CN115443191A - 用于细胞培养的二硼化物微图案化表面 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及微图案化基底，所述微图案化基底将Si和TiB₂组合，以通过基底介导的蛋白质吸附促进优先的和选择性的细胞生长行为。在材料刚度、硬度、粗糙度、可润湿性和表面电荷方面不同的Si和TiB₂的组合适用于微加工工艺并支持扩展的2D和3D细胞培养。虽然以各种各样的可定制几何图案通用，但微图案化基底是特别合适的用于可生存组织培养的平台。

Description

用于细胞培养的二硼化物微图案化表面

优先权声明

本申请要求2020年2月27日提交的美国临时申请序列号62/982,449的优先权权益，其全部内容在此通过引用并入。

背景

I.技术领域

本公开内容涉及光刻、材料科学、组织工程、细胞生物学和化学领域。更特别地，本公开内容涉及用于微图案化表面的改进方法和组合物及其作为细胞培养基底(二维(2D)和三维(3D)体外组织培养系统)的用途。

II.背景技术

在过去的几十年中，生物材料[1]和用于微图案化的微米/纳米技术[2-5]的发展取得了巨大的增长。常规的光学光刻(最早用于微图案化方法中的方法之一)允许在曝光的情况下将几何图案从光掩模转移至基底例如玻璃或硅(Si)晶片[4]。图案化区域通常通过操纵表面疏水性或化学修饰来针对细胞类型依赖性黏附和生长进行功能化，以呈现黏附肽/蛋白质。或者，软光刻技术利用生物相容性材料例如聚二甲基硅氧烷图案模制，以将生物活性分子或水凝胶压印至靶标表面。虽然在软光刻中并入生物活性分子是相对简单的，但在常规光刻中需要复杂的表面修饰以引入特定的配体或蛋白质[6]。

为了其可调的半导体特性而用于微电子学的Si晶片为基于光刻的微图案化提供了理想的背景基底材料，因为它们是原子级平坦的并且适用于微加工工艺[7、8]。Si也被广泛用于生物学目的[9-11]。类似地，钛(Ti)及其合金也是生物医学应用中大量使用的材料[12]，提供了由在Ti上自然生长(在空气或热氧化中)[13]或者可以表面沉积[14]的二氧化钛(TiO₂)促进的生物相容性和耐腐蚀性。此外，硬的、耐腐蚀的、生物相容的且惰性的元素[15、16]的增强剂例如硼[15]已被用于增强钛的机械特性[17、18]。硼是人体内的主要微量元素之一，并且在骨组织的形成和功能中发挥重要作用[19、20]。因此，硼已被用作各种医学材料中的骨诱导剂[21、22]，由于B-OH键的形成而提高了材料的生物相容性和生物活性[23、24]。值得注意的是，硼掺杂的TiO₂涂层表现出亲水特性并且改善了成骨细胞黏附[25]，而B掺杂的TiO₂颗粒呈现出高的抗菌活性[26]。类似地，二硼化钛(TiB₂)通过诸如硼化的工艺在生物医学科学中的应用越来越多，部分是由于其机械硬度、稳定性和耐磨性[18、27-32]。其他的第4族过渡金属Zr和Hf的二硼化物具有类似的特性，包括机械[171]、电、化学[172]和热力学[173]特性。这些硼化物在其各自的相合组成下显示出非常高的熔化温度，并且它们是具有高导电性和优异硬度的陶瓷材料[174]。本发明人研究了TiB₂、ZrB₂和HfB₂的电特性例如高功函数值和电导率、以及对于在微电子中的应用重要的热力学稳定性和结构稳定性[175-177]。据报道，当在植入骨中并围绕周围组织之后通过组织响应进行测试时，Hf具有与Ti类似的生物相容性[178]。向金属合金例如Ti-Nb中添加Zr和Hf[179-181]也显示出生物相容性，包括形状记忆装置的应用[182]。这些结果表明在细胞培养期间，ZrB₂和HfB₂的行为与TiB₂相同，没有表面降解或腐蚀的迹象，因此表明它们没有化学活性。因此，本公开内容涉及这些材料在组织培养应用中用于微图案化的用途。

微图案化已成为生物材料工程中的标准，并且被用于研究细胞-生物材料相互作用以及现象例如细胞取向、细胞骨架重排、细胞分化和迁移[33]。微图案化表面上的细胞生长、排列和取向取决于基底材料的特性和细胞类型，并且进一步由几何形状、形貌和所使用的材料图案尺寸引导[34、35]。细胞不仅响应于强烈依赖于基底材料的特性的机械信号[36]，而且还响应于图案的形状和尺寸进行排列和取向[37]。细胞对微图案化基底的黏附可以通过特定的化学功能化进一步定制，从而产生改善生物材料–细胞相互作用的生物被动或生物活性模式；例如，从补充培养基中吸附的黏附蛋白[38-41]，其中显示蛋白质密度和构象以确定细胞行为[42]。这种初始相互作用介导细胞附着和扩散，以及随后的事件例如增殖、胞外基质(extracellular matrix，ECM)的建立和重组。重要的是，可溶性ECM组分和固定化ECM组分二者均控制生长因子的可用性和呈现，所述生长因子是细胞行为的主要调节剂[43]。此外，这样的细胞响应预测细胞命运，并且是最近在细胞培养和/或再生医学中基于微图案化装置的应用激增的创立基础[5、34、41、44-47]。

