CN115485367A - 用于细胞工程的安全港基因座 - Google Patents

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Abstract

本文提供了可以用作用于基因修饰的位点的安全港基因座。本公开文本的安全港基因座显示支持持续的转基因表达，并且沉默最小以及对局部或全局基因表达的影响最小。本文公开的安全港基因座可以用于各种遗传和细胞工程应用。

Description

用于细胞工程的安全港基因座
交叉引用
本申请要求国际专利申请号PCT/CN2021/087819的优先权和利益，将所述专利申请通过引用以其整体并入本文。
背景技术
基因编辑技术有潜力革命性地改变现代医学，例如应用于治疗癌症、遗传疾病和广泛的其他疾病。许多遗传编辑技术涉及将所希望的表达盒引入细胞中。例如，可以产生工程化免疫细胞，其具有希望的特性，诸如通过抗原识别受体识别特定靶标的能力，并且所述工程化免疫细胞引起对靶细胞希望的反应，诸如对癌细胞的细胞毒性反应。由基因突变引起的疾病可以潜在地治疗或治愈，例如通过引入和表达缺陷基因的功能拷贝。这些例子勉强浅显地触及有望由基因编辑技术所达到的非常广泛的治疗可能性。在一些情况下，可以将核酸序列(例如，转基因)引入细胞的基因组中，以例如实现由遗传编辑所涵盖的许多希望结局。
发明内容
在一些方面，本文公开了一种工程化细胞群体，所述群体中的每个工程化细胞包含插入在基因组位点中的转基因，其中在所述转基因插入所述基因组位点中后，(i)所述群体的超过98.8％维持所述转基因的表达持续至少约15天，或(ii)所述群体的超过97.2％维持所述转基因的表达持续至少约21天。
在一些方面，本文公开了一种工程化细胞群体，所述群体中的每个工程化细胞包含插入在非AAVS1的基因组位点中的转基因，其中在所述转基因插入所述基因组位点中后，(i)所述群体的超过68％维持所述转基因的表达持续至少约15天，或(ii)所述群体的超过65％维持所述转基因的表达持续至少约21天。
在一些方面，本文公开了一种工程化细胞群体，所述群体中的每个工程化细胞包含插入在基因组位点中的转基因，其中所述工程化细胞是多能干细胞，并且其中在使所述群体经受向细胞谱系的分化后，分化群体的至少约92％维持所述转基因的表达。
在一些实施方案中，所述群体经受所述分化持续至少约14或21天。在一些实施方案中，所述细胞谱系选自胚状体、中胚层细胞、内胚层细胞和外胚层细胞。在一些实施方案中，所述细胞谱系包括造血干细胞。在一些实施方案中，所述细胞谱系包括NK细胞。在一些实施方案中，所述细胞谱系包括T细胞。
在一些方面，本文公开了一种工程化细胞群体，所述群体的每个工程化细胞在基因组位点中包含人工诱导的修饰，其中所述人工诱导的修饰引起不超过约100个内源基因的表达水平不超过约10倍的变化。
在一些方面，本文公开了一种工程化细胞群体，所述群体的每个工程化细胞在基因组位点中包含人工诱导的修饰，其中所述人工诱导的修饰引起不超过约10个内源基因的表达水平不超过约10倍的变化，所述内源基因在所述基因组位点的300kb以内。
在一些方面，本文公开了一种工程化细胞群体，所述群体的每个工程化细胞在所述工程化细胞的基因组位点中包含人工诱导的修饰，其中在5'或3'方向上最接近所述基因组位点的开放阅读框编码核糖体蛋白、泛素调节因子、凋亡调节因子、细胞周期进程调节因子、转录因子或含锌指蛋白，其中所述工程化细胞是干细胞或NK细胞。
在一些方面，本文公开了一种工程化细胞群体，所述群体的每个工程化细胞在所述工程化细胞的基因组位点中包含人工诱导的修饰，其中所述基因组位点是以下之间的基因间区：(a)FAU与ZNHIT2；(b)RPL3与SYNGR1；(c)RPLP2与PIDD1；(d)RPS7与RNASEH1；(e)THEM4与S100A10；(f)DDIT4与ANAPC16；(g)ANXA2与FOXB1；(h)TOB2与TEF；(i)NDUFA4与PHF14；(j)DDX5与CEP95；(k)PIN4与RPS4X；(l)PLEKHG2与RPS16；(m)TRIM41与RACK1；(n)HINT1与LYRM7；(o)CFL1与MUS81；或(p)VPS13B与COX6C。
在一些实施方案中，所述基因组位点与可操作地偶联至一个或多个内源基因的启动子相邻，所述一个或多个内源基因选自FAU、ZNHIT2、RPL3、RPLP2、RPS7、TM EM4、S100A10、ANAPC16、DDIT4、FOXB1、ANXA2、TEF、TOB2、NDUFA4、DD X5、CEP95、PIN4、RPS4X、PLEKHG2、RPS16、TRIM41、RACK1、HINT1、CFL1、MUS81、VPS13B和COX6C。在一些实施方案中，所述基因组位点与来自基因组参考联盟人类构建38(GRCh38/hg38)人类基因组的一个或多个序列具有至少80％的序列同一性，所述一个或多个序列选自：(a)chr11:65,117,969-65,120,057；(b)chr22:39,319,072-39,321,167；(c)chr11:808,403-810,414；(d)chr2:3,574,031-3,576,263；(e)chr1:151,944,637-151,946,598；(f)chr10:72,259,705-72,261,554；(g)chr15:60,126,969-60,128,831；(h)chr22:41,413,106-41,414,808；(i)chr7:10,940,150-10,940,760；(j)chr17:64,506,290-64,506,960；(k)chrX:72,268,950-72,270,750；(l)chr19:39,430,700-39,431,400；(m)chr5:181,235,790-181,236,860；(n)chr5:131,165,330-131,165,510；(o)chr11:65,859,410-65,860,050；和(p)chr8:99,877,580-99,877,850。在一些实施方案中，在将所述工程化细胞引入宿主受试者后，所述群体中超过80％的细胞维持所述转基因的表达持续至少约两个月。在一些实施方案中，所述基因组位点距所述基因组中最近的开放阅读框至少0.5kb、1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb或15kb。在一些实施方案中，所述基因组位点距所述基因组中最近的癌症相关基因至少1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、50kb、60kb、70kb、75kb、80kb、90kb或100kb。在一些实施方案中，所述基因组位点距所述基因组中最近的snoRNA编码基因、miRNA编码基因或lincRNA编码基因至少1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、50kb、60kb、70kb、75kb、80kb、90kb或100kb。在一些实施方案中，所述人工诱导的修饰包括将转基因插入所述基因组位点中。在一些实施方案中，所述转基因编码免疫受体。在一些实施方案中，所述转基因编码抗原识别受体。在一些实施方案中，所述转基因编码NK受体。在一些实施方案中，所述转基因编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体进一步包含共刺激结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域包含源自以下的氨基酸序列：CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D或其任何组合。在一些实施方案中，所述转基因编码细胞因子。在一些实施方案中，所述转基因编码细胞因子受体。在一些实施方案中，所述工程化细胞是干细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞是胚胎干细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞是诱导多能干细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞是NK细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞是T细胞。在一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码核糖体蛋白。在一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码泛素家族成员。在一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码含锌指蛋白。在一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码泛素调节因子。在一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码正调节凋亡的因子。在一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码负调节凋亡的因子。在一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码细胞周期进程调节因子。在一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码转录因子。在一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码碱性区/亮氨酸拉链(bZIP)转录因子。在一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码DN A损伤反应调节因子。在一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码泛素连接酶。在一些实施方案中，所述基因组位点不是AAVS1或H11。在一些实施方案中，所述基因组位点不是Rosa26、colA1、TIGRE或CCR5。在一些实施方案中，所述转基因与组成型启动子可操作地偶联。在一些实施方案中，所述转基因与诱导型启动子可操作地偶联。在一些实施方案中，所述转基因不与诱导型启动子可操作地偶联。在一些实施方案中，所述转基因与组织特异性启动子可操作地偶联。在一些实施方案中，(i)所述群体的超过98.8％维持所述转基因的组成型表达持续至少约15天，或(ii)所述群体的超过97.2％维持所述转基因的组成型表达持续至少约21天。在一些实施方案中，所述基因组位点是在TEF与TOB2之间的基因间区。在一些实施方案中，所述基因组位点是在FAU与ZNHIT2之间的基因间区。在一些实施方案中，所述基因组位点是在PIDD1与RPLP2之间的基因间区。在一些实施方案中，所述基因组位点是在ANAPC16与DDIT4之间的基因间区。在一些实施方案中，所述基因组位点在来自基因组参考联盟人类构建38(GRCh38/hg38)人类基因组的坐标chr22:41,413,106-41,414,808内。在一些实施方案中，所述基因组位点在来自基因组参考联盟人类构建38(GRCh38/hg38)人类基因组的坐标chr11:65,117,969-65,120,057内。在一些实施方案中，所述基因组位点在来自基因组参考联盟人类构建38(GRCh38/hg38)人类基因组的坐标chr11:808,403-810,414内。在一些实施方案中，所述基因组位点在来自基因组参考联盟人类构建38(GRCh38/hg38)人类基因组的坐标chr10:72,259,705-72,261,554内。
在一些方面，本文公开了一种被配置用于产生根据前述实施方案中任一项所述的工程化细胞的载体，所述载体包含转基因和至少一个同源臂，其中所述同源臂的长度为至少20个核苷酸，并且包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与在以下之间的基因间区中的相应序列具有至少90％的序列同一性：(a)FAU与ZNHIT2；(b)RPL3与SYNGR1；(c)RPLP2与PIDD1；(d)RPS7与RNASEH1；(e)THEM4与S100A10；(f)DDIT4与ANAPC16；(g)ANXA2与FOXB1；(h)TOB2与TEF；(i)NDUFA4与PHF14；(j)DDX5与CEP95；(k)PIN4与RPS4X；(l)PLEKHG2与RPS16；(m)TRIM41与RACK1；(n)HINT1与LYRM7；(o)CFL1与MUS81；或(p)VPS13B与COX6C。
在一些实施方案中，所述同源臂的长度为至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1000个核苷酸。
在一些方面，本文公开了一种制备根据前述实施方案中任一项所述的工程化细胞的方法，所述方法包括将所述转基因或所述人工诱导的修饰引入细胞的所述基因组位点中。
在一些实施方案中，所述转基因或所述人工诱导的修饰的引入包括在所述基因组位点中引入双链断裂。在一些实施方案中，所述双链断裂是由核酸酶引入的。在一些实施方案中，所述核酸酶是CRISPR相关(Cas)核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶。在一些实施方案中，所述转基因或所述人工诱导的修饰的引入包括提供通过同源定向修复整合到所述基因组位点中的多核苷酸。在一些实施方案中，在所述引入后20天，(i)多个从包含插入所述基因组位点处的所述转基因的克隆表达所述转基因的细胞的百分比高于(ii)多个从包含插入AAVS1基因座处的所述转基因的克隆表达所述转基因的细胞的百分比。在一些实施方案中，(i)从多个包含在所述基因组位点插入的所述转基因的克隆表达所述转基因的平均持续时间高于(ii)从多个包含插入AAVS1基因座处的所述转基因的克隆表达所述转基因的平均持续时间。在一些实施方案中，(i)从多个包含在所述基因组位点插入的所述转基因的克隆表达所述转基因的平均水平高于(ii)从多个包含插入AAVS1基因座处的所述转基因的克隆表达所述转基因的平均水平。在一些实施方案中，插入所述基因组位点处的所述转基因的表达和插入所述AAVS1基因座处的所述转基因的表达由相同或基本相同的启动子驱动。
在一些方面，本文公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含根据前述实施方案中任一项所述的工程化细胞或载体以及药学上可接受的赋形剂、载体、媒介物或稀释剂。
在一些方面，本文公开了一种治疗有需要的受试者的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据前述实施方案中任一项所述的工程化细胞或药物组合物。
通过引用并入
此说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，并入程度就像每个单独的出版物、专利或专利申请被明确和单独地指出以通过引用并入一样。就通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开文本相矛盾而言，本说明书旨在取代和/或优先于任何这种矛盾的材料。
附图说明
本发明的新型特征具体陈述于所附的权利要求中。将通过参考陈述利用本发明原理的说明性实施方案的以下具体描述和附图获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在所述附图中：
图1展示了在将表达盒整合到hESC克隆中的本公开文本的安全港基因座中之后的稳定报告基因表达。
图2展示了在将表达盒整合到hESC克隆中的对照安全港基因座中之后的报告基因表达。
图3展示了在将表达盒整合到hESC克隆中的本公开文本的安全港基因座(hSH8)中之后的稳定报告基因表达(每行针对不同的克隆)。
图4A展示了在将表达盒整合到iPSC克隆中的本公开文本的安全港基因座或AAVS1中之后的报告基因表达。
图4B展示了在9-15次传代后将表达盒整合到iPSC克隆中的AAVS1中之后的报告基因表达。
图4C展示了在11-21次传代后将表达盒整合到iPSC克隆中的hSH1中之后的报告基因表达。
图4D展示了在12-22次传代后将表达盒整合到iPSC克隆中的hSH8中之后的报告基因表达。
图5A展示了在将表达盒整合到分化为胚状体的iPSC克隆中的本公开文本的安全港基因座(hSH8)中之后的稳定报告基因表达(每行针对不同的克隆)。
图5B展示了在将表达盒整合到分化为胚状体的iPSC克隆中的AAVS1中之后的报告基因表达的损失。
图6展示了在将表达盒整合到分化为胚状体的iPSC克隆中的本公开文本的安全港基因座(hSH1和hSH3)中之后的稳定报告基因表达(每行针对不同的克隆)。
图7展示了在将表达盒整合到分化为NK细胞(如通过分化方案的第14天所确定)的iPSC克隆中的本公开文本的安全港基因座(hSH8)中之后的稳定报告基因表达(每行针对不同的克隆)。
图8展示了在将表达盒整合到分化为NK细胞(如通过分化方案的第21天所确定)的iPSC克隆中的本公开文本的安全港基因座(hSH8)中之后的稳定报告基因表达(每行针对不同的克隆)。
图9展示了在将表达盒整合到分化为NK细胞(如通过分化方案的第14天所确定)的iPSC克隆中的本公开文本的安全港基因座(hSH1)中之后的稳定报告基因表达(每行针对不同的克隆)。
图10展示了在将表达盒整合到分化为NK细胞(如通过分化方案的第21天所确定)的iPSC克隆中的本公开文本的安全港基因座(hSH1)中之后的稳定报告基因表达(每行针对不同的克隆)。
图11展示了在将表达盒整合到分化为NK细胞(如通过分化方案的第14天所确定)的iPSC克隆中的本公开文本的安全港基因座(hSH3)中之后的稳定报告基因表达(每行针对不同的克隆)。
图12展示了在将表达盒整合到分化为NK细胞(如通过分化方案的第21天所确定)的iPSC克隆中的本公开文本的安全港基因座(hSH3)中之后的稳定报告基因表达(每行针对不同的克隆)。
图13展示了在将表达盒整合到hESC中的本公开文本的安全港基因座(hSH8)中、将hESC植入裸小鼠中以及两个月分化为畸胎瘤之后的稳定体内报告基因表达。
图14展示了在将表达盒整合到hESC中的本公开文本的hSH6和hSH8安全港基因座中、将hESC植入裸小鼠中以及两个月分化为畸胎瘤之后的稳定体内报告基因表达。
图15提供了来自用在本公开文本的安全港基因座处具有表达盒的hESC注射后两个月的小鼠的畸胎瘤组织的显微镜图像，证明hESC已经分化为外胚层、中胚层和内胚层谱系。
图16A提供了火山图，其示出了在将转基因引入本公开文本的hSH1、hSH3、hSH6和hSH8安全港基因座后hESC中的差异化基因表达。
图16B提供了火山图，其示出了在将转基因引入AAVS1或H11基因座后hESC中的差异化基因表达。
具体实施方式
除非上下文另有明确指示，如说明书和权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数指示物。例如，术语“嵌合跨膜受体”包括多个嵌合跨膜受体。
术语“约”或“大约”通常意指在如通过本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，所述误差范围部分取决于如何测量或确定所述值，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1个或多于1个标准偏差内。可替代地，“约”可以意指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。可替代地，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指在值的数量级以内、优选在值的5倍以内、更优选地在值的2倍以内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意指所述特定值在可接受的误差范围内。
替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两者或它们的任何组合。术语“和/或”应理解为意指替代方案中的一个或两个。
术语“分化”通常是指一种过程，其中未特化(“未定型”)或特化程度较低的细胞获得特化细胞(例如像免疫细胞)的特征。分化细胞或分化诱导细胞是在细胞谱系中占据更特化(“定型”)位置的细胞。术语“定型”通常是指这样的细胞，所述细胞在分化途径中已经进行到某个点，这时在正常情况下，它将继续分化为特定的细胞类型或细胞类型的子集，并且在正常情况下不能分化为不同的细胞类型或恢复为分化程度较低的细胞类型。
术语“多能”通常是指细胞形成身体或躯体的所有谱系的能力(即，胚体(embryoproper))。例如，胚胎干细胞是一种类型的多能干细胞，其能够从三个胚层(外胚层，中胚层和内胚层)中的每一个形成细胞。多能性可以是发育潜能的连续统一，其范围为从无法产生完整生物体的不完全或部分多能细胞(例如，上胚层干细胞)到能够产生完整生物体的更原始更多能的细胞(例如，胚胎干细胞)。
术语“诱导多能干细胞”(iPSC)通常是指源自分化细胞(例如，分化的成人、新生儿或胎儿细胞)的干细胞，所述分化细胞已经诱导或改变(即，重新编程)为能够分化为以下所有三个胚层或真皮层的组织的细胞：中胚层，内胚层和外胚层。所产生的iPSC并非是指自然界中发现的细胞。在一些情况下，iPSC可以经工程化以直接分化为定型细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞)。在一些情况下，iPSC可以经工程化以首先分化为组织特异性干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，所述组织特异性干细胞可以被进一步诱导分化成定型细胞(例如，NK细胞)。
术语“胚胎干细胞”(ESC)通常是指胚胎囊胚的内细胞团的天然存在的多能干细胞。胚胎干细胞是多能性的并且在发育过程中产生以下三个主要胚层的所有衍生物：外胚层、内胚层和中胚层。在一些情况下，ESC可以经工程化以直接分化成定型细胞(例如，NK细胞)。在一些情况下，ESC可以经工程化以首先分化为组织特异性干细胞(例如，HSC)，所述组织特异性干细胞可以被进一步诱导分化成定型细胞(例如，NK细胞)。
术语“分离的干细胞”通常是指从例如多细胞生物体中分离出的本文公开的任何类型的干细胞(例如，ESC、HSC、间充质干细胞(MSC)等)。例如，HSC可以分离自哺乳动物的身体，诸如人体。在另一个例子中，可以从胚胎中分离出胚胎干细胞。
术语“分离的”通常是指已经与其原始环境分离的细胞或细胞群体。例如，分离的细胞的新环境基本上没有如在其中存在“未分离的”参考细胞的环境中发现的至少一种组分。分离的细胞可以是当细胞在其自然环境中被发现时从一些或所有组分中去除的细胞，例如从组织或活检样品中分离的。所述术语还包括当细胞在非天然存在的环境中被发现时从至少一种、一些或所有组分中去除的细胞，例如从细胞培养物或细胞悬液分离的。因此，当细胞在自然界中被发现时或其在非天然存在的环境中生长、储存或生存时，分离的细胞与至少一种组分(包括其他物质、细胞或细胞群体)部分或完全分离。
如本文可互换使用的术语“造血干细胞和祖细胞”、“造血干细胞”、“造血祖细胞”或“造血前体细胞”通常是指这样的细胞，所述细胞被定型为造血谱系但能够进一步进行造血分化(例如，分化为NK细胞)，并且包括多能造血干细胞(成血细胞)、髓样祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴样祖细胞。造血干细胞和祖细胞(HSC)是多能干细胞，其产生所有血细胞类型，包括髓样细胞(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)和淋巴样谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。在一些情况下，HSC可以是CD34+造血细胞，其能够产生成熟髓样细胞和淋巴样细胞类型，包括T细胞、NK细胞和B细胞。
术语“免疫细胞”通常是指分化的造血细胞。免疫细胞的非限制性例子可以包括NK细胞、T细胞、单核细胞、先天淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。
术语“NK细胞”或“自然杀伤细胞”通常是指由CD56和/或CD16的表达和T细胞受体(CD3)的缺失所定义的外周血淋巴细胞子集。在一些情况下，表型为CD3-和CD56+的NK细胞表达NKG2C和CD57中的至少一种(例如，NKG2C、CD57、或程度相同或不同的两者)以及任选地CD16，但缺乏表达以下中的一种或多种：PLZF、SYK、FceRγ和EAT-2。在一些情况下，分离的CD56+NK细胞亚群可以展现出CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCR配体、NKp30、NKp40、NKp46、激活和抑制性KIR、NKG2A和/或DNAM-1的表达。
如本文所用，术语“核苷酸”通常是指碱基-糖-磷酸组合。核苷酸可以包括合成核苷酸。核苷酸可以包括合成核苷酸类似物。核苷酸可以是核酸序列(例如，脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))的单体单元。术语核苷酸可以包括核糖核苷三磷酸：三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸尿苷(UTP)、三磷酸胞嘧啶(CTP)、三磷酸鸟苷(GTP)，以及脱氧核糖核苷三磷酸，诸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。此类衍生物可以包括例如[αS]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP，以及核苷酸衍生物，所述核苷酸衍生物赋予含有它们的核酸分子上的核酸酶抗性。如本文所用的术语核苷酸可以是指双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。二脱氧核糖核苷三磷酸的说明性例子可以包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。核苷酸可以是未标记的或通过众所周知的技术可检测地标记的。标记也可以用量子点进行。可检测标记可以包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。核苷酸的荧光标记可以包括但不限于荧光素、5-羧基荧光素(FAM)、2'7'-二甲氧基-4'5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、罗丹明、6-羧基罗丹明(R6G)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、4-(4'二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)、Cascade蓝、俄勒冈绿、德克萨斯红、花青和5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。荧光标记的核苷酸的具体例子可以包括可从加利福尼亚州福斯特的Perkin Elmer获得的[R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G]dCTP、[TAMRA]dCTP、[JOE]ddATP、[R6G]ddATP、[FAM]ddCTP、[R110]ddCTP、[TAMRA]ddGTP、[ROX]ddTTP、[dR6G]ddATP、[dR110]ddCTP、[dTAMRA]ddGTP和[dROX]ddTTP；可从伊利诺斯州阿灵顿高地Amersham获得的FluoroLink脱氧核苷酸、FluoroLink Cy3-dCTP、FluoroLink Cy5-dCTP、FluoroLink Fluor X-dCTP、FluoroLink Cy3-dUTP和FluoroLink Cy5-dUTP；可从印第安纳州印第安纳波利斯Boehringer Mannheim获得的荧光素-15-dATP、荧光素-12-dUTP、四甲基-罗丹明-6-dUTP、IR770-9-dATP、荧光素-12-ddUTP、荧光素-12-UTP和荧光素-15-2’-dATP；以及可从美国俄勒冈州尤金Molecular Probes获得的染色体标记的核苷酸、BODIPY-FL-14-UTP、BODIPY-FL-4-UTP、BODIPY-TMR-14-UTP、BODIPY-TMR-14-dUTP、BODIPY-TR-14-UTP、BODIPY-TR-14-dUTP、Cascade蓝-7-UTP、Cascade蓝-7-dUTP、荧光素-12-UTP、荧光素-12-dUTP、俄勒冈绿488-5-dUTP、罗丹明绿-5-UTP、罗丹明绿-5-dUTP、四甲基罗丹明-6-UTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、得克萨斯红-5-UTP、得克萨斯红-5-dUTP和得克萨斯红-12-dUTP。核苷酸也可以通过化学修饰来标记或标示。经化学修饰的单核苷酸可以是生物素-dNTP。生物素化dNTP的一些非限制性例子可以包括生物素-dATP(例如，bio-N6-ddATP，生物素-14-dATP)、生物素-dCTP(例如，生物素-11-dCTP，生物素-14-dCTP)和生物素-dUTP(例如，生物素-11-dUTP、生物素-16-dUTP、生物素-20-dUTP)。
如本文可互换使用的术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”或“核酸”通常是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合物形式，呈单链、双链或多链形式。多核苷酸可以是细胞外源性或内源性的。多核苷酸可以存在于无细胞的环境中。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是DNA。多核苷酸可以是RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。多核苷酸可以包含一种或多种类似物(例如，改变的主链、糖或核碱基)。可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰(如果存在的话)。类似物的一些非限制性例子包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸(xenonucleic acid)、吗啉代(morpholinos)、锁核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、虫草素、7-脱氮-GTP、荧光团(florophore)(例如，罗丹明或与糖连接的荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化核苷酸、肌苷、硫尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷(queuosine)和丫苷(wyosine)。多核苷酸的非限制性例子包括基因或基因片段的编码或非编码区、由链分析定义的多个基因座(一个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酸酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、无细胞多核苷酸(包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA))、核酸探针和引物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。
术语“基因”通常是指核酸(例如，DNA，诸如基因组DNA和cDNA)及其相应的核苷酸序列，其参与编码RNA转录物。如本文关于基因组DNA所用，所述术语包括中间的非编码区以及调控区，并且可以包括5'端和3'端。在一些用途中，所述术语包括转录序列，包括5'和3'非翻译区(5'-UTR和3'-UTR)、外显子和内含子。在一些基因中，转录区将含有编码多肽的“开放阅读框”。在所述术语的一些用途中，“基因”仅包含编码多肽所需的编码序列(例如，“开放阅读框”或“编码区”)。在一些情况下，基因不编码多肽，例如核糖体RNA基因(rRNA)和转移RNA(tRNA)基因。在一些情况下，术语“基因”不仅包括转录序列，而且还包括非转录区，包括上游和下游调节区、增强子和启动子。基因可以指在生物体基因组中的其天然位置的“内源基因”或天然基因。基因可以指“外源基因”或非天然基因或转基因。非天然基因或转基因可以指通常不在宿主生物体中发现但通过基因转移引入宿主生物体的基因。非天然基因或转基因也可以指生物体基因组中不在其天然位置的基因。非天然基因或转基因也可以指包含突变、插入和/或缺失(例如，非天然序列)的天然存在的核酸或多肽序列。
术语“表达”通常是指多核苷酸从DNA模板转录(诸如转录成mRNA或其他RNA转录物)的一个或多个过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可统称为“基因产物”。如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中表达可以包括mRNA的剪接。关于表达，“上调”通常是指多核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)和/或多肽序列的表达水平相对于其在野生型状态下的表达水平增加，而“下调”通常是指多核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)和/或多肽序列的表达水平相对于其在野生型状态下的表达降低。
如本文中可互换使用的术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”通常是指通过一个或多个肽键连接的至少两个氨基酸残基的聚合物。此术语不表示特定长度的聚合物，也不旨在暗示或区分肽是使用重组技术、化学或酶促合成生产的，还是天然存在的。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及包含至少一个经修饰的氨基酸的聚合物。在一些情况下，聚合物可以被非氨基酸打断。所述术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，以及具有或不具有二级和/或三级结构(例如，结构域)的蛋白质。所述术语还包括氨基酸聚合物，所述氨基酸聚合物已被修饰，例如通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、氧化和任何其他操作，诸如与标记组分缀合。如本文所用，术语“一个氨基酸”和“多个氨基酸”通常是指天然和非天然氨基酸，包括但不限于经修饰的氨基酸和氨基酸类似物。经修饰的氨基酸可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸，它们已经化学修饰以包含不天然存在于氨基酸上的基团或化学部分。氨基酸类似物可以指氨基酸衍生物。术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸两者。
如本文关于多肽使用的术语“衍生物”、“变体”或“片段”通常是指与野生型多肽相关(例如，通过氨基酸序列、结构(例如，二级和/或三级)、活性(例如，酶活性)和/或功能而相关的)的多肽。与野生型多肽相比，多肽的衍生物、变体和片段可以包含一种或多种氨基酸变异(例如，突变、插入和缺失)、截短、修饰或其组合。
术语“基因编辑部分”通常是指能够编辑核酸序列(无论是对包含所述核酸序列的细胞而言是外源的还是内源的)的部分。在一些实施方案中，基因编辑部分通过编辑核酸序列来调节基因的表达。在一些情况下，基因编辑部分可以通过编辑基因组DNA序列来调节基因的表达。在一些情况下，基因编辑部分可以通过编辑mRNA模板来调节基因的表达。在一些情况下，编辑核酸序列可以改变基因表达的基础模板。可替代地或另外，基因编辑部分可以能够通过特异性地结合至与基因(或基因内的靶序列)可操作地偶联的靶序列并且调节从DNA(诸如染色体DNA或cDNA)产生mRNA来调节基因的表达或活性。在一些情况下，基因编辑部分可以募集或包含至少一种与特定DNA序列结合的转录因子，从而控制遗传信息从DNA到mRNA的转录速率。基因编辑部分本身可以与DNA结合并且通过物理阻碍来调节转录，例如阻止蛋白质(诸如RNA聚合酶和其他相关蛋白质)在DNA模板上组装。基因编辑部分可以在翻译水平上调节基因的表达，例如通过调节从mRNA模板产生蛋白质。在一些情况下，基因编辑部分可以通过影响mRNA转录物的稳定性来调节基因表达。
术语“嵌合多肽受体”通常是指包含一个或多个抗原结合部分的非天然多肽受体，每个抗原结合部分能够与特定抗原结合。嵌合多肽受体可以是单特异性的(即，能够与一种类型的特定抗原结合)。可替代地，嵌合多肽受体可以是多特异性的(即，能够与两种或更多种不同类型的特定抗原结合)。嵌合多肽受体可以是单价的(即，包含单个抗原结合部分)。可替代地，嵌合多肽受体可以是多价的(即，包含多个抗原结合部分)。在一些情况下，嵌合多肽受体可以包含T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)或嵌合抗原受体(CAR)。
术语“抗体”通常是指具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子。术语抗体包括抗体(例如，单克隆抗体和多克隆抗体)以及其衍生物、变体和片段。抗体包括但不限于不同类别的免疫球蛋白(Ig)(即，IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和子类的免疫球蛋白(诸如IgG1、IgG2等)。其衍生物、变体或片段可以是指保留相应抗体的结合特异性(例如，完全和/或部分)的功能衍生物或片段。抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、微抗体(minibody)、双抗体和单结构域抗体(“sdAb”或“纳米抗体”或“骆驼科动物”)。术语抗体包括已被优化、工程化或化学缀合的抗体和抗体的抗原结合片段。已优化的抗体的例子包括亲和成熟抗体。已经工程化的抗体的例子包括Fc优化抗体(例如，在片段可结晶区中优化的抗体)和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
术语“抗原结合结构域”通常是指展现出与特定靶抗原优先结合的构建体。抗原结合结构域可以是多肽构建体，诸如抗体、其修饰、其片段或其组合。抗原结合结构域可以是如本文公开的任何抗体或其功能变体。抗原结合结构域的非限制性例子可以包括鼠抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼Ig、仅鲨鱼重链抗体(VNAR)、Ig NAR、嵌合抗体、重组抗体或其抗体片段。抗体片段的非限制性例子包括Fab、Fab'、F(ab)'2、F(ab)'3、Fv、单链抗原结合片段(scFv)、(scFv)2、二硫键稳定的Fv(dsFv)、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、单结构域抗原结合片段(sdAb、纳米抗体)、重组仅重链抗体(VHH)和其他维持整个抗体的结合特异性的抗体片段。“抗原结合结构域”也可以指特异性结合靶标的非抗体分子，例如DARPin、结合受体的配体、结合配体的受体等。
术语“增强的表达”、“增加的表达”或“上调的表达”通常是指目的部分(例如，多核苷酸或多肽)的产生水平高于宿主株(例如，宿主细胞)中目的部分的正常表达水平。正常表达水平可以基本为零(或空)或高于零。目的部分可以包含宿主株的内源基因或多肽构建体。目的部分可以包含被引入宿主株到或到宿主株中的异源基因或多肽构建体。例如，可以将编码目的多肽的异源基因敲入(KI)到宿主株的基因组中，以增强目的多肽在宿主株中的表达。
术语“增强的活性”、“增加的活性”或“上调的活性”通常是指目的部分(例如，多核苷酸或多肽)的活性，所述目的部分被修饰至高于宿主株(例如，宿主细胞)中目的部分的正常活性水平的水平。正常活性水平可以基本为零(或空)或高于零。目的部分可以包含宿主株的多肽构建体。目的部分可以包含被引入宿主株到或到宿主株中的异源多肽构建体。例如，可以将编码目的多肽的异源基因敲入(KI)到宿主株的基因组中，以增强目的多肽在宿主株中的活性。
术语“减少的表达”、“降低的表达”或“下调的表达”通常是指目的部分(例如，多核苷酸或多肽)的产生水平低于宿主株(例如，宿主细胞)中目的部分的正常表达水平。正常表达水平高于零。目的部分可以包含宿主株的内源基因或多肽构建体。在一些情况下，可以在宿主株中敲除或敲低目的部分。在一些例子中，目的部分的降低的表达可以包括在宿主株中此类表达的完全抑制。
术语“减少的活性”、“降低的活性”或“下调的活性”通常是指目的部分(例如，多核苷酸或多肽)的活性，所述目的部分被修饰至低于宿主株(例如，宿主细胞)中目的部分的正常活性水平的水平。正常活性水平高于零。目的部分可以包含宿主株的内源基因或多肽构建体。在一些情况下，可以在宿主株中敲除或敲低目的部分。在一些例子中，目的部分的降低的活性可以包括在宿主株中此类活性的完全抑制。
如本文可互换使用的，术语“受试者”、“个体”或“患者”通常是指脊椎动物，优选哺乳动物，诸如人。哺乳动物包括但不限于鼠、猿、人、农场动物、竞技动物和宠物。还包括在体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。
术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”通常是指用于获得有益或所希望的结果的方法，所述结果包括但不限于治疗益处和/或预防益处。例如，治疗可以包括施用本文公开的系统或细胞群体。治疗益处意指治疗中的一种或多种疾病、病症或症状的任何治疗相关改善或对其的影响。为了预防益处，可以将组合物施用于处于发展特定疾病、病症或症状的风险的受试者或者施用于报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即使所述疾病、病症或症状可能尚未显现。
术语“有效量”或“治疗有效量”通常是指足以在施用于有需要的受试者后产生所希望的活性的组合物量，所述组合物例如包含免疫细胞诸如淋巴细胞(例如，T淋巴细胞和/或NK细胞)的组合物，所述免疫细胞包含本公开的系统。在本公开文本的上下文中，术语“治疗有效的”通常是指足以延迟表现、阻止进展、缓解或减轻通过本公开文本方法治疗的障碍的至少一种症状的组合物量。
I.概述
基因编辑技术有潜力革命性地改变现代医学，例如应用于治疗癌症、遗传疾病和广泛的其他疾病。
在一些情况下，可以将核酸序列(例如，包含转基因的表达盒)引入细胞的基因组中。在这样做时，重要的是在基因组中选择位点，所述位点可能不会显著破坏可能对例如抑制肿瘤转化或其他重要细胞功能很重要的其他基因的表达。在一些情况下，选择可能允许转基因持续表达的位点可能很重要；如果沉默抑制转基因表达，则其在基因组中的存在价值很小。然而，缺少符合这些标准的已知位点。
II.安全港基因座和工程化细胞
