行的。
在某些实施方案中，所述步骤S-b是在L-丙氨酸存在下进行的。
在某些实施方案中，所述步骤S-b是在磷酸三钾存在下进行的。
在某些实施方案中，所述步骤S-b中对氟苯硫酚，对氯苯甲醛，碘化亚铜，L-丙氨酸，磷酸三钾的摩尔比为1.1:1:0.05:0.1:0.3。
第三方面，本发明提供一种药物组合物，其包含式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述组合物包含疫苗。
第四方面，本发明提供一种式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐，或者上述药物组合物，其用作制备疫苗佐剂。
第五方面，本发明提供一种式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐，或者上述药物组合物在制备疫苗佐剂中的应用。
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的范围限制；实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
下述实施例中1H NMR图谱是用Bruker仪器(400MHz)测定而得，化学位移用ppm表示。使用四甲基硅烷内标准(0.00ppm)。1H NMR的表示方法：s=单峰，d=双重峰，t=三重峰，q=四重峰，m=多重峰，br=宽峰，dd=双重峰的双重峰，dt=三重峰的双重峰。若提供偶合常数时，其单位为Hz。
四氟节门层析柱（型号：C363230C,C364640C）是购自重庆欣维尔玻璃有限公司。
低温循环泵（型号：DLSB-5/20），控温仪（型号：ZNHW-II），磁力搅拌器（型号：98-2），机械搅拌器（型号：100W），旋片式真空泵（型号：2XZ-4），暗箱紫外分析仪器（型号：ZF-20D），鼓风干燥箱（型号：DHG-9240A）均购自上海信铮科贸有限公司。
HPLC：Agilent 1260 Infinityll，设备编号：ME-D-044（J）；色谱柱：InfinityLabPoroshell 120 EC C18（色谱柱编号：C18-03）购自上海赛默飞世尔科技有限公司。
实验用水为Milli-Q水（18.2 MΩ·cm，Millipore公司）。
吡啶（Py）、三乙胺（TEA）、乙酸乙酯（EA）、石油醚（PE）、甲醇（MeOH）、无水乙醇（Ethanol absolute）、四氢呋喃（THF）、二氯甲烷（CH2Cl2）等均为分析纯试剂，购买于上海泰坦科技，直接使用；其他主要试剂货号及质量标准如下表1，铝佐剂和新冠原始株CHO表达的抗原RBD三聚体蛋白由成都迈科康生物提供。
表1 主要试剂货号及质量标准
实施例中无特殊说明，反应中的溶液是指水溶液。
实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。
实施例1：化合物S-3的制备
取一个500mL的四口烧瓶，加入对氟苯硫酚（25 g，195 mmol），对氯苯甲醛（25g，178mmol），碘化亚铜（1.7g），L-丙氨酸（2.05g），磷酸三钾（90.6g）溶于乙醇/水（3：4）70ml中，待混合均匀，缓慢升温至80℃，并用TLC监测反应进度。反应结束后，100 mL乙酸乙酯溶解，水洗，饱和食盐水洗涤至pH中性。有机相用无水硫酸钠干燥，负压浓缩得化合物粗品粗产物，用薄层层析法进行分离纯化（PE:EA=6:1）得油状液体化合物S-3，产量23 g，产率55.7%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：7.12(d，J=8.65Hz，2H)，7.22(d，J=8.53Hz，2H)，7.32(q，J=8.65Hz，J=4.68Hz，2H)，7.66(d，J=8.84 Hz，2H)，9.83(s，1H)；MS (ESI): 232.8(C13H9FOS, [M+H]+)。
实施例2：化合物S-4的制备
取一个500 mL的四口烧瓶，加入10-溴癸酸（19.65g），三苯基膦（21.45g）混合，缓慢升温至150℃，熔融，搅拌反应24h降温得维蒂希试剂；加入四氢呋喃（300mL）溶解，溶清后降温，控温0-5℃，加入叔丁醇钾（41.6g），加入化合物S-3（15g），转到室温搅拌反应，TLC检测进度。反应完，加入1N盐酸调pH为中性，水洗，食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥，过滤，负压浓缩得粗品固体化合物，加入乙醇/水（1：1）160mL，加热回流溶清后降温重结晶得黄色固体，50℃烘干得化合物S-4，产量20.45 g，收率82.0%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：6.96-7.40(m，8H)，6.33(m，1H)，6.20(m，1H)，2.1-2.4(m，4H)，1.22-1.65(m，12H)；MS (ESI): 386.9 (C13H9FOS, [M+H]+)。
实施例3：化合物S的制备
取一个500 mL的四口圆底烧瓶，分别向其中加入甲醇160ml和乙酸乙酯160ml，加入化合物S-4（20 g），磁力搅拌，再加入2g 10%的Pd/C，氢气球保护。用TLC监测并用HPLC分析。反应完全后，减压蒸馏至干。加入甲醇：水（5：1）20ml溶解，加热至回流溶解，降温至室温析出并搅拌1h，过滤出淡黄色色固体，50℃烘干得化合物S，产量15.3g，产率76.5%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ：6.96-7.37(m，8H)，2.56(t，J=7.6Hz，2H)，2.36(t，J=7.4Hz，2H)，1.22-1.65(m，16H)；MS (ESI): 388.9 (C13H9FOS, [M+H]+)。