发明内容

本公开内容涉及包含图案化表面的组合物，所述图案化表面包含(a)含硅的基底(Si/SiO₂)；和(b)在所述硅基底上图案化的来自第4族的过渡金属二硼化物TiB₂、ZrB₂或HfB₂，其中所述图案化表面包含硅暴露部分和二硼化物暴露部分二者。图案化表面还可以暴露于一种或更多种生物分子，从而包含吸附的生物分子，例如肝素、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、内皮生长因子(endothelial growth factor，EGF)、和/或具有肝素结合结构域的任何蛋白质。一种或更多种生物分子还可以包括内皮细胞生长补充剂(endothelial cell growthsupplement，ECGS)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和肝素，和/或肝素结合蛋白、胎牛血清(FBS)和肝素。

图案化表面可以包含一个或更多个被硅暴露区域包围的二硼化物暴露区域，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、500个、750个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、7500个或10,000个二硼化物暴露区域。一个或更多个二硼化物区域可以包括5μM至1000μM的区域，例如呈线、圆、正方形、矩形、椭圆形和/或任何几何形状的形式。图案化表面可以使得能够通过细胞聚集实现3D微环境。图案化表面可以位于微孔中、载玻片、芯片或晶片、组织培养瓶和/或任何其他常规组织培养容器上。图案化表面可以包含ECGS+肝素、FBS+肝素、FBS+ECGS+肝素、和/或FBS+肝素+任何肝素结合蛋白。

还提供了用于捕获和/或培养细胞的方法，所述方法包括使细胞或含细胞的组合物与如本文所限定的组合物接触。细胞可以为内皮细胞(例如，HUVEC)、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞(例如，SKOV3、OVCAR3)、间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)、上皮和/或内皮谱系和中胚层谱系的任何细胞、以及非侵袭性和/或侵袭性癌细胞，及其组合(即，不同细胞类型的共培养物)。所述方法还可以包括测量细胞生物学的功能、表面或结构参数。功能、表面或结构参数可以为生长、迁移、分裂、基因表达、表面生物标志物、生物力学力、生存力、微骨骼状态、氧化呼吸、转移潜能、凋亡、分泌组、和/或转录物组。所述方法还可以包括用药物、生物制剂、光、热或辐射处理所述细胞。所述方法还可以包括再次测量所述细胞生物学的功能、表面或结构参数。

当在权利要求和/或说明书中结合术语“包括/包含”使用时，词语“一个”或“一种”的使用可以意指“一个/种”，但其也与“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。词语“约”意指所述数字的正负5％。

预期本文中描述的任何方法或组合物可以相对于本文中描述的任何其他方法或组合物来实施。本公开内容的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得显而易见。然而，应理解，详细描述和具体实例虽然指示了本公开内容的具体实施方案，但仅通过举例说明的方式给出，因为通过该详细描述，在本公开内容的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分并且被包括在内以进一步说明本公开内容的某些方面。通过参照这些附图中的一者或更多者结合本文中呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开内容。本专利或申请文件包含至少一幅以彩色制作的附图。在提出请求并支付必要的费用之后，官方将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。

图1A至1D：使用各种各样的成像方法进行表面表征使微图案化基底可视化。(图1A)六种基底设计的图片(100μm比例尺)：未图案化的硅(Si)、未图案化的二硼化钛(TiB₂)、具有200μm直径的TiB₂圆形图案的Si、具有直径在200μm至600μm的范围内的TiB₂圆形图案的Si、具有直径100μm的TiB₂圆形图案和宽度5μm至20μm的线的Si、以及具有直径100μm的TiB₂圆形图案和宽度5μm至10μm的线的Si。(图1B)微图案化基底在两个不同放大倍数下的SEM图像，(图1C)Si上的所沉积的TiB₂的TEM截面，其中插图SAED图案示出了TiB₂层的无定形结构。(图1D)图案化基底的AFM。界面区域Si-TiB₂的3D高度数据，TiB₂层的厚度为约40nm，Si背景的高分辨率形貌(高度范围0nm至1.0nm)，以及TiB₂图案的高分辨率形貌(高度范围0nm至1.6nm)。在通过电子束蒸镀在硅基底上沉积的ZrB₂和HfB₂层上产生相同的图案。

图2A至2F：微图案化基底的表面、粗糙度、硬度、组成和电荷的定量表征。(图2A)用AFM高度数据计算的Si(

蓝色)和TiB₂(

橙色)的粗糙度(Rq)的直方图。(图2B)纳米压痕记录的与Si的10GPa和150GPa的值相比的TiB₂在14GPa下的硬度和在200GPa下的杨氏模量。(图2C)XPS表明在顶表面层处存在薄氧化物，例如在192.6eV下的B₂O₃和在523eV下的Ti-O-B(仅示出了TiO₂峰)，并且在大部分硼化物膜中存在纯化学计量的TiB₂成分。(图2D)所沉积的TiB₂层的XPS深度曲线。(图2E)EDX光谱Si峰在TiB₂图案中较低。在图案上检测到TiB₂峰，但在Si背景上未检测到TiB₂峰。(图2F)在去离子水中，TiB₂的开路电势值相对于n型Si和p型Si二者的负性较小。