本文提供了可以用作用于基因修饰的位点的安全港基因座。本公开文本的安全港基因座可以支持持续的转基因表达，并且沉默最小和/或对局部或全局基因表达的影响最小。本文公开的安全港基因座可以用于各种遗传和细胞工程应用。插入序列诸如包含转基因的表达盒可以引入任何希望的细胞类型中的本文公开的安全港基因座中。可以将转基因引入干细胞中，然后可以使其分化为目的谱系或特定细胞类型，例如以产生工程化免疫细胞，诸如工程化NK细胞。转基因可以引入免疫细胞，例如T细胞或NK细胞。可以将任何希望的一个或多个表达盒和一个或多个转基因引入安全港基因座中，包括例如免疫受体、细胞因子受体、嵌合融合蛋白、转录因子或具有有用应用的任何其他转基因。转基因可以与一系列调控元件有效地偶联，例如启动子，诸如诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。本文还公开了安全港基因座的遗传背景的某些特征，诸如在5'和/或3'方向上的相邻基因及其类别，以及距开放阅读框、癌症相关基因、snoRNA编码基因、miRNA编码基因和lincRNA编码基因的距离。
还公开了用于将修饰引入安全港基因座中的载体、包含所述修饰的工程化细胞群体、制备所述细胞的方法、包含所述细胞和/或载体的组合物、以及将所述细胞用于治疗应用的方法。
在一些方面，本公开文本提供了一种工程化细胞群体，所述群体中的每个工程化细胞包含插入在基因组位点中的转基因。在将转基因插入基因组位点后，所述群体的超过90％(例如，98.8％)可以维持转基因的表达持续至少约15天。可替代地或另外，在将转基因插入基因组位点后，所述群体的超过90％(例如，97.2％)可以维持转基因的表达持续至少约21天。
在一些实施方案中，群体的超过95％、超过95.1％、超过95.2％、超过95.3％、超过95.4％、超过95.5％、超过95.6％、超过95.7％、超过95.8％、超过95.9％、超过96％、超过96.1％、超过96.2％、超过96.3％、超过96.4％、超过96.5％、超过96.6％、超过96.7％、超过96.8％、超过96.9％、超过97％、超过超过97.1％、超过97.2％、超过97.3％、超过97.4％、超过97.5％、超过97.6％、超过97.7％、超过97.8％、超过97.9％、超过98％、超过98.1％、超过98.2％、超过98.3％、超过98.4％、超过98.5％、超过98.6％、超过98.7％、超过98.8％、超过98.9％、超过99％、超过99.1％、超过99.2％、超过99.3％、超过99.4％、超过99.5％、超过99.6％、超过99.7％、超过99.8％、超过99.85％、超过99.9％、超过99.95％或超过99.99％可以维持转基因的表达持续至少约15天(例如，至少约15、16、17、18、19、20或更多天)。在一些实施方案中，群体的超过95％、超过95.1％、超过95.2％、超过95.3％、超过95.4％、超过95.5％、超过95.6％、超过95.7％、超过95.8％、超过95.9％、超过96％、超过96.1％、超过96.2％、超过96.3％、超过96.4％、超过96.5％、超过96.6％、超过96.7％、超过96.8％、超过96.9％、超过97％、超过超过97.1％、超过97.2％、超过97.3％、超过97.4％、超过97.5％、超过97.6％、超过97.7％、超过97.8％、超过97.9％、超过98％、超过98.1％、超过98.2％、超过98.3％、超过98.4％、超过98.5％、超过98.6％、超过98.7％、超过98.8％、超过98.9％、超过99％、超过99.1％、超过99.2％、超过99.3％、超过99.4％、超过99.5％、超过99.6％、超过99.7％、超过99.8％、超过99.85％、超过99.9％、超过99.95％或超过99.99％可以维持转基因的表达持续至少约21天(例如，至少约21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多天)。
在一些方面，本公开文本提供了一种工程化细胞群体，所述群体中的每个工程化细胞包含插入在基因组位点中的转基因，所述基因组位点不是腺相关病毒整合位点(AAVS)，例如不是AAVS1。群体的超过50％(例如，68％)可以维持转基因的表达至少约15天。可替代地或另外，群体的超过50％(例如，65％)可以维持转基因的表达持续至少约21天。
在一些实施方案中，群体的超过50％、超过55％、超过60％、超过61％、超过62％、超过63％、超过64％、超过65％、超过66％、超过67％、超过68％、超过69％、超过70％、超过71％、超过72％、超过73％、超过74％、超过75％、超过76％、超过77％、超过78％、超过79％、超过80％、超过81％、超过82％、超过83％、超过84％、超过85％、超过86％、超过87％、超过88％、超过89％、超过90％、超过91％、超过92％、超过93％、超过94％、超过95％、超过95.5％、超过96％、超过96.5％、超过97％、超过97.5％、超过98％、超过98.5％、超过99％或超过99.5％维持转基因从基因组位点(例如，非AAVS1基因组位点)的表达持续至少约15天(例如，至少约15、16、17、18、19、20或更多天)。在一些实施方案中，群体的超过20％、超过25％、超过30％、超过35％、超过40％、超过45％、超过50％、超过55％、超过60％、超过61％、超过62％、超过63％、超过64％、超过65％、超过66％、超过67％、超过68％、超过69％、超过70％、超过71％、超过72％、超过73％、超过74％、超过75％、超过76％、超过77％、超过78％、超过79％、超过80％、超过81％、超过82％、超过83％、超过84％、超过85％、超过86％、超过87％、超过88％、超过89％、超过90％、超过91％、超过92％、超过93％、超过94％、超过95％、超过95.5％、超过96％、超过96.5％、超过97％、超过97.5％、超过98％、超过98.5％、超过99％或超过99.5％维持转基因从基因组位点(例如，非AAVS1基因组位点)的表达持续至少约21天(例如，至少约21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多天)。
在一些方面，本公开文本提供了一种工程化细胞群体，所述群体中的每个工程化细胞包含插入在基因组位点中的转基因。工程化细胞可以是干细胞(例如，多能干细胞)。在群体经受向细胞谱系的分化后或在分化成特定的细胞谱系或特定的细胞类型之后，群体中至少约10％(例如，80％)的细胞可以维持转基因的表达。
在一些实施方案中，在群体经受向细胞谱系的分化后或在分化成特定的细胞谱系或特定的细胞类型之后，群体中至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95.5％、至少约96％、至少约96.5％、至少约97％、至少约97.5％、至少约98％、至少约98.5％、至少约99％、至少约99.5％或至少约99.9％的细胞可以维持转基因的表达。在一些实施方案中，所述细胞谱系包括胚状体、中胚层细胞、内胚层细胞和外胚层细胞、造血干细胞、造血细胞、免疫细胞、髓样细胞、淋巴样细胞、淋巴细胞、T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、α-βT细胞，γ-δT细胞、T调节细胞(Treg)、细胞毒性T淋巴细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Th9细胞、幼稚T细胞、记忆T细胞、效应T细胞、效应记忆T细胞(TEM)、中央记忆T细胞(TCM)、常驻记忆T细胞(TRM)、滤泡辅助T细胞(TFH)、幼稚T细胞、自然杀伤T细胞(NKT)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤细胞(NK)、固有淋巴样细胞(ILC)、ILC1细胞，ILC2细胞、ILC3细胞、淋巴样组织诱导(LTi)细胞、B细胞、B1细胞、B1a细胞、B1b细胞、B2细胞、浆细胞、B调节细胞、记忆B细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、生发中心B细胞、抗原呈递细胞(APC)、单核细胞、巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、组织相关巨噬细胞、树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其任何组合。
在一些实施方案中，群体经受分化持续至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约60或至少约70天。在一些实施方案中，群体经受分化持续至少约14天。在一些实施方案中，群体经受分化持续至少约21天。
在一些方面，本发明提供了一种工程化细胞群体，所述群体中的每个工程化细胞包括在基因组位点中的人工诱导的修饰。在一些情况下，人工诱导的修饰引起不超过约1000个(例如，不超过约100个)内源基因的表达水平不超过约500倍的变化(例如，不超过约10倍的变化)。
在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450或不超过约500倍的变化。在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约100个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450或不超过约500倍的变化。在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约55个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450或不超过约500倍的变化。
在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约40、不超过约50、不超过约55、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500、不超过约550、不超过约600、不超过约650、不超过约700、不超过约750、不超过约800、不超过约850、不超过约900、不超过约950或不超过约1000个内源基因的表达不超过约2倍的变化。在一些实施方案中，所述人工诱导的修饰引起不超过50个内源基因的表达不超过约2倍的变化。在一些实施方案中，所述人工诱导的修饰引起不超过55个内源基因的表达不超过约2倍的变化。在一些实施方案中，所述人工诱导的修饰引起不超过60个内源基因的表达不超过约2倍的变化。在一些实施方案中，所述人工诱导的修饰引起不超过70个内源基因的表达不超过约2倍的变化。在一些实施方案中，所述人工诱导的修饰引起不超过80个内源基因的表达不超过约2倍的变化。在一些实施方案中，所述人工诱导的修饰引起不超过100个内源基因的表达不超过约2倍的变化。
在一些方面，本发明提供了一种工程化细胞群体，所述群体中的每个工程化细胞包括在基因组位点中的人工诱导的修饰。在一些情况下，人工诱导的修饰引起不超过约1000个内源基因(例如，不超过约100个内源基因)的表达水平不超过约500倍的变化(例如，不超过约10倍的变化)，所述内源基因在基因组位点的至多约1000kb(例如，至多约300kb)内。
在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450或不超过约500倍的变化，所述内源基因在从基因组位点起至多约500kb、400kb、300kb、200kb、100kb、50kb、40kb、30kb、25kb、20kb、15kb、10kb或5kb。在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约5个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450或不超过约500倍的变化，所述内源基因在从基因组位点起至多约300kb。在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约5个内源基因的表达不超过约2倍的变化，所述内源基因在从基因组位点起至多约300kb。在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约3个内源基因的表达不超过约2倍的变化，所述内源基因在从基因组位点起至多约300kb。在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约2个内源基因的表达不超过约2倍的变化，所述内源基因在从基因组位点起至多约300kb。在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约1个内源基因的表达不超过约2倍的变化，所述内源基因在从基因组位点起至多约300kb。在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起任何内源基因的表达不超过约2倍的变化，所述内源基因在从基因组位点起至多约300kb。
在一些方面，本发明提供了一种工程化细胞群体，所述群体中的每个工程化细胞包括在基因组位点中的人工诱导的修饰。在5'或3'方向上最接近所述基因组位点的开放阅读框可以编码核糖体蛋白、泛素调节因子、凋亡调节因子、细胞周期进程调节因子、转录因子或含锌指蛋白。工程化细胞可以是干细胞或NK细胞。
在一些方面，本发明提供了一种工程化细胞群体，所述群体中的每个工程化细胞包括在基因组位点中的人工诱导的修饰。基因组位点可以是在以下之间的基因间区：(a)FAU与ZNHIT2；(b)RPL3与SYNGR1；(c)RPLP2与PIDD1；(d)RPS7与RNASEH1；(e)THEM4与S100A10；(f)DDIT4与ANAPC16；(g)ANXA2与FOXB1；(h)TOB2与TEF；(i)NDUFA4与PHF14；(j)DDX5与CEP95；(k)PIN4与RPS4X；(l)PLEKHG2与RPS16；(m)TRIM41与RACK1；(n)HINT1与LYRM7；(o)CFL1与MUS81；或(p)VPS13B与COX6C。基因组位点可以是选自以下的基因间区：(a)FAU与ZNHIT2；(b)RPL3与SYNGR1；(c)RPLP2与PIDD1；(d)RPS7与RNASEH1；(e)THEM4与S100A10；(f)DDIT4与ANAPC16；(g)ANXA2与FOXB1；(h)TOB2与TEF；(i)NDUFA4与PHF14；(j)DDX5与CEP95；(k)PIN4与RPS4X；(l)PLEKHG2与RPS16；(m)TRIM41与RACK1；(n)HINT1与LYRM7；(o)CFL1与MUS81；和(p)VPS13B与COX6C。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，基因组位点与可操作地偶联至一个或多个内源基因的启动子相邻，所述一个或多个内源基因包括FAU、ZNHIT2、RPL3、RPLP2、RPS7、TMEM4、S100A10、ANAPC16、DDIT4、FOXB1、ANXA2、TEF、TOB2、NDUFA4、DDX5、CEP95、PIN4、RPS4X、PLEKHG2、RPS16、TRIM41、RACK1、HINT1、CFL1、MUS81、VPS13B或COX6C。基因组位点可以与可操作地偶联至一个或多个内源基因的启动子相邻，所述一个或多个内源基因选自FAU、ZNHIT2、RPL3、RPLP2、RPS7、TMEM4、S100A10、ANAPC16、DDIT4、FOXB1、ANXA2、TEF、TOB2、NDUFA4、DDX5、CEP95、PIN4、RPS4X、PLEKHG2、RPS16、TRIM41、RACK1、HINT1、CFL1、MUS81、VPS13B和COX6C。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，基因组位点与来自人类基因组的一个或多个序列具有至少80％的序列同一性，所述序列包括(a)chr11:65,117,969-65,120,057；(b)chr22:39,319,072-39,321,167；(c)chr11:808,403-810,414；(d)chr2:3,574,031-3,576,263；(e)chr1:151,944,637-151,946,598；(f)chr10:72,259,705-72,261,554；(g)chr15:60,126,969-60,128,831；(h)chr22:41,413,106-41,414,808；(i)chr7:10,940,150-10,940,760；(j)chr17:64,506,290-64,506,960；(k)chrX:72,268,950-72,270,750；(l)chr19:39,430,700-39,431,400；(m)chr5:181,235,790-181,236,860；(n)chr5:131,165,330-131,165,510；(o)chr11:65,859,410-65,860,050；或(p)chr8:99,877,580-99,877,850。基因组位点可以与来自人类基因组的一个或多个序列具有至少80％的序列同一性，所述序列选自：例如基因组参考联盟人类构建(Genome Reference ConsortiumHuman Build)38(GRCh38/hg38)的(a)chr11:65,117,969-65,120,057；(b)chr22:39,319,072-39,321,167；(c)chr11:808,403-810,414；(d)chr2:3,574,031-3,576,263；(e)chr1:151,944,637-151,946,598；(f)chr10:72,259,705-72,261,554；(g)chr15:60,126,969-60,128,831；(h)chr22:41,413,106-41,414,808；(i)chr7:10,940,150-10,940,760；(j)chr17:64,506,290-64,506,960；(k)chrX:72,268,950-72,270,750；(l)chr19:39,430,700-39,431,400；(m)chr5:181,235,790-181,236,860；(n)chr5:131,165,330-131,165,510；(o)chr11:65,859,410-65,860,050；和(p)chr8:99,877,580-99,877,850。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，在将工程化细胞引入宿主受试者中之后，群体中超过1％、超过2％、超过3％、超过4％、超过5％、超过6％、超过7％、超过8％、超过9％、超过10％、超过15％、超过20％、超过25％、超过30％、超过35％、超过40％、超过45％、超过50％、超过55％、超过60％、超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过95％、超过95.5％、超过96％、超过96.5％、超过97％、超过97.5％、超过98％、超过98.5％、超过99％、超过99.1％、超过99.2％、超过99.3％、超过99.4％、超过99.5％、超过99.6％、超过99.7％、超过99.8％、超过99.9％或超过99.95％的细胞维持转基因的表达持续至少1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11或至少约12个月。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，在将工程化细胞引入宿主受试者中之后，群体中超过1％、超过2％、超过3％、超过4％、超过5％、超过6％、超过7％、超过8％、超过9％、超过10％、超过15％、超过20％、超过25％、超过30％、超过35％、超过40％、超过45％、超过50％、超过55％、超过60％、超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过95％、超过95.5％、超过96％、超过96.5％、超过97％、超过97.5％、超过98％、超过98.5％、超过99％、超过99.1％、超过99.2％、超过99.3％、超过99.4％、超过99.5％、超过99.6％、超过99.7％、超过99.8％、超过99.9％或超过99.95％的细胞维持转基因的表达持续至少约两个月。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，在将所述工程化细胞引入宿主受试者后，所述群体中超过80％的细胞维持所述转基因的表达持续至少约两个月。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述人工诱导的修饰包括将转基因和/或表达盒插入所述基因组位点中。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述转基因编码免疫受体。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述转基因编码抗原识别受体。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述转基因编码NK受体。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述转基因编码嵌合抗原受体(CAR)。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述转基因编码细胞因子受体。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述转基因编码细胞因子。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述转基因与组成型启动子可操作地偶联。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述转基因与诱导型启动子可操作地偶联。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述转基因与组织特异性启动子可操作地偶联。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述转基因不与组成型启动子可操作地偶联。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述转基因不与诱导型启动子可操作地偶联。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述转基因不与组织特异性启动子可操作地偶联。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述人工诱导的修饰距基因组中最近的开放阅读框至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少11kb、至少12kb、至少13kb、至少14kb或至少15kb。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述人工诱导的修饰距基因组中最近的癌症相关基因至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少11kb、至少12kb、至少13kb、至少14kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、至少35kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少75kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少110kb、至少120kb、至少130kb、至少140kb、至少150kb、至少160kb、至少170kb、至少180kb、至少190kb、至少200kb、至少210kb、至少220kb、至少230kb、至少240kb、至少250kb、至少260kb、至少270kb、至少280kb、至少290kb或至少300kb。癌症相关基因可以是，例如，以下中列出的基因：Sondka等人TheCOSMIC Cancer Gene Census:describing genetic dysfunction across all humancancers.Nature Reviews Cancer,2018,18(11):696-705；或Martínez-Jiménez等人Acompendium of mutational cancer driver genes.Nature Reviews Cancer,2020:1-18，将其各自通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，癌症相关基因是或包含A1CF、ABI1、ABL1、ABL2、ACKR3、ACSL3、ACSL6、ACVR1、ACVR2A、AFDN、AFF1、AFF3、AFF4、AKAP9、AKT1、AKT2、AKT3、ALDH2、ALK、AMER1、ANK1、APC、APOBEC3B、AR、ARAF、ARHGAP26、ARHGAP5、ARHGEF10、ARHGEF10L、ARHGEF12、ARID1A、ARID1B、ARID2、ARNT、ASPSCR1、ASXL1、ASXL2、ATF1、ATIC、ATM、ATP1A1、ATP2B3、ATR、ATRX、AXIN1、AXIN2、B2M、BAP1、BARD1、BAX、BAZ1A、BCL10、BCL11A、BCL11B、BCL2、BCL2L12、BCL3、BCL6、BCL7A、BCL9、BCL9L、BCLAF1、BCOR、BCORL1、BCR、BIRC3、BIRC6、BLM、BMP5、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD3、BRD4、BRIP1、BTG1、BTK、BUB1B、C15orf65、CACNA1D、CALR、CAMTA1、CANT1、CARD11、CARS、CASP3、CASP8、CASP9、CBFA2T3、CBFB、CBL、CBLB、CBLC、CCDC6、CCNB1IP1、CCNC、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CCR4、CCR7、CD209、CD274、CD28、CD74、CD79A、CD79B、CDC73、CDH1、CDH10、CDH11、CDH17、CDK12、CDK4、CDK6、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2C、CDX2、CEBPA、CEP89、CHCHD7、CHD2、CHD4、CHEK2、CHIC2、CHST11、CIC、CIITA、CLIP1、CLP1、CLTC、CLTCL1、CNBD1、CNBP、CNOT3、CNTNAP2、CNTRL、COL1A1、COL2A1、COL3A1、COX6C、CPEB3、CREB1、CREB3L1、CREB3L2、CREBBP、CRLF2、CRNKL1、CRTC1、CRTC3、CSF1R、CSF3R、CSMD3、CTCF、CTNNA2、CTNNB1、CTNND1、CTNND2、CUL3、CUX1、CXCR4、CYLD、CYP2C8、CYSLTR2、DAXX、DCAF12L2、DCC、DCTN1、DDB2、DDIT3、DDR2、DDX10、DDX3X、DDX5、DDX6、DEK、DGCR8、DICER1、DNAJB1、DNM2、DNMT3A、DROSHA、DUX4L1、EBF1、ECT2L、EED、EGFR、EIF1AX、EIF3E、EIF4A2、ELF3、ELF4、ELK4、ELL、ELN、EML4、EP300、EPAS1、EPHA3、EPHA7、EPS15、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERG、ESR1、ETNK1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、EZR、FAM131B、FAM135B、FAM47C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FAS、FAT1、FAT3、FAT4、FBLN2、FBXO11、FBXW7、FCGR2B、FCRL4、FEN1、FES、FEV、FGFR1、FGFR1OP、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FHIT、FIP1L1、FKBP9、FLCN、FLI1、FLNA、FLT3、FLT4、FNBP1、FOXA1、FOXL2、FOXO1、FOXO3、FOXO4、FOXP1、FOXR1、FSTL3、FUBP1、FUS、GAS7、GATA1、GATA2、GATA3、GLI1、GMPS、GNA11、GNAQ、GNAS、GOLGA5、GOPC、GPC3、GPC5、GPHN、GRIN2A、GRM3、H3F3A、H3F3B、HERPUD1、HEY1、HIF1A、HIP1、HIST1H3B、HIST1H4I、HLA-A、HLF、HMGA1、HMGA2、HMGN2P46、HNF1A、HNRNPA2B1、HOOK3、HOXA11、HOXA13、HOXA9、HOXC11、HOXC13、HOXD11、HOXD13、HRAS、HSP90AA1、HSP90AB1、ID3、IDH1、IDH2、IGF2BP2、IGH、IGK、IGL、IKBKB、IKZF1、IL2、IL21R、IL6ST、IL7R、IRF4、IRS4、ISX、ITGAV、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、JAZF1、JUN、KAT6A、KAT6B、KAT7、KCNJ5、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KDSR、KEAP1、KIAA1549、KIF5B、KIT、KLF4、KLF6、KLK2、KMT2A、KMT2C、KMT2D、KNL1、KNSTRN、KRAS、KTN1、LARP4B、LASP1、LATS1、LATS2、LCK、LCP1、LEF1、LEPROTL1、LHFPL6、LIFR、LMNA、LMO1、LMO2、LPP、LRIG3、LRP1B、LSM14A、LYL1、LZTR1、MACC1、MAF、MAFB、MALAT1、MALT1、MAML2、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MAP3K13、MAPK1、MAX、MB21D2、MDM2、MDM4、MDS2、MECOM、MED12、MEN1、MET、MGMT、MITF、MLF1、MLH1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT6、MN1、MNX1、MPL、MRTFA、MSH2、MSH6、MSI2、MSN、MTCP1、MTOR、MUC1、MUC16、MUC4、MUTYH、MYB、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYH11、MYH9、MYO5A、MYOD1、N4BP2、NAB2、NACA、NBEA、NBN、NCKIPSD、NCOA1、NCOA2、NCOA4、NCOR1、NCOR2、NDRG1、NF1、NF2、NFATC2、NFE2L2、NFIB、NFKB2、NFKBIE、NIN、NKX2-1、NONO、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NR4A3、NRAS、NRG1、NSD1、NSD2、NSD3、NT5C2、NTHL1、NTRK1、NTRK3、NUMA1、NUP214、NUP98、NUTM1、NUTM2B、NUTM2D、OLIG2、OMD、P2RY8、PABPC1、PAFAH1B2、PALB2、PATZ1、PAX3、PAX5、PAX7、PAX8、PBRM1、PBX1、PCBP1、PCM1、PDCD1LG2、PDE4DIP、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PER1、PHF6、PHOX2B、PICALM、PIK3CA、PIK3CB、PIK3R1、PIM1、PLAG1、PLCG1、PML、PMS1、PMS2、POLD1、POLE、POLG、POLQ、POT1、POU2AF1、POU5F1、PPARG、PPFIBP1、PPM1D、PPP2R1A、PPP6C、PRCC、PRDM1、PRDM16、PRDM2、PREX2、PRF1、PRKACA、PRKAR1A、PRKCB、PRPF40B、PRRX1、PSIP1、PTCH1、PTEN、PTK6、PTPN11、PTPN13、PTPN6、PTPRB、PTPRC、PTPRD、PTPRK、PTPRT、PWWP2A、QKI、RABEP1、RAC1、RAD17、RAD21、RAD51B、RAF1、RALGDS、RANBP2、RAP1GDS1、RARA、RB1、RBM10、RBM15、RECQL4、REL、RET、RFWD3、RGPD3、RGS7、RHOA、RHOH、RMI2、RNF213、RNF43、ROBO2、ROS1、RPL10、RPL22、RPL5、RPN1、RSPO2、RSPO3、RUNX1、RUNX1T1、S100A7、SALL4、SBDS、SDC4、SDHA、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、44444、44445、44448、SET、SETBP1、SETD1B、SETD2、SETDB1、SF3B1、SFPQ、SFRP4、SGK1、SH2B3、SH3GL1、SHTN1、SIRPA、SIX1、SIX2、SKI、SLC34A2、SLC45A3、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMARCD1、SMARCE1、SMC1A、SMO、SND1、SNX29、SOCS1、SOX2、SOX21、SPECC1、SPEN、SPOP、SRC、SRGAP3、SRSF2、SRSF3、SS18、SS18L1、SSX1、SSX2、SSX4、STAG1、STAG2、STAT3、STAT5B、STAT6、STIL、STK11、STRN、SUFU、SUZ12、SYK、TAF15、TAL1、TAL2、TBL1XR1、TBX3、TCEA1、TCF12、TCF3、TCF7L2、TCL1A、TEC、TENT5C、TERT、TET1、TET2、TFE3、TFEB、TFG、TFPT、TFRC、TGFBR2、THRAP3、TLX1、TLX3、TMEM127、TMPRSS2、TNC、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFRSF17、TOP1、TP53、TP63、TPM3、TPM4、TPR、TRA、TRAF7、TRB、TRD、TRIM24、TRIM27、TRIM33、TRIP11、TRRAP、TSC1、TSC2、TSHR、U2AF1、UBR5、USP44、USP6、USP8、VAV1、VHL、VTI1A、WAS、WDCP、WIF1、WNK2、WRN、WT1、WWTR1、XPA、XPC、XPO1、YWHAE、ZBTB16、ZCCHC8、ZEB1、ZFHX3、ZMYM2、ZMYM3、ZNF331、ZNF384、ZNF429、ZNF479、ZNF521、ZNRF3或ZRSR2。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述人工诱导的修饰距基因组中最近的snoRNA编码基因、miRNA编码基因或lincRNA编码基因至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少11kb、至少12kb、至少13kb、至少14kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、至少35kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少75kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少110kb、至少120kb、至少130kb、至少140kb、至少150kb、至少160kb、至少170kb、至少180kb、至少190kb、至少200kb、至少210kb、至少220kb、至少230kb、至少240kb、至少250kb、至少260kb、至少270kb、至少280kb、至少290kb或至少300kb。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述工程化细胞是干细胞(例如，分离的干细胞)。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述工程化细胞是胚胎干细胞。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述工程化细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述工程化细胞是多能干细胞。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述工程化细胞是全能干细胞。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述工程化细胞是免疫细胞。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述工程化细胞是NK细胞。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述工程化细胞是T细胞。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述工程化细胞是哺乳动物细胞。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述工程化细胞是人细胞。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码核糖体蛋白。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码泛素家族成员。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码泛素调节因子。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码含锌指蛋白。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码正调节凋亡的因子。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码负调节凋亡的因子。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码细胞周期进程调节因子。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码转录因子。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码碱性区/亮氨酸拉链(bZIP)转录因子。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码DNA损伤反应调节因子。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码泛素连接酶。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述基因组位点不是腺相关病毒整合位点(AAVS)。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述基因组位点不是AAVS1。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述基因组位点不是H11。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述基因组位点不是AAVS1或H11。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，所述基因组位点不是Rosa26、colA1、TIGRE或CCR5。
在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，群体的超过95％、超过95.1％、超过95.2％、超过95.3％、超过95.4％、超过95.5％、超过95.6％、超过95.7％、超过95.8％、超过95.9％、超过96％、超过96.1％、超过96.2％、超过96.3％、超过96.4％、超过96.5％、超过96.6％、超过96.7％、超过96.8％、超过96.9％、超过97％、超过超过97.1％、超过97.2％、超过97.3％、超过97.4％、超过97.5％、超过97.6％、超过97.7％、超过97.8％、超过97.9％、超过98％、超过98.1％、超过98.2％、超过98.3％、超过98.4％、超过98.5％、超过98.6％、超过98.7％、超过98.8％、超过98.9％、超过99％、超过99.1％、超过99.2％、超过99.3％、超过99.4％、超过99.5％、超过99.6％、超过99.7％、超过99.8％、超过99.85％、超过99.9％、超过99.55％或超过99.99％维持转基因的组成型表达持续至少约15天。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，群体的超过95％、超过95.1％、超过95.2％、超过95.3％、超过95.4％、超过95.5％、超过95.6％、超过95.7％、超过95.8％、超过95.9％、超过96％、超过96.1％、超过96.2％、超过96.3％、超过96.4％、超过96.5％、超过96.6％、超过96.7％、超过96.8％、超过96.9％、超过97％、超过超过97.1％、超过97.2％、超过97.3％、超过97.4％、超过97.5％、超过97.6％、超过97.7％、超过97.8％、超过97.9％、超过98％、超过98.1％、超过98.2％、超过98.3％、超过98.4％、超过98.5％、超过98.6％、超过98.7％、超过98.8％、超过98.9％、超过99％、超过99.1％、超过99.2％、超过99.3％、超过99.4％、超过99.5％、超过99.6％、超过99.7％、超过99.8％、超过99.85％、超过99.9％、超过99.55％或超过99.99％可以维持转基因的组成型表达持续至少约21天。在本文公开的任何一种工程化细胞群体的一些实施方案中，群体的超过98.8％维持转基因的组成型表达持续至少约15天。