实施例4：化合物2的制备
取一个50 mL的四口烧瓶，加入化合物S（0.70 g，1.8 mmol），1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDCI）（2.3 g，11.8 mmol），1-羟基苯并三唑（HOBT）（1.6 g，11.8mmol），分子筛活化粉（1.4g），四氢呋喃12mL，氮气保护下冰浴降温至0℃，保温搅拌30分钟；再将化合物1（1.23 g，1.2 mmol）溶于12 mL四氢呋喃，加入二异丙基乙二胺（DIPEA）（0.46g，3.6 mmol）混合，再将混合后的溶液滴加到蜡酸溶液中，继续保温0-5℃反应30分钟，转移到室温搅拌过夜，并用TLC监测反应进度。反应结束后，水洗，饱和食盐水洗至中性，负压浓缩得粗品，粗产物用薄层层析法进行分离纯化（PE:EA=10:1）得油状液体化合物2，产量0.84g，收率50%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.0-7.6 (d, 28H), 5.5-6.0(d, 3H), 5.15 -5.4(d, 2H), 4.25 – 4.75 (m, 3H), 2.62 (t, 2H), 2.15 (t, 2H), 1.87 (dd, J = 17.1,10.3 Hz, 2H), 1.31 – 1.22 (m, 36H), 0.87 (dt, J = 6.9, 3.3 Hz, 9H).MS (ESI):1408.2 (C83H108FNO13SSi, [M+H]+)。
实施例5：化合物3的制备
取一个25 mL的四口烧瓶，将化合物2（0.8 g，0.568 mmol）溶于8 mL四氢呋喃中，冰浴至0℃；滴加氢氟酸吡啶2.4 mL溶液至反应液中，滴完升至室温搅拌至反应完成，并用TLC监测反应进度。反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应至中性，负压浓缩至只有水层，加入二氯甲烷搅拌15分钟，分液取有机层，饱和食盐水洗涤两次至pH中性。负压浓缩得化合物粗品粗产物，用薄层层析法进行分离纯化（PE:EA=2:1）得油状液体化合物3，产量0.57 g，产率79%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.0-7.6 (d, 28H), 5.5-6.0(d, 3H), 5.15 -5.4(d, 2H), 4.25 – 4.75 (m, 3H), 2.62 (t, 1H), 2.15 (t, 1H),1.89 (s, 2H), 1.81(dd, J = 14.5, 7.4 Hz, 2H), 1.66 (s, 2H), 1.27 (d, J = 26.2 Hz, 36H), 0.86(t, J = 6.4 Hz, 3H).MS (ESI): 1290.3(C75H92FNO13S, [M+Na]+)。
实施例6：化合物I的制备
取一个25 mL的四口烧瓶，将化合物3（0.5 g，0.4 mmol）溶于10 mL甲醇中，冰浴至0℃，反应物未溶解；滴加甲醇钠/甲醇溶液调pH=10，滴完升温至室温继续反应，并用TLC监测反应进度。反应完，加入732氢型强酸型阳离子交换树脂调节pH等于6-7，加入氯仿溶解，过滤，氯仿漂洗，负压浓缩得固体粗品，加入5ml甲醇搅拌出固体，过滤得粗品，再加入5ml石油醚搅拌30分钟，过滤出白色固体化合物I，产量0.27 g，产率80.2%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.0-7.6 (d, 8H), 5.56 (d, J = 3.6 Hz, 1H),5.25 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 4.25 – 4.75 (m, 7H), 2.42 (t, J = 7.3 Hz, 2H),1.89(s, 2H), 1.81 (dd, J = 14.5, 7.4 Hz, 2H), 1.66 (s, 2H), 1.27 (d, J = 26.2 Hz,36H), 0.86 (t, J = 6.4 Hz, 3H).MS (ESI): 873.2 (C47H76FNO9S, [M+Na]+)。
实施例7：活性检测
新冠原始株CHO表达的抗原RBD三聚体蛋白和佐剂制成疫苗， Balb/C小鼠皮下注射两次（相隔三周）；收集小鼠血清，检测抗体滴度。
步骤1.小鼠饲养与免疫
Balb/C 小鼠，雌性，5-7周龄。约体重20g，每组10只，共110只。
动物饲养：生活环境12h白12h黑，温度22℃，湿度55%，自由进食饮水，适应性喂养后再进行后续实验。皮下注射相应疫苗200ul，间隔3周注射第二针，观察小鼠免疫后状态（体温、饮食、接种处是否红肿）。小鼠免疫前一天、第21天及第二次免疫后14天眼眶采血。
步骤2.ELISA法检测血清样本中IgG
抗体：每次免疫前（第1，21天）和第二次免疫后14天取血，检查IgG。（备注：抗体滴度计算方法：Positive/negative, P/N，当P/N大于2.1时为阳性， P/N小于2.1为阴性，取稀释倍数最大的阳性结果为测得的抗体滴度。1: X (X表示抗体可以被检测出来的最大稀释倍数) X的数值越大，抗体效价越大，表示抗体与抗原结合能力越强。）
1. 小鼠血清分离：采集各组动物血清，37℃放置2小时或2~8℃ 放置过夜，8000转/分钟，离心10分钟，分离血清，适量分装后置于-20℃冻存。