图3：在ECGS和肝素的存在下Si和TiB₂的开路电势。TiB₂的开路电势值相对于n型Si和p型Si二者的负性较小。

图4A至4E：生长因子补充的培养基中表面形貌和组成的表征。(图4A)在ECGS和肝素中Si-TiB₂基底的AFM图像。Si-TiB₂界面的3D高度轮廓以及Si和TiB₂区域的表面形貌。(图4B)在ECGS和肝素的存在下Si和TiB₂的表面粗糙度的直方图。(图4C)在ECGS和肝素的存在下Si和TiB₂的XPS曲线。(图4D)在没有肝素的情况下在ECGS中Si和TiB₂上的吸附的蛋白质的高度的承载(Bearing)和颗粒分析。(图4E)在具有肝素的情况下在ECGS中Si和TiB₂上的吸附的蛋白质的高度的承载和颗粒分析。在图4D和图4E中的插图图像中，应用由干燥对照基底计算的高度阈值来突出蛋白质特征(以青色示出)，同时排除基底特征。

图5：具有不同培养基补充剂的微图案化基底上的HUVEC和MSC的细胞图案。左图顶行中示出了在24小时至48小时时MSC的图像，以及底行示出了在培养一周之后的相同区域(比例200μm)。在(a)不具有ECGS和肝素、(b)具有ECGS而不具有肝素、(c)具有肝素而不具有ECGS以及(d)具有ECGS和肝素的培养基中在微图案化Si-TiB₂(以及类似地在ZrB₂或HfB₂)基底上培养MSC。在不具有ECGS和肝素的培养基中在微图案化Si-TiB₂基底上培养1至11天的时间的HUVEC的图像(右上图，比例200μm)，以及在具有ECGS和肝素的培养基中培养4至17天的时间的HUVEC的图像(底部，比例150μm)。左下图中呈现了在不含补充剂的培养基和补充培养基中Si-TiB₂上的MSC和HUVEC在九天时间内的细胞计数。

图6A至6E：HUVEC中生存力、生物标志物表达和微图案的排列的可视化。(图6A)生长在具有不同的圆和线几何图案的微图案化基底上的用生存力染料吖啶橙染色的HUVEC的荧光图像(第1至3行)。第1列中的图像处于4倍放大倍数(比例为150μm)，其中在20倍的较高放大倍数下示出了低放大倍数图像中的选定区域(彩色框)(第2至4列，比例为50μm)。(图6B)血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM-1，也称为CD31)的HUVEC细胞表型免疫荧光染色。(图6C)肌动蛋白(细胞骨架)和黏着斑蛋白(黏着斑)的HUVEC细胞结构免疫荧光染色。细胞核被DAPI染成蓝色。(图6D)在两周时间内在具有圆和线图案的微图案化基底上的HUVEC形状(伸长率)的图(比例150μm)。样品图例中从上到下与图中从左到右相关。(图6E)定量分析在线和圆形图案上的取向。样品图例中从上到下与图中从左到右相关。

图7A至7E：MSC 3D聚集体中的形态学、生存力和生物标志物评估。(图7A).由TiB₂圆形微图案上的MSC 3D聚集体的DAPI染色的细胞核的共焦z-堆叠产生的XY-和Y-最大强度投影，以及聚集体尺寸(直径和厚度)相对于图案尺寸(圆形图案的直径)的图。(图7B)由针对生存力用吖啶橙(绿色，活的)和碘化丙啶(红色，死的)染色的300μm直径的圆形图案上的MSC 3D聚集体的共焦z-堆叠产生的最大强度投影。(图7C)由针对F-肌动蛋白(绿色)、细胞核(DAPI，蓝色)和CD105(红色)染色的300μm直径的圆形图案上的MSC 3D聚集体的共焦z-堆叠产生的最大强度投影。(图7D)由针对F-肌动蛋白(绿色)、细胞核(DAPI，蓝色)和n-钙黏着蛋白(红色)染色的600μm直径的圆形图案上的MSC 3D聚集体的共焦z-堆叠产生的最大强度正交投影。(图7E)图7D中带有灰色箭头的图像的单个z切片示出了N-钙黏着蛋白在聚集体中的聚集与图案边界处的细胞中的均匀染色(比例100μm)。

图8A至8D：RNA测序转录物组分析。(图8A)示出了在常规组织培养瓶(塑料)和微图案化TiB₂基底(TiB₂)上生长的HUVEC中表达基因列表之间的重叠的维恩图。(图8B)示出了在常规组织培养瓶(塑料)和微图案化TiB₂(TiB₂)基底上生长的MSC中表达基因列表之间的重叠的维恩图。(图8C)包含当比较在研究条件下表达的基因列表时被确定为过度/不足代表的PANTHER途径的列表的表。(图8D)在TiB₂基底上生长的HUVEC细胞中差异表达基因的累积分布分析，所述图显示了两个富集过程的倍数变化分布：线粒体活性和NADH活性(倍数变化>±1.5；FDR<0.05)。