在一些方面，本公开文本提供了一种用于产生本文公开的任何一种工程化细胞群体的载体。所述载体可以包含至少一个同源臂。所述同源臂的长度可以是至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950或至少1000个核苷酸。同源臂的长度可以是至少20个核苷酸。同源臂的长度可以是至少100个核苷酸。同源臂的长度可以是至少500个核苷酸。同源臂可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与在以下之间的基因间区中的相应序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.1％、至少95.2％、至少95.3％、至少95.4％、至少95.5％、至少95.6％、至少95.7％、至少95.8％、至少95.9％、至少96％、至少96.1％、至少96.2％、至少96.3％、至少96.4％、至少96.5％、至少96.6％、至少96.7％、至少96.8％、至少96.9％、至少97％、至少97.1％、至少97.2％、至少97.3％、至少97.4％、至少97.5％、至少97.6％、至少97.7％、至少97.8％、至少97.9％、至少98％、至少98.1％、至少98.2％、至少98.3％、至少98.4％、至少98.5％、至少98.6％、至少98.7％、至少98.8％、至少98.9％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.85％、至少99.9％、至少99.95％或至少99.99％的序列同一性：(a)FAU与ZNHIT2；(b)RPL3与SYNGR1；(c)RPLP2与PIDD1；(d)RPS7与RNASEH1；(e)THEM4与S100A10；(f)DDIT4与ANAPC16；(g)ANXA2与FOXB1；(h)TOB2与TEF；(i)NDUFA4与PHF14；(j)DDX5与CEP95；(k)PIN4与RPS4X；(l)PLEKHG2与RPS16；(m)TRIM41与RACK1；(n)HINT1与LYRM7；(o)CFL1与MUS81；或(p)VPS13B与COX6C。同源臂的长度可以是至少500个核苷酸。同源臂可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与在以下之间的基因间区中的相应序列具有至少90％的序列同一性：(a)FAU与ZNHIT2；(b)RPL3与SYNGR1；(c)RPLP2与PIDD1；(d)RPS7与RNASEH1；(e)THEM4与S100A10；(f)DDIT4与ANAPC16；(g)ANXA2与FOXB1；(h)TOB2与TEF；(i)NDUFA4与PHF14；(j)DDX5与CEP95；(k)PIN4与RPS4X；(l)PLEKHG2与RPS16；(m)TRIM41与RACK1；(n)HINT1与LYRM7；(o)CFL1与MUS81；或(p)VPS13B与COX6C。同源臂的长度可以是至少500个核苷酸。所述载体可以包含第二同源臂，例如具有与第一同源臂相似的长度，和/或包含与相邻于基因组中第一相应序列的第二相应序列具有高序列同一性的核苷酸序列。
在一些方面，本公开文本提供了一种制备本文公开的任何一种工程化细胞群体的方法。所述方法可以包括将人工诱导的修饰引入细胞的基因组位点中。
在一些实施方案中，所述人工诱导的修饰包括表达盒，例如用于转基因的表达。在一些实施方案中，所述人工诱导的修饰的引入包括在所述基因组位点中引入双链断裂。在一些实施方案中，所述双链断裂是由核酸酶引入的。在一些实施方案中，所述核酸酶是CRISPR相关(Cas)核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶。
在一些实施方案中，所述人工诱导的修饰的引入包括提供通过同源定向修复整合到所述基因组位点中的多核苷酸。在一些实施方案中，将通过同源定向修复整合到基因组位点中的多核苷酸存在于本文公开的载体中。
在一些实施方案中，在引入之后，在与在AAVS1基因座处插入转基因或表达盒的相应工程化细胞群体相比少至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍或至少1000倍的细胞中观察到转基因表达的沉默。可以在将人工诱导的修饰引入基因组位点中后约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20周进行确定转基因表达的沉默。在一些实施方案中，在引入后20天，在与在AAVS1基因座处插入转基因的相应工程化细胞群体相比少至少1％的细胞中观察到转基因表达的沉默。具有沉默的细胞的百分比可以通过评估至少五、至少十、至少二十、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个在AAVS1基因座处插入转基因的克隆和相似或相同数量的在所述基因组位点处插入转基因的克隆来确定。具有沉默的细胞的百分比可以通过评估至少十个在基因组位点处插入转基因的克隆和至少十个在AAVS1基因座处插入转基因的克隆来确定。
在一些实施方案中，在引入之后，转基因的表达持续与在AAVS1基因座处插入转基因的相应工程化细胞群体相比长至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。转基因表达的持续时间可以通过评估至少五、至少十、至少二十、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个在AAVS1基因座处插入转基因的克隆和相似或相同数量的在所述基因组位点处插入转基因的克隆来确定。转基因表达的持续时间可以通过评估至少十个在基因组位点处插入转基因的克隆和至少十个在AAVS1基因座处插入转基因的克隆来确定。转基因表达的持续时间可以通过确定当至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的工程化细胞不再表达转基因时的第一测量时间点来评估。转基因表达的持续时间可以通过确定当至少5％的工程化细胞不再表达转基因时的第一测量时间点来评估。转基因表达的持续时间可以通过确定当至少10％的工程化细胞不再表达转基因时的第一测量时间点来评估。转基因表达的持续时间可以通过确定当至少20％的工程化细胞不再表达转基因时的第一测量时间点来评估。
在一些方面，本公开文本提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的任何一种工程化细胞群体以及药学上可接受的赋形剂、载体、媒介物或稀释剂。
在一些方面，本公开文本提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的任何一种载体以及药学上可接受的赋形剂、载体、媒介物或稀释剂。
在一些方面，本公开文本提供了一种治疗有需要的受试者的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的任何一种工程化细胞群体。所述工程化细胞群体可以存在于本文公开的药物组合物中。
在一些方面，本公开文本提供了一种治疗有需要的受试者的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的任何一种载体。所述载体可以存在于本文公开的药物组合物中。
在一些实施方案中，所述病症是急性髓样白血病(AML)。在一些实施方案中，所述病症是多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，所述病症是骨髓增生异常综合征(MDS)。在一些实施方案中，所述病症是B细胞白血病。在一些实施方案中，所述病症是T细胞白血病。在一些实施方案中，所述病症是实体瘤。在一些实施方案中，所述病症是血液癌症。
III.安全港基因座和工程化细胞的其他方面
A.表达的稳定性
本公开文本的安全港基因座可以支持本公开文本的转基因的稳定和持续表达。如本文所证明的，其他安全港基因座易于沉默，其中至少一些克隆在一定比例的细胞中失去转基因表达，例如在培养的几次传代之后。
在转基因与组成型启动子可操作地偶联的情况下，维持表达通常可以是指维持在活细胞中可检测的表达水平。在转基因与诱导型启动子可操作地偶联的情况下，维持表达通常可以是指维持在适当刺激的情况下在活细胞中诱导可检测的表达水平的能力。在转基因与组织特异性启动子可操作地偶联的情况下，维持表达通常可以是指维持在适当的调节背景下(例如，在转录因子和/或诱导从组织特异性启动子表达的其他调节元件的存在下)在活细胞中表达可检测水平的转基因的能力。转基因的表达可以使用本公开文本的工程化细胞中的任何适当方法测量，例如qPCR、RNAseq、基因阵列、ELISA、流式细胞术、质量细胞术等。
在一些实施方案中，存在于本公开文本的安全港基因座中的转基因的表达的维持可以通过在将转基因引入基因组位点中之后约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约100、约200、约300或约365天评估本文公开的任何一种工程化细胞群体来确定。
在一些实施方案中，存在于本公开文本的安全港基因座中的转基因的表达的维持可以通过在将转基因引入基因组位点中之后至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约100、至少约200、至少约300或至少约365天评估本文公开的任何一种工程化细胞群体来确定。
在一些实施方案中，转基因表达的维持可以针对经受向细胞谱系的分化的细胞群体或在分化成特定细胞谱系或特定细胞类型之后确定。存在于本公开文本的安全港基因座中的转基因的表达的维持可以通过在诱导向细胞谱系或特定细胞类型分化之后约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约100、约200、约300或约365天评估细胞群体。
存在于本公开文本的安全港基因座中的转基因的表达的维持可以通过在诱导向细胞谱系或特定细胞类型分化之后至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约100、至少约200、至少约300或至少约365天评估细胞群体来确定。
在一些实施方案中，存在于本公开文本的安全港基因座中的转基因的表达的维持可以通过在将转基因引入基因组位点中之后约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100次传代评估本文公开的任何一种工程化细胞群体来确定。
在一些实施方案中，存在于本公开文本的安全港基因座中的转基因的表达的维持可以通过在将转基因引入基因组位点中之后至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约25、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90或至少约100次传代评估本文公开的任何一种工程化细胞群体来确定。传代可以是例如约2-4天，诸如约2、约3或约4天，或适于培养特定工程化细胞类型的任何其他时间长度。
在一些实施方案中，存在于本公开文本的安全港基因座中的转基因的表达的维持可以通过在将转基因引入基因组位点中之后至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约100、至少约200、至少约300或至少约365天评估本文公开的任何一种工程化细胞群体来确定。
在一些实施方案中，群体的超过20％、超过25％、超过30％、超过35％、超过40％、超过45％、超过50％、超过55％、超过60％、超过61％、超过62％、超过63％、超过64％、超过65％、超过66％、超过67％、超过68％、超过69％、超过70％、超过71％、超过72％、超过73％、超过74％、超过75％、超过76％、超过77％、超过78％、超过79％、超过80％、超过81％、超过82％、超过83％、超过84％、超过85％、超过86％、超过87％、超过88％、超过89％、超过90％、超过91％、超过92％、超过93％、超过94％、超过95％、超过95.1％、超过95.2％、超过95.3％、超过95.4％、超过95.5％、超过95.6％、超过95.7％、超过95.8％、超过95.9％、超过96％、超过96.1％、超过96.2％、超过96.3％、超过96.4％、超过96.5％、超过96.6％、超过96.7％、超过96.8％、超过96.9％、超过97％、超过超过97.1％、超过97.2％、超过97.3％、超过97.4％、超过97.5％、超过97.6％、超过97.7％、超过97.8％、超过97.9％、超过98％、超过98.1％、超过98.2％、超过98.3％、超过98.4％、超过98.5％、超过98.6％、超过98.7％、超过98.8％、超过98.9％、超过99％、超过99.1％、超过99.2％、超过99.3％、超过99.4％、超过99.5％、超过99.6％、超过99.7％、超过99.8％、超过99.85％、超过99.9％、超过99.95％或超过99.99％可以维持转基因的表达持续至少本文公开的时间长度(例如，约15天、约21天、约2个月、约3个月、约6个月或约一年)。
在一些实施方案中，维持本公开文本转基因表达的细胞的百分比可以展现出克隆之间的异质性。例如，在本文公开的一些实施方案中，若干克隆各自由各自包含相同基因组修饰的单细胞生长，并且一些克隆在高百分比的细胞中保留转基因的表达，而其他克隆展现出相当低的表达维持。为了解决这种异质性，在一些实施方案中评估多个克隆。例如，在一些实施方案中，可以评估至少五、至少十、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个具有相同遗传修饰的克隆。可以对结果进行平均，或者例如，可以确定将表达维持在细胞的某个阈值百分比以上的克隆的比例。相同的方法可以用于比较在安全港基因座之间的表达的维持，例如在本公开文本安全港基因座与对照安全港基因座(诸如AAVS1或H11)之间的达的维持。
在一些实施方案中，(i)从多个包含插入本公开文本基因组位点处的所述转基因的克隆表达所述转基因的细胞的百分比高于(ii)多个从包含插入AAVS1基因座处的所述转基因的克隆表达所述转基因的细胞的百分比。克隆可以在引入转基因之后在本文公开的任何合适时间段内评估，例如在将转基因引入基因组位点中之后至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约100、至少约200、至少约300或至少约365天。在一些实施方案中，(i)比(ii)高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％。
在一些实施方案中，(i)从多个包含在所述基因组位点插入的所述转基因的克隆表达所述转基因的持续时间大于(ii)从多个包含插入AAVS1基因座处的所述转基因的克隆表达所述转基因的持续时间。在一些实施方案中，(i)比(ii)大至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，(i)从多个包含在所述基因组位点插入的所述转基因的克隆表达所述转基因的平均水平高于(ii)从多个包含插入AAVS1基因座处的所述转基因的克隆表达所述转基因的平均水平。平均表达水平可以通过任何合适的技术来确定，例如，平均(average)(例如，平均(mean)、几何平均、中位)荧光强度、qPCT、RNAseq、ELISA、蛋白质印迹等。在一些实施方案中，(i)比(ii)高至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，测试预期安全港基因座支持转基因维持表达的程度有多好可以包括确定时间点，此时至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％的克隆在克隆的工程化细胞的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％中不再表达转基因。
在一些实施方案中，测试预期安全港基因座支持转基因维持表达的程度有多好可以包括确定时间点，此时至少25％的克隆在克隆的工程化细胞的至少98％中不再表达转基因。在一些实施方案中，测试预期安全港基因座支持转基因维持表达的程度有多好可以包括确定时间点，此时至少50％的克隆在克隆的工程化细胞的至少98％中不再表达转基因。在一些实施方案中，测试预期安全港基因座支持转基因维持表达的程度有多好可以包括确定时间点，此时至少75％的克隆在克隆的工程化细胞的至少98％中不再表达转基因。
在一些实施方案中，测试预期安全港基因座支持转基因维持表达的程度有多好可以包括确定时间点，此时至少25％的克隆在克隆的工程化细胞的至少95％中不再表达转基因。在一些实施方案中，测试预期安全港基因座支持转基因维持表达的程度有多好可以包括确定时间点，此时至少50％的克隆在克隆的工程化细胞的至少95％中不再表达转基因。在一些实施方案中，测试预期安全港基因座支持转基因维持表达的程度有多好可以包括确定时间点，此时至少75％的克隆在克隆的工程化细胞的至少95％中不再表达转基因。
在一些实施方案中，测试预期安全港基因座支持转基因维持表达的程度有多好可以包括确定时间点，此时至少25％的克隆在克隆的工程化细胞的至少90％中不再表达转基因。在一些实施方案中，测试预期安全港基因座支持转基因维持表达的程度有多好可以包括确定时间点，此时至少50％的克隆在克隆的工程化细胞的至少90％中不再表达转基因。在一些实施方案中，测试预期安全港基因座支持转基因维持表达的程度有多好可以包括确定时间点，此时至少75％的克隆在克隆的工程化细胞的至少90％中不再表达转基因。
在一些实施方案中，测试预期安全港基因座支持转基因维持表达的程度有多好可以包括确定时间点，此时至少25％的克隆在克隆的工程化细胞的至少80％中不再表达转基因。在一些实施方案中，测试预期安全港基因座支持转基因维持表达的程度有多好可以包括确定时间点，此时至少50％的克隆在克隆的工程化细胞的至少80％中不再表达转基因。在一些实施方案中，测试预期安全港基因座支持转基因维持表达的程度有多好可以包括确定时间点，此时至少75％的克隆在克隆的工程化细胞的至少80％中不再表达转基因。
在一些实施方案中，测试预期安全港基因座支持转基因维持表达的程度有多好可以包括在本文公开的时间段(例如，约15天、约21天、约2个月、约3个月、约6个月或约一年)之后确定在至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的工程化细胞中不再表达转基因的克隆的比例。
B.基因组位点
在一些实施方案中，本发明提供了基因组位点，所述基因组位点是安全港并且适合作为位点用于人工诱导的修饰，例如，用于表达本文公开的转基因的表达盒的插入。本文还公开了安全港基因座的遗传背景的某些特征，诸如在5'和/或3'方向上的相邻基因及其类别，以及距开放阅读框、癌症相关基因、snoRNA编码基因、miRNA编码基因和lincRNA编码基因的距离。
在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点在5'方向上最接近的开放阅读框或在3'方向上最接近的开放阅读框编码核糖体蛋白，例如，构成核糖体亚基的一部分或与核糖体亚基相互作用的蛋白或有助于核糖体生物发生的蛋白。在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点最接近的开放阅读框编码核糖体蛋白，例如，构成核糖体亚基的一部分或与核糖体亚基相互作用的蛋白或有助于核糖体生物发生的蛋白。核糖体蛋白的非限制性例子包括FAU、ZNHIT2、RPS7、RPLP2、RPL3、RPS4X、RPS16和PIN4。
在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点在5'方向上最接近的开放阅读框或在3'方向上最接近的开放阅读框编码泛素调节因子，例如泛素连接酶，或有助于单或多泛素化(例如，K48或K63泛素化)的蛋白质。在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点最接近的开放阅读框编码泛素调节因子。泛素调节因子的非限制性例子包括FAU、PIDD1、ANAPC16。
在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点在5'方向上最接近的开放阅读框或在3'方向上最接近的开放阅读框编码凋亡调节因子，例如，凋亡的阳性或阴性调节因子。在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点最接近的开放阅读框编码凋亡调节因子。凋亡调节因子的非限制性例子包括PIDD1、DDIT4和TOB2。
在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点在5'方向上最接近的开放阅读框或在3'方向上最接近的开放阅读框编码细胞周期进程调节因子，例如，促进或抑制细胞周期进程的因子。在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点最接近的开放阅读框编码细胞周期进程调节因子。细胞周期进程调节因子的非限制性例子包括DDIT4、ANAPC16、TOB2和PIN4。
在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点在5'方向上最接近的开放阅读框或在3'方向上最接近的开放阅读框编码转录因子。在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点最接近的开放阅读框编码转录因子。在一些实施方案中，所述转录因子是TEF。
在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点在5'方向上最接近的开放阅读框或在3'方向上最接近的开放阅读框编码含锌指蛋白。在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点最接近的开放阅读框编码含锌指蛋白。含锌指蛋白的非限制性例子包括ZNHIT2。
在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点在5'方向上最接近的开放阅读框或在3'方向上最接近的开放阅读框编码碱性区/亮氨酸拉链(bZIP)转录因子。在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点最接近的开放阅读框编码碱性区/亮氨酸拉链(bZIP)转录因子。TEF是碱性区/亮氨酸拉链(bZIP)转录因子的非限制性例子。
在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点在5'方向上最接近的开放阅读框或在3'方向上最接近的开放阅读框编码DNA损伤反应调节因子。在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点最接近的开放阅读框编码DNA损伤反应调节因子。DNA损伤反应调节因子的非限制性例子包括PIDD1、DDIT4和MUS81。
在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点在5'方向上最接近的开放阅读框或在3'方向上最接近的开放阅读框编码泛素连接酶。在一些实施方案中，与本文公开的任何一个基因组位点最接近的开放阅读框编码泛素连接酶。泛素连接酶的非限制性例子包括AFF4、AMFR、ANAPC11、ANAPC16、ANKIB1、APC/C、AREL1、ARIH1、ARIH2、BARD1、β-TrCP1、BFAR、BIRC2、BIRC3、BIRC7、BIRC8、BMI1、BRAP、BRCA1、c-IAP1CBL、CBLB、CBLC、CBLL1、CCDC36、CCNB1IP1、Cereblon(CRBN)、CGRRF1、CHFR、CHIP、CNOT4、CUL9、CYHR1、DCST1、DTX1、DTX2、DTX3、DTX3L、DTX4、DZIP3、E4F1、E6AP、FANCL、G2E3、gp78、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HECTD4、HECW1、HECW2、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HERC5、HERC6、HLTF、HOIL-IL、HOIP、HUL5、HUWE1、IAP、IRF2BP1、IRF2BP2、IRF2BPL、Itch、KCMF1、KMT2C、KMT2D、LNX1、LNX2、LONRF1、LONRF2、LONRF3、LRSAM1、LTN1、LUBAC、MAEA、MAP3K1、MARCH1、MARCH10、MARCH11、MARCH2、MARCH3、MARCH4、MARCH5、MARCH6、MARCH7、MARCH8、MARCH9、Mdm2、MDM4、MECOM、MEX3A、MEX3B、MEX3C、MEX3D、MGRN1、MIB1、MIB2、MID1、MID2、MKRN1、MKRN2、MKRN3、MKRN4P、MNAT1、MSL2、MUL1、MYCBP2、MYLIP、NEDD4、NEDD4L、NEURL1、NEURL1B、NEURL3、NFX1、NFXL1、NHLRC1、NOSIP、NSMCE1、Parkin、PARK2、PCGF1、PCGF2、PCGF3、PCGF5、PCGF6、PDZRN3、PDZRN4、PELI1、PELI2、PELI3、PEX10、PEX12、PEX2、PHF7、PHRF1、PJA1、PJA2、PLAG1、PLAGL1、PML、PPIL2、PRPF19、pVHL、RAD18、RAG1、RAPSN、RBBP6、RBCK1、RBX1、RC3H1、RC3H2、RCHY1、RFFL、RFPL1、RFPL2、RFPL3、RFPL4A、RFPL4AL1、RFPL4B、RFWD2、RFWD3、RING1、RLF、RLIM、RMND5A、RMND5B、RNF10、RNF103、RNF11、RNF111、RNF112、RNF113A、RNF113B、RNF114、RNF115、RNF121、RNF122、RNF123、RNF125、RNF126、RNF128、RNF13、RNF130、RNF133、RNF135、RNF138、RNF139、RNF14、RNF141、RNF144A、RNF144B、RNF145、RNF146、RNF148、RNF149、RNF150、RNF151、RNF152、RNF157、RNF165、RNF166、RNF167、RNF168、RNF169、RNF17、RNF170、RNF175、RNF180、RNF181、RNF182、RNF183、RNF185、RNF186、RNF187、RNF19A、RNF19B、RNF2、RNF20、RNF207、RNF208、RNF212、RNF212B、RNF213、RNF214、RNF215、RNF216、RNF217、RNF219、RNF220、RNF222、RNF223、RNF224、RNF225、RNF24、RNF25、RNF26、RNF31、RNF32、RNF34、RNF38、RNF39、RNF4、RNF40、RNF41、RNF43、RNF44、RNF5、RNF6、RNF7、RNF8、RNFT1、RNFT2、Rsp5、RSPRY1、San1、SCAF11、SCF、SHARPIN、SH3RF1、SH3RF2、SH3RF3、SHPRH、SIAH1、SIAH2、SIAH3、SMURF1、SMURF2、STUB1、SYVN1、TMEM129、Topors、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRAF7、TRAIP、TRIM10、TRIM11、TRIM13、TRIM15、TRIM17、TRIM2、TRIM21、TRIM22、TRIM23、TRIM24、TRIM25、TRIM26、TRIM27、TRIM28、TRIM3、TRIM31、TRIM32、TRIM33、TRIM34、TRIM35、TRIM36、TRIM37、TRIM38、TRIM39、TRIM4、TRIM40、TRIM41、TRIM42、TRIM43、TRIM43B、TRIM45、TRIM46、TRIM47、TRIM48、TRIM49、TRIM49B、TRIM49C、TRIM49D1、TRIM5、TRIM50、TRIM51、TRIM52、TRIM54、TRIM55、TRIM56、TRIM58、TRIM59、TRIM6、TRIM60、TRIM61、TRIM62、TRIM63、TRIM64、TRIM64B、TRIM64C、TRIM65、TRIM67、TRIM68、TRIM69、TRIM7、TRIM71、TRIM72、TRIM73、TRIM74、TRIM75P、TRIM77、TRIM8、TRIM9、TRIML1、TRIML2、TRIP12、TTC3、UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE3D、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR1、UBR2、UBR3、UBR4、UBR5、UBR7、UHRF1、UHRF2、UNK、UNKL、VHL、VPS11、VPS18、VPS41、VPS8、WDR59、WDSUB1、WWP1、WWP2、XIAP、ZBTB12、ZFP91、ZFPL1、ZNF280A、ZNF341、ZNF511、ZNF521、ZNF598、ZNF645、ZNRF1、ZNRF2、ZNRF3、ZNRF4、Zswim2和ZXDC(它们也是泛素调节因子)。在一些实施方案中，泛素连接酶是ANAPC16。
在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至FAU的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至ZNHIT2的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至RPL3的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至RPLP2的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至RPS7的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至TMEM4的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至S100A10的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至ANAPC16的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至DDIT4的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至FOXB1的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至ANXA2的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至TEF的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至TOB2的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至NDUFA4的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至DDX5的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至CEP95的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至PIN4的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至RPS4X的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至PLEKHG2的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至RPS16的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至TRIM41的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至RACK1的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至HINT1的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至CFL1的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至MUS81的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至VPS13B的启动子相邻。在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与可操作地偶联至和COX6C的启动子相邻。
在一些实施方案中，所述基因组位点是或在FAU与ZNHIT2之间的基因间区内。在一些实施方案中，所述基因组位点是或在RPL3与SYNGR1之间的基因间区内。在一些实施方案中，所述基因组位点是或在RPLP2与PIDD1之间的基因间区内。在一些实施方案中，所述基因组位点是或在RPS7与RNASEH1之间的基因间区内。在一些实施方案中，所述基因组位点是或在THEM4与S100A10之间的基因间区内。在一些实施方案中，所述基因组位点是或在DDIT4与ANAPC16之间的基因间区内。在一些实施方案中，所述基因组位点是或在ANXA2与FOXB1之间的基因间区内。在一些实施方案中，所述基因组位点是或在TOB2与TEF之间的基因间区内。在一些实施方案中，所述基因组位点是或在NDUFA4与PHF14之间的基因间区内。在一些实施方案中，所述基因组位点是或在DDX5与CEP95之间的基因间区内。在一些实施方案中，所述基因组位点是或在PIN4与RPS4X之间的基因间区内。在一些实施方案中，所述基因组位点是或在PLEKHG2与RPS16之间的基因间区内。在一些实施方案中，所述基因组位点是或在TRIM41与RACK1之间的基因间区内。在一些实施方案中，所述基因组位点是或在HINT1与LYRM7之间的基因间区内。在一些实施方案中，所述基因组位点是或在CFL1与MUS81之间的基因间区内。在一些实施方案中，所述基因组位点是或在VPS13B与COX6C之间的基因间区内。
在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点与选自以下的人类基因组的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.1％、至少95.2％、至少95.3％、至少95.4％、至少95.5％、至少95.6％、至少95.7％、至少95.8％、至少95.9％、至少96％、至少96.1％、至少96.2％、至少96.3％、至少96.4％、至少96.5％、至少96.6％、至少96.7％、至少96.8％、至少96.9％、至少97％、至少97.1％、至少97.2％、至少97.3％、至少97.4％、至少97.5％、至少97.6％、至少97.7％、至少97.8％、至少97.9％、至少98％、至少98.1％、至少98.2％、至少98.3％、至少98.4％、至少98.5％、至少98.6％、至少98.7％、至少98.8％、至少98.9％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.85％、至少99.9％、至少99.95％或至少99.99％的序列同一性：例如基因组参考联盟人类构建38(GRCh38/hg38)的(a)chr11:65,117,969-65,120,057；(b)chr22:39,319,072-39,321,167；(c)chr11:808,403-810,414；(d)chr2:3,574,031-3,576,263；(e)chr1:151,944,637-151,946,598；(f)chr10:72,259,705-72,261,554；(g)chr15:60,126,969-60,128,831；(h)chr22:41,413,106-41,414,808；(i)chr7:10,940,150-10,940,760；(j)chr17:64,506,290-64,506,960；(k)chrX:72,268,950-72,270,750；(l)chr19:39,430,700-39,431,400；(m)chr5:181,235,790-181,236,860；(n)chr5:131,165,330-131,165,510；(o)chr11:65,859,410-65,860,050；和(p)chr8:99,877,580-99,877,850。
在一些实施方案中，本文公开的任何一个基因组位点在选自以下的人类基因组的一套坐标内：例如基因组参考联盟人类构建38(GRCh38/hg38)的(a)chr11:65,117,969-65,120,057；(b)chr22:39,319,072-39,321,167；(c)chr11:808,403-810,414；(d)chr2:3,574,031-3,576,263；(e)chr1:151,944,637-151,946,598；(f)chr10:72,259,705-72,261,554；(g)chr15:60,126,969-60,128,831；(h)chr22:41,413,106-41,414,808；(i)chr7:10,940,150-10,940,760；(j)chr17:64,506,290-64,506,960；(k)chrX:72,268,950-72,270,750；(l)chr19:39,430,700-39,431,400；(m)chr5:181,235,790-181,236,860；(n)chr5:131,165,330-131,165,510；(o)chr11:65,859,410-65,860,050；和(p)chr8:99,877,580-99,877,850。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chr11:65,117,969-65,120,057内。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chr22:39,319,072-39,321,167内。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chr11:808,403-810,414内。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chr2:3,574,031-3,576,263内。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chr1:151,944,637-151,946,598内。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chr10:72,259,705-72,261,554内。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chr15:60,126,969-60,128,831内。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chr22:41,413,106-41,414,808内。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chr7:10,940,150-10,940,760内。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chr17:64,506,290-64,506,960内。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chrX:72,268,950-72,270,750内。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chr19:39,430,700-39,431,400内。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chr5:181,235,790-181,236,860内。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chr5:131,165,330-131,165,510内。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chr11:65,859,410-65,860,050内。在一些实施方案中，基因组位点在一套坐标chr8:99,877,580-99,877,850内。
在一些实施方案中，基因组位点的特征在于选自以下的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或六个成员：(a)与基因组中最接近的开放阅读框的距离；(b)与基因组中最接近的癌症相关基因的距离；(c)与基因组中最接近的snoRNA编码基因、miRNA编码基因或lincRNA编码基因的距离；(d)不在基因转录单位内；(e)不在超保守区内；(f)不在VISTA增强区域内；和(g)在DNA酶超敏位点内。
在一些实施方案中，与基因组中最接近的开放阅读框的距离是距基因组中最接近的开放阅读框至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少11kb、至少12kb、至少13kb、至少14kb或至少15kb。
在一些实施方案中，与基因组中最接近的癌症相关基因的距离是距基因组中最接近的癌症相关基因至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少11kb、至少12kb、至少13kb、至少14kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、至少35kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少75kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少110kb、至少120kb、至少130kb、至少140kb、至少150kb、至少160kb、至少170kb、至少180kb、至少190kb、至少200kb、至少210kb、至少220kb、至少230kb、至少240kb、至少250kb、至少260kb、至少270kb、至少280kb、至少290kb或至少300kb。
在一些实施方案中，与基因组中最接近的snoRNA编码基因、miRNA编码基因或lincRNA编码基因的距离是距基因组中最接近的snoRNA编码基因、miRNA编码基因或lincRNA编码基因至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少11kb、至少12kb、至少13kb、至少14kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、至少35kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少75kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少110kb、至少120kb、至少130kb、至少140kb、至少150kb、至少160kb、至少170kb、至少180kb、至少190kb、至少200kb、至少210kb、至少220kb、至少230kb、至少240kb、至少250kb、至少260kb、至少270kb、至少280kb、至少290kb或至少300kb。
在一些实施方案中，基因组位点的特征在于选自以下的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或六个成员：(a)距基因组中最接近的开放阅读框至少6kb；(b)距基因组中最接近的癌症相关基因至少20kb；(c)距基因组中最接近的snoRNA编码基因、miRNA编码基因或lincRNA编码基因至少20kb；(d)不在基因转录单位内；(e)不在超保守区内；(f)不在VISTA增强区域内；和(g)在DNA酶超敏位点内。