2. ELISA板包被（Greiner Bui-One; Cat#: Microlon@600）MKK400原液用包被液稀释至1μg/ml，100μl/孔加样。密封包被好的ELISA板并置于4ºC冰箱孵育过夜。
3.封闭
用1× PBST 洗3次，300μl/孔。
加入封闭液：1×TBS/1% BSA，200μl/孔，25℃ 孵育1小时。
4.血清样品稀释：
待测血清稀释：取待测实验组血清样品适量（不小于5μl），加入稀释液稀释至合适浓度，作为起始稀释度，加入封闭后的酶标板中，进行两倍倍比稀释，共稀释六个梯度。起始稀释倍数可根据待测血清中预计抗体滴度水平进行调整，必要时进行预实验确定待测血清起始稀释倍数。
参比血清稀释（氢氧化铝组）：取参比血清样品5μl，加入45μl稀释液中（1：10），混匀后取40μl加入160μl稀释液中（1：5），混匀后两倍比例进行梯度稀释。以1:400作为起始稀释倍数，标准曲线进行10个梯度稀释。
5. 样品孵育：各稀释梯度参比血清及待测样品同时100μl/孔加入酶标板，25℃孵育1.0h。6. 用1× PBST 洗3次，300μl/孔。
7. 按下表进行相应二抗稀释及孵育：
8. 用1*PBST洗5次，300μl/孔。
9．TMB显色：加入TMB显色液，100μl/孔，25℃ 避光孵育15分钟。
10．终止颜色反应：加入1M H3PO4，100μl/孔。
11. 酶标仪450nm处读吸光值。
12. 结果计算
12.1通过标准曲线计算待测样品血清及质控血清抗体滴度，在不同稀释度待测样品检测结果中选择OD450值位于“S”型标准曲线中间段直线区域内的值进行结果计算。取值上限为标准曲线上达到饱和值的前一点，取值下限为标准曲线上递增拐点的后一点。
12.2 若血清检测OD450值低于标曲取值下限时赋值（计算公式：血清起始稀释倍数×标曲取值下限的滴度值×1/2）。
12.3 判定标准
ELISA检测成立标准：四参数曲线的线性相关系数R2≥0.98，若R2＜0.98，可进行标准曲线中异常点剔除（异常点数目不得超过2个），若剔除异常点后仍不能满足R2≥0.98，需重新进行ELISA检测。
13. 注意事项
整个反应过程要避免让ELISA板干燥。
读数时有气泡需刺破气泡再读数。
14. 检测结果
检测结果如图2所示，式I所示的化合物相比KRN7000、C34以及铝佐剂，可以产生更多的IgG，从而显示出出色的佐剂效果。
C34的结构如下：
。
应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。

Claims (11)

1.一种式I所示的化合物或其药学上可接受的盐：
。
2.一种权利要求1所述的式I所示的化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
；
其中R1、R2、R3、R4选自羟基保护基；
步骤S1：化合物1与化合物S反应得到化合物2；
步骤S2：化合物2脱除硅叉保护基得到化合物3；
步骤S3：化合物3脱除保护基得到化合物I。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述R1、R2、R3、R4各自独立地选自甲基、叔丁基、烯丙基、苄基、甲氧基甲基、乙氧基乙基、2-四氢吡喃基、甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、三乙基硅基、三异丙基硅基、叔丁基二甲基硅基和叔丁基二苯基硅基。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1是在缩合剂存在下进行的；
所述缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI）、N,N'-二环己基碳化二亚胺（DCC）、N,N'-二异丙基碳二酰亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羟基苯并三唑（HOBT）、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲脲六氟磷酸酯、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2是在氢氟酸吡啶存在下进行的。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物S是由化合物S-4制备得到，反应步骤如下：
步骤S-d：化合物S-4通过还原反应得到化合物S。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述化合物S-4是由化合物S-2和S-3反应得到，反应步骤如下：
步骤S-c：化合物S-2和S-3反应得到化合物S-4；
所述化合物S-2是由化合物S-1制备得到，反应步骤如下：
步骤S-a：化合物S-1和三苯基膦反应得到化合物S-2。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述化合物S-3是由对氟苯硫酚和对氯苯甲醛反应得到，反应步骤如下：
步骤S-b：化合物对氟苯硫酚和对氯苯甲醛反应得到化合物S-3。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的式I所示的化合物或其药学上可接受的盐。
10.权利要求1所述的式I所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备疫苗佐剂中的应用。
11.权利要求9所述的药物组合物在制备疫苗佐剂中的应用。
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