图9A至9C：EOC细胞系SKOV3在微图案化的Si-TiB₂基底上生长成3D聚集体。(图9A)第3天和(图9B)第5天(100μm比例)：(图9C)用吖啶橙/碘化丙啶生存力染料染色的基底上的SKOV3 3D聚集体的共焦图像。对于直径为250μm和500μm的图案，处于4倍(200μm比例)和20倍(100μm比例)的图像。

图10A至10C：微图案化的Si-TiB₂基底上的细胞生长。(图10A)六个基底的图片(100μm比例)：未图案化(空白)的Si、具有均匀TiB₂层的Si，剩余4个基底为具有不同TiB₂圆形和线图案的Si。(图10B)OVCAR3细胞优先以单层生长在TiB₂微图案上并且未能形成3D聚集体。(图10C)SKOV3细胞以单层生长在未图案化的TiB₂(左)上，并且大约在第3至5天自组装成3D聚集体(右)。

图11A至11B：形成聚集体间“细胞桥”。(图11A)SKOV3细胞大约在第3至5天生长成3D聚集体。在4至6天之间，看到发生跨越两个或更多个聚集体形成细胞桥(白色箭头，100μm比例)。(图11B)示出了跨越3D聚集体的桥的多细胞组成的DAPI和F-肌动蛋白在4倍、20倍和60倍下的免疫荧光图像。

图12A至12B：RNA-seq分析。(图12A)维恩图。(图12B)GSEA Top Pathways

图13A至13E：SAHA对SKOV3的影响。(图13A至13B)未经处理的第7天和第9天。看到细胞桥的生长(红色箭头，100μm比例)。(图13C)示出了紧凑的3D聚集体形成和细胞桥(蓝色箭头)的第7天图像。将聚集体用3μM SAHA处理48小时。(图13D)在SAHA处理之后第9天拍摄的图像示出了细胞解离，导致聚集体的尺寸减小和细胞桥损失(蓝色箭头)。(图13E)与对照相比的聚集体深度的图(平均值±SEM.；n＝3；*p<0.001，使用配对t检验)示出了经SAHA后处理，尺寸减小约50％。

图14A至14H：MSC和HUVEC的共培养。MSC和HUVEC的单一培养和共培养的图像。图6A至6C示出了HUVEC，以及图6D至6F示出了MSC。使用亲脂性膜染料来追踪HUVEC(PKH67，绿色)和MSC(Cell Vue，红色)。相衬(phase contrast)比例20μm，荧光比例100μm)。G至H示出了聚合体共培养的MSC和HUVEC。相衬比例200μm，荧光比例100μm)。

补充图(SFIG)1A至1B：关于不同图案在补充培养基和不含补充剂的培养基中在微图案化基底上的MSC生长。顶部图片：具有圆设计的微图案化基底上的MSC的细胞图案化。MSC在微图案化的Si-TiB₂基底(比例200μm)上培养了两周时间。(补充图1A)具有FBS和抗生素的培养基。(补充图1B)具有FBS、ECGS、肝素和抗生素的培养基。红色箭头表示MSC 3D聚集体的形成。底部图片：在补充培养基中具有圆和线设计的微图案化基底上的MSC的细胞图案化。示出了第6至21天的图像。(比例为200μm)。

补充图2A至2G：用于确定微图案化基底上的细胞计数的图像分析处理途径。(补充图2A)在细胞接种之前的基底的图像(比例为200μm)。(补充图2B)二元掩模图像，其中TiB₂图案区域以白色标识，以及Si背景以黑色标识。(补充图2C)在第06天在不含补充剂的培养基中在基底上接种MSC之后的情况下基底的图像(比例为200μm)。(补充图2D)以白色描绘细胞周长的二值图像。(补充图2E)示出了Si背景上的分割细胞边界(红色)的图像。(补充图2F)示出了TiB₂图案上的分割细胞边界(蓝色)的图像。(补充图2G)示出了在Si背景(红色)上和TiB₂图案(蓝色)上生长的细胞的叠加图像。

补充图3：具有圆和线图案的微图案化基底上的MSC的细胞图案。在具有圆和线图案的微图案化的Si-TiB₂基底上在补充培养基中培养三周时间的MSC(比例500μm)。

补充图4：接种HUVEC细胞并使其生长两周时间。在具有450μm直径的圆图案的基底上接种之后的第1、4、7、9、11和13天的不同时间点时对基底进行采样。通过确定覆盖图案化表面的可生存细胞的总面积来计算图案化基底上的细胞生长和生存力。如在此所见，HUVEC是可生存的(保留绿色荧光)直到接种之后的第13天。对于定量分析，确定被染成绿色的细胞的总面积，并计算可生存细胞的面积与圆图案的面积(即，0.158mm²)的比率。如在接种之后的不同天数时覆盖有可生存细胞的图案的面积百分比的图中所示，从接种之后的第4天直至第7天观察到显著生长(p值为0.0002<0.05)，其后，在第11天观察到细胞的数量减少(p值为0.004<0.05)，随后细胞生长保持在稳定状态(第11至13天；p>0.05)。