C.脱靶效应
本公开文本的基因组位点(例如，安全港基因座)可以用作用于基因组中人工引入的修饰的位点，其中所述人工引入的修饰具有最小脱靶效应，例如，对细胞功能的最小非预期影响。所述人工诱导的修饰可以包括例如整合用于表达转基因的表达盒。
在一些实施方案中，所述人工引入的修饰对细胞功能具有最小影响，如通过功能测定所确定的。功能测定的非限制性例子包括增殖测定、分化测定、迁移测定、细胞毒性测定(例如，工程化免疫细胞杀死靶细胞的能力)、评估响应于刺激物(例如，病原体相关分子模式)的细胞因子产生的测定、分化测定(例如，将干细胞或前体细胞分化为特定谱系或者定型的或最终分化的细胞类型的能力)和评估响应于促凋亡刺激物的反应的测定。
在一些实施方案中，所述人工引入的修饰对全局基因表达具有最小影响，例如，如通过RNA seq或基因阵列所确定的。
在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约10个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约50个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约100个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约200个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约300个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约500个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，人工诱导的修饰引起不超过约1000个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，所述人工诱导的修饰不会导致任何内源基因展现出至少约2、至少约2.5、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500或至少约1000倍的表达变化。
在一些实施方案中，所述人工引入的修饰对局部基因表达具有最小影响，例如，如通过RNA seq或基因阵列所确定的。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰不会导致在所述修饰的300kb以内的任何内源基因展现出至少约2、至少约2.5、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500或至少约1000倍的表达变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的300kb以内的不超过约2个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的300kb以内的不超过约3个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的300kb以内的不超过约5个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的300kb以内的不超过约10个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的300kb以内的不超过约15个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的300kb以内的不超过约20个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的300kb以内的不超过约25个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的300kb以内的不超过约50个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰不会导致在所述修饰的200kb以内的任何基因展现出至少约2、至少约2.5、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500或至少约1000倍的表达变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的200kb以内的不超过约2个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的200kb以内的不超过约3个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的200kb以内的不超过约5个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的200kb以内的不超过约10个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的200kb以内的不超过约15个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的200kb以内的不超过约20个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的200kb以内的不超过约25个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的200kb以内的不超过约50个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰不会导致在所述修饰的100kb以内的任何基因展现出至少约2、至少约2.5、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500或至少约1000倍的表达变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的100kb以内的不超过约2个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的100kb以内的不超过约3个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的100kb以内的不超过约5个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的100kb以内的不超过约10个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的100kb以内的不超过约15个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的100kb以内的不超过约20个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的100kb以内的不超过约25个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的100kb以内的不超过约50个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰不会导致在所述修饰的50kb以内的任何基因展现出至少约2、至少约2.5、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500或至少约1000倍的表达变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的50kb以内的不超过约2个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的50kb以内的不超过约3个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的50kb以内的不超过约5个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的50kb以内的不超过约10个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的50kb以内的不超过约15个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的50kb以内的不超过约20个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的50kb以内的不超过约25个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰引起在基因组位点的50kb以内的不超过约50个内源基因的表达不超过约0.25、不超过约0.5、不超过约1、不超过约1.5、不超过约2、不超过约2.5、不超过约3、不超过约4、不超过约5、不超过约6、不超过约7、不超过约8、不超过约9、不超过约10、不超过约11、不超过约12、不超过约13、不超过约14、不超过约15、不超过约20、不超过约25、不超过约30、不超过约35、不超过约40、不超过约45、不超过约50、不超过约60、不超过约70、不超过约80、不超过约90、不超过约100、不超过约150、不超过约200、不超过约250、不超过约300、不超过约350、不超过约400、不超过约450、不超过约500或不超过约1000倍的变化。
在一些情况下，表达的倍数变化是指表达的倍数增加。在一些情况下，表达的倍数变化是指表达的倍数降低。在一些情况下，表达的倍数变化包括至少所陈述量级的表达的增加和降低。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰不诱导或基本上不诱导在不存在人工诱导的修饰的相应细胞中不表达(例如，表达不高于检测限)的任何基因的表达。在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰诱导不超过2、不超过3、不超过4、不超过5、不超过6、不超过7、不超过8、不超过9、不超过10、不超过11、不超过12、不超过13、不超过14、不超过15、不超过16、不超过17、不超过18、不超过19、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过50、不超过60、不超过70、不超过80、不超过90、不超过100、不超过110、不超过120、不超过130、不超过140、不超过150、不超过160、不超过170、不超过180、不超过190、不超过200、不超过250、不超过300、不超过350、不超过400、不超过450、不超过500、不超过550、不超过600、不超过650、不超过700或不超过750个基因的表达，所述基因在不存在人工诱导的修饰的相应细胞中不表达(例如，表达不高于检测限)。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰不诱导或基本上不诱导在不存在人工诱导的修饰的相应细胞中不表达(例如，表达不超过检测限)的在基因组位点的300kb以内的任何基因的表达。在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰诱导不超过2、不超过3、不超过4、不超过5、不超过6、不超过7、不超过8、不超过9、不超过10、不超过11、不超过12、不超过13、不超过14、不超过15、不超过16、不超过17、不超过18、不超过19、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过50、不超过60、不超过70、不超过80、不超过90、不超过100、不超过110、不超过120、不超过130、不超过140、不超过150、不超过160、不超过170、不超过180、不超过190、不超过200、不超过250、不超过300、不超过350、不超过400、不超过450、不超过500、不超过550、不超过600、不超过650、不超过700或不超过750个在基因组位点的300kb以内的基因的表达，所述基因在不存在人工诱导的修饰的相应细胞中不表达(例如，表达不高于检测限)。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰不会减少或基本上不会减少或消除在不存在人工诱导的修饰的相应细胞中表达的任何基因的表达(例如，不会将表达从可检测的水平减少到低于检测限)。在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰会减少或消除不超过2、不超过3、不超过4、不超过5、不超过6、不超过7、不超过8、不超过9、不超过10、不超过11、不超过12、不超过13、不超过14、不超过15、不超过16、不超过17、不超过18、不超过19、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过50、不超过60、不超过70、不超过80、不超过90、不超过100、不超过110、不超过120、不超过130、不超过140、不超过150、不超过160、不超过170、不超过180、不超过190、不超过200、不超过250、不超过300、不超过350、不超过400、不超过450、不超过500、不超过550、不超过600、不超过650、不超过700或不超过750个在不存在人工诱导的修饰的相应细胞中表达的基因的表达(例如，不会将表达从可检测的水平减少到低于检测限)。
在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰不会减少或基本上不会减少或消除在不存在人工诱导的修饰的相应细胞中表达的在基因组位点的300kb以内的任何基因的表达(例如，不会将表达从可检测的水平减少到低于检测限)。在一些实施方案中，在基因组位点处的人工诱导的修饰会减少或消除不超过2、不超过3、不超过4、不超过5、不超过6、不超过7、不超过8、不超过9、不超过10、不超过11、不超过12、不超过13、不超过14、不超过15、不超过16、不超过17、不超过18、不超过19、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过50、不超过60、不超过70、不超过80、不超过90、不超过100、不超过110、不超过120、不超过130、不超过140、不超过150、不超过160、不超过170、不超过180、不超过190、不超过200、不超过250、不超过300、不超过350、不超过400、不超过450、不超过500、不超过550、不超过600、不超过650、不超过700或不超过750个在不存在人工诱导的修饰的相应细胞中表达的在基因组位点的300kb以内的基因的表达(例如，不会将表达从可检测的水平减少到低于检测限)。
在一些实施方案中，人工引入的修饰可以具有脱靶效应，所述脱靶效应依赖于人工引入的修饰本身而不是基因组中的位置。例如，在一些情况下，转基因的表达可以影响表达所述转基因的细胞的信号传导通路、激酶组学和/或转录组谱。在一些实施方案中，可以例如通过比较从多个整合位点(例如，其他安全港基因座)表达转基因的细胞和/或瞬时转染以表达转基因的细胞的转录谱来确定此类效应。在一些实施方案中，这样的分析可以用于区分是作为人工引入的修饰的结果(例如，表达的转基因的作用)的基因表达变化与作为使用基因组位点(例如，候选安全港基因座)作为整合位点的结果的基因表达变化。在一些实施方案中，可以将展现出依赖于转基因表达而不是基因组位点的表达变化的基因从由于在基因组位点处的人工诱导的修饰而差异化表达的基因的计数中排除。
D.人工诱导的修饰和转基因
在一些实施方案中，本公开文本提供了工程化细胞(例如，其群体)，所述工程化细胞在本文公开的基因组位点(诸如安全港位点)中包含人工诱导的修饰。人工诱导的修饰可以包括插入、缺失、取代或其组合。在一些实施方案中，人工诱导的修饰可以包括从基因组位点缺失一个或多个核苷酸。在一些实施方案中，人工诱导的修饰可以包括从基因组位点取代一个或多个核苷酸。人工诱导的修饰可以包括插入序列，例如，在人工引入修饰之前不存在于基因组位点处的核苷酸序列。在一些实施方案中，人工诱导的修饰可以包括从基因组位点缺失一个或多个核苷酸以及插入序列。人工诱导的修饰(例如，插入序列)可以包括一个或多个表达盒。表达盒可以包含例如与一种或多种调节元件(诸如启动子)可操作地偶联的一种或多种转基因。表达盒可以包括中间的非编码区以及调控区，并且可以包括5'端和3'端；转录序列，包括5'和3’非翻译区(5'-UTR和3'-UTR)、外显子和内含子、编码一个或多个多肽的“一个或多个开放阅读框”；和/或非转录区，包括上游和下游调节区、增强子和启动子。
在一些实施方案中，人工诱导的修饰(例如，插入序列)包含一个表达盒。在一些实施方案中，人工诱导的修饰(例如，插入序列)包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个表达盒。在一些实施方案中，人工诱导的修饰(例如，插入序列)包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个表达盒。
在一些实施方案中，人工诱导的修饰(例如，插入序列)包含一个转基因。在一些实施方案中，人工诱导的修饰(例如，插入序列)包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个转基因。在一些实施方案中，人工诱导的修饰(例如，插入序列)包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19个或至少20个转基因。
在一些实施方案中，表达盒包含一个转基因。在一些实施方案中，表达盒包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个转基因。在一些实施方案中，表达盒包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个转基因。
在人工诱导的修饰(例如，插入序列)包含两个或更多个转基因的情况下，所述两个或更多个转基因的表达可以由一个启动子、相同或不同启动子的多个启动子或其组合驱动。在人工诱导的修饰(例如，插入序列)包含两个或更多个转基因的情况下，所述两个或更多个转基因可以是单独的转录单位的一部分、一个转录单位(例如，具有被由如本文公开的一个或多个可切割接头或IRES隔开的单独转基因)或其组合。
在一些实施方案中，人工诱导的修饰包含插入序列，所述插入序列的长度为至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、至少1500、至少1600、至少1700、至少1800、至少1900、至少2000、至少2100、至少2200、至少2300、至少2400、至少2500、至少2600、至少2700、至少2800、至少2900、至少3000、至少3100、至少3200、至少3300、至少3400、至少3500、至少3600、至少3700、至少3800、至少3900、至少4000、至少4100、至少4200、至少4300、至少4400、至少4500、至少4600、至少4700、至少4800、至少4900、至少5000、至少5100、至少5200、至少5300、至少5400、至少5500、至少5600、至少5700、至少5800、至少5900、至少6000、至少6100、至少6200、至少6300、至少6400、至少6500、至少6600、至少6700、至少6800、至少6900、至少7000、至少7100、至少7200、至少7300、至少7400、至少7500、至少7600、至少7700、至少7800、至少7900、至少8000、至少8100、至少8200、至少8300、至少8400、至少8500、至少8600、至少8700、至少8800、至少8900、至少9000、至少9100、至少9200、至少9300、至少9400、至少9500、至少9600、至少9700、至少9800、至少9900、至少10000、至少2x 10^4、至少3x 10^4、至少4x 10^4、至少5x 10^4、至少6x 10^4、至少7x 10^4、至少8x 10^4、至少9x 10^4或至少1x10^5个核苷酸。
在一些实施方案中，人工诱导的修饰包含插入序列，所述插入序列的长度为至多500、至多550、至多600、至多650、至多700、至多750、至多800、至多850、至多900、至多950、至多1000、至多1100、至多1200、至多1300、至多1400、至多1500、至多1600、至多1700、至多1800、至多1900、至多2000、至多2100、至多2200、至多2300、至多2400、至多2500、至多2600、至多2700、至多2800、至多2900、至多3000、至多3100、至多3200、至多3300、至多3400、至多3500、至多3600、至多3700、至多3800、至多3900、至多4000、至多4100、至多4200、至多4300、至多4400、至多4500、至多4600、至多4700、至多4800、至多4900、至多5000、至多5100、至多5200、至多5300、至多5400、至多5500、至多5600、至多5700、至多5800、至多5900、至多6000、至多6100、至多6200、至多6300、至多6400、至多6500、至多6600、至多6700、至多6800、至多6900、至多7000、至多7100、至多7200、至多7300、至多7400、至多7500、至多7600、至多7700、至多7800、至多7900、至多8000、至多8100、至多8200、至多8300、至多8400、至多8500、至多8600、至多8700、至多8800、至多8900、至多9000、至多9100、至多9200、至多9300、至多9400、至多9500、至多9600、至多9700、至多9800、至多9900、至多10000、至多2x 10^4、至多3x 10^4、至多4x 10^4、至多5x 10^4、至多6x 10^4、至多7x 10^4、至多8x 10^4、至多9x 10^4或至多1x 10^5个核苷酸。
在一些实施方案中，人工诱导的修饰包含插入序列，所述插入序列的长度为约50、约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1600、约1700、约1800、约1900、约2000、约2100、约2200、约2300、约2400、约2500、约2600、约2700、约2800、约2900、约3000、约3100、约3200、约3300、约3400、约3500、约3600、约3700、约3800、约3900、约4000、约4100、约4200、约4300、约4400、约4500、约4600、约4700、约4800、约4900、约5000、约5100、约5200、约5300、约5400、约5500、约5600、约5700、约5800、约5900、约6000、约6100、约6200、约6300、约6400、约6500、约6600、约6700、约6800、约6900、约7000、约7100、约7200、约7300、约7400、约7500、约7600、约7700、约7800、约7900、约8000、约8100、约8200、约8300、约8400、约8500、约8600、约8700、约8800、约8900、约9000、约9100、约9200、约9300、约9400、约9500、约9600、约9700、约9800、约9900、约10000、约2x 10^4、约3x 10^4、约4x 10^4、约5x 10^4、约6x 10^4、约7x 10^4、约8x 10^4、约9x 10^4或约1x 10^5个核苷酸。
在一些实施方案中，在本公开文本的基因组位点处的人工诱导的修饰包括包含转基因的表达盒。转基因可以编码细胞因子。细胞因子可以被分泌。在一些实施方案中，所述细胞因子与工程化细胞的细胞表面膜结合。
在一些实施方案中，转基因编码4-1BBL、APRIL、CD153、CD154、CD178、CD70、G-CSF、GITRL、GM-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1RA、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-20、IL-23、LIF、LIGHT、LT-β、M-CSF、MSP、OSM、OX40L、SCF、TALL-1、TGF-β、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TNF-α、TNF-β、TRAIL、TRANCE或TWEAK。在一些实施方案中，本公开文本的工程化细胞包含编码细胞因子的转基因和编码所述细胞因子的受体的转基因。此类工程化细胞(例如，工程化NK细胞)可以展现出由细胞因子和/或受体诱导(例如，由细胞因子和/或受体诸如IL-15/IL-15R诱导)的信号传导通路的增强。
在一些实施方案中，转基因编码趋化因子。例如，转基因可以编码ACT-2、AMAC-a、ATAC、ATAC、BLC、CCL1、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CKb-6、CKb-8、CTACK、CX3CL1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、DC-CK1、ELC、ENA-78、嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、嗜酸性粒细胞趋化因子-3、Eskine、exodus-1、exodus-2、exodus-3、fractalkine、GCP-2、GROa、GROb、GROg、HCC-1、HCC-2、HCC-4、I-309、IL-8、ILC、IP-10-、I-TAC-、LAG-1、LARC、LCC-1、LD78α、LEC、Lkn-1、LMC、淋巴细胞趋化因子、淋巴细胞趋化因子b、MCAF、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC、MDNCF、MGSA-a、MGSA-b、MGSA-g、Mig、MIP-1d、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2a、MIP-2b、MIP-3、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、MIP-4a、MIP-5、MPIF-1、MPIF-2、NAF、NAP-1、NAP-2、制瘤素、PARC、PF4、PPBP、RANTES、SCM-1a、SCM-1b、SDF-1α/β-、SLC、STCP-1、TARC、TECK、XCL1或XCL2。
在一些实施方案中，转基因编码受体，例如，本文公开的细胞因子或趋化因子的相应受体(例如，IL-15R)。在一些实施方案中，转基因编码常见的γ链受体、常见的β链受体、干扰素受体、TNF家族受体、TGF-B受体、Apo3、BCMA、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD120、CD120a、CD120b、CD121、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD126、CD127、CD130、CD131、CD132、CD212、CD213、CD213a1、CD213a13、CD213a2、CD25、CD27、CD30、CD4、CD40、CD95(Fas)、CDw119、CDw121b、CDw125、CDw131、CDw136、CDw137(41BB)、CDw210、CDw217、GITR、HVEM、IL-11R、IL-11Ra、IL-14R、IL-15R、IL-15Ra、IL-18R、IL-18Rα、IL-18Rβ、IL-20R、IL-20Rα、IL-20Rβ、IL-9R、LIFR、LTβR、OPG、OSMR、OX40、RANK、TACI、TGF-βR1、TGF-βR2、TGF-βR3、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3或TRAILR4。在一些实施方案中，转基因编码CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CX3CR1、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、XCR1或XCR1。
在一些实施方案中，转基因编码NK受体，例如激活性NK受体或抑制性NK受体。在一些实施方案中，转基因编码CD100(SEMA4D)、CD16(FcgRIIIA)、CD160(BY55)、CD244(2B4、SLAMF4)、CD27、CD94-NKG2C、CD94-NKG2E、CD94-NKG2H、CD96、CRTAM、DAP12、DNAM1(CD226)、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、Ly49、NCR、NKG2D(KLRK1、CD314)、NKp30(NCR3)、NKp44(NCR2)、NKp46(NCR1)、NKp80(KLRF1、CLEC5C)、NTB-A(SLAMF6)、PSGL1或SLAMF7(CRACC、CS1、CD319)。在一些实施方案中，转基因编码CD161(NKR-P1A、NK1.1)、CD94-NKG2A、CD96、CEACAM1、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KLRG1、LAIR1、LIR1(ILT2、LILRB1)、Ly49a、Ly49b、NKR-P1A(KLRB1)、SIGLEC-10、SIGLEC-11、SIGLEC-14、SIGLEC-16、SIGLEC-3(CD33)、SIGLEC-5(CD170)、SIGLEC-6(CD327)、SIGLEC-7(CD328)、SIGLEC-8、SIGLEC-9(CD329)、SIGLEC-E、SIGLEC-F、SIGLEC-G、SIGLEC-H或TIGIT。
在一些实施方案中，转基因编码免疫共受体，例如激活性或抑制性免疫共受体。
在一些实施方案中，转基因编码2B4、B7-1、BTLA、CD160、CTLA-4、DR6、Fas、LAG3、LAIR1、Ly108、PD-1、PD-L1、PD1H、TIGIT、TIM1、TIM2或TIM3。在一些实施方案中，转基因编码4-1BB、CD2、CD4、CD8、CD21、CD27、CD28、CD30、CD40、CD84、CD226、CD355、CRACC、DcR3、DR3、GITR、HVEM、ICOS、Ly9、Ly108、LIGHT、LTβR、OX40、SLAM、TIM1或TIM2。
在一些实施方案中，转基因编码转录因子，例如，在免疫细胞亚群中具有活性的转录因子，或指导干细胞分化成细胞谱系或特定细胞类型或指导未成熟的免疫细胞分化为所希望的免疫细胞亚群或成熟的免疫细胞的转录因子。可由本公开文本的转基因编码的转录因子的非限制性例子包括AP-1、Bcl6、E2A、EBF、Eomes、FoxP3、GATA3、Id2、Ikaros、IRF、IRF1、IRF2、IRF3、IRF3、IRF7、NFAT、NFkB、Pax5、PLZF、PU.1、ROR-γ-T、STAT、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT5A、STAT5B、STAT6、T-bet、TCF7和ThPOK。
在一些实施方案中，转基因编码CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD45RA、CD45RB、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L(L-选择素)、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD71、CD79(例如，CD79a、CD79b)、CD90、CD95(Fas)、CD103、CD104、CD125(IL5RA)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD152(CTLA-4)、CD221、CD274、CD279(PD-1)、CD319(SLAMF7)或CD326(EpCAM)。
转基因可以编码CD16变体，例如，用于与对照细胞相比增强的CD16信号传导。转基因可以编码CD137、CD80、CD86或DAP10(例如，带有或不带有点突变)。转基因可以编码CD3、CD4、CD80、41BBL或CD131。
转基因可以编码嵌合多肽受体，例如，包含能够与抗原结合的抗原结合部分的抗原识别受体，如本公开中所提供的。在一些例子中，工程化细胞可以包含多种不同的嵌合多肽受体以特异性地结合多种不同的抗原，其中的一种或多种可以插入本公开文本的遗传位点(例如，安全港基因座)中。在一些例子中，嵌合多肽受体可以包含多个抗原结合部分以特异性结合多种不同的抗原。
嵌合多肽受体可以包含T细胞受体融合蛋白(TFP)。术语“T细胞受体融合蛋白”或“TFP”通常是指重组多肽构建体，所述重组多肽构建体包含(i)一个或多个抗原结合部分(例如，单特异性或多特异性)，(ii)TCR胞外结构域的至少一部分，(iii)TCR跨膜结构域的至少一部分，和(iv)TCR胞内结构域的至少一部分。
嵌合多肽受体可以包含嵌合抗原受体(CAR)。术语“嵌合抗原受体”或“CAR”通常是指重组多肽构建体，所述重组多肽构建体至少包含胞外抗原结合部分(例如，抗原结合结构域)、跨膜结构域、和胞质信号传导结构域(在本文中也称为“信号传导结构域”、“胞内信号传导结构域”或“内在信号传导结构域”)，其包含源自刺激分子的功能信号传导结构域。在一些情况下，刺激分子可以是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一些情况下，所述胞内信号传导结构域进一步包含一个或多个共刺激结构域，例如，源自至少一种共刺激分子或受体的功能信号传导结构域。在一些情况下，共刺激分子可以包含4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28。在一方面，CAR包含在CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)处的任选前导序列。在一方面，CAR进一步包含在胞外抗原识别结构域的N-末端处的前导序列，其中前导序列任选地在CAR的细胞加工和定位到细胞膜期间从抗原识别结构域(例如，scFv)切割。
CAR可以是第一代、第二代、第三代或第四代CAR系统、其功能变体或其任何组合。第一代CARs(例如，CD19R或CD19CAR)包括对特定抗原具有特异性的抗原结合结构域(例如，抗体或其抗原结合片段，诸如scFv、Fab片段、VHH结构域或仅重链抗体的VH结构域)、源自适应性免疫受体的跨膜结构域(例如，来自CD28受体的跨膜结构域)和源自适应性免疫受体的信号传导结构域(例如，源于CD3ζ受体或FcεRIγ的胞内区域的一个或多个(例如，三个)ITAM结构域)。第二代CAR通过向CAR的胞内信号传导结构域部分添加共刺激结构域(例如，源自与T细胞受体一起作用的共刺激受体，诸如CD28、CD137/4-1BB和CD134/OX40)来修饰第一代CAR，这消除了与第一代CAR一起施用辅因子(例如，IL-2)的需要。第三代CAR向CAR的胞内信号传导结构域部分添加多个共刺激结构域(例如，CD3ζ-CD28-OX40或CD3ζ-CD28-41BB)。第四代CAR通过向CAR的胞内信号传导部分(例如，在一个或多个共刺激结构域与CD3ζITAM结构域之间的激活性细胞因子受体的信号传导结构域)添加激活性细胞因子(例如，IL-12、IL-23或IL-27)或受CAR诱导的启动子(例如，NFAT/IL-2最小启动子)的控制来修饰第二代或第三代CAR。在一些情况下，CAR可以是不同于如本文公开的第一代、第二代、第三代或第四代CAR系统的新一代CAR系统。
如本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)中的CAR的铰链结构域(例如，胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间的接头)可以包含CD3D、CD3E、CD3G、CD3c CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体多肽的天然或经修饰的跨膜区的全长或至少一部分。
如本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)中的CAR的跨膜结构域可以包含CD3D、CD3E、CD3G、CD3c CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或T细胞受体多肽的天然或经修饰的跨膜区的全长或至少一部分。
如本文公开的CAR的铰链结构域和跨膜结构域(例如，对于工程化免疫细胞，诸如工程化NK细胞)可以源自相同的蛋白质(例如，CD8)。可替代地，如本文公开的CAR的铰链结构域和跨膜结构域可以源自不同的蛋白质。
CAR的信号传导结构域可以包括至少或最多约1个信号传导结构域、至少或最多约2个信号传导结构域、至少或最多约3个信号传导结构域、至少或最多约4个信号传导结构域、至少或最多约5个信号传导结构域、至少或最多约6个信号传导结构域、至少或最多约7个信号传导结构域、至少或最多约8个信号传导结构域、至少或最多约9个信号传导结构域或至少或最多约10个信号传导结构域。
如本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)中的CAR的信号传导结构域(例如，胞内信号传导结构域、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域的信号肽)可以包含CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D或其任何组合的多肽的全长或至少一部分。
可替代地或另外，CAR信号传导结构域(例如，胞内信号传导结构域或共刺激结构域)可以包含CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D或其任何组合的多肽的全长或至少一部分。
在一些实施方案中，CAR包含至少一个CD8跨膜结构域和以下中的一个或多个：(i)2B4信号传导结构域，和(ii)DAP10信号传导结构域。
在一些实施方案中，嵌合多肽受体(例如，TFP或CAR)至少包含(i)CD8跨膜结构域，(ii)2B4信号传导结构域，和(iii)DAP10信号传导结构域。2B4信号传导结构域的侧翼可以是CD8跨膜结构域和DAP10信号传导结构域。可替代地，DAP10信号传导结构域的侧翼可以是CD8跨膜结构域和2B4信号传导结构域。在一些情况下，如本文公开的嵌合多肽受体可以进一步包含又另外的源自CD3ζ的信号传导结构域。
如本文公开的嵌合多肽受体(例如，TFP或CAR)的抗原结合部分的抗原(即，靶抗原)可以是细胞表面标记物、分泌标记物或胞内标记物。
如本文公开的嵌合多肽受体(例如，TFP或CAR)的抗原结合部分的抗原(即，靶抗原)的非限制性例子可以包括ADGRE2、碳酸酐酶IX(CA1X)、CCRI、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3ζ、CD5、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD133、CD138、CD269(BCMA)、CD S、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染细胞的抗原(例如，细胞表面抗原)、上皮糖蛋白2(EGP 2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体-a、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、gp100、人表皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、κ、Lewis A(CA19.9)、Lewis Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、MART-1、黑色素瘤抗原家族A1(MAGE-A1)、MICA/B、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、NY-ESO-2、癌胚抗原(h5T4)、PRAIVIE、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、肾母细胞瘤蛋白(WT-1)、和各种病原体抗原(例如，源自能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫或原生动物的病原体抗原)。在一些例子中，病原体抗原源自HIV、HBV、EBV、HPV、Lasse病毒、流感病毒或冠状病毒。
如本文公开的嵌合多肽受体的抗原结合部分的抗原(即，靶抗原)的其他例子可以包括1-40-β-淀粉样蛋白、4-1BB、5AC、5T4、激活素受体样激酶1、ACVR2B、腺癌抗原、AGS-22M6、甲胎蛋白、血管生成素2、血管生成素3、炭疽毒素、AOC3(VAP-1)、B7-H3、炭疽杆菌(Bacillus anthracis anthrax)、BAFF、β-淀粉样蛋白、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、C5、CA-125、家犬(Canis lupus familiaris)IL31、碳酸酐酶9(CA-IX)、心肌肌球蛋白、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子-1)、CCR4、CCR5、CD11、CD18、CD125、CD140a、CD147(basigin)、CD15、CD152、CD154(CD40L)、CD19、CD2、CD20、CD200、CD22、CD221、CD25(IL-2受体的α链)、CD27、CD274、CD28、CD3、CD3epsilon、CD30、CD33、CD37、CD38、CD4、CD40、CD40配体、CD41、CD44 v6、CD5、CD51、CD52、CD56、CD6、CD70、CD74、CD79B、CD80、CEA、CEA相关抗原、CFD、ch4D5、CLDN18.2、艰难梭菌(Clostridium difficile)、聚集因子A、CSF1R、CSF2、CTLA-4、C-X-C趋化因子受体类型4、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白B、达比加群、DLL4、DPP4、DR5、大肠杆菌(E.coli)志贺毒素类型1、大肠杆菌志贺毒素类型2、EGFL7、EGFR、内毒素、EpCAM、上皮唾蛋白(episialin)、ERBB3、大肠杆菌(Escherichia coli)、呼吸道合胞病毒的F蛋白、FAP、纤维蛋白IIβ链、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸水解酶、叶酸受体1、叶酸受体α、卷曲受体、神经节苷脂GD2、GD2、GD3神经节苷脂、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)3、GMCSF受体α链、GPNMB、生长分化因子8、GUCY2C、血凝素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎病毒、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HHGFR、组蛋白复合物、HIV-1、HLA-DR、HNGF、Hsp90、人散射因子受体激酶、人TNF、人β-淀粉样蛋白、ICAM-1(CD54)、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fc区、IGF-1受体、IGF-1、IGHE、IL17A、IL17F、IL20、IL-12、IL-13、IL-17、IL-1β、IL-22、IL-23、IL-31RA、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6受体、IL-9、ILGF2、甲型流感血凝素、甲型流感病毒血凝素、胰岛素样生长因子I受体、整合素α4β7、整合素α4、整合素α5β1、整合素α7β7、整合素αIIbβ3、整合素αvβ3、干扰素α/β受体、干扰素γ诱导蛋白、ITGA2、ITGB2(CD18)、KIR2D、Lewis-Y抗原、LFA-1(CD11a)、LINGO-1、脂磷壁酸、LOXL2、L-选择素(CD62L)、LTA、MCP-1、间皮素、MIF、MS4A1、MSLN、MUC1、粘蛋白CanAg、髓磷脂相关糖蛋白、肌肉生长抑制素、NCA-90(粒细胞抗原)、神经凋亡调节蛋白酶1、NGF、N-羟乙酰神经氨酸、NOGO-A、Notch受体、NRP1、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、OX-40、oxLDL、PCSK9、PD-1、PDCD1、PDGF-Rα、磷酸钠协同转运蛋白、磷脂酰丝氨酸、血小板衍生生长因子受体β、前列腺癌细胞、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、狂犬病病毒糖蛋白、RANKL、呼吸道合胞病毒、RHD、恒河猴因子、RON、RTN4、硬化蛋白、SDC1、选择素P、SLAMF7、SOST、鞘氨醇-1-磷酸、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、STEAP1、TAG-72、T细胞受体、TEM1、肌腱蛋白C、TFPI、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、MUC1的肿瘤特异性糖基化、肿瘤相关钙信号转导因子2、TWEAK受体、TYRP1(糖蛋白75)、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2、波形蛋白、和VWF。
如本文公开的嵌合多肽受体的抗原结合部分的抗原(即，靶抗原)的其他例子可以包括707-AP、生物素化分子、a-辅肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、脂肪分化相关蛋白(adipophilin)、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、b-连环蛋白、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-abl p210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CAG-3、CAIX、CAMEL、半胱天冬酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2 M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞粘附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、Lewis Y、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶、乳腺球蛋白-A、MART-1/Melan-A、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌浆球蛋白、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚抗原(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、生存素、生存素-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFaRII、TGFbRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体和κ-轻链。
如本文公开的嵌合多肽受体的抗原结合部分可以包括抗体、其片段或其变体。此类抗体可以是天然抗体(例如，由受试者的免疫细胞(诸如B细胞)天然分泌的)、合成抗体或经修饰的抗体。在一些情况下，如本文公开的嵌合多肽受体的抗原结合部分可以包括来自以下的抗体的抗原结合片段：20-(74)-(74)(米拉组单抗(milatuzumab)；维妥珠单抗(veltuzumab))、20-2b-2b、3F8、74-(20)-(20)(米拉组单抗；维妥珠单抗)、8H9、A33、AB-16B5、阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿比妥珠单抗、林妥珠单抗)、阿克托舒单抗(actoxumab)、阿达木单抗、ADC-1013、ADCT-301、ADCT-402、阿德木单抗(adecatumumab)、阿杜那单抗(aducanumab)、阿非莫单抗、AFM13、阿托珠单抗(afutuzumab)、AGEN1884、AGS15E、AGS-16C3F、AGS67E、培戈-阿拉赛珠单抗(alacizumab pegol)、ALD518、阿仑单抗、阿莫罗布单抗、喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)、阿麦妥单抗(amatuximab)、AMG 228、AMG820、马安那莫单抗(anatumomab mafenatox)、雷星-阿奈妥单抗(anetumab ravtansine)、阿尼鲁单抗(anifrolumab)、安芦组单抗(anrukinzumab)、APN301、APN311、阿泊珠单抗(apolizumab)、APX003/SIM-BD0801(sevacizumab)、APX005M、阿西莫单抗、ARX788、阿伐苏单抗(ascrinvacumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、ASG-15ME、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿替奴单抗(atinumab)、ATL101、atlizumab(也称为托珠单抗)、阿托木单抗(atorolimumab)、阿维单抗(avelumab)、B-701、巴匹组单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗、巴维妥昔单抗、BAY1129980、BAY1187982、贝妥莫单抗、贝戈洛单抗(begelomab)、贝利木单抗、贝那利珠单抗(benralizumab)、柏替木单抗(bertilimumab)、贝索单抗(besilesomab)、Betalutin(177Lu-tetraxetan-tetulomab)、贝伐单抗、BEVZ92(贝伐单抗生物仿制药)、贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)、BGB-A317、BHQ880、BI 836880、BI-505、比西单抗、比玛卢单抗(bimagrumab)、比美吉珠单抗(bimekizumab)、bivatuzumab mertansine、BIW-8962、博纳吐单抗、布索组单抗(blosozumab)、BMS-936559、BMS-986012、BMS-986016、BMS-986148、BMS-986178、BNC101、伯考赛珠单抗(bococizumab)、本妥昔单抗(brentuximabvedotin)、BrevaRex、布雷奴单抗(briakinumab)、布罗达单抗(brodalumab)、布洛赛珠单抗(brolucizumab)、布隆妥珠单抗(brontictuzumab)、C2-2b-2b、卡那单抗、莫坎妥珠单抗美登素(cantuzumab mertansine)、坎妥珠单抗拉坦素(cantuzumab ravtansine)、卡帕珠单抗(caplacizumab)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、卡芦单抗(carlumab)、卡妥索单抗、CBR96-阿霉素免疫缀合物、CBT124(贝伐单抗)、CC-90002、CDX-014、CDX-1401、西利珠单抗(cedelizumab)、培塞利珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15029、CGEN-15049、CGEN-15052、CGEN-15092、Ch.14.18、泊西他组单抗(citatuzumab bogatox)、西妥木单抗、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、克立昔单抗(clenoliximab)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)、CM-24、考曲妥珠单抗(codrituzumab)、雷星-考妥昔单抗(coltuximab ravtansine)、可那木单抗(conatumumab)、康赛珠单抗(concizumab)、Cotara(碘I-131美妥昔单抗(derlotuximab)生物素)、cR6261、克雷内治单抗(crenezumab)、DA-3111(曲妥单抗生物仿制药)、达西组单抗(dacetuzumab)、达克珠单抗、达罗托组单抗(dalotuzumab)、培戈-达匹利珠单抗(dapirolizumab pegol)、达雷木单抗、Daratumumab Enhanze(达雷木单抗)、Darleukin、德屈库单抗(dectrekumab)、登赛珠单抗(demcizumab)、玛汀-地宁妥珠单抗(denintuzumabmafodotin)、地诺单抗、迪妥昔珠单抗(Depatuxizumab)、玛汀-迪妥昔珠单抗(Depatuxizumab mafodotin)、美妥昔单抗生物素、地莫单抗、DI-B4、地妥昔单抗(dinutuximab)、地利伏单抗(diridavumab)、DKN-01、DMOT4039A、阿托度单抗、曲齐妥单抗(drozitumab)、DS-1123、DS-8895、杜利妥单抗(duligotumab)、度普利尤单抗(dupilumab)、德瓦鲁单抗、度司妥单抗(dusigitumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃巴单抗、依决洛单抗、依法珠单抗、依芬古单抗(efungumab)、埃迪鲁单抗(eldelumab)、依更妥单抗(elgemtumab)、埃罗妥珠单抗、艾西莫单抗(elsilimomab)、依米妥珠单抗(emactuzumab)、依玛妥珠单抗(emibetuzumab)、依那妥组单抗(enavatuzumab)、恩诺单抗(enfortumab vedotin)、培戈赖莫单抗(enlimomab pegol)、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)、依诺凯组单抗(enokizumab)、依诺苏单抗(enoticumab)、恩妥昔单抗(ensituximab)、西依匹莫单抗(epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、埃达组单抗(etaracizumab)、依曲利组单抗(etrolizumab)、依维苏单抗(evinacumab)、依沃苏单抗(evolocumab)、艾韦单抗(exbivirumab)、fanolesomab、法拉莫单抗(faralimomab)、法妥组单抗(farletuzumab)、法司努单抗(fasinumab)、FBTA05、泛维珠单抗(felvizumab)、非扎奴单抗(fezakinumab)、FF-21101、FGFR2抗体-药物缀合物、Fibromun、非拉妥组单抗(ficlatuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、非利伏单抗(firivumab)、弗兰托单抗(flanvotumab)、夫来库单抗(fletikumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、福雷芦单抗(foralumab)、福拉韦单抗(foravirumab)、FPA144、非苏木单抗(fresolimumab)、FS102、福拉奴单抗(fulranumab)、伏妥昔单抗(futuximab)、加利昔单抗(galiximab)、加尼妥单抗(ganitumab)、更汀芦单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(gavilimomab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin)、Gerilimzumab、吉伏组单抗(gevokizumab)、吉妥昔单抗(girentuximab)、格巴妥木单抗(glembatumumab vedotin)、GNR-006、GNR-011、戈利木单抗(golimumab)、gomiliximab、GSK2849330、GSK2857916、GSK3174998、GSK3359609、古塞库单抗(guselkumab)、Hu14.18K322A MAb、hu3S193、Hu8F4、HuL2G7、HuMab-5B1、伊巴组单抗(ibalizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、艾芦库单抗(icrucumab)、艾达赛珠单抗(idarucizumab)、IGN002、IGN523、伊戈伏单抗、IMAB362、IMAB362(claudiximab)、伊玛鲁单抗(imalumab)、IMC-CS4、IMC-D11、英西单抗、伊马曲单抗(imgatuzumab)、IMGN529、IMMU-102(钇Y-90依帕珠单抗(epratuzumab tetraxetan))、IMMU-114、ImmuTune IMP701拮抗剂抗体、INCAGN1876、inclacumab、INCSHR1210、雷英妥昔单抗(indatuximab ravtansine)、维汀-英度妥单抗(indusatumab vedotin)、英夫利昔单抗(infliximab)、伊诺莫单抗、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、英妥木单抗(intetumumab)、Ipafricept、IPH4102、伊匹单抗、伊妥木单抗(iratumumab)、艾萨妥昔单抗(isatuximab)、艾司妥单抗(Istiratumab)、伊利组单抗(itolizumab)、伊卡组单抗(ixekizumab)、JNJ-56022473、JNJ-61610588、凯利昔单抗(keliximab)、KTN3379、L19IL2/L19TNF、拉贝妥珠单抗(Labetuzumab)、戈维替康-拉贝妥珠单抗(Labetuzumab Govitecan)、LAG525、兰洛利珠单抗(lambrolizumab)、兰帕利珠单抗(lampalizumab)、L-DOS47、来瑞组单抗(lebrikizumab)、lemalesomab、仑兹鲁单抗(lenzilumab)、lerdelimumab、Leukotuximab、来沙木单抗(lexatumumab)、利韦单抗(libivirumab)、维汀-利法妥珠单抗(lifastuzumab vedotin)、利格利珠单抗(ligelizumab)、lilotomab satetraxetan、林妥珠单抗(lintuzumab)、利瑞鲁单抗(lirilumab)、LKZ145、洛迪赛珠单抗(lodelcizumab)、洛吉维单抗(lokivetmab)、莫星-洛沃妥珠单抗(lorvotuzumab mertansine)、卢卡木单抗(lucatumumab)、培戈-鲁利珠单抗(lulizumab pegol)、鲁昔单抗(lumiliximab)、鲁妥珠单抗(lumretuzumab)、LY3164530、马帕木单抗(mapatumumab)、玛格妥昔单抗(margetuximab)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥珠单抗(matuzumab)、玛弗利木单抗(mavrilimumab)、MB311、MCS-110、MEDI0562、MEDI-0639、MEDI0680、MEDI-3617、MEDI-551(英比利珠单抗(inebilizumab))、MEDI-565、MEDI6469、美泊利单抗(mepolizumab)、美替木单抗(metelimumab)、MGB453、MGD006/S80880、MGD007、MGD009、MGD011、米拉组单抗(milatuzumab)、米拉组单抗-SN-38、明瑞莫单抗(minretumomab)、索星-米妥昔单抗(mirvetuximab soravtansine)、米妥莫单抗(mitumomab)、MK-4166、MM-111、MM-151、MM-302、莫格利珠单抗(mogamulizumab)、MOR202、MOR208、MORAb-066、莫罗木单抗(morolimumab)、莫维组单抗(motavizumab)、帕克莫单抗(moxetumomab pasudotox)、莫罗单抗(muromonab)-CD3、他那可单抗(nacolomabtafenatox)、那美芦单抗(namilumab)、埃托-那普妥莫单抗(naptumomab estafenatox)、那呐妥单抗(narnatumab)、那他珠单抗、奈巴库单抗、耐昔妥珠单抗、奈莫利珠单抗(nemolizumab)、奈瑞莫单抗(nerelimomab)、奈伐苏单抗(nesvacumab)、尼妥珠单抗、纳武单抗、诺非妥莫单抗(nofetumomab merpentan)、NOV-10、奥托萨昔单抗(obiltoxaximab)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥瑞组单抗(ocrelizumab)、奥度莫单抗、奥法木单抗、奥拉单抗(olaratumab)、奥洛组单抗(olokizumab)、奥马珠单抗、OMP-131R10、OMP-305B83、奥那妥组单抗(onartuzumab)、昂妥昔珠单抗(ontuxizumab)、奥匹努单抗(opicinumab)、莫妥组单抗(oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗、奥替苏单抗(orticumab)、奥昔组单抗(otelixizumab)、奥乐妥珠单抗(otlertuzumab)、OX002/MEN1309、奥塞芦单抗(oxelumab)、奥扎尼珠单抗、奥利组单抗(ozoralizumab)、帕吉昔单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗、帕尼单抗、pankomab、PankoMab-GEX、帕巴库单抗(panobacumab)、帕萨妥珠单抗(parsatuzumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、帕妥昔珠单抗(pasotuxizumab)、帕替组单抗(pateclizumab)、帕曲妥单抗(patritumab)、PAT-SC1、PAT-SM6、派姆单抗、培妥莫单抗(pemtumomab)、培拉凯珠单抗(perakizumab)、帕妥珠单抗、培克珠单抗、PF-05082566(乌托鲁单抗(utomilumab))、PF-06647263、PF-06671008、PF-06801591、匹地利珠单抗(pidilizumab)、维汀-匹那妥珠单抗(pinatuzumab vedotin)、平妥莫单抗(pintumomab)、普拉鲁单抗(placulumab)、泊洛妥珠单抗(polatuzumabvedotin)、泊奈组单抗(ponezumab)、普立昔单抗、瑞托萨昔单抗(pritoxaximab)、普林木单抗(pritumumab)、PRO 140、Proxinium、PSMA ADC、奎利珠单抗(quilizumab)、雷妥莫单抗(racotumomab)、雷曲妥单抗(radretumab)、雷韦单抗(rafivirumab)、雷泮赛珠单抗(ralpancizumab)、雷莫芦单抗、兰尼单抗、雷昔库单抗(raxibacumab)、瑞法奈珠单抗(refanezumab)、瑞加韦单抗(regavirumab)、REGN1400、REGN2810/SAR439684、瑞利珠单抗(reslizumab)、RFM-203、RG7356、RG7386、RG7802、RG7813、RG7841、RG7876、RG7888、RG7986、利妥木单抗(rilotumumab)、利努苏单抗(rinucumab)、利妥昔单抗、RM-1929、RO7009789、罗妥木单抗(robatumumab)、罗来度单抗(roledumab)、罗莫单抗(romosozumab)、隆利组单抗(rontalizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、戈沙妥珠单抗(sacituzumab govitecan)、沙马组单抗(samalizumab)、SAR408701、SAR566658、西鲁库单抗(sarilumab)、SAT 012、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)、SCT200、SCT400、SEA-CD40、苏金单抗、瑟瑞妥单抗(seribantumab)、瑟托萨昔单抗(setoxaximab)、司韦单抗、SGN-CD19A、SGN-CD19B、SGN-CD33A、SGN-CD70A、SGN-LIV1A、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西法木单抗、司妥昔单抗、辛妥珠单抗(simtuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)、西鲁库单抗(sirukumab)、维汀-索非妥珠单抗(sofituzumab vedotin)、苏兰组单抗(solanezumab)、索利托单抗(solitomab)、索尼普西珠单抗(sonepcizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、司他芦单抗(stamulumab)、硫索单抗、舒维组单抗(suvizumab)、SYD985、SYM004(伏妥昔单抗(futuximab)和扎妥昔单抗(modotuximab))、Sym015、TAB08、他贝芦单抗(tabalumab)、泰坦-克利妥珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗、他利珠单抗(talizumab)、他尼珠单抗(tanezumab)、Tanibirumab、帕他莫单抗(taplitumomabpaptox)、他瑞妥单抗(tarextumab)、TB-403、替非组单抗(tefibazumab)、Teleukin、阿替莫单抗(telimomab aritox)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替奈昔单抗(teneliximab)、替利组单抗(teplizumab)、替妥木单抗(teprotumumab)、特度鲁单抗(tesidolumab)、tetulomab、TG-1303、TGN1412、钍-227-依帕珠单抗缀合物、ticilimumab、替加组单抗(tigatuzumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)、Tisotumab vedotin、TNX-650、托珠单抗、toralizumab、托萨托舒单抗(tosatoxumab)、托西莫单抗、托维妥单抗(tovetumab)、曲罗芦单抗(tralokinumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、恩美曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)、TRBS07、TRC105、曲利组单抗(tregalizumab)、曲美木单抗、曲戈卢单抗(trevogrumab)、TRPH 011、TRX518、TSR-042、TTI-200.7、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(tuvirumab)、U3-1565、U3-1784、乌妥昔单抗(ublituximab)、乌洛鲁单抗(ulocuplumab)、乌瑞芦单抗(urelumab)、乌珠单抗(urtoxazumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、他立林-伐达妥昔单抗(Vadastuximab Talirine)、维汀-万多妥珠单抗(vandortuzumab vedotin)、万替妥单抗(vantictumab)、伐努赛珠单抗(vanucizumab)、伐利昔单抗(vapaliximab)、伐立鲁单抗(varlilumab)、伐利组单抗(vatelizumab)、VB6-845、维多珠单抗、维妥组单抗(veltuzumab)、维帕莫单抗、维西库单抗(vesencumab)、维西珠单抗(visilizumab)、伏洛昔单抗(volociximab)、玛汀-沃瑟妥珠单抗(vorsetuzumabmafodotin)、伏妥莫单抗、YYB-101、扎芦木单抗(zalutumumab)、扎木单抗(zanolimumab)、扎妥昔单抗(zatuximab)、齐拉木单抗(ziralimumab)和阿佐莫单抗(zolimomab aritox)。
在一些实施方案中，如本文公开的嵌合多肽受体的抗原结合部分与抗体、其片段或其变体结合。此类抗体可以是天然抗体(例如，由受试者的免疫细胞(诸如B细胞)天然分泌的)、合成抗体或经修饰的抗体。在一些情况下，如本文公开的嵌合多肽受体的抗原结合部分可以结合来自以下的抗体(例如，其恒定结构域或Fc结构域)：20-(74)-(74)(米拉组单抗(milatuzumab)；维妥珠单抗(veltuzumab))、20-2b-2b、3F8、74-(20)-(20)(米拉组单抗；维妥珠单抗)、8H9、A33、AB-16B5、阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿比妥珠单抗、林妥珠单抗)、阿克托舒单抗(actoxumab)、阿达木单抗、ADC-1013、ADCT-301、ADCT-402、阿德木单抗(adecatumumab)、阿杜那单抗(aducanumab)、阿非莫单抗、AFM13、阿托珠单抗(afutuzumab)、AGEN1884、AGS15E、AGS-16C3F、AGS67E、培戈-阿拉赛珠单抗(alacizumabpegol)、ALD518、阿仑单抗、阿莫罗布单抗、喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)、阿麦妥单抗(amatuximab)、AMG 228、AMG 820、马安那莫单抗(anatumomab mafenatox)、雷星-阿奈妥单抗(anetumab ravtansine)、阿尼鲁单抗(anifrolumab)、安芦组单抗(anrukinzumab)、APN301、APN311、阿泊珠单抗(apolizumab)、APX003/SIM-BD0801(sevacizumab)、APX005M、阿西莫单抗、ARX788、阿伐苏单抗(ascrinvacumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、ASG-15ME、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿替奴单抗(atinumab)、ATL101、atlizumab(也称为托珠单抗)、阿托木单抗(atorolimumab)、阿维单抗(avelumab)、B-701、巴匹组单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗、巴维妥昔单抗、BAY1129980、BAY1187982、贝妥莫单抗、贝戈洛单抗(begelomab)、贝利木单抗、贝那利珠单抗(benralizumab)、柏替木单抗(bertilimumab)、贝索单抗(besilesomab)、Betalutin(177Lu-tetraxetan-tetulomab)、贝伐单抗、BEVZ92(贝伐单抗生物仿制药)、贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)、BGB-A317、BHQ880、BI 836880、BI-505、比西单抗、比玛卢单抗(bimagrumab)、比美吉珠单抗(bimekizumab)、bivatuzumab mertansine、BIW-8962、博纳吐单抗、布索组单抗(blosozumab)、BMS-936559、BMS-986012、BMS-986016、BMS-986148、BMS-986178、BNC101、伯考赛珠单抗(bococizumab)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、BrevaRex、布雷奴单抗(briakinumab)、布罗达单抗(brodalumab)、布洛赛珠单抗(brolucizumab)、布隆妥珠单抗(brontictuzumab)、C2-2b-2b、卡那单抗、莫坎妥珠单抗美登素(cantuzumab mertansine)、坎妥珠单抗拉坦素(cantuzumab ravtansine)、卡帕珠单抗(caplacizumab)、卡罗单抗喷地肽(capromabpendetide)、卡芦单抗(carlumab)、卡妥索单抗、CBR96-阿霉素免疫缀合物、CBT124(贝伐单抗)、CC-90002、CDX-014、CDX-1401、西利珠单抗(cedelizumab)、培塞利珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15029、CGEN-15049、CGEN-15052、CGEN-15092、Ch.14.18、泊西他组单抗(citatuzumab bogatox)、西妥木单抗、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、克立昔单抗(clenoliximab)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)、CM-24、考曲妥珠单抗(codrituzumab)、雷星-考妥昔单抗(coltuximab ravtansine)、可那木单抗(conatumumab)、康赛珠单抗(concizumab)、Cotara(碘I-131美妥昔单抗(derlotuximab)生物素)、cR6261、克雷内治单抗(crenezumab)、DA-3111(曲妥单抗生物仿制药)、达西组单抗(dacetuzumab)、达克珠单抗、达罗托组单抗(dalotuzumab)、培戈-达匹利珠单抗(dapirolizumab pegol)、达雷木单抗、DaratumumabEnhanze(达雷木单抗)、Darleukin、德屈库单抗(dectrekumab)、登赛珠单抗(demcizumab)、玛汀-地宁妥珠单抗(denintuzumab mafodotin)、地诺单抗、迪妥昔珠单抗(Depatuxizumab)、玛汀-迪妥昔珠单抗(Depatuxizumab mafodotin)、美妥昔单抗生物素、地莫单抗、DI-B4、地妥昔单抗(dinutuximab)、地利伏单抗(diridavumab)、DKN-01、DMOT4039A、阿托度单抗、曲齐妥单抗(drozitumab)、DS-1123、DS-8895、杜利妥单抗(duligotumab)、度普利尤单抗(dupilumab)、德瓦鲁单抗、度司妥单抗(dusigitumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃巴单抗、依决洛单抗、依法珠单抗、依芬古单抗(efungumab)、埃迪鲁单抗(eldelumab)、依更妥单抗(elgemtumab)、埃罗妥珠单抗、艾西莫单抗(elsilimomab)、依米妥珠单抗(emactuzumab)、依玛妥珠单抗(emibetuzumab)、依那妥组单抗(enavatuzumab)、恩诺单抗(enfortumab vedotin)、培戈赖莫单抗(enlimomab pegol)、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)、依诺凯组单抗(enokizumab)、依诺苏单抗(enoticumab)、恩妥昔单抗(ensituximab)、西依匹莫单抗(epitumomabcituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、埃达组单抗(etaracizumab)、依曲利组单抗(etrolizumab)、依维苏单抗(evinacumab)、依沃苏单抗(evolocumab)、艾韦单抗(exbivirumab)、fanolesomab、法拉莫单抗(faralimomab)、法妥组单抗(farletuzumab)、法司努单抗(fasinumab)、FBTA05、泛维珠单抗(felvizumab)、非扎奴单抗(fezakinumab)、FF-21101、FGFR2抗体-药物缀合物、Fibromun、非拉妥组单抗(ficlatuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、非利伏单抗(firivumab)、弗兰托单抗(flanvotumab)、夫来库单抗(fletikumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、福雷芦单抗(foralumab)、福拉韦单抗(foravirumab)、FPA144、非苏木单抗(fresolimumab)、FS102、福拉奴单抗(fulranumab)、伏妥昔单抗(futuximab)、加利昔单抗(galiximab)、加尼妥单抗(ganitumab)、更汀芦单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(gavilimomab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin)、Gerilimzumab、吉伏组单抗(gevokizumab)、吉妥昔单抗(girentuximab)、格巴妥木单抗(glembatumumab vedotin)、GNR-006、GNR-011、戈利木单抗(golimumab)、gomiliximab、GSK2849330、GSK2857916、GSK3174998、GSK3359609、古塞库单抗(guselkumab)、Hu14.18K322A MAb、hu3S193、Hu8F4、HuL2G7、HuMab-5B1、伊巴组单抗(ibalizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、艾芦库单抗(icrucumab)、艾达赛珠单抗(idarucizumab)、IGN002、IGN523、伊戈伏单抗、IMAB362、IMAB362(claudiximab)、伊玛鲁单抗(imalumab)、IMC-CS4、IMC-D11、英西单抗、伊马曲单抗(imgatuzumab)、IMGN529、IMMU-102(钇Y-90依帕珠单抗(epratuzumabtetraxetan))、IMMU-114、ImmuTune IMP701拮抗剂抗体、INCAGN1876、inclacumab、INCSHR1210、雷英妥昔单抗(indatuximab ravtansine)、维汀-英度妥单抗(indusatumabvedotin)、英夫利昔单抗(infliximab)、伊诺莫单抗、奥英妥珠单抗(inotuzumabozogamicin)、英妥木单抗(intetumumab)、Ipafricept、IPH4102、伊匹单抗、伊妥木单抗(iratumumab)、艾萨妥昔单抗(isatuximab)、艾司妥单抗(Istiratumab)、伊利组单抗(itolizumab)、伊卡组单抗(ixekizumab)、JNJ-56022473、JNJ-61610588、凯利昔单抗(keliximab)、KTN3379、L19IL2/L19TNF、拉贝妥珠单抗(Labetuzumab)、戈维替康-拉贝妥珠单抗(Labetuzumab Govitecan)、LAG525、兰洛利珠单抗(lambrolizumab)、兰帕利珠单抗(lampalizumab)、L-DOS47、来瑞组单抗(lebrikizumab)、lemalesomab、仑兹鲁单抗(lenzilumab)、lerdelimumab、Leukotuximab、来沙木单抗(lexatumumab)、利韦单抗(libivirumab)、维汀-利法妥珠单抗(lifastuzumab vedotin)、利格利珠单抗(ligelizumab)、lilotomab satetraxetan、林妥珠单抗(lintuzumab)、利瑞鲁单抗(lirilumab)、LKZ145、洛迪赛珠单抗(lodelcizumab)、洛吉维单抗(lokivetmab)、莫星-洛沃妥珠单抗(lorvotuzumab mertansine)、卢卡木单抗(lucatumumab)、培戈-鲁利珠单抗(lulizumab pegol)、鲁昔单抗(lumiliximab)、鲁妥珠单抗(lumretuzumab)、LY3164530、马帕木单抗(mapatumumab)、玛格妥昔单抗(margetuximab)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥珠单抗(matuzumab)、玛弗利木单抗(mavrilimumab)、MB311、MCS-110、MEDI0562、MEDI-0639、MEDI0680、MEDI-3617、MEDI-551(英比利珠单抗(inebilizumab))、MEDI-565、MEDI6469、美泊利单抗(mepolizumab)、美替木单抗(metelimumab)、MGB453、MGD006/S80880、MGD007、MGD009、MGD011、米拉组单抗(milatuzumab)、米拉组单抗-SN-38、明瑞莫单抗(minretumomab)、索星-米妥昔单抗(mirvetuximab soravtansine)、米妥莫单抗(mitumomab)、MK-4166、MM-111、MM-151、MM-302、莫格利珠单抗(mogamulizumab)、MOR202、MOR208、MORAb-066、莫罗木单抗(morolimumab)、莫维组单抗(motavizumab)、帕克莫单抗(moxetumomab pasudotox)、莫罗单抗(muromonab)-CD3、他那可单抗(nacolomabtafenatox)、那美芦单抗(namilumab)、埃托-那普妥莫单抗(naptumomab estafenatox)、那呐妥单抗(narnatumab)、那他珠单抗、奈巴库单抗、耐昔妥珠单抗、奈莫利珠单抗(nemolizumab)、奈瑞莫单抗(nerelimomab)、奈伐苏单抗(nesvacumab)、尼妥珠单抗、纳武单抗、诺非妥莫单抗(nofetumomab merpentan)、NOV-10、奥托萨昔单抗(obiltoxaximab)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥瑞组单抗(ocrelizumab)、奥度莫单抗、奥法木单抗、奥拉单抗(olaratumab)、奥洛组单抗(olokizumab)、奥马珠单抗、OMP-131R10、OMP-305B83、奥那妥组单抗(onartuzumab)、昂妥昔珠单抗(ontuxizumab)、奥匹努单抗(opicinumab)、莫妥组单抗(oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗、奥替苏单抗(orticumab)、奥昔组单抗(otelixizumab)、奥乐妥珠单抗(otlertuzumab)、OX002/MEN1309、奥塞芦单抗(oxelumab)、奥扎尼珠单抗、奥利组单抗(ozoralizumab)、帕吉昔单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗、帕尼单抗、pankomab、PankoMab-GEX、帕巴库单抗(panobacumab)、帕萨妥珠单抗(parsatuzumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、帕妥昔珠单抗(pasotuxizumab)、帕替组单抗(pateclizumab)、帕曲妥单抗(patritumab)、PAT-SC1、PAT-SM6、派姆单抗、培妥莫单抗(pemtumomab)、培拉凯珠单抗(perakizumab)、帕妥珠单抗、培克珠单抗、PF-05082566(乌托鲁单抗(utomilumab))、PF-06647263、PF-06671008、PF-06801591、匹地利珠单抗(pidilizumab)、维汀-匹那妥珠单抗(pinatuzumab vedotin)、平妥莫单抗(pintumomab)、普拉鲁单抗(placulumab)、泊洛妥珠单抗(polatuzumabvedotin)、泊奈组单抗(ponezumab)、普立昔单抗、瑞托萨昔单抗(pritoxaximab)、普林木单抗(pritumumab)、PRO 140、Proxinium、PSMA ADC、奎利珠单抗(quilizumab)、雷妥莫单抗(racotumomab)、雷曲妥单抗(radretumab)、雷韦单抗(rafivirumab)、雷泮赛珠单抗(ralpancizumab)、雷莫芦单抗、兰尼单抗、雷昔库单抗(raxibacumab)、瑞法奈珠单抗(refanezumab)、瑞加韦单抗(regavirumab)、REGN1400、REGN2810/SAR439684、瑞利珠单抗(reslizumab)、RFM-203、RG7356、RG7386、RG7802、RG7813、RG7841、RG7876、RG7888、RG7986、利妥木单抗(rilotumumab)、利努苏单抗(rinucumab)、利妥昔单抗、RM-1929、RO7009789、罗妥木单抗(robatumumab)、罗来度单抗(roledumab)、罗莫单抗(romosozumab)、隆利组单抗(rontalizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、戈沙妥珠单抗(sacituzumab govitecan)、沙马组单抗(samalizumab)、SAR408701、SAR566658、西鲁库单抗(sarilumab)、SAT 012、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)、SCT200、SCT400、SEA-CD40、苏金单抗、瑟瑞妥单抗(seribantumab)、瑟托萨昔单抗(setoxaximab)、司韦单抗、SGN-CD19A、SGN-CD19B、SGN-CD33A、SGN-CD70A、SGN-LIV1A、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西法木单抗、司妥昔单抗、辛妥珠单抗(simtuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)、西鲁库单抗(sirukumab)、维汀-索非妥珠单抗(sofituzumab vedotin)、苏兰组单抗(solanezumab)、索利托单抗(solitomab)、索尼普西珠单抗(sonepcizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、司他芦单抗(stamulumab)、硫索单抗、舒维组单抗(suvizumab)、SYD985、SYM004(伏妥昔单抗(futuximab)和扎妥昔单抗(modotuximab))、Sym015、TAB08、他贝芦单抗(tabalumab)、泰坦-克利妥珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗、他利珠单抗(talizumab)、他尼珠单抗(tanezumab)、Tanibirumab、帕他莫单抗(taplitumomabpaptox)、他瑞妥单抗(tarextumab)、TB-403、替非组单抗(tefibazumab)、Teleukin、阿替莫单抗(telimomab aritox)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替奈昔单抗(teneliximab)、替利组单抗(teplizumab)、替妥木单抗(teprotumumab)、特度鲁单抗(tesidolumab)、tetulomab、TG-1303、TGN1412、钍-227-依帕珠单抗缀合物、ticilimumab、替加组单抗(tigatuzumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)、Tisotumab vedotin、TNX-650、托珠单抗、toralizumab、托萨托舒单抗(tosatoxumab)、托西莫单抗、托维妥单抗(tovetumab)、曲罗芦单抗(tralokinumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、恩美曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)、TRBS07、TRC105、曲利组单抗(tregalizumab)、曲美木单抗、曲戈卢单抗(trevogrumab)、TRPH 011、TRX518、TSR-042、TTI-200.7、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(tuvirumab)、U3-1565、U3-1784、乌妥昔单抗(ublituximab)、乌洛鲁单抗(ulocuplumab)、乌瑞芦单抗(urelumab)、乌珠单抗(urtoxazumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、他立林-伐达妥昔单抗(Vadastuximab Talirine)、维汀-万多妥珠单抗(vandortuzumab vedotin)、万替妥单抗(vantictumab)、伐努赛珠单抗(vanucizumab)、伐利昔单抗(vapaliximab)、伐立鲁单抗(varlilumab)、伐利组单抗(vatelizumab)、VB6-845、维多珠单抗、维妥组单抗(veltuzumab)、维帕莫单抗、维西库单抗(vesencumab)、维西珠单抗(visilizumab)、伏洛昔单抗(volociximab)、玛汀-沃瑟妥珠单抗(vorsetuzumabmafodotin)、伏妥莫单抗、YYB-101、扎芦木单抗(zalutumumab)、扎木单抗(zanolimumab)、扎妥昔单抗(zatuximab)、齐拉木单抗(ziralimumab)和阿佐莫单抗(zolimomab aritox)。