补充图5A至5D：(补充图5A)使用PANTHER将在塑料和微图案化TiB₂上的HUVEC中表达的转录物映射为“生物过程”的GO术语，(补充图5B)使用PANTHER将在塑料和微图案化TiB₂上的MSC中表达的转录物映射为“生物过程”的GO术语。(补充图5C)使用PANTHER将在塑料和微图案化TiB₂上的HUVEC中表达的转录物映射为“分子功能”的GO术语，以及(补充图5D)使用PANTHER将在塑料和微图案化TiB₂上的MSC中表达的转录物映射为“分子功能”的GO术语。

补充图6A至6B：使用PANTHER分类系统针对在包被有0.2％明胶的塑料组织培养瓶中培养的HUVEC相对于在二硼化钛基底上培养的HUVEC进行的基因功能分析。(补充图6A)生物过程和(补充图6B)分子功能。

具体实施方式

在该研究中，本发明人介绍并评估了用于细胞培养应用的新的基底，使用在组织工程和癌症生物学研究中广泛使用的上皮细胞系(HUVEC)、中胚层细胞系(MSC)和卵巢癌细胞系(SKOV3、OVCAR3)，证明了用于临床转化的巨大潜力[48-54]。MSC是表现出多能分化潜能和免疫调节特性的自我更新干细胞。此外，它们的容易分离和通过体外培养扩增的能力已经使它们成为有吸引力的治疗剂。HUVEC是用于研究内皮细胞的功能和病理学以及工程组织中微流体血管网络的产生的广泛接受的模型[55]。重要的是，这两种细胞类型也被广泛用于研究基底表面特性例如粗糙度、刚度、电荷和化学性质对细胞行为模式(包括黏附、形状、排列和机械力转导)的影响[14、56-58]。对于HUVEC和MSC二者，分别观察到细胞类型特异性行为例如接触引导和排列、趋硬性(durotaxis)和聚集。

卵巢癌细胞系小组(Ovarian Cancer Cell Line Panel，OCCP)强调了通过体外研究了解和表征形态亚型差异的临床重要性[228]。表达传统上皮样形态的卵巢癌细胞系从组织中培养，并与专门的膜结构(例如紧密连接、黏附连接和缝隙连接)紧密相连，而表达间充质样形态的细胞系从肿胀的受损组织中(例如在腹水或胸腔积液中)提取，并形成有组织的细胞层。

上皮细胞系的基因组图谱表明OVCAR3和SKOV3二者均已被检验。两种细胞系之间的主要差异在于它们的形态和它们的不同水平的侵袭性[204]。OVCAR3具有圆形形状并且趋于呈现出较小的侵袭潜力，而SKOV3具有更纺锤状形状与较大的侵袭潜力。浆液性肿瘤通常出现在输卵管伞部的上皮中，并且随后在植入卵巢中之后呈现为明显的卵巢肿瘤，并在晚期出现，生长迅速，并且扩散到整个腹膜腔中。虽然研究表明OVCAR3肿瘤的基因突变与SKOV3肿瘤不同，但它们在侵袭性行为方面的差异尚不明确，并因此强调了了解用治疗选择治疗肿瘤可能如何影响侵袭和迁移行为的重要性。

本发明人还描述了这样的新的微图案化基底，所述微图案化基底将Si和来自元素周期表第4族的过渡金属的二硼化物(TiB₂、ZrB₂或HfB₂)组合，以通过基底介导的蛋白质吸附促进优先的和选择性的细胞生长行为。在材料刚度、硬度、粗糙度、可润湿性和表面电荷方面不同的Si和这些硼化物的新组合适用于微加工工艺并支持扩展的细胞培养。虽然以各种各样的可定制几何图案通用，但微图案化基底是适当的用于可生存组织培养的平台。如由可生存增殖、生物标志物表达和转录物组分析表明的，HUVEC、MSC和SKOV3表现出稳定且稳健的细胞谱。重要的是，内皮细胞生长补充剂(ECGS)和肝素在建立特定的HUVEC和MSC细胞生长中起主导作用。在它们不存在的情况下，细胞表现出相对于Si优先附着至二硼化物(TiB₂、ZrB₂和HfB₂)图案(即，相对于Si背景，更多细胞附着至微图案)，而在补充培养基中观察到高度选择性生长(即，细胞仅附着至微图案)。类似地，在肝素的存在下碱性成纤维细胞生长因子(FGF)在培养7天的时间内诱导SKOV3的模式特异性生长。根据先进的细胞培养技术，MSC和SKOV3在本发明人的基底上的聚集提供了三维(3D)培养微环境，这在推动MSC中的基本细胞发育、再生和分化过程[46、59]以及SKOV3中的肿瘤发生中是至关重要的。潜在的基底应用包括多种细胞类型的共培养、间充质干细胞分化、诱导多能干细胞分化、脂肪干细胞分化以及用于2/3D癌症培养物中的药物开发的高通量技术。

I.微图案化

微图案化是图案小型化的技术。最初用于电子产品的微图案化最近已经成为生物材料工程和通过软光刻进行细胞生物学的基础研究的标准。其通常使用光刻法，但已经开发了许多技术。

在细胞生物学中，微图案可以用于控制黏附的几何形状和基底刚度。该工具帮助科学家发现环境如何影响过程例如细胞分裂轴的取向、细胞器定位、细胞骨架重排、细胞分化和细胞迁移的方向。微图案可以在从玻璃到聚丙烯酰胺和聚二甲基硅氧烷(PDMS)的广泛的基底上制作。聚丙烯酰胺和PDMS尤其派上用场，因为它们让科学家专门调节基底的刚度，并且它们允许研究人员测量细胞力(牵引力显微术)。先进的定制微图案化允许精确且相对快速的实验控制细胞黏附、细胞迁移、引导、3D限制和微结构芯片的微加工。使用先进的工具，可以以几乎无限数量(2D/3D形状和体积)产生蛋白质图案。

通过使用自上而下的光刻技术实现了蛋白质的纳米图案化。用于生物材料的气溶胶微图案化使用喷雾微观特征来获得特别适合于生物材料的半随机图案。

以下术语在下文中定义并且适用于本公开内容及其权利要求。

术语“培养平台”是指包含经一个或更多个几何单元的阵列微图案化的纳米纹理表面的基底。

术语“纳米纹理的”在本文中可以与“纳米形貌特征”或“纳米形貌”以及“纳米图案化”、“纳米凹槽化”互换使用，是指纳米级图案化表面。如本文中所使用的术语“微图案化”或“微图案”是指表面上的微米级图案。

术语“细胞黏附区域”在本文中可以与“细胞允许区域”互换使用，并且是指细胞相对于表面的其他区域选择性或优先结合的区域。细胞黏附区域由至少一个较小或非黏附区域界定。虽然优选的是细胞非黏附区域根本不允许细胞黏附，但是相对于附着至细胞非黏附区域的相同表面区域的细胞的比例，细胞黏附区域最少允许至少75％或更多的细胞附着至表面。

术语“细胞非黏附区域”是指其上基本上不附着细胞或基本上附着有细胞的纳米纹理或纳米图案化基底的表面。相对于附着至细胞黏附区域的相同表面区域的细胞的比例，细胞非黏附区域允许不多于5％的细胞附着至表面。

如本文中所使用的术语“软光刻”是指本领域中通常已知的技术。软光刻使用具有转移表面的图案化装置，例如印模、模具或掩模，所述转移表面包含与接收或适型材料结合的明确定义的图案以接收转移图案。微米尺寸和纳米尺寸的结构通过涉及基底与图案化装置的转移表面之间的分子尺度上的共形接触的材料加工来形成。

“图案化装置”旨在广义地解释为是指可以用于传送与待在基底的靶标部分中产生的图案相对应的图案化截面的装置。

“图案”旨在意指预定的标记或设计，通常是基本上微米级或纳米级的设计。

术语“表面”在本文中可以与“基底”或“支架”互换使用，并且在这方面应理解为意指细胞能够附着或黏附(固有地或处理之后以促进细胞黏附)且可以如本文中所述为纳米纹理的和微图案化的任何合适的载体材料。在一些实施方案中，基底是“生物相容性基底”，如该术语在本文中所定义。在一个实施方案中，生物相容性基底提供了允许细胞附着至其并在其上生长的支撑框架。然后培养的细胞群可以在生物相容性基底上生长。

术语“组织”是指共同执行某些特殊功能的类似特化细胞的组或层。术语“组织”还旨在包括完整的细胞、血液、血液制剂例如血浆和血清、骨、关节、肌肉、平滑肌、和器官。术语“组织特异的”是指来自特定组织的细胞的来源或最典型的特征。

如本文中所提及的术语“细胞培养基”(本文中也称为“培养基(culture medium)”或“培养基(medium)”)是包含维持细胞生存力和支持细胞增殖的营养物和其他因子的用于培养细胞的培养基。细胞培养基可以以适当的组合包含任何以下物质：盐、缓冲液、氨基酸、葡萄糖或其他糖、抗生素、血清或血清替代物、以及其他组分例如肽生长因子等。通常用于特定细胞类型的细胞培养基是本领域技术人员已知的。

II.材料

根据本公开内容，本发明人确定了可以用于为我们在细胞结合和培养中产生图案化表面的改进的表面特征的组合。主要的表面组分为TiB₂、ZrB₂、以及HfB₂和Si，以及附着至这些表面组分的任选生物因子。

A.TiB₂、ZrB₂和HfB₂

钛的二硼化物(TiB₂)、锆的二硼化物(ZrB₂)和铪的二硼化物(HfB₂)[183]是具有优异的导热性、氧化稳定性和抗机械侵蚀性的极硬陶瓷。它们也是良好的电导体，因此TiB₂可以用作铝熔炼中的阴极保护材料，并且可以通过放电机加工成型。

TiB₂与碳化硼和碳化钛共有一些特性，但其许多特性优于B4C和TiC的特性，例如在极端温度下的优异的硬度。与来自元素周期表的其他族的硼化物相比，这些硼化物具有类似的优点，例如具有最高的弹性模量值、最高的剪切模量(G)、最小的泊松比。这些硼化物的硬度非常高，并且在43GPa至50GPa的范围内。电子功函数(electron work function，EWF)值高，通常低于5eV，表明这些材料中原子键合的化学稳定性高。电子功函数根据包括多晶结构和原子表面终止的晶体取向而变化(对于B，EWF为约6eV，以及对于Ti，EWF为约4.6eV)[184]。这些基于开尔文探针和MOS电容器的TiB₂和ZrB₂的功函数测量确定了由于退火和形成增加EWF的薄表面氧化物而引起的对结晶的依赖性[175]。所有这些二硼化物具有示出了在熔化温度TiB₂(3225℃)、ZrB₂(3247℃)和HfB₂(3380℃)下的相合组成的相图，所述相图有助于电子束沉积期间的化学计量蒸镀。其他优点包括高导热性(60W/m K至120W/mK)和高导电性(约10⁵S/cm)。然而，其由于高的熔化温度而难以模制，并且由于高的共价键合而难以烧结。其还限于使用放电等离子体烧结压制成小的整体式件。

关于化学稳定性，与碳化钨或氮化硅相比，TiB₂与纯铁接触更稳定。这些二硼化物在高温下容易在空气中氧化[185]，并且与所选择的酸(氢氟酸、硝酸和硫酸)和H₂O₂反应。

TiB₂并非天然存在于地球中。二硼化钛粉末可以通过多种多样的高温方法来制备，例如钛或其氧化物/氢化物与单质硼在高于1000℃下直接反应、通过钛氧化物和硼氧化物的铝热反应的碳热还原、或者硼卤化物在金属或其卤化物的存在下的氢还原。在各种合成路线中，已经开发了电化学合成和固态反应以大量制备更细的二硼化钛。固态反应的一个实例为硼热还原，其可以通过以下反应来举例说明：

(1)2TiO₂+B₄C+3C→2TiB₂+4CO

(2)TiO₂+3NaBH₄→TiB₂+2Na(g，l)+NaBO₂+6H₂(g)

然而，第一种合成路线(1)无法生产纳米尺寸的粉末。纳米晶(5nm至100nm)TiB₂使用反应(2)或以下技术来合成：

NaBH₄和TiCl₄的溶液相反应，然后使获得的无定形前体在900℃至1100℃下退火；

单质Ti和B粉末的混合物的机械合金化；

涉及添加不同量的NaCl的自蔓延高温合成过程；

铣削辅助自蔓延高温合成(milling assisted Self-propagating hightemperature synthesis，MA-SHS)

金属钠与无定形硼粉末和TiCl₄在400℃下在苯中的溶剂热反应：

TiCl₄+2B+4 Na→TiB₂+4 NaCl

许多TiB₂应用受经济因素限制，特别是使高熔点材料致密化的成本，并且由于在粉末颗粒的表面上形成的二氧化钛层，其非常耐烧结。约10％的氮化硅的混合物有助于烧结，尽管也已证明在无氮化硅的情况下的烧结。

TiB₂的薄膜可以通过数种技术来生产。与物理气相沉积或化学气相沉积相比，TiB₂层的电镀具有两个主要优点：层的生长速率是200倍高(高至5μm/秒)，并且显著减少了覆盖复杂形状产品的不便。

TiB₂的当前用途似乎限于这样的领域如抗冲击装甲、切削工具、坩埚、中子吸收体和耐磨涂层中的专业应用。TiB₂作为坩埚广泛用于电子束蒸镀舟。对于较高熔化温度的蒸镀，使用材料例如TiB₂或其他硼化物SiC坩埚。TiB₂作为在铸造铝合金时细化晶粒尺寸的孕育剂对于铝工业来说是有吸引力的材料，因为其的被熔融铝的可润湿性和在熔融铝中的低溶解度以及良好的导电性。TiB₂薄膜可以用于向廉价和/或坚硬的基底提供耐磨性和耐腐蚀性。

B.硅

硅是符号为Si且原子序数为14的化学元素。其是具有蓝灰色金属光泽的硬且脆的结晶固体；并且其是四价第4族间接半导体。其是元素周期表中第14族的成员：碳在其上面；以及锗、锡和铅在其下面。其相对不活泼，并且其1414℃的熔点用于生长单晶。硅是宇宙中按质量计第八大最常见的元素，但很少作为纯元素出现在地壳中。其以二氧化硅(硅石)或硅酸盐的各种形式最广泛地分布在尘埃、沙、小行星和行星中。地壳的多于90％由硅酸盐矿物构成，使硅成为地壳中仅次于氧的第二最丰富元素(按质量计约28％)。

大多数硅在商业上使用而未经分离，并且通常很少对天然矿物进行加工。这样的用途包括用粘土、硅砂和石头的工业建筑。硅酸盐在波特兰水泥(Portland cement)中用于砂浆和灰泥并且与硅砂和砾石混合以制造用于人行道、地基和道路的混凝土。它们还用于白色陶瓷例如瓷器中，以及传统的基于石英的钠钙玻璃和许多其他特种玻璃中。诸如碳化硅的硅化合物被用作磨料和高强度陶瓷的组分。硅是广泛使用的被称为有机硅的合成聚合物的基础。

晶体块状硅为相当惰性的，但在高温下变得更具反应性。与其邻近的铝一样，硅形成保护半导体免受进一步氧化的薄的、连续的二氧化硅(SiO₂)表面层。硅可测量地与空气反应，该反应随温度而增加并且取决于氧化环境。在高温下在氮气环境中退火导致氮化物SiN和Si₃N₄形成。硅在600℃下与气态硫反应，并且在1000℃下与气态磷反应。然而，该氧化物层不能防止与卤素的反应；氟在室温下猛烈攻击硅，氯在约300℃下攻击硅，以及溴和碘在约500℃下攻击硅。硅不与大多数水性酸反应，但被浓硝酸和氢氟酸的混合物氧化和侵蚀；其容易溶解在热的碱水溶液中以形成硅酸盐。在高温下，硅也与烷基卤化物反应；该反应可以由铜催化以直接合成作为有机硅聚合物的前体的有机硅氯化物。硅与金属反应以形成硅化物。硅晶体的生长通常通过切克劳斯基(Czochralski)法来进行，在所述方法中将硅熔体保持在由石墨支撑的石英坩埚中。

二氧化硅(SiO₂)(也被称为硅石)是研究最多的化合物之一，仅次于水。已知硅石的十二种不同的晶体变型，最常见的是α-石英，其是许多岩石例如花岗岩和砂岩的主要成分。已知其也作为水晶以纯的形式出现。不纯的形式被认为是蔷薇石英、烟晶、黑水晶、紫水晶、和黄水晶。还已知石英的一些结晶性较差的形式，例如玉髓、绿玉髓、红玉髓、玛瑙、缟玛瑙、碧玉、血玉髓、和燧石。在一些其他矿物中已知二氧化硅的其他变型，例如鳞石英和方石英、以及不太常见的柯石英和斯石英。生物学上产生的形式也被称为硅藻土(kieselguhr)和硅藻土(diatomaceous earth)。玻璃状二氧化硅被称为玻陨石和黑曜岩，并且很少被称为焦石英。一些合成形式被称为热液石英和W-硅石。蛋白石由部分水合二氧化硅的复杂结晶聚集体构成。硅单晶的最重要的用途之一是用于制造硅集成电路的微电子工业。

C.生物因子

可以向Si-TiB₂、Si-ZrB₂或Si-HfB₂基底的表面上添加一种或更多种生物因子。这些因子可以为随后被添加至图案化基底的细胞提供结合功能，或者一旦结合，它们可以向细胞提供信号，即，生长、分裂、迁移等。

一种预期的结合因子为肝素，也被称为未分级肝素(unfractionated heparin，UFH)。肝素是药物和天然存在的糖胺聚糖。作为药物，其被用作抗凝剂(血液稀释剂)。具体地，其还用于治疗心脏病发作和不稳定型心绞痛。其通过注射到静脉或皮下来给予。其他用途包括内部试管和肾透析机。被称为低分子量肝素的肝素的分级版本也是可用的。

天然肝素是分子量在3kDa至30kDa的范围内的聚合物，但是大多数商业肝素制剂的平均分子量在12kDa至15kDa范围内。肝素是碳水化合物的糖胺聚糖家族的成员(其包括密切相关的分子硫酸乙酰肝素)，并且由可变硫酸化重复二糖单元组成。以下示出了在肝素中存在的主要二糖单元。最常见的二糖单元由2-O-硫酸化艾杜糖醛酸和6-O-硫酸化、N-硫酸化葡糖胺IdoA(2S)-GlcNS(6S)构成。例如，这占来自牛肺的肝素的85％和来自猪肠黏膜的肝素的约75％。

以下未示出的是含有3-O-硫酸化葡糖胺(GlcNS(3S,6S))或游离胺基(GlcNH₃ ⁺)的稀有二糖。在生理条件下，酯和酰胺硫酸根基团被去质子化并吸引带正电的反离子以形成肝素盐。肝素通常作为抗凝剂以这种形式施用。

根据本公开内容的特别有用的生物制剂的广泛类别为生长因子。生长因子是能够刺激细胞生长、增殖、愈合和细胞分化的天然存在的物质。通常其为蛋白质或类固醇激素。生长因子对于调节各种各样的细胞过程是重要的。生长因子通常充当细胞之间的信号传导分子。实例为与其靶细胞的表面上的特异性受体结合的细胞因子和激素。

它们经常促进细胞分化和成熟，这在生长因子之间变化。例如，表皮生长因子(EGF)增强成骨分化，而成纤维细胞生长因子(FGF-1-23)和血管内皮生长因子(VEGF)刺激血管分化(血管生成)。胰岛素样生长因子(IGF)受人生长激素刺激并促进生长。其他生长因子包括集落刺激因子(G-CSF、M-CSF、GM-CSF)、肝配蛋白(ephrin)、白介素、神经调节蛋白、转化生长因子(TGF-α和TGF-β)、和neutrophilin(神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子-3和神经营养因子-4)。

生物因子还可以包括复杂的生物溶液，例如生长血清。例如，胎牛血清(FBS)来自通过屠宰场的封闭收集系统从牛胎儿中抽取的血液。胎牛血清是用于真核细胞的体外细胞培养的最广泛使用的血清补充剂。这是因为其具有非常低的抗体水平并且含有更多的生长因子，从而允许在许多不同的细胞培养应用中具有通用性。球状蛋白牛血清白蛋白(bovineserum albumin，BSA)是胎牛血清的主要组分。胎牛血清中丰富多样的蛋白质将培养的细胞保持在培养基中，在培养基中它们可以存活、生长和分裂。FBS不是完全限定培养基组分，并因此批次之间的组成可能不同。因此，已经开发了无血清和化学限定培养基(chemicallydefined media