在一些实施方案中，所述嵌合多肽受体(例如，TFP或CAR)包含抗原结合结构域，并且所述抗原结合结构域能够特异性地并且优先地结合包含选自以下的一个或多个成员的抗原：BCMA、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD70、κ、Lewis Y、NKG2D配体、ROR1、NY-ESO-1、NY-ESO-2、MART-1和gp100。NKG2D配体的非限制性例子包括选自以下的一个或多个成员：MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6。
在一些实施方案中，所述嵌合多肽受体(例如，TFP或CAR)包含抗原结合结构域，并且所述抗原结合结构域能够特异性地并且优先地结合CD38。
在一些实施方案中，表达盒、人工诱导的修饰、或工程化细胞包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或更多种不同类型的嵌合多肽受体。
转基因可以编码安全开关。在一些实施方案中，转基因编码能够影响工程化细胞死亡的安全开关。在一些实施方案中，安全开关可以激活前药以引发杀伤工程化细胞。在一些情况下，安全开关可以包含选自以下的一个或多个成员：半胱天冬酶(例如，半胱天冬酶3、7或9)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR、B细胞CD20及其功能变体。在一些情况下，安全开关可以通过激活因子(例如，小分子或蛋白质，诸如抗体)被激活，用于对受试者工程化细胞的死亡(或耗竭)的翻译后、时间和/或位点特异性调节。安全开关及其激活因子的非限制性例子可以包括半胱天冬酶9(或半胱天冬酶3或7)和AP1903；胸苷激酶(TK)和更昔洛韦(GCV)；和胞嘧啶脱氨酶(CD)和5-氟胞嘧啶(5-FC)。可替代地或另外，当受试者细胞暴露于抗体时，含有被抗体(例如，抗EGFR Ab，诸如西妥昔单抗)识别的表位的经修饰的表皮生长因子受体(EGFR)可以用于耗尽工程化细胞。
转基因可以编码免疫调节多肽，例如，选自以下的一个或多个成员：HLA-E、CD47、CD113、PDL1、PDL2、A2AR、HLA-G、TGF-β、CCL21、IL10、CD46、CD55和CD59。
转基因可以编码抗体、其片段(例如，其抗原结合片段)或其变体。在一些情况下，转基因编码以下抗体或抗原结合片段：20-(74)-(74)(米拉组单抗(milatuzumab)；维妥珠单抗(veltuzumab))、20-2b-2b、3F8、74-(20)-(20)(米拉组单抗；维妥珠单抗)、8H9、A33、AB-16B5、阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿比妥珠单抗、林妥珠单抗)、阿克托舒单抗(actoxumab)、阿达木单抗、ADC-1013、ADCT-301、ADCT-402、阿德木单抗(adecatumumab)、阿杜那单抗(aducanumab)、阿非莫单抗、AFM13、阿托珠单抗(afutuzumab)、AGEN1884、AGS15E、AGS-16C3F、AGS67E、培戈-阿拉赛珠单抗(alacizumab pegol)、ALD518、阿仑单抗、阿莫罗布单抗、喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)、阿麦妥单抗(amatuximab)、AMG 228、AMG820、马安那莫单抗(anatumomab mafenatox)、雷星-阿奈妥单抗(anetumab ravtansine)、阿尼鲁单抗(anifrolumab)、安芦组单抗(anrukinzumab)、APN301、APN311、阿泊珠单抗(apolizumab)、APX003/SIM-BD0801(sevacizumab)、APX005M、阿西莫单抗、ARX788、阿伐苏单抗(ascrinvacumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、ASG-15ME、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿替奴单抗(atinumab)、ATL101、atlizumab(也称为托珠单抗)、阿托木单抗(atorolimumab)、阿维单抗(avelumab)、B-701、巴匹组单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗、巴维妥昔单抗、BAY1129980、BAY1187982、贝妥莫单抗、贝戈洛单抗(begelomab)、贝利木单抗、贝那利珠单抗(benralizumab)、柏替木单抗(bertilimumab)、贝索单抗(besilesomab)、Betalutin(177Lu-tetraxetan-tetulomab)、贝伐单抗、BEVZ92(贝伐单抗生物仿制药)、贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)、BGB-A317、BHQ880、BI 836880、BI-505、比西单抗、比玛卢单抗(bimagrumab)、比美吉珠单抗(bimekizumab)、bivatuzumab mertansine、BIW-8962、博纳吐单抗、布索组单抗(blosozumab)、BMS-936559、BMS-986012、BMS-986016、BMS-986148、BMS-986178、BNC101、伯考赛珠单抗(bococizumab)、本妥昔单抗(brentuximabvedotin)、BrevaRex、布雷奴单抗(briakinumab)、布罗达单抗(brodalumab)、布洛赛珠单抗(brolucizumab)、布隆妥珠单抗(brontictuzumab)、C2-2b-2b、卡那单抗、莫坎妥珠单抗美登素(cantuzumab mertansine)、坎妥珠单抗拉坦素(cantuzumab ravtansine)、卡帕珠单抗(caplacizumab)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、卡芦单抗(carlumab)、卡妥索单抗、CBR96-阿霉素免疫缀合物、CBT124(贝伐单抗)、CC-90002、CDX-014、CDX-1401、西利珠单抗(cedelizumab)、培塞利珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗、CGEN-15001T、CGEN-15022、CGEN-15029、CGEN-15049、CGEN-15052、CGEN-15092、Ch.14.18、泊西他组单抗(citatuzumab bogatox)、西妥木单抗、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、克立昔单抗(clenoliximab)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)、CM-24、考曲妥珠单抗(codrituzumab)、雷星-考妥昔单抗(coltuximab ravtansine)、可那木单抗(conatumumab)、康赛珠单抗(concizumab)、Cotara(碘I-131美妥昔单抗(derlotuximab)生物素)、cR6261、克雷内治单抗(crenezumab)、DA-3111(曲妥单抗生物仿制药)、达西组单抗(dacetuzumab)、达克珠单抗、达罗托组单抗(dalotuzumab)、培戈-达匹利珠单抗(dapirolizumab pegol)、达雷木单抗、Daratumumab Enhanze(达雷木单抗)、Darleukin、德屈库单抗(dectrekumab)、登赛珠单抗(demcizumab)、玛汀-地宁妥珠单抗(denintuzumabmafodotin)、地诺单抗、迪妥昔珠单抗(Depatuxizumab)、玛汀-迪妥昔珠单抗(Depatuxizumab mafodotin)、美妥昔单抗生物素、地莫单抗、DI-B4、地妥昔单抗(dinutuximab)、地利伏单抗(diridavumab)、DKN-01、DMOT4039A、阿托度单抗、曲齐妥单抗(drozitumab)、DS-1123、DS-8895、杜利妥单抗(duligotumab)、度普利尤单抗(dupilumab)、德瓦鲁单抗、度司妥单抗(dusigitumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃巴单抗、依决洛单抗、依法珠单抗、依芬古单抗(efungumab)、埃迪鲁单抗(eldelumab)、依更妥单抗(elgemtumab)、埃罗妥珠单抗、艾西莫单抗(elsilimomab)、依米妥珠单抗(emactuzumab)、依玛妥珠单抗(emibetuzumab)、依那妥组单抗(enavatuzumab)、恩诺单抗(enfortumab vedotin)、培戈赖莫单抗(enlimomab pegol)、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)、依诺凯组单抗(enokizumab)、依诺苏单抗(enoticumab)、恩妥昔单抗(ensituximab)、西依匹莫单抗(epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、埃达组单抗(etaracizumab)、依曲利组单抗(etrolizumab)、依维苏单抗(evinacumab)、依沃苏单抗(evolocumab)、艾韦单抗(exbivirumab)、fanolesomab、法拉莫单抗(faralimomab)、法妥组单抗(farletuzumab)、法司努单抗(fasinumab)、FBTA05、泛维珠单抗(felvizumab)、非扎奴单抗(fezakinumab)、FF-21101、FGFR2抗体-药物缀合物、Fibromun、非拉妥组单抗(ficlatuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、非利伏单抗(firivumab)、弗兰托单抗(flanvotumab)、夫来库单抗(fletikumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、福雷芦单抗(foralumab)、福拉韦单抗(foravirumab)、FPA144、非苏木单抗(fresolimumab)、FS102、福拉奴单抗(fulranumab)、伏妥昔单抗(futuximab)、加利昔单抗(galiximab)、加尼妥单抗(ganitumab)、更汀芦单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(gavilimomab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin)、Gerilimzumab、吉伏组单抗(gevokizumab)、吉妥昔单抗(girentuximab)、格巴妥木单抗(glembatumumab vedotin)、GNR-006、GNR-011、戈利木单抗(golimumab)、gomiliximab、GSK2849330、GSK2857916、GSK3174998、GSK3359609、古塞库单抗(guselkumab)、Hu14.18K322A MAb、hu3S193、Hu8F4、HuL2G7、HuMab-5B1、伊巴组单抗(ibalizumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、艾芦库单抗(icrucumab)、艾达赛珠单抗(idarucizumab)、IGN002、IGN523、伊戈伏单抗、IMAB362、IMAB362(claudiximab)、伊玛鲁单抗(imalumab)、IMC-CS4、IMC-D11、英西单抗、伊马曲单抗(imgatuzumab)、IMGN529、IMMU-102(钇Y-90依帕珠单抗(epratuzumab tetraxetan))、IMMU-114、ImmuTune IMP701拮抗剂抗体、INCAGN1876、inclacumab、INCSHR1210、雷英妥昔单抗(indatuximab ravtansine)、维汀-英度妥单抗(indusatumab vedotin)、英夫利昔单抗(infliximab)、伊诺莫单抗、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、英妥木单抗(intetumumab)、Ipafricept、IPH4102、伊匹单抗、伊妥木单抗(iratumumab)、艾萨妥昔单抗(isatuximab)、艾司妥单抗(Istiratumab)、伊利组单抗(itolizumab)、伊卡组单抗(ixekizumab)、JNJ-56022473、JNJ-61610588、凯利昔单抗(keliximab)、KTN3379、L19IL2/L19TNF、拉贝妥珠单抗(Labetuzumab)、戈维替康-拉贝妥珠单抗(Labetuzumab Govitecan)、LAG525、兰洛利珠单抗(lambrolizumab)、兰帕利珠单抗(lampalizumab)、L-DOS47、来瑞组单抗(lebrikizumab)、lemalesomab、仑兹鲁单抗(lenzilumab)、lerdelimumab、Leukotuximab、来沙木单抗(lexatumumab)、利韦单抗(libivirumab)、维汀-利法妥珠单抗(lifastuzumab vedotin)、利格利珠单抗(ligelizumab)、lilotomab satetraxetan、林妥珠单抗(lintuzumab)、利瑞鲁单抗(lirilumab)、LKZ145、洛迪赛珠单抗(lodelcizumab)、洛吉维单抗(lokivetmab)、莫星-洛沃妥珠单抗(lorvotuzumab mertansine)、卢卡木单抗(lucatumumab)、培戈-鲁利珠单抗(lulizumab pegol)、鲁昔单抗(lumiliximab)、鲁妥珠单抗(lumretuzumab)、LY3164530、马帕木单抗(mapatumumab)、玛格妥昔单抗(margetuximab)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥珠单抗(matuzumab)、玛弗利木单抗(mavrilimumab)、MB311、MCS-110、MEDI0562、MEDI-0639、MEDI0680、MEDI-3617、MEDI-551(英比利珠单抗(inebilizumab))、MEDI-565、MEDI6469、美泊利单抗(mepolizumab)、美替木单抗(metelimumab)、MGB453、MGD006/S80880、MGD007、MGD009、MGD011、米拉组单抗(milatuzumab)、米拉组单抗-SN-38、明瑞莫单抗(minretumomab)、索星-米妥昔单抗(mirvetuximab soravtansine)、米妥莫单抗(mitumomab)、MK-4166、MM-111、MM-151、MM-302、莫格利珠单抗(mogamulizumab)、MOR202、MOR208、MORAb-066、莫罗木单抗(morolimumab)、莫维组单抗(motavizumab)、帕克莫单抗(moxetumomab pasudotox)、莫罗单抗(muromonab)-CD3、他那可单抗(nacolomabtafenatox)、那美芦单抗(namilumab)、埃托-那普妥莫单抗(naptumomab estafenatox)、那呐妥单抗(narnatumab)、那他珠单抗、奈巴库单抗、耐昔妥珠单抗、奈莫利珠单抗(nemolizumab)、奈瑞莫单抗(nerelimomab)、奈伐苏单抗(nesvacumab)、尼妥珠单抗、纳武单抗、诺非妥莫单抗(nofetumomab merpentan)、NOV-10、奥托萨昔单抗(obiltoxaximab)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥瑞组单抗(ocrelizumab)、奥度莫单抗、奥法木单抗、奥拉单抗(olaratumab)、奥洛组单抗(olokizumab)、奥马珠单抗、OMP-131R10、OMP-305B83、奥那妥组单抗(onartuzumab)、昂妥昔珠单抗(ontuxizumab)、奥匹努单抗(opicinumab)、莫妥组单抗(oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗、奥替苏单抗(orticumab)、奥昔组单抗(otelixizumab)、奥乐妥珠单抗(otlertuzumab)、OX002/MEN1309、奥塞芦单抗(oxelumab)、奥扎尼珠单抗、奥利组单抗(ozoralizumab)、帕吉昔单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗、帕尼单抗、pankomab、PankoMab-GEX、帕巴库单抗(panobacumab)、帕萨妥珠单抗(parsatuzumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、帕妥昔珠单抗(pasotuxizumab)、帕替组单抗(pateclizumab)、帕曲妥单抗(patritumab)、PAT-SC1、PAT-SM6、派姆单抗、培妥莫单抗(pemtumomab)、培拉凯珠单抗(perakizumab)、帕妥珠单抗、培克珠单抗、PF-05082566(乌托鲁单抗(utomilumab))、PF-06647263、PF-06671008、PF-06801591、匹地利珠单抗(pidilizumab)、维汀-匹那妥珠单抗(pinatuzumab vedotin)、平妥莫单抗(pintumomab)、普拉鲁单抗(placulumab)、泊洛妥珠单抗(polatuzumabvedotin)、泊奈组单抗(ponezumab)、普立昔单抗、瑞托萨昔单抗(pritoxaximab)、普林木单抗(pritumumab)、PRO 140、Proxinium、PSMA ADC、奎利珠单抗(quilizumab)、雷妥莫单抗(racotumomab)、雷曲妥单抗(radretumab)、雷韦单抗(rafivirumab)、雷泮赛珠单抗(ralpancizumab)、雷莫芦单抗、兰尼单抗、雷昔库单抗(raxibacumab)、瑞法奈珠单抗(refanezumab)、瑞加韦单抗(regavirumab)、REGN1400、REGN2810/SAR439684、瑞利珠单抗(reslizumab)、RFM-203、RG7356、RG7386、RG7802、RG7813、RG7841、RG7876、RG7888、RG7986、利妥木单抗(rilotumumab)、利努苏单抗(rinucumab)、利妥昔单抗、RM-1929、RO7009789、罗妥木单抗(robatumumab)、罗来度单抗(roledumab)、罗莫单抗(romosozumab)、隆利组单抗(rontalizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、戈沙妥珠单抗(sacituzumab govitecan)、沙马组单抗(samalizumab)、SAR408701、SAR566658、西鲁库单抗(sarilumab)、SAT 012、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)、SCT200、SCT400、SEA-CD40、苏金单抗、瑟瑞妥单抗(seribantumab)、瑟托萨昔单抗(setoxaximab)、司韦单抗、SGN-CD19A、SGN-CD19B、SGN-CD33A、SGN-CD70A、SGN-LIV1A、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西法木单抗、司妥昔单抗、辛妥珠单抗(simtuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)、西鲁库单抗(sirukumab)、维汀-索非妥珠单抗(sofituzumab vedotin)、苏兰组单抗(solanezumab)、索利托单抗(solitomab)、索尼普西珠单抗(sonepcizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、司他芦单抗(stamulumab)、硫索单抗、舒维组单抗(suvizumab)、SYD985、SYM004(伏妥昔单抗(futuximab)和扎妥昔单抗(modotuximab))、Sym015、TAB08、他贝芦单抗(tabalumab)、泰坦-克利妥珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗、他利珠单抗(talizumab)、他尼珠单抗(tanezumab)、Tanibirumab、帕他莫单抗(taplitumomabpaptox)、他瑞妥单抗(tarextumab)、TB-403、替非组单抗(tefibazumab)、Teleukin、阿替莫单抗(telimomab aritox)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替奈昔单抗(teneliximab)、替利组单抗(teplizumab)、替妥木单抗(teprotumumab)、特度鲁单抗(tesidolumab)、tetulomab、TG-1303、TGN1412、钍-227-依帕珠单抗缀合物、ticilimumab、替加组单抗(tigatuzumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)、Tisotumab vedotin、TNX-650、托珠单抗、toralizumab、托萨托舒单抗(tosatoxumab)、托西莫单抗、托维妥单抗(tovetumab)、曲罗芦单抗(tralokinumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、恩美曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)、TRBS07、TRC105、曲利组单抗(tregalizumab)、曲美木单抗、曲戈卢单抗(trevogrumab)、TRPH 011、TRX518、TSR-042、TTI-200.7、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(tuvirumab)、U3-1565、U3-1784、乌妥昔单抗(ublituximab)、乌洛鲁单抗(ulocuplumab)、乌瑞芦单抗(urelumab)、乌珠单抗(urtoxazumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、他立林-伐达妥昔单抗(Vadastuximab Talirine)、维汀-万多妥珠单抗(vandortuzumab vedotin)、万替妥单抗(vantictumab)、伐努赛珠单抗(vanucizumab)、伐利昔单抗(vapaliximab)、伐立鲁单抗(varlilumab)、伐利组单抗(vatelizumab)、VB6-845、维多珠单抗、维妥组单抗(veltuzumab)、维帕莫单抗、维西库单抗(vesencumab)、维西珠单抗(visilizumab)、伏洛昔单抗(volociximab)、玛汀-沃瑟妥珠单抗(vorsetuzumabmafodotin)、伏妥莫单抗、YYB-101、扎芦木单抗(zalutumumab)、扎木单抗(zanolimumab)、扎妥昔单抗(zatuximab)、齐拉木单抗(ziralimumab)、阿佐莫单抗(zolimomab aritox)或其衍生物或其组合(例如，多特异性抗体，诸如双特异性抗体)。
在一些实施方案中，转基因编码与细胞表面蛋白特异性结合的抗体，所述细胞表面蛋白是癌细胞表达的抗原。在一些实施方案中，转基因编码特异性结合新表位的抗体。在一些实施方案中，转基因编码特异性结合肿瘤相关抗原的抗体。在一些实施方案中，转基因编码特异性结合以下的抗体：甲胎蛋白、ASLG659、B7-H3、BAFF-R、短小蛋白聚糖、CA125(MUC16)、CA15-3、CA19-9、癌胚抗原(CEA)、CA242、CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎瘤衍生生长因子)、CTLA-4、CXCR5、E16(LAT1、SLC7A5)、FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含磷酸酶锚蛋白1a的SH2结构域)、SPAP1B、SPAP1C)、上皮生长因子、ETBR、Fc受体样蛋白1(FCRH1)、GEDA、HLA-DOB(MHC II类分子(Ia抗原)的β亚基、人绒毛膜促性腺激素、ICOS、IL-2受体、IL20Rα、免疫球蛋白超家族受体易位相关2(IRTA2)、L6、Lewis Y、Lewis X、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE 4、MART1、间皮素、MDP、MPF(SMR、MSLN)、MCP1(CCL2)、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MPG、MSG783、粘蛋白、MUC1-KLH、Napi3b(SLC34A2)、连接素-4、Neu癌基因产物、NCA、胎盘碱性磷酸酶、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、前列腺酸性磷酸酶、PSCA hlg、抗转铁蛋白受体、p97、嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5(P2X5)、LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)、gp100、P21、前列腺六跨膜上皮抗原(STEAP1)、STEAP2、Sema 5b、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、或瞬时受体电位阳离子通道、亚家族M成员4)。
在一些实施方案中，转基因编码免疫检查点调节因子，例如免疫检查点抑制因子。免疫检查点抑制因子可以是抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与免疫检查点分子结合并且抑制其活性，例如，以降低免疫检查点分子对免疫反应的抑制作用，从而促进免疫反应，诸如抗癌免疫反应。
在一些实施方案中，转基因编码融合蛋白。在一些实施方案中，转基因编码Fc融合蛋白。在一些实施方案中，转基因编码基于受体的生物品，例如，包含来自例如Fc融合体中的一个或多个VEGF受体或一个或多个TNF受体的结构域的蛋白质。
在一些实施方案中，转基因编码骨形态发生蛋白、酶、生长因子、激素、激酶、磷酸酶或血栓溶解剂。在一些实施方案中，转基因编码胰岛素。
在一些实施方案中，转基因编码报告基因，例如荧光或发光蛋白。
在一些实施方案中，转基因编码不翻译成蛋白质的RNA。在一些实施方案中，转基因编码反义寡核苷酸、siRNA、tRNA、rRNA、snRNA、shRNA、微RNA或非编码RNA。
在一些实施方案中，转基因编码基因编辑系统组件，例如本文公开的核酸酶。编码本文公开的基因编辑系统组件的转基因的整合可以促进细胞的后续基因编辑，例如，通过需要向细胞递送较少的组件以实现基因编辑，例如，gRNA和修复模板，而不是核酸酶。
本公开文本的表达盒或转基因可以编码连接至多肽的结构域的接头。在一些实例中，接头是刚性接头。在其他实例中，接头是柔性接头。在一些情况下，接头是不可切割接头。在其他情况下，接头是可切割接头。在另外的情况下，接头包括线性结构或非线性结构(例如，环状结构)。
本公开文本的表达盒或转基因可以编码可切割接头。如本文公开的可切割接头可以包括自切割肽，诸如自切割2A肽。自切割肽可以在小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)病毒家族的成员中找到，所述病毒家族包括口蹄疫病毒属(aphthoviruses)，诸如口蹄疫病毒(FMDV)、马鼻炎A病毒(ERAV)、Thosea asigna病毒(TaV)和猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1(PTV-I)；以及心脏病毒，诸如泰勒病毒(Theilovirus)(例如，泰勒氏鼠脑脊髓炎)和脑心肌炎病毒。自切割2A肽的非限制性例子可以包括“F2A”、“E2A”、“P2A”、“T2A”及其功能变体。在一些实施方案中，接头是pH敏感性接头。在一个实例中，接头在碱性pH条件下切割。在其他实例中，接头在酸性pH条件下切割。在一些实施方案中，接头在体内被内源性酶(例如，蛋白酶)切割，诸如丝氨酸蛋白酶，包括但不限于凝血酶、金属蛋白酶、弗林蛋白酶、组织蛋白酶B、坏死酶(例如，钙蛋白酶)等。
表达盒或转基因可以包含一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。
在一些实施方案中，本公开文本的工程化细胞进一步包含在本公开文本的某些基因组位点(例如，安全港基因座)之外的一种或多种人工诱导的修饰。
在一些实施方案中，本公开文本的工程化细胞包含人工诱导的修饰，所述人工诱导的修饰减少PD1、CTLA-4、TIM-3、KIR2D、CD94、NKG2A、NKG2D、TIGIT、CD96、LAG3、TIGIT、TGFβ受体、2B4、SHIP2或其组合的表达或活性。
在一些实施方案中，本公开文本的工程化细胞包含人工诱导的修饰，所述人工诱导的修饰减少B2M、CIITA、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、CD80、CD86、ICOSL、CD40L、ICAM1、MICA、MICB、ULBP1、HLA-E、CD47、CD113、PDL1、PDL2、A2AR、HLA-G、TGF-β、CCL21、IL10、CD46、CD55、CD59或其组合的表达或活性。
在一些实施方案中，本公开文本的工程化细胞包含人工诱导的修饰，所述人工诱导的修饰减少CD38的表达或活性。
在一些情况下，本公开文本的工程化细胞的内源T细胞受体(TCR)可以被失活。在一些例子中，工程化细胞的内源TCR的功能可以被抑制因子抑制。在一些例子中，编码内源TCR的亚基的基因可以被失活(例如，通过如本文公开的基因编辑部分的作用进行编辑)，使得内源TCR被失活。编码内源TCR的亚基的基因可以是以下中的一种或多种：TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ。
转基因可以与一种或多种调节元件(诸如启动子)可操作地偶联。启动子可以是例如组成型启动子、诱导型启动子、时间启动子、组织特异性启动子和/或细胞类型特异性启动子。启动子可以是在工程化细胞中具有活性的启动子，例如，在本文公开的任何细胞类型中具有活性和/或特异性的启动子。启动子可以是内源人类启动子。启动子可以是经修饰的人类启动子。启动子可以是人工启动子。在一些实施方案中，启动子可以是内源启动子，例如，驱动生物体中转基因表达的相同启动子。在一些实施方案中，启动子可以是异源启动子，例如，与在生物体中与转基因或转基因的野生型形式可操作地偶联的启动子不同的启动子。动子可以是病毒启动子。
可使用的启动子的非限制性例子包括hEF-1a、CMV、EF1a、PGK、CAG和UBC。组成型启动子的非限制性例子包括人β-肌动蛋白(ACTB)、巨细胞病毒(CMV)、延伸因子-1α、(EF1α)、磷酸甘油酸激酶(PGK)泛素(UbC)、SV40和CAGC启动子。诱导型启动子的非限制性例子包括化学诱导型启动子(例如，TET-ON和TET-OFF)和温度诱导型启动子。
在一些实施方案中，可使用的启动子对免疫系统转录因子有反应，所述免疫系统转录因子诸如AP-1、Bcl6、E2A、EBF、Eomes、FoxP3、GATA3、Id2、Ikaros、IRF、IRF1、IRF2、IRF3、IRF3、IRF7、NFAT、NFkB、Pax5、PLZF、PU.1、ROR-gamma-T、STAT、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT5A、STAT5B、STAT6、T-bet、TCF7、或ThPOK转录因子。
在一些实施方案中，可使用的启动子对NK细胞转录因子有反应，所述转录因子例如Aiolos、E4bp4、Eomes、Ets1、FoxO1、Gata2、Gata3、Helios、id2、Ikaros、IRF2、Nfil3、Notch、PU.1、Runx3、T-bet、Tox1/2或Tox2。
在一些实施方案中，可使用的启动子对胚胎干细胞转录因子有反应，所述转录因子诸如Brachyury、EOMES、FoxC2、FoxD3、FoxF1、FoxH1、FoxO1/FKHR、GATA-2、GATA-3、GBX2、Goosecoid、HES-1、HNF-3α/FoxA1、c-Jun、KLF2、KLF4、KLF5、c-Maf、Max、MEF2C、MIXL1、MTF2、c-Myc、Nanog、NFkB/IkB激活因子、NFkB/IkB抑制因子、NFkB1、NFkB2、Oct-3/4、Otx2、p53、Pax2、Pax6、PRDM14、Rex-1/ZFP42、SALL1、SALL4、Smad1、Smad2、Smad2/3、Smad3、Smad4、Smad5、Smad8、Snail、SOX2、SOX7、SOX15、SOX17、STAT激活因子、STAT抑制因子、STAT3、SUZ12、TBX6、TCF-3/E2A、THAP11、UTF1、WDR5、WT1、ZNF206或ZNF281。
在一些实施方案中，可使用的启动子对iPSC转录因子有反应，所述转录因子诸如KLF2、KLF4、c-Maf、c-Myc、Nanog、Oct-3/4、p53、SOX1、SOX2、SOX3、SOX15、SOX18或TBX18。
在一些实施方案中，可使用的启动子对造血干细胞转录因子有反应，所述转录因子诸如AHR、Aiolos/IKZF3、CDX4、CREB、DNMT3A、DNMT3B、EGR1、FoxO3、GATA-1、GATA-2、GATA-3、Helios、HES-1、HHEX、HIF-1α/HIF1A、HMGB1/HMG-1、HMGB3、Ikaros、c-Jun、LMO2、LMO4、c-Maf、MafB、MEF2C、MYB、c-Myc、NFATC2、NFIL3/E4BP4、Nrf2、p53、PITX2、PRDM16/MEL1、Prox1、PU.1/Spi-1、RUNX1/CBFA2、SALL4、SCL/Tal1、Smad2、Smad2/3、Smad4、Smad7、Spi-B、STAT激活因子、STAT抑制因子、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT6或TSC22。
在一些实施方案中，可使用的启动子对上皮干细胞转录因子有反应，所述转录因子诸如ASCL2/Mash2、CDX2、DNMT1、ELF3、Ets-1、FoxM1、FoxN1、GATA-6、Hairless、HNF-4α/NR2A1、IRF6、c-Maf、MITF、Miz-1/ZBTB17、MSX1、MSX2、MYB、c-Myc、神经原素-3、NFATC1、NKX3.1、Nrf2、p53、p63/TP73L、Pax2、Pax3、RUNX1/CBFA2、RUNX2/CBFA1、RUNX3/CBFA3、Smad1、Smad2、Smad2/3、Smad4、Smad5、Smad7、Smad8、Snail、SOX2、SOX9、STAT激活因子、STAT抑制因子、STAT3、SUZ12、TCF-3/E2A或TCF7/TCF1。
在一些实施方案中，可使用的启动子对间充质干细胞转录因子有反应，所述转录因子诸如DUX4、DUX4/DUX4c、DUX4c、EBF-1、EBF-2、EBF-3、ETV5、FoxC2、FoxF1、GATA-4、GATA-6、HMGA2、c-Jun、MYF-5、心肌素、MyoD、成肌素、NFATC2、p53、Pax3、PDX-1/IPF1、PLZF、PRDM16/MEL1、RUNX2/CBFA1、Smad1、Smad3、Smad4、Smad5、Smad8、Smad9、Snail、SOX2、SOX9、SOX11、STAT激活因子、STAT抑制因子、STAT1、STAT3、TBX18、Twist-1或Twist-2。
在一些实施方案中，可使用的启动子对癌症干细胞转录因子有反应，所述转录因子诸如雄性激素R/NR3C4、AP-2γ、β-连环蛋白、β-连环蛋白抑制因子、Brachyury、CREB、ERα/NR3A1、ERβ/NR3A2、FoxM1、FoxO3、FRA-1、GLI-1、GLI-2、GLI-3、HIF-1α/HIF1A、HIF-2α/EPAS1、HMGA1B、c-Jun、JunB、KLF4、c-Maf、MCM2、MCM7、MITF、c-Myc、Nanog、NFkB/IkB激活因子、NFkB/IkB抑制因子、NFkB1、NKX3.1、Oct-3/4、p53、PRDM14、Snail、SOX2、SOX9、STAT激活因子、STAT抑制因子、STAT3、TAZ/WWTR1、TBX3、Twist-1、Twist-2、WT1或ZEB1。
在一些实施方案中，可使用的启动子对癌症相关的转录因子有反应，所述转录因子诸如ASCL1/Mash1、ASCL2/Mash2、ATF1、ATF2、ATF4、BLIMP1/PRDM1、CDX2、CDX4、DLX5、DNMT1、E2F-1、EGR1、ELF3、Ets-1、FosB/G0S3、FoxC1、FoxC2、FoxF1、GADD153、GATA-2、HMGA2、HMGB1/HMG-1、HNF-3α/FoxA1、HNF-6/ONECUT1、HSF1、ID1、ID2、JunD、KLF10、KLF12、KLF17、LMO2、MEF2C、MYCL1/L-Myc、NFkB2、Oct-1、p63/TP73L、Pax3、PITX2、Prox1、RAP80、Rex-1/ZFP42、RUNX1/CBFA2、RUNX3/CBFA3、SALL4、SCL/Tal1、Sirtuin 2/SIRT2、Smad3、Smad4、Smad5、SOX11、STAT5a/b、STAT5a、STAT5b、TCF7/TCF1、TORC1、TORC2、TRIM32、TRPS1或TSC22。
E.细胞类型
本文公开的任何一种工程化细胞群体可以包含本文公开的任何合适的细胞类型或谱系的细胞。本文公开的工程化细胞可以是离体、体外的并且在一些情况下是体内工程化的。
可以作为本公开文本工程化细胞的细胞类型的非限制性例子包括淋巴样细胞，诸如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节T细胞、T辅助细胞)、自然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞(参见例如US20080241194)；髓样细胞，诸如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞/分叶过多嗜中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、红细胞、网织红细胞、肥大细胞、血小板/巨核细胞、树突状细胞；来自内分泌系统的细胞，包括甲状腺(甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺(甲状旁腺主细胞、嗜酸细胞)、肾上腺(嗜铬细胞)、松果体(松果体细胞)细胞；神经系统的细胞，包括神经胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞)、大细胞神经分泌细胞、星状细胞、伯特歇尔细胞(Boettcher cell)和垂体(促性腺激素、促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、促生长素、促乳激素)；呼吸系统的细胞，包括肺细胞(I型肺细胞、II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯状细胞、噬尘细胞；循环系统的细胞，包括心肌细胞、周皮细胞；消化系统的细胞，包括胃(胃主细胞、壁细胞)、杯状细胞、帕内特细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞；肠内分泌细胞，包括肠嗜锚细胞、APUD细胞、肝细胞(例如，肝细胞或枯氏细胞(Kupffer cell))、软骨/骨/肌肉；骨细胞，包括成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、牙齿细胞(成牙骨质细胞、成釉细胞)；软骨细胞，包括成软骨细胞、软骨细胞；皮肤细胞，包括刺细胞、角质形成细胞、黑色素细胞(痣细胞)；肌肉细胞，包括肌细胞；泌尿系统细胞，包括足状突细胞、近肾小球细胞、肾小球内系膜细胞/肾小球外系膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞、致密斑细胞；生殖系统细胞，包括精子、塞尔托利氏细胞、莱氏细胞、卵子；以及其他细胞，包括脂肪细胞，成纤维细胞，肌腱细胞，表皮角质形成细胞，表皮基底细胞，指甲和趾甲的角质形成细胞，甲床基底细胞，髓质毛干细胞，皮质毛干细胞，表皮毛干细胞，表皮毛根鞘细胞，赫胥黎层毛根鞘细胞，亨勒层毛根鞘细胞，外毛根鞘细胞，毛发基质细胞，湿复层屏障上皮细胞，角膜、舌、口腔、食道、肛管、尿道远端和阴道的复层鳞状上皮的表面上皮细胞，角膜、舌、口腔、食道、肛管、尿道远端和阴道的上皮的基底细胞，尿路上皮细胞，外分泌上皮细胞，唾液腺粘液细胞，唾液腺浆液细胞，舌的埃伯内腺(Von Ebner'sgland)细胞，乳腺细胞，泪腺细胞，耳部耵聍腺细胞，外分泌汗腺暗细胞，外分泌汗腺透明细胞。大汗腺细胞、眼睑的莫耳腺细胞、皮脂腺细胞、鼻子的鲍曼氏腺细胞、十二指肠的十二指肠腺细胞、精囊细胞、前列腺细胞、尿道球腺细胞、巴多林氏腺细胞、利特雷氏腺细胞、子宫内膜细胞、分离的呼吸道和消化道杯状细胞、胃壁粘液细胞、胃腺酶原细胞、胃腺泌酸细胞、胰腺腺泡细胞、小肠帕内特细胞、肺的II型肺细胞、肺克拉拉细胞、激素分泌细胞、垂体前叶细胞、促生长激素细胞、催乳素细胞、促甲状腺激素细胞、促性腺激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞、中间垂体细胞、大细胞神经分泌细胞、肠和呼吸道细胞、甲状腺细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、甲状旁腺细胞、甲状旁腺主细胞、嗜酸细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸的莱迪希细胞、卵巢卵泡的泡膜内细胞、破裂的卵巢卵泡的黄体细胞、粒层叶黄素细胞、泡膜叶黄素细胞、近肾小球细胞、肾脏的致密斑细胞、代谢和贮藏细胞、屏障功能细胞(例如，肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、肾脏、I型肺细胞、胰腺导管细胞(泡心细胞)、(汗腺、唾液腺、乳腺等的)非横纹管细胞、(精囊、前列腺等的)导管细胞、封闭体腔内壁的上皮细胞、具有推进功能的纤毛细胞、胞外基质分泌细胞、收缩细胞；骨骼肌细胞、干细胞、心肌细胞、血液和免疫系统细胞、红细胞、巨核细胞、单核细胞、结缔组织巨噬细胞(各种类型)、表皮朗格汉斯细胞、破骨细胞、树突状细胞、小胶质细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、网织红细胞、干细胞和针对血液和免疫系统的定型祖细胞(各种类型)、多能干细胞、全能干细胞、诱导多能干细胞、成体干细胞、感觉传导细胞、神经元、自主神经元细胞、感觉器官和周围神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、晶状体细胞、色素细胞、黑色素细胞、视网膜色素上皮细胞、生殖细胞、卵原细胞/卵母细胞、精细胞、精母细胞、精原细胞、精子、哺育细胞、卵巢卵泡细胞、塞尔托利氏细胞、胸腺上皮细胞、间质细胞、肾间质细胞、普通髓样祖细胞、普通淋巴样祖细胞、和分化成或将要分化成本文公开的任何细胞类型的干细胞。
本文公开的任何一种工程化细胞群体可以是工程化免疫细胞群体。
工程化细胞群体可以包括，例如，淋巴细胞、T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、α-βT细胞，γ-δT细胞、T调节细胞(Treg)、细胞毒性T淋巴细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Th9细胞、幼稚T细胞、记忆T细胞、效应T细胞、效应记忆T细胞(TEM)、中央记忆T细胞(TCM)、常驻记忆T细胞(TRM)、滤泡辅助T细胞(TFH)、自然杀伤T细胞(NKT)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤细胞(NK)、固有淋巴样细胞(ILC)、ILC1细胞，ILC2细胞、ILC3细胞、淋巴样组织诱导(LTi)细胞、B细胞、B1细胞、B1a细胞、B1b细胞、B2细胞、浆细胞、B调节细胞、记忆B细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、生发中心B细胞、抗原呈递细胞(APC)、单核细胞、巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、组织相关巨噬细胞、树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、普通髓样祖细胞、普通淋巴样祖细胞或其任何组合。在一些实施方案中，工程化细胞群体包含NK细胞。在一些实施方案中，工程化细胞群体是NK细胞群体。在一些实施方案中，工程化细胞群体包含T细胞。在一些实施方案中，工程化细胞群体是T细胞群体。
在一些实施方案中，工程化免疫细胞可以诱导针对靶细胞的免疫反应。靶细胞可以是例如患病细胞、癌细胞、肿瘤细胞等。
与对照细胞(例如，非工程化免疫细胞)相比，免疫细胞可以经工程化以展现出增强的半衰期。与对照细胞相比，免疫细胞可以经改造以展现出增强的增殖。免疫细胞可以经工程化以有效且特异性地靶向对照细胞不足以或不能靶向的患病细胞(例如，癌细胞)。
适合T细胞培养的条件可以包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640、TexMACS(Miltenyi)或X-vivo 5(Lonza))，其可能含有增殖和生存力所必需的因子，包括血清。在一些情况下，使用无血清培养基。在一方面，细胞可以维持在支持生长所需的条件下；例如，适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气+5％CO2)。在一些实施方案中，制备工程化细胞的方法可以包括刺激，诸如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C激活因子(例如，苔藓抑素)(任选地与钙离子载体结合)接触。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，可以使用结合所述辅助分子的配体。在一些情况下，T细胞群体可以在可刺激T细胞增殖的条件下进行CD3-CD28共刺激，例如与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。
在一些例子中，工程化免疫细胞是源自分离的ESC或诱导干细胞(例如，iPSC)的工程化NK细胞。
在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞(例如，工程化NK细胞)可以源自一种或多种分离的干细胞(例如，分离的ESC)。在一些情况下，本文公开的工程化免疫细胞可以源自一种或多种诱导干细胞(例如，iPSC)。
本文公开的任何一种工程化细胞可以是或可以源自分离的干细胞(例如，ESC)或诱导干细胞(例如，iPSC)。分离的干细胞或诱导干细胞可以在本文公开的遗传位点处经修饰(例如，遗传修饰)以产生工程化干细胞。
在一些情况下，干细胞(例如，ESC或iPSC)的多能性可以部分地通过评估细胞的多能性特征来确定。多能性特征可以包括但不限于：(i)多能干细胞形态；(ii)无限自我更新的潜力；(iii)多能干细胞标记物的表达，包括但不限于SSEA1(仅小鼠)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30和/或CD50；(iv)分化成所有三个体细胞谱系(外胚层，中胚层和内胚层)的能力；(v)形成包含三个体细胞谱系的畸胎瘤的能力；和(vi)形成包含来自三个体细胞谱系的细胞的胚状体。
本文公开的任何一种工程化细胞可以是或可以源自造血干细胞。在一些实施方案中，造血干细胞可以来自受试者，例如来自骨髓或外周血(动员的外周血单采产品，例如通过施用GCSF、GM-CSF、普乐沙福(mozobil)或其组合动员的)。
在一些情况下，干细胞(例如，ESC或iPSC)可以经遗传修饰以产生(例如，诱导分化成)CD34+造血干细胞。可以在诱导的造血干细胞分化之前、之后或期间对干细胞进行遗传修饰以表达如本文公开的任何一种转基因(例如，细胞因子、受体等)。可以在诱导的造血干细胞分化之前、之后或期间对干细胞进行遗传修饰以减少如本文公开的任何一种内源基因或多肽(例如，细胞因子、受体等)的表达或活性。在一些情况下，此类经遗传修饰的CD34+造血干细胞是本公开文本的任何一种工程化细胞或是本公开文本的任何一种工程化细胞的来源。一种或多种遗传修饰可以在本文公开的安全港基因组位点处。
在一些例子中，可以在具有ROCKi(Y-27632)(例如，约10微摩尔(μM))、SCF(例如，约40毫克/毫升(ng/mL)培养基)、VEGF(例如，约20ng/mL培养基)和BMP-4(例如，约20ng/mL培养基)的APEL培养基中培养如本文公开的干细胞以将细胞分化为CD34+造血干细胞。
在一些情况下，可以诱导CD34+造血干细胞(例如，用本公开文本的一种或多种人工诱导的修饰进行遗传修饰)分化为定型免疫细胞，诸如T细胞或NK细胞。因此，在一些情况下，诱导分化过程产生本公开文本的任何一种工程化免疫细胞。
在一些例子中，在IL-3(例如，约5ng/mL)、IL-7(例如，约20ng/mL)、IL-15(例如，约10ng/mL)、SCF(例如，约20ng/mL)和Flt3L(例如，约10ng/mL)的存在下培养经遗传修饰的CD34+造血干细胞以分化为CD45+NK细胞。
在一些情况下，可以将CD45+NK细胞在培养物中扩增，例如使用气体可渗透快速扩增(G-Rex)平台在包含IL-2、mbIL-21aAPC的培养基中扩增。
在一些情况下，如本文公开的iPSC源NK细胞可以与包括IL-2、IL-15或IL-21的一种或多种细胞因子一起培养。在一些情况下，如本文公开的iPSC源NK细胞可以与选自IL-2、IL-15和IL-21的一种或多种细胞因子一起培养(例如，用于细胞扩增)。在一些情况下，如本文公开的iPSC源NK细胞可以同时或以任何顺序按顺序与选自IL-2、IL-15和IL-21的两种或更多种细胞因子(例如，IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、或IL-15和IL-21)一起培养。在一些情况下，如本文公开的iPSC源NK细胞可以同时或以任何顺序按顺序与所有IL-2、IL-15和IL-21一起培养。
在一些实施方案中，工程化细胞可以在无血清培养基中培养。
可以从任何合适的来源获得细胞，用于产生工程化细胞。细胞可以是原代细胞。细胞可以是重组细胞。细胞可以获自许多非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织、和肿瘤。细胞可以源自健康的供体、被诊断出患有癌症的患者、或被诊断出具有感染的患者。细胞也可以获自细胞疗法库。细胞也可以获自受试者的全血、单采或肿瘤样品。细胞可以是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些情况下，单采可以是白细胞去除术。
如果细胞是原代细胞，则可以通过任何方法从个体中收获它们。例如，可以通过单采、白细胞去除术、密度梯度分离等收获白细胞。可以通过活检从诸如皮肤、肌肉、骨髓、脾脏、肝脏、胰腺、肺、肠、胃等组织中收获细胞。可以使用适当的溶液，用于分散或悬浮收获的细胞。此类溶液通常可以是平衡的盐溶液(例如，生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、汉克平衡盐溶液等)，方便地补充有胎牛血清或其他天然存在的或合成的因子，并且结合低浓度的可接受缓冲液。缓冲液可以包括HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。细胞可以立即使用或可以储存(例如，通过冷冻)。冷冻细胞可以解冻，并且可以重复使用。可以将细胞冷冻在DMSO、血清、培养基缓冲液(例如，10％DMSO、50％血清、40％缓冲培养基)和/或用于在冷冻温度下保存细胞的一些其他此类普通溶液中。
也可以在修饰之前或之后选择所希望的细胞群体。选择可以包括以下中的至少一种：磁性分离、流式细胞术选择、和抗生素选择。
在一些实施方案中，工程化细胞用于制造生物品，例如，抗体或其他基于蛋白质的治疗剂。在一些实施方案中，工程化细胞是细胞系，例如HEK细胞。
F.载体、基因编辑部分和制备工程化细胞的方法
基因编辑部分可以用于在本公开文本的基因组位点中引入人工诱导的修饰。
如本文公开的基因编辑部分可以包含CRISPR相关多肽(Cas)、锌指核酸酶(ZFN)、锌指相关基因调控多肽、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、转录激活因子样效应相关基因调控多肽、大范围核酸酶、天然主转录因子、表观遗传修饰酶、重组酶、翻转酶、转座酶、RNA结合蛋白(RBP)、Argonaute蛋白、其任何衍生物、其任何变体或其任何片段。在一些实施方案中，基因编辑部分包含Cas蛋白，并且所述系统进一步包含与Cas蛋白复合的引导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，基因编辑部分包含与能够与Cas蛋白形成复合物的gRNA复合的RBP。在一些实施方案中，gRNA包括靶向区段，所述靶向区段与靶多核苷酸展现出至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或至少100％的序列同一性。在一些实施方案中，Cas蛋白基本上缺乏DNA切割活性。
在一些情况下，合适的基因编辑部分包括CRISPR相关(Cas)蛋白或Cas核酸酶，包括I型CRISPR相关(Cas)多肽、II型CRISPR相关(Cas)多肽、III型CRISPR相关(Cas)多肽、IV型CRISPR相关(Cas)多肽、V型CRISPR相关(Cas)多肽和VI型CRISPR相关(Cas)多肽；锌指核酸酶(ZFN)；转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)；大范围核酸酶；RNA结合蛋白(RBP)；CRISPR相关RNA结合蛋白；重组酶；翻转酶；转座酶；Argonaute(Ago)蛋白(例如，原核Argonaute(pAgo)、古细菌Argonaute(aAgo)和真核Argonaute(eAgo))；其任何衍生物、其任何变体；及其任何片段。
Cas蛋白的非限制性例子包括c2c1、C2c2、c2c3、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9(Csn1或Csx12)、Cas10、Cas10d、Cas1O、Cas1Od、CasF、CasG、CasH、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx1O、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cul966及其同系物或修饰形式。
在一些情况下，可以使用双切口酶方法来引入双链断裂。Cas蛋白可以在任一核酸酶结构域中的某些氨基酸处发生突变，从而缺失一个核酸酶结构域的活性并且生成能够产生单链断裂的切口酶Cas蛋白。可以利用镍酶以及靶向相对链的两个不同的引导RNA来在靶位点内产生DSB(通常称为“双缺口”或“双镍酶”CRISPR系统)。
也可以将包含要被引入到基因组位点(例如，本公开文本的安全港基因座)的核苷酸序列的插入序列与基因编辑部分一起或独立于基因编辑部分引入细胞中。插入序列可以侧翼有如本文公开的一个或多个同源臂，以靶向整合到基因组中，例如，通过同源定向修复、同源重组或适合整合到基因组中的任何其他方法。
在一些情况下，如本文公开的基因编辑部分可以与另外的功能部分融合(例如，以形成融合部分)，并且所述另外的功能部分的功能的非限制性例子可以包括甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光裂解酶活性或糖基化酶活性、乙酰基转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、脱腺苷化活性、SUMO化活性，脱SUMO化酶活性、脱核糖基化活性、肉豆蔻酰化活性、重塑活性、蛋白酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂合酶活性、异构酶活性、合酶活性、合成酶活性和脱肉豆蔻酰化活性。例如，融合蛋白可以是Cas蛋白和效应物或阻遏物功能部分的融合。
可替代地或另外地，基因编辑(例如，敲入)或递送异源遗传物质可以利用其他基于病毒和/或非病毒的基因转移方法以将核酸引入宿主细胞(例如，干细胞、造血干细胞、免疫细胞、如本文所公开的)中。在一些实施方案中，病毒载体可以用于将基因编辑部分引入细胞中。此类方法可以用于向培养物中的细胞或宿主生物体中的细胞施用本公开文本的插入序列。病毒载体递送系统可以包括DNA和RNA病毒。非病毒载体递送系统可以包括DNA质粒、RNA(例如，本文所述载体的转录物)、裸核酸、和与递送载体(诸如脂质体)复合的核酸。
基于RNA或DNA病毒的系统可以用于靶向特定细胞并且将病毒有效载荷运送到细胞核。病毒载体可以用于体外或离体处理细胞，并且工程化细胞可以任选地施用于受试者。可替代地或另外，病毒载体可以直接(在体内)施用于受试者。基于病毒的系统可以包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒载体。在一些实施方案中，整合在宿主基因组中可以与逆转病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法一起发生，这可以导致插入的转基因的长期表达。
核酸的非病毒递送方法可以包括脂转染、核转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子、和DNA的药剂增强摄取。可以使用阳离子和中性脂质，所述脂质适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染。
可替代地或另外，反义寡核苷酸可以用于抑制或沉默靶基因的表达。反义寡核苷酸的非限制性例子可以包括短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)。
可以使用任何合适的方法来制备本公开文本的工程化细胞。
制备工程化细胞的方法可以包括使用载体，例如，以引入包含本公开文本的转基因的核酸序列。载体可以是任何遗传元件，例如质粒、染色体、病毒或转座子。合适的载体包括但不限于质粒、转座子、噬菌体和粘粒。载体可以含有多核苷酸序列，所述多核苷酸序列对于实现将插入序列连接或插入所希望的宿主细胞的本文公开的基因组位点和/或实现转基因的表达是必需的。此类序列可以包括实现转录的启动子序列、增加转录的增强子序列、核糖体结合位点序列以及转录和翻译终止序列。载体可以包含选择标记基因。
可用于本文所述的方法和组合物的载体可以是良好生产规范(GMP)相容的载体。例如，GMP载体可以比非GMP载体更纯。
G.使用方法
可以使用(例如，施用)本公开文本的工程化细胞以治疗有需要的受试者。受试者可以具有或可以疑似具有病症，诸如疾病(例如，癌症、肿瘤、组织变性、纤维化等)。可以从受试者获得细胞(例如，干细胞或定型成体细胞)，并且此类细胞可以离体培养并且经遗传修饰以产生本文公开的任何受试者工程化细胞(例如，任何工程化NK细胞)。随后，可以将工程化细胞施用于受试者，例如用于适应性免疫疗法。
可以用本公开文本的工程化细胞(例如，工程化NK细胞)群体治疗(例如，施用)受试者，至少或最多约1剂、至少或最多约2剂、至少或最多约3剂、至少或最多约4剂、至少或最多约5剂、至少或最多约6剂、至少或最多约7剂、至少或最多约8剂、至少或最多约9剂或至少或最多约10剂。
施用于有需要的受试者的工程化细胞可以是受试者自体的。施用于有需要的受试者的工程化细胞可以是对受试者而言同种异体的，例如，完全HLA匹配的，在1、2、3、4、5、6、7或8个HLA等位基因或至少1个、至少2个、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7个或至少8个HLA等位基因处HLA匹配的。施用于有需要的受试者的工程化细胞可以是与受试者单倍体相合的。施用于有需要的受试者的工程化细胞可以来自与受试者相关的供体。施用于有需要的受试者的工程化细胞可以来自与受试者不相关的供体。
在某些实施方案中，如本文所述将冷冻保存的细胞(例如，工程化细胞)解冻和洗涤，并且在使用本公开文本的方法激活之前在室温下静置一小时。在一方面，包含工程化细胞的组合物可以包括细胞的剂型，例如单位剂型。
在一方面，本公开文本提供了一种方法，所述方法包括：(a)从受试者获得细胞；和(b)从所述细胞产生本文公开的任何一种工程化细胞(例如，工程化NK细胞)。在一些情况下，从受试者获得的细胞是ESC。在一些情况下，从受试者获得的细胞(例如，成纤维细胞，诸如成体皮肤成纤维细胞)经修饰并且转化为iPSC。
在一方面，本公开文本提供了一种方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含本文公开的任何一种工程化细胞(例如，工程化NK细胞)的NK细胞群体。在一些情况下，所述方法可以进一步包括向受试者施用共治疗剂(例如，化疗剂、抗CD20抗体等)。
在一方面，本公开文本提供了一种方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文公开的任何一种组合物。在一些情况下，所述组合物可以包含(i)本文公开的任何一种工程化细胞(例如，工程化NK细胞)，和(ii)共治疗剂(例如，化学治疗剂、抗CD20抗体等)。
本文公开的任何一种方法可以用于治疗受试者的靶细胞、靶组织、靶病症或靶疾病。
在一些实施方案中，工程化细胞包含在本公开文本的基因组位点处的编码嵌合多肽受体的转基因，所述嵌合多肽受体识别由靶细胞表达和/或呈递的抗原，在识别所述抗原后触发所述工程化细胞的希望反应。
靶疾病可以是病毒、细菌和/或寄生虫感染；炎性和/或自身免疫性疾病；或赘生物，诸如癌症和/或肿瘤。
靶细胞可以是患病细胞。患病细胞可以具有改变的代谢、基因表达和/或形态特征。患病细胞可以是癌细胞、糖尿病细胞或凋亡细胞。患病细胞可以是来自患病受试者的细胞。示例性疾病可以包括血液疾病、癌症、代谢疾病、眼睛疾病、器官疾病、肌肉骨骼疾病、心脏病等。
可以使用本文公开的任何一种工程化细胞(例如，工程化NK细胞)杀伤多种靶细胞。在一些实施方案中，工程化细胞包含在本公开文本的基因组位点处的编码嵌合多肽受体的转基因，并且所述嵌合多肽受体识别由靶细胞表达和/或呈现的抗原。靶细胞可以包括多种多样的细胞类型。靶细胞可以在体外。靶细胞可以在体内。靶细胞可以是离体的。靶细胞可以是分离的细胞。靶细胞可以是生物体内部的细胞。靶细胞可以是生物体。靶细胞可以是细胞培养物中的细胞。靶细胞可以是细胞集合中的一个。靶细胞可以是哺乳动物细胞或源自哺乳动物细胞。靶细胞可以是啮齿动物细胞或源自啮齿动物细胞。靶细胞可以是人类细胞或源自人类细胞。靶细胞可以是原核细胞或源自原核细胞。靶细胞可以是细菌细胞或可以源自细菌细胞。靶细胞可以是古菌细胞或可以源自古菌细胞。靶细胞可以是真核细胞或可以源自真核细胞。靶细胞可以是多能干细胞。靶细胞可以是植物细胞或源自植物细胞。靶细胞可以是动物细胞或源自动物细胞。靶细胞可以是无脊椎动物细胞或源自无脊椎动物细胞。靶细胞可以是脊椎动物细胞或源自脊椎动物细胞。靶细胞可以是微生物细胞或源自微生物细胞。靶细胞可以是真菌细胞或源自真菌细胞。靶细胞可以来自特定的器官或组织。
靶细胞可以是干细胞或祖细胞。靶细胞可以包括干细胞(例如，成体干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞(iPSC))和祖细胞(例如，心脏祖细胞、神经祖细胞等)。靶细胞可以包括哺乳动物干细胞和祖细胞，包括啮齿动物干细胞、啮齿动物祖细胞、人类干细胞、人类祖细胞等。克隆细胞可以包含细胞的后代。靶细胞可以包含靶核酸。靶细胞可以在活生物体中。靶细胞可以是经遗传修饰的细胞。靶细胞可以是宿主细胞。
靶细胞可以是全能干细胞，然而，在本公开文本的一些实施例中，术语“细胞”可以使用，但可以不是指全能干细胞。靶细胞可以是植物细胞，但在本公开文本的一些实施方案中，术语“细胞”可以使用，但可以不是指植物细胞。靶细胞可以是多能细胞。例如，靶细胞可以是造血细胞，其可以分化成造血细胞谱系中的其他细胞，但可能不能分化成任何其他非造血细胞。靶细胞可能能够发育成整个生物体。靶细胞可能或可能不能发育成整个生物体。靶细胞可以是整个生物体。
靶细胞可以是原代细胞。例如，原代细胞的培养物可以传代0次、1次、2次、4次、5次、10次、15次或更多。细胞可以是单细胞生物体。细胞可以在培养物中生长。
靶细胞可以是患病细胞。患病细胞可以具有改变的代谢、基因表达和/或形态特征。患病细胞可以是癌细胞、糖尿病细胞或凋亡细胞。患病细胞可以是来自患病受试者的细胞。示例性疾病可以包括血液疾病、癌症、代谢疾病、眼睛疾病、器官疾病、肌肉骨骼疾病、心脏病等。
如果靶细胞是原代细胞，则可以通过任何方法从个体中收获它们。例如，可以通过单采、白细胞去除术、密度梯度分离等收获白细胞。可以通过活检从诸如皮肤、肌肉、骨髓、脾脏、肝脏、胰腺、肺、肠、胃等组织中收获细胞。可以使用适当的溶液，用于分散或悬浮收获的细胞。此类溶液通常可以是平衡的盐溶液(例如，生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、汉克平衡盐溶液等)，方便地补充有胎牛血清或其他天然存在的或合成的因子，并且结合低浓度的可接受缓冲液。缓冲液可以包括HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。细胞可以立即使用或可以储存(例如，通过冷冻)。冷冻细胞可以解冻，并且可以重复使用。可以将细胞冷冻在DMSO、血清、培养基缓冲液(例如，10％DMSO、50％血清、40％缓冲培养基)和/或用于在冷冻温度下保存细胞的一些其他此类普通溶液中。
可以作为靶细胞的细胞的非限制性例子包括但不限于淋巴样细胞，诸如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节T细胞、T辅助细胞)、自然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞(参见例如US20080241194)；髓样细胞，诸如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞/分叶过多嗜中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、红细胞、网织红细胞、肥大细胞、血小板/巨核细胞、树突状细胞；来自内分泌系统的细胞，包括甲状腺(甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺(甲状旁腺主细胞、嗜酸细胞)、肾上腺(嗜铬细胞)、松果体(松果体细胞)细胞；神经系统的细胞，包括神经胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞)、大细胞神经分泌细胞、星状细胞、伯特歇尔细胞和垂体(促性腺激素、促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、促生长素、促乳激素)；呼吸系统的细胞，包括肺细胞(I型肺细胞、II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯状细胞、噬尘细胞；循环系统的细胞，包括心肌细胞、周皮细胞；消化系统的细胞，包括胃(胃主细胞、壁细胞)、杯状细胞、帕内特细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞；肠内分泌细胞，包括肠嗜锚细胞、APUD细胞、肝细胞(例如，肝细胞或枯氏细胞)、软骨/骨/肌肉；骨细胞，包括成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、牙齿细胞(成牙骨质细胞、成釉细胞)；软骨细胞，包括成软骨细胞、软骨细胞；皮肤细胞，包括刺细胞、角质形成细胞、黑色素细胞(痣细胞)；肌肉细胞，包括肌细胞；泌尿系统细胞，包括足状突细胞、近肾小球细胞、肾小球内系膜细胞/肾小球外系膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞、致密斑细胞；生殖系统细胞，包括精子、塞尔托利氏细胞、莱氏细胞、卵子；以及其他细胞，包括脂肪细胞，成纤维细胞，肌腱细胞，表皮角质形成细胞，表皮基底细胞，指甲和趾甲的角质形成细胞，甲床基底细胞，髓质毛干细胞，皮质毛干细胞，表皮毛干细胞，表皮毛根鞘细胞，赫胥黎层毛根鞘细胞，亨勒层毛根鞘细胞，外毛根鞘细胞，毛发基质细胞，湿复层屏障上皮细胞，角膜、舌、口腔、食道、肛管、尿道远端和阴道的复层鳞状上皮的表面上皮细胞，角膜、舌、口腔、食道、肛管、尿道远端和阴道的上皮的基底细胞，尿路上皮细胞，外分泌上皮细胞，唾液腺粘液细胞，唾液腺浆液细胞，舌的埃伯内腺细胞，乳腺细胞，泪腺细胞，耳部耵聍腺细胞，外分泌汗腺暗细胞，外分泌汗腺透明细胞。大汗腺细胞、眼睑的莫耳腺细胞、皮脂腺细胞、鼻子的鲍曼氏腺细胞、十二指肠的十二指肠腺细胞、精囊细胞、前列腺细胞、尿道球腺细胞、巴多林氏腺细胞、利特雷氏腺细胞、子宫内膜细胞、分离的呼吸道和消化道杯状细胞、胃壁粘液细胞、胃腺酶原细胞、胃腺泌酸细胞、胰腺腺泡细胞、小肠帕内特细胞、肺的II型肺细胞、肺克拉拉细胞、激素分泌细胞、垂体前叶细胞、促生长激素细胞、催乳素细胞、促甲状腺激素细胞、促性腺激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞、中间垂体细胞、大细胞神经分泌细胞、肠和呼吸道细胞、甲状腺细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、甲状旁腺细胞、甲状旁腺主细胞、嗜酸细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸的莱迪希细胞、卵巢卵泡的泡膜内细胞、破裂的卵巢卵泡的黄体细胞、粒层叶黄素细胞、泡膜叶黄素细胞、近肾小球细胞、肾脏的致密斑细胞、代谢和贮藏细胞、屏障功能细胞(例如，肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、肾脏、I型肺细胞、胰腺导管细胞(泡心细胞)、(汗腺、唾液腺、乳腺等的)非横纹管细胞、(精囊、前列腺等的)导管细胞、封闭体腔内壁的上皮细胞、具有推进功能的纤毛细胞、胞外基质分泌细胞、收缩细胞；骨骼肌细胞、干细胞、心肌细胞、血液和免疫系统细胞、红细胞、巨核细胞、单核细胞、结缔组织巨噬细胞(各种类型)、表皮朗格汉斯细胞、破骨细胞、树突状细胞、小胶质细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、网织红细胞、干细胞和针对血液和免疫系统的定型祖细胞(各种类型)、多能干细胞、全能干细胞、诱导多能干细胞、成体干细胞、感觉传导细胞、神经元、自主神经元细胞、感觉器官和周围神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、晶状体细胞、色素细胞、黑色素细胞、视网膜色素上皮细胞、生殖细胞、卵原细胞/卵母细胞、精细胞、精母细胞、精原细胞、精子、哺育细胞、卵巢卵泡细胞、塞尔托利氏细胞、胸腺上皮细胞、间质细胞、肾间质细胞、和分化成或将要分化成本文公开的任何细胞类型的干细胞。
特别令人感兴趣的是癌细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是癌细胞。癌细胞的非限制性例子包括癌症的细胞，所述癌症包括棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端黑色素瘤、肢端汗腺瘤、急性嗜酸性粒细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性成巨核细胞白血病、急性单核细胞白血病、伴随成熟的急性成髓细胞白血病、急性髓样树突状细胞白血病、急性髓样白血病、急性早幼粒细胞白血病、釉质瘤、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、腺瘤样牙源性肿瘤、肾上腺皮质癌、成人T细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、艾滋病相关癌症、艾滋病相关淋巴瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、未分化甲状腺癌、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、血管平滑肌脂肪瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样瘤、基底细胞癌、基底细胞样癌、B细胞白血病、B细胞淋巴瘤、贝利尼导管癌(Bellini duct carcinoma)、胆道癌、膀胱癌、母细胞瘤、骨癌、骨肿瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、布伦纳肿瘤、支气管肿瘤、细支气管肺泡癌、棕色肿瘤、伯基特淋巴瘤、原发部位不明的癌症、类癌瘤、癌、原位癌、阴茎癌、原发部位不明的癌、癌肉瘤、Castleman病、中枢神经系统胚胎肿瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、宫颈癌、胆管癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性单核细胞白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性骨髓增生性障碍、慢性嗜中性粒细胞白血病、透明细胞瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、Degos病、隆突性皮肤纤维肉瘤、皮样囊肿、促纤维增生性小圆形细胞肿瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胚胎发育不良性神经上皮肿瘤、胚胎癌、内胚窦肿瘤、子宫内膜癌、子宫内膜癌、子宫内膜样肿瘤、肠病相关T细胞淋巴瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、上皮样肉瘤、红白血病、食道癌、嗅神经母细胞瘤、尤文家族肿瘤、尤文家族肉瘤、尤文肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、乳腺外佩吉特病、输卵管癌、寄生胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性甲状腺癌、胆囊癌、胆囊癌、神经节胶质瘤、神经节神经瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠道癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质肿瘤、胃肠道间质肿瘤、生殖细胞肿瘤、生殖细胞瘤、生殖细胞瘤、妊娠绒毛膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、骨巨细胞肿瘤、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、大脑胶质瘤病、血管球瘤、胰高血糖素瘤、性腺母细胞瘤、粒层细胞肿瘤、毛细胞白血病、毛细胞白血病、头颈癌、头颈癌、心脏癌、血管母细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、血液系统恶性肿瘤、肝细胞癌、肝脾T细胞淋巴瘤、遗传性乳腺卵巢癌综合征、霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑胶质瘤、炎性乳腺癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞肿瘤、幼年型粒单核细胞白血病、卡波西肉瘤、卡波西肉瘤、肾癌、肝门部胆管癌(Klatskin tumor)、库肯勃肿瘤(Krukenberg tumor)、喉癌、喉癌、恶性雀斑样痣性黑色素瘤、白血病、白血病、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴样白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、恶性骨纤维组织细胞瘤、恶性神经胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性周围神经鞘肿瘤、恶性横纹肌样肿瘤、恶性蝾螈瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肥大细胞白血病、纵隔生殖细胞肿瘤、纵隔肿瘤、甲状腺髓样癌、成神经管细胞瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、转移性尿路上皮癌、混合性苗勒管肿瘤、单核细胞白血病、口癌、粘液性肿瘤、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、蕈样真菌病、蕈样真菌病、骨髓增生异常疾病、骨髓增生异常综合征、髓样白血病、髓样肉瘤、骨髓增生性疾病、粘液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、鼻咽癌、赘生物、神经鞘瘤、成神经细胞瘤、成神经细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节性黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼部肿瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、嗜酸细胞瘤、视神经鞘脑膜瘤、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、乳腺佩吉特病、肺上沟肿瘤、胰腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、血管周围上皮样细胞肿瘤、咽癌、嗜铬细胞瘤、中间分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体肿瘤、浆细胞赘生物、胸膜肺母细胞瘤、多胚瘤、前体T淋巴母细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹膜癌、原始神经外胚层肿瘤、前列腺癌、腹膜假粘液瘤、直肠癌、肾细胞癌、涉及染色体15上的NUT基因的呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、Richter氏转化、骶尾部畸胎瘤、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤病、皮脂腺癌、继发性赘生物、精原细胞瘤、浆液性肿瘤、支持-间质细胞肿瘤(Sertoli-Leydigcell tumor)、性索间质肿瘤、塞扎里综合征(Sezary Syndrome)、印戒细胞癌、皮肤癌、小蓝圆细胞肿瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、煤灰疣、脊髓肿瘤、脊柱肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、浅表播散性黑色素瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、表面上皮-间质肿瘤、滑膜肉瘤、T细胞急性成淋巴细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞前淋巴细胞白血病、畸胎瘤、晚期淋巴癌、睾丸癌、卵泡膜细胞瘤、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌、尿道癌、泌尿生殖器赘生物、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、阴道癌、弗纳-莫里森综合征(Verner Morrison syndrome)、疣状癌、视觉通路神经胶质瘤、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、沃辛瘤、维尔姆斯瘤及其组合。在一些实施方案中，所述靶癌细胞表示癌细胞群体内的亚群，诸如癌症干细胞。在一些实施方案中，所述癌症是造血谱系的，诸如淋巴瘤。抗原可以是肿瘤相关抗原。
在一些情况下，如本文公开的靶细胞(例如，B细胞)与自身免疫性疾病相关或疑似与自身免疫性疾病相关。用本公开文本的任何一种工程化细胞(例如，工程化NK细胞)治疗的受试者可以具有或可以疑似具有自身免疫性疾病。
自身免疫性疾病的非限制性例子可以包括急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死出血性脑白质脑炎、阿狄森氏病、无丙种球蛋白血症、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗体介导的移植排斥、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经障碍、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病、巴娄病(Balo disease)、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、Castleman病、乳糜泻、查加斯病、慢性疲劳综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、查格-施特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、克罗恩病、柯根氏综合征(Cogans syndrome)、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST病、原发性混合冷球蛋白血症、脱髓鞘神经病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(Devic'sdisease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒综合征(Dressler's syndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、实验性过敏性脑脊髓炎、伊文综合征(Evanssyndrome)、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征、肉芽肿病伴多血管炎(GPA)、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本脑炎、桥本甲状腺炎、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、高丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫调节性脂蛋白、包涵体肌炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、幼年型糖尿病、川崎综合征、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)、白细胞碎裂性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木质性结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮(SLE)、莱姆病、梅尼埃病、显微镜下多血管炎、混合结缔组织病(MCTD)、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、蚕蚀性角膜溃疡(Mooren's ulcer)、穆-哈二氏病(Mucha-Habermanndisease)、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(德维克氏)、嗜中性粒细胞减少症、眼部瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病、PANDAS(与链球菌相关的儿童自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)、帕罗综合征(Parry Romberg syndrome)、帕森-特纳综合征(Parsonnage-Turner syndrome)、扁平部炎(周围葡萄膜炎)、天疱疮、周围神经病、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型和III型自身免疫性多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、黄体酮皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、银屑病、银屑病性关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、雷诺现象、反射性交感神经营养不良、雷特氏综合征、复发性多软骨炎、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏综合征(Susac'ssyndrome)、交感性眼炎、多发性大动脉炎(Takayasu's arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、托洛萨-亨特综合征(Tolosa-Hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、水疱性皮肤病、白癜风、华氏巨球蛋白血症(WM)和韦格纳氏肉芽肿病(肉芽肿病伴多血管炎(GPA))。
在一些情况下，自身免疫性疾病包括选自以下的一个或多个成员：类风湿性关节炎、1型糖尿病、系统性红斑狼疮(狼疮或SLE)、重症肌无力、多发性硬化症、硬皮病、艾迪生氏病、大疱性类天疱疮、寻常型天疱疮、格林-巴利综合征、干燥综合征、皮肌炎、血栓性血小板减少性紫癜、高丙种球蛋白血症、意义不明的单克隆球蛋白病(MGUS)、华氏巨球蛋白血症(WM)、慢性炎性脱髓鞘性多神经性神经病(CIDP)、桥本脑病(HE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、韦格纳氏肉芽肿病、和抗体介导的移植排斥反应(例如，对于组织移植，诸如肾移植)。例如，自身免疫性疾病可以是1型糖尿病、狼疮或类风湿性关节炎。
在一些情况下，靶疾病是急性髓样白血病(AML)。例如，包含在基因组位点处的人工诱导的修饰的本文公开的任何一种工程化细胞(例如，工程化NK细胞)可以施用于有需要的受试者以治疗AML。在一些实施方案中，工程化细胞是工程化NK细胞，其包含以下中的一种或多种：(i)如本文公开的嵌合多肽受体，其包含能够结合抗原(例如，CD33)的抗原结合结构域，(ii)如本文公开的细胞因子(例如，IL-15)，和(iii)如本文公开的用于增强的CD16信号传导的CD16变体。可以将工程化NK细胞施用于有需要的受试者以治疗AML。
在一些情况下，靶疾病是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
在一些情况下，靶疾病是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
在一些情况下，靶疾病是B细胞白血病(BCL)。例如，包含在基因组位点处的人工诱导的修饰的本文公开的任何一种工程化细胞(例如，工程化NK细胞)可以施用于有需要的受试者以治疗BCL。在一些实施方案中，工程化细胞是工程化NK细胞，其包含以下中的一种或多种：(i)如本文公开的嵌合多肽受体，其包含能够结合CD19的抗原结合结构域，(ii)如本文公开的细胞因子(例如，IL-15)，和(iii)如本文公开的用于增强的CD16信号传导的CD16变体。可以将工程化NK细胞施用于有需要的受试者以治疗BCL。
在一些情况下，靶疾病是非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一些情况下，靶细胞形成肿瘤(例如，实体瘤)。用本文方法治疗的肿瘤可以导致稳定的肿瘤生长(例如，一个或多个肿瘤在大小上不增加超过1％、超过5％、超过10％、超过15％或超过20％，和/或不转移)。在一些情况下，肿瘤稳定至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11或至少约12或更多周。在一些情况下，肿瘤稳定至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11或至少约12或更多个月。在一些情况下，肿瘤稳定至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9或至少约10或更多年。在一些情况下，肿瘤的大小或肿瘤细胞的数量减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多。在一些情况下，肿瘤被完全消除或降低到低于检测水平。在一些情况下，在治疗后，受试者保持无肿瘤(例如，处于缓解)持续至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12或更多周。在一些情况下，在治疗后，受试者保持无肿瘤持续至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12或更多个月。在一些情况下，在治疗后，受试者保持无肿瘤持续至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10或更多年。
在一些情况下，将工程化细胞配制在药物组合物中，所述药物组合物包含工程化细胞以及药学上可接受的赋形剂、媒介物、载体或稀释剂。可以使用一种或多种生理上可接受的载体(包括赋形剂和助剂)以常规方式配制药物组合物，所述载体有助于将活性化合物或细胞加工成可药学使用的制剂。恰当的配制品可以取决于所选择的施用途径。本文描述的药物组合物的概述在以下中找到：例如，Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,宾夕法尼亚州伊斯顿1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.编辑,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,纽约州纽约,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第七版(Lippincott Williams&Wilkins 1999)。
在某些实施方案中，组合物还可以包含一种或多种pH调节剂或缓冲剂，包括酸，诸如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，诸如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；以及缓冲液，诸如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。此类酸、碱和缓冲液的包含量可以有效地将组合物的pH保持在可接受范围内。
在一些实施方案中，组合物还可以包含一种或多种盐，其量是使组合物的重量渗透压摩尔浓度达到可接受范围所需的。此类盐包括具有钠、钾或铵阳离子和氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的那些盐，合适的盐包括但不限于氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
本文所述的药物组合物可以通过任何合适的施用途径施用，所述施用途径包括但不限于肠胃外(例如，静脉内、瘤内、皮下、肌内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)、鼻内、经颊、舌下、口服、或直肠施用途径。在一些情况下，所述药物组合物被配制用于肠胃外(例如，静脉内、瘤内、皮下、肌内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)施用。
将本文所述的药物组合物配制成任何合适的剂型，包括但不限于水性分散体、液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆料、混悬剂等，用于施用于待治疗的受试者。在一些实施方案中，将所述药物组合物配制成溶液(例如，用于静脉内施用)。在一些情况下，所述药物组合物被配制为输液。在一些情况下，所述药物组合物被配制为注射剂。
肠胃外施用可以例如通过推注或随着时间逐渐输注或灌注。施用也可以通过手术沉积细胞团或沉淀物，或定位医疗装置。
本文所述的药物固体剂型任选地包括本文所述的化合物或细胞以及一种或多种药学上可接受的添加剂，诸如相容的载体、粘合剂、填充剂、助悬剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、润湿剂、增塑剂、稳定剂、渗透增强剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或其一种或多种组合。
IV.实施例
H.实施例1：候选安全港基因座的鉴定
在第一方法中，数据来源于ENCODE，包括与以下相关的数据：DNaseI敏感性、H3K4me3组蛋白甲基化、H3K27ac组蛋白乙酰化、全基因组亚硫酸氢盐测序、RNAseq、LaminB1、超级增强子、snoRNA、lincRNA、miRNA、tRNA和超保守元件。数据针对组织和细胞类型，包括NK、CMP、T细胞、B细胞、CD14+单核细胞、肝、肺、肌肉和胃。处理文件以生成滑动窗口的得分矩阵，对其进行质量检查，合并，并且用于计算平均信号、存在率和方差系数。基于脱氧核糖核酸酶超敏反应和组蛋白芯片序列对数据进行处理以鉴定开放染色质区域。然后基于与最近编码基因的距离、与最近的癌症相关基因的距离、与snoRNA、lincRNA和miRNA的距离、在基因转录单位内部或外部的存在、在超保守区内部或外部的存在、以及存在于vista增强子区内部或外部的存在对开放区域进行分级。
在第二方法中，对通过单细胞RNA-seq数据鉴定的300候选区进行相似标准的评价。
对通过两种方法鉴定的候选者进行排名，并且手动检查安全港的适用性。在基因组参考联盟人类构建38(GRCh38/hg38)中鉴定出的候选安全港基因座的例子示出在表1中。
表1
Figure BDA0003763508060000701
Figure BDA0003763508060000711
I.实施例2：候选安全港基因座中的报告基因整合
使用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑以将报告基因表达盒通过同源定向修复整合在候选基因座。设计供体质粒，其包括用于靶向整合在候选安全港基因座处的同源臂，以及由组成型启动子(例如，hEF-1a)驱动的GFP或RFP。盒还包括土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)，以增强报告基因的表达。
将供体质粒和Cas9-gRNA核糖核蛋白共转染到细胞中，例如H9人胚胎干细胞(hESC)和ALD诱导的多能干细胞(iPSC)。将已知的安全港位点AAVS1和H11用作对照。
所用的gRNA的例子提供在表2中。
表2
安全港名称 gRNA
hSH1 GATGAACCAGTCAAGTGATC
hSH2 CGCGCTTGATTCTGAGGGTC
hSH3 TTAGCGACTGCGGCCCTATC
hSH4 GGCACCAAAGTACGAATCCT
hSH5 TCAGGTAGTTCAGTGTAATC
hSH6 CCCGAGAACTCACGTCAGAG
hSH7 AGAGCGGGTTGGTCCTGTTT
hSH8 GGGTTACGTAACGGGCTGCG
hAAVS1 GATTCCCTTCTCAGGTTACG
hH11 TGCACCTTCGCCCAAGTTAT
通过荧光激活细胞分选(FACS)分离单细胞克隆并且扩增。在克隆长大之后，进行连接PCR以确认报告基因在候选安全港基因座处的整合，并且进行ddPCR以筛选仅具有单个拷贝的整合的报告基因的克隆。
J.实施例3：从人胚胎干细胞(hESC)中的候选安全港基因座处表达转基因的稳定性
评价如实施例2中产生的选择克隆的在人胚胎干细胞(hESC)中转基因表达的稳定性。将hESC克隆在培养物中保持最多8个传代，并且通过流式细胞术评估表达报告基因的后代的百分比。
在hSH1基因座处整合表达盒的克隆在三次传代后在99.2％-99.7％的细胞中展现出转基因表达(图1，左上图)。
在hSH3基因座处整合表达盒的克隆在四次传代后在99％-99.9％的细胞中展现出转基因表达(图1，左下图)。
在hSH6基因座处整合表达盒的克隆在七次传代后在99.4％-99.8％的细胞中展现出转基因表达(图1，右上图)。
在hSH8基因座处整合表达盒的克隆在八次传代后在100％的细胞中展现出转基因表达(图1，右下图)。
在hAAVS1(对照)基因座处整合表达盒的克隆在5-7次传代后在51.2％-98.8％的细胞中展现出转基因表达(图2，上图)。值得注意地，六个克隆中的四个通过第5或6次传代展现出相当大的转基因表达沉默，并且在12％-48.8％的细胞中表达丧失。单细胞PCR表明GFP阴性群体起源于沉默而非野生型细胞污染，因为GFP阴性群体与GFP阳性群体之间的连接PCR阳性率相当。
在hH11(对照)基因座处整合表达盒的克隆在5-7次传代后在2.64％-67.6％的细胞中展现出转基因表达(图2，下图)。值得注意地，所有克隆都展现出相当大的转基因表达沉默，并且在32.4％-97.36％的细胞中表达丧失。对分选细胞进行ddPCR表明GFP阴性群体起源于沉默而非野生型细胞污染，因为根据ddPCR，未分选的、分选的GFP阴性、和分选的GFP阳性群体各具有1个GFP拷贝。
具有整合在hSH8基因座处的表达盒的克隆被进一步评估至第20次传代，并且在20次传代后在99.9％-100％的细胞中展现出转基因表达(图3，每行代表不同的克隆)。
这些数据证明，与现有的安全港基因座相比，本公开文本的安全港基因座在转基因表达方面展现出优异的稳定性。
K.实施例4：从ALD诱导多能干细胞(iPSC)中的候选安全港基因座处表达转基因的稳定性
评价如实施例2中产生的选择克隆的在iPSC中转基因表达的稳定性。将iPSC克隆在培养物中保持最多5个传代，并且通过流式细胞术评估表达报告基因的后代的百分比。
在hSH1基因座处整合表达盒的克隆在三次传代后在99.9％-100％的细胞中展现出转基因表达(图4A，左上图)。
在hSH3基因座处整合表达盒的克隆在三次传代后在100％的细胞中展现出转基因表达(图4A，右上图)。
在hSH8基因座处整合表达盒的克隆在三至五次传代后在100％的细胞中展现出转基因表达(图4A，左下图)。
在hAAVS1(对照)基因座处整合表达盒的克隆在3-4次传代后在92％-99.9％的细胞中展现出转基因表达(图4A，右下图)。值得注意地，通过第3-4次传代，七个克隆中的四个在至少2％的细胞中展现出表达丧失。
在随后的传代中，在具有整合在hAAVS1(对照)基因座处的表达盒的克隆中观察到表达的逐渐丧失(图4B)。相比之下，对于在hSH1或hSH8处整合表达盒的克隆，100％的细胞保持转基因的高表达至至少第21或22次传代(分别为图4C和图4D)。
这些数据证明，与现有的安全港基因座相比，本公开文本的安全港基因座在转基因表达方面展现出优异的稳定性。
L.实施例5：在分化为胚状体(EB)后从干细胞中的候选安全港基因座处表达转基因的稳定性
评价如实施例2中产生的选择克隆在分化成胚状体(EB)后转基因表达的稳定性。通过流式细胞术评估表达报告基因的后代的百分比，并且CD34用作指示分化的标记物。
在第一实验中，在iPSC中评估hSH8。CD34+细胞在分化方案的第9天出现，此时100％的活细胞维持转基因表达(图5A)。相比之下，大约10％-13％的具有整合在AAVS1处的表达盒的细胞展现出转基因表达的损失(图5B)。
在第二实验中，在iPSC中评估hSH1和hSH3。CD34+细胞在分化方案的第9天出现，此时100％的具有整合在hSH1处的表达盒的活细胞和99.4％-99.9％的具有整合在hSH3处的表达盒的活细胞维持转基因表达(图6)。
这些数据证明，本公开文本的安全港基因座可以通过细胞分化过程(包括干细胞向胚状体的分化)促进稳定的转基因表达。
M.实施例6：在分化为自然杀伤(NK)细胞后从干细胞中的候选安全港基因座处表达转基因的稳定性
评价如实施例2中产生的选择克隆的在分化为NK细胞后转基因表达的稳定性。通过流式细胞术评估表达报告基因的后代的百分比，并且CD45和CD56用作指示NK细胞的标记物。
在第一实验中，在iPSC中评估hSH8。CD45+CD56+NK细胞在分化方案的第14天出现，此时所有活细胞的98.2％-99.6％和活NK细胞的99.4％-99.9％维持转基因表达(图7)。NK细胞代表此时大约18％-31％的活细胞(图7)。到第21天，NK细胞代表所有细胞的大约47％-80％，并且所有细胞的97.9％-99.1％维持转基因表达，并且98％-99.9％的NK细胞维持转基因表达(图8)。此时不通过染色排除死细胞。
在第二实验中，在iPSC中评估hSH1。CD45+CD56+NK细胞在分化方案的第14天出现，此时所有细胞的98.2％-99.6％和NK细胞的99.4％-99.9％维持转基因表达(图9)。NK细胞代表此时大约59％-78％的细胞(图9)。到第21天，NK细胞代表所有细胞的大约61％-87％，所有细胞的97.8％-98.7％维持转基因表达，并且99.6％-99.7％的NK细胞维持转基因表达(图10)。在本实验中，不通过染色排除死细胞。
在第三实验中，在iPSC中评估hSH3。CD45+CD56+NK细胞在分化方案的第14天出现，此时所有细胞的83％-98.9％和NK细胞的99.2％-100％维持转基因表达(图11)。NK细胞代表此时大约13％-59％的活细胞(图11)，然而，相对少的细胞可用于评估具有83％转基因表达的克隆。到第21天，NK细胞代表所有细胞的大约59％-87％，所有细胞的97.4％-99.3％维持转基因表达，并且96.7％-100％的NK细胞维持转基因表达(图12)。在本实验中，不通过染色排除死细胞。
这些数据证明，本公开文本的安全港基因座可以通过细胞分化过程(包括干细胞向NK细胞的分化)促进稳定的转基因表达。
N.实施例7：体内植入和分化后从干细胞中的候选安全港基因座表达转基因的稳定性
此实施例证明了从本公开文本的候选安全港基因座的体内稳定的转基因表达。
如实施例2中那样产生在hSH6基因座或hSH8基因座处具有GFP表达盒的hESC克隆。将500万细胞注射到裸鼠中，并且在两个月后，收获脾脏和畸胎瘤组织，并且通过流式细胞术和组织病理学进行加工以评估。抗人HLA抗体用于鉴定源自注射的hESC的细胞。基于前向散射面积与前向散射高度对单细胞进行门控，并且基于碘化丙啶染色对死细胞进行门控。
如图13中所示，基于hHLA染色，来自所收集的畸胎瘤组织的活单细胞的大约40％-50％起源于植入的hESC克隆。在这些细胞中，来自用在hSH8处具有GFP表达盒的克隆注射的动物的细胞的98.8％，在植入和两个月分化为畸胎瘤后保持GFP表达(图13)。
另外，来自用在hSH6处具有表达盒的克隆注射的动物的人细胞的96.7％-97.3％维持转基因表达，并且来自用在hSH8处具有表达盒的克隆注射的动物的人细胞的98.4％-99.8％维持转基因表达(图14)。
加工用于H&E染色的组织切片表明，在hSH6和hSH8处具有表达盒的克隆完全分化为外胚层、中胚层和内胚层谱系(图15)。
这些数据显示，从本公开文本的候选安全港基因座的转基因表达在体内是稳定和持续的，包括在从hESC向畸胎瘤分化两个月之后。
O.实施例8：在本公开文本的安全港基因座中的插入对局部和全局基因表达的影响最小
此实施例证明，在本公开文本的安全港基因座中的转基因插入不会显著破坏内源基因的表达。
如实施例2中那样产生选择H9 hESC克隆，并且在培养物中保持大约6-9次传代。从克隆中提取RNA，并且通过RNA seq进行加工以评估基因表达。在本公开文本的安全港基因座(hSH1、hSH3、hSH6和hSH8；图16A)中插入转基因的克隆相对于在AAVS1或H11基因座中保持有转基因插入的对照H9 hESC培养物展现出非常少的差异化表达基因(图16B)。
这些数据证明，本公开文本的安全港基因座中的转基因插入不会显著破坏局部或全局地内源基因表达。
P.实施例9：工程化免疫细胞的产生
本公开文本的安全港基因座可以用作插入表达盒以产生工程化免疫细胞的位点。例如，可以将编码嵌合多肽受体的表达盒插入本公开文本的安全港基因座中。
在说明性例子中，利用本公开文本的基因组编辑技术诸如如实施例2中所述的CRISPR/Cas9基因组编辑将编码嵌合抗原受体(CAR)的表达盒插入本公开文本的安全港基因座中以产生干细胞克隆，例如，胚胎干细胞或诱导多能干细胞中的hSH1、hSH2、hSH3、hSH4、hSH5、hSH6、hSH7或hSH8中的任一个。
干细胞分化为免疫细胞，例如NK细胞。
表达嵌合多肽受体的工程化免疫细胞被施用于或适于施用于有需要的受试者以治疗疾病，诸如急性髓样白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、B细胞白血病、T细胞白血病、实体瘤或血液癌症。

Claims (74)

1.一种工程化细胞群体，所述群体中的每个工程化细胞包含插入在基因组位点中的转基因，
其中在所述转基因插入所述基因组位点中后，
(i)所述群体的超过98.8％维持所述转基因的表达持续至少约15天，或
(ii)所述群体的超过97.2％维持所述转基因的表达持续至少约21天。
2.一种工程化细胞群体，所述群体中的每个工程化细胞包含插入在非AAVS1的基因组位点中的转基因，
其中在所述转基因插入所述基因组位点中后，
(i)所述群体的超过68％维持所述转基因的表达持续至少约15天，或
(ii)所述群体的超过65％维持所述转基因的表达持续至少约21天。
3.一种工程化细胞群体，所述群体中的每个工程化细胞包含插入在基因组位点中的转基因，
其中所述工程化细胞是多能干细胞，并且
其中在使所述群体经受向细胞谱系的分化后，分化群体的至少约92％维持所述转基因的表达。
4.根据权利要求3所述的工程化细胞群体，其中所述群体经受所述分化持续至少约14或21天。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的工程化细胞群体，其中所述细胞谱系选自胚状体、中胚层细胞、内胚层细胞和外胚层细胞。
6.根据权利要求3或权利要求4所述的工程化细胞群体，其中所述细胞谱系包括造血干细胞。
7.根据权利要求3或权利要求4所述的工程化细胞群体，其中所述细胞谱系包括NK细胞。
8.根据权利要求3或权利要求4所述的工程化细胞群体，其中所述细胞谱系包括T细胞。
9.一种工程化细胞群体，所述群体的每个工程化细胞在基因组位点中包含人工诱导的修饰，
其中所述人工诱导的修饰引起不超过约100个内源基因的表达水平不超过约10倍的变化。
10.一种工程化细胞群体，所述群体的每个工程化细胞在基因组位点中包含人工诱导的修饰，
其中所述人工诱导的修饰引起不超过约10个内源基因的表达水平不超过约10倍的变化，所述内源基因在所述基因组位点的300kb以内。
11.一种工程化细胞群体，所述群体的每个工程化细胞在所述工程化细胞的基因组位点中包含人工诱导的修饰，
其中在5'或3'方向上最接近所述基因组位点的开放阅读框编码核糖体蛋白、泛素调节因子、凋亡调节因子、细胞周期进程调节因子、转录因子或含锌指蛋白，其中所述工程化细胞是干细胞或NK细胞。
12.一种工程化细胞群体，所述群体的每个工程化细胞在所述工程化细胞的基因组位点中包含人工诱导的修饰，其中所述基因组位点是以下之间的基因间区：
(a)TOB2与TEF；
(b)FAU与ZNHIT2；
(c)RPL3与SYNGR1；
(d)RPLP2与PIDD1；
(e)RPS7与RNASEH1；
(f)THEM4与S100A10；
(g)DDIT4与ANAPC16；
(h)ANXA2与FOXB1；
(i)NDUFA4与PHF14；
(j)DDX5与CEP95；
(k)PIN4与RPS4X；
(l)PLEKHG2与RPS16；
(m)TRIM41与RACK1；
(n)HINT1与LYRM7；
(o)CFL1与MUS81；或
(p)VPS13B与COX6C。
13.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述基因组位点与可操作地偶联至一个或多个内源基因的启动子相邻，所述一个或多个内源基因选自FAU、ZNHIT2、RPL3、RPLP2、RPS7、TMEM4、S100A10、ANAPC16、DDIT4、FOXB1、ANXA2、TEF、TOB2、NDUFA4、DDX5、CEP95、PIN4、RPS4X、PLEKHG2、RPS16、TRIM41、RACK1、HINT1、CFL1、MUS81、VPS13B和COX6C。
14.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述基因组位点与来自基因组参考联盟人类构建38(GRCh38/hg38)人类基因组的一个或多个序列具有至少80％的序列同一性，所述一个或多个序列选自：
(a)chr22:41,413,106-41,414,808；
(b)chr11:65,117,969-65,120,057；
(c)chr22:39,319,072-39,321,167；
(d)chr11:808,403-810,414；
(e)chr2:3,574,031-3,576,263；
(f)chr1:151,944,637-151,946,598；
(g)chr10:72,259,705-72,261,554；
(h)chr15:60,126,969-60,128,831；
(i)chr7:10,940,150-10,940,760；
(j)chr17:64,506,290-64,506,960；
(k)chrX:72,268,950-72,270,750；
(l)chr19:39,430,700-39,431,400；
(m)chr5:181,235,790-181,236,860；
(n)chr5:131,165,330-131,165,510；
(o)chr11:65,859,410-65,860,050；和
(p)chr8:99,877,580-99,877,850。
15.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中在将所述工程化细胞引入宿主受试者后，所述群体中超过80％的细胞维持所述转基因的表达持续至少约两个月。
16.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述基因组位点距所述基因组中最近的开放阅读框至少0.5kb、1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb或15kb。
17.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述基因组位点距所述基因组中最近的癌症相关基因至少1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、50kb、60kb、70kb、75kb、80kb、90kb或100kb。
18.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述基因组位点距所述基因组中最近的snoRNA编码基因、miRNA编码基因或lincRNA编码基因至少1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、50kb、60kb、70kb、75kb、80kb、90kb或100kb。
19.根据权利要求9-18中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述人工诱导的修饰包括将转基因插入所述基因组位点中。
20.根据权利要求9-19中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述人工诱导的修饰引起不超过约55个内源基因的表达水平不超过约2倍的变化。
21.根据权利要求9-20中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述人工诱导的修饰引起任何内源基因的表达水平不超过约2倍的变化，所述内源基因在所述基因组位点的300kb以内。
22.根据权利要求1-8和13-19中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述转基因编码免疫受体。
23.根据权利要求1-8和13-19中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述转基因编码抗原识别受体。
24.根据权利要求1-8和13-19中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述转基因编码NK受体。
25.根据权利要求1-8和13-19中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述转基因编码嵌合抗原受体(CAR)。
26.根据权利要求25所述的工程化细胞群体，其中所述嵌合抗原受体进一步包含共刺激结构域。
27.根据权利要求26所述的工程化细胞群体，其中所述共刺激结构域包含源自以下的氨基酸序列：CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D或其任何组合。
28.根据权利要求1-8和13-19中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述转基因编码细胞因子。
29.根据权利要求1-8和13-19中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述转基因编码细胞因子受体。
30.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述工程化细胞是干细胞。
31.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述工程化细胞是胚胎干细胞。
32.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述工程化细胞是诱导多能干细胞。
33.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述工程化细胞是免疫细胞。
34.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述工程化细胞是NK细胞。
35.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述工程化细胞是T细胞。
36.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述工程化细胞是B细胞。
37.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码核糖体蛋白。
38.根据权利要求1-36中任一项所述的工程化细胞群体，其中最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码泛素家族成员。
39.根据权利要求1-36中任一项所述的工程化细胞群体，其中最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码含锌指蛋白。
40.根据权利要求1-36中任一项所述的工程化细胞群体，其中最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码泛素调节因子。
41.根据权利要求1-36中任一项所述的工程化细胞群体，其中最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码正调节凋亡的因子。
42.根据权利要求1-36中任一项所述的工程化细胞群体，其中最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码负调节凋亡的因子。
43.根据权利要求1-36中任一项所述的工程化细胞群体，其中最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码细胞周期进程调节因子。
44.根据权利要求1-36中任一项所述的工程化细胞群体，其中最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码转录因子。
45.根据权利要求1-36中任一项所述的工程化细胞群体，其中最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码碱性区/亮氨酸拉链(bZIP)转录因子。
46.根据权利要求1-36中任一项所述的工程化细胞群体，其中最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码DNA损伤反应调节因子。
47.根据权利要求1-36中任一项所述的工程化细胞群体，其中最接近所述基因组位点的5'开放阅读框或最接近所述基因组位点的3'开放阅读框编码泛素连接酶。
48.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述基因组位点不是AAVS1或H11。
49.根据权利要求1-8和13-48中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述转基因与组成型启动子可操作地偶联。
50.根据权利要求1-8和13-48中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述转基因与诱导型启动子可操作地偶联。
51.根据权利要求1-8和13-49中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述转基因不与诱导型启动子可操作地偶联。
52.根据权利要求1-8和13-51中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述转基因与组织特异性启动子可操作地偶联。
53.根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞群体，其中(i)所述群体的超过98.8％维持所述转基因的组成型表达持续至少约15天，或(ii)所述群体的超过97.2％维持所述转基因的组成型表达持续至少约21天。
54.根据权利要求1-36和49-53中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述基因组位点是在TEF与TOB2之间的基因间区。
55.根据权利要求1-36和49-53中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述基因组位点是在FAU与ZNHIT2之间的基因间区。
56.根据权利要求1-36和49-53中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述基因组位点是在PIDD1与RPLP2之间的基因间区。
57.根据权利要求1-36和49-53中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述基因组位点是在ANAPC16与DDIT4之间的基因间区。
58.根据权利要求1-36和49-53中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述基因组位点在来自基因组参考联盟人类构建38(GRCh38/hg38)人类基因组的坐标chr22:41,413,106-41,414,808内。
59.根据权利要求1-36和49-53中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述基因组位点在来自基因组参考联盟人类构建38(GRCh38/hg38)人类基因组的坐标chr11:65,117,969-65,120,057内。
60.根据权利要求1-36和49-53中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述基因组位点在来自基因组参考联盟人类构建38(GRCh38/hg38)人类基因组的坐标chr11:808,403-810,414内。
61.根据权利要求1-36和49-53中任一项所述的工程化细胞群体，其中所述基因组位点在来自基因组参考联盟人类构建38(GRCh38/hg38)人类基因组的坐标chr10:72,259,705-72,261,554内。
62.一种被配置用于产生根据前述权利要求中任一项所述的工程化细胞的载体，所述载体包含转基因和至少一个同源臂，其中所述同源臂的长度为至少20个核苷酸，并且包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与在以下之间的基因间区中的相应序列具有至少90％的序列同一性：
(a)TOB2与TEF；
(b)FAU与ZNHIT2；
(c)RPL3与SYNGR1；
(d)RPLP2与PIDD1；
(e)RPS7与RNASEH1；
(f)THEM4与S100A10；
(g)DDIT4与ANAPC16；
(h)ANXA2与FOXB1；
(i)NDUFA4与PHF14；
(j)DDX5与CEP95；
(k)PIN4与RPS4X；
(l)PLEKHG2与RPS16；
(m)TRIM41与RACK1；
(n)HINT1与LYRM7；
(o)CFL1与MUS81；或
(p)VPS13B与COX6C。
63.根据权利要求62所述的载体，其中所述同源臂的长度为至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1000个核苷酸。
64.一种制备根据权利要求1-61中任一项所述的工程化细胞的方法，所述方法包括将所述转基因或所述人工诱导的修饰引入细胞的所述基因组位点中。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述转基因或所述人工诱导的修饰的引入包括在所述基因组位点中引入双链断裂。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述双链断裂是由核酸酶引入的。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述核酸酶是CRISPR相关(Cas)核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶。
68.根据权利要求64-67中任一项所述的方法，其中所述转基因或所述人工诱导的修饰的引入包括提供通过同源定向修复整合到所述基因组位点中的多核苷酸。
69.根据权利要求64-68中任一项所述的方法，其中在所述引入后20天，(i)多个从包含插入所述基因组位点处的所述转基因的克隆表达所述转基因的细胞的百分比高于(ii)多个从包含插入AAVS1基因座处的所述转基因的克隆表达所述转基因的细胞的百分比。
70.根据权利要求64-69中任一项所述的方法，其中(i)从多个包含在所述基因组位点插入的所述转基因的克隆表达所述转基因的平均持续时间高于(ii)从多个包含插入AAVS1基因座处的所述转基因的克隆表达所述转基因的平均持续时间。
71.根据权利要求64-70中任一项所述的方法，其中(i)从多个包含在所述基因组位点插入的所述转基因的克隆表达所述转基因的平均水平高于(ii)从多个包含插入AAVS1基因座处的所述转基因的克隆表达所述转基因的平均水平。
72.根据权利要求69-71中任一项所述的方法，其中插入所述基因组位点处的所述转基因的表达和插入所述AAVS1基因座处的所述转基因的表达由相同或基本相同的启动子驱动。
73.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-61中任一项所述的工程化细胞或根据权利要求62或63所述的载体以及药学上可接受的赋形剂、载体、媒介物或稀释剂。
74.一种治疗有需要的受试者的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-61中任一项所述的工程化细胞或根据权利要求73所述的药物组合物。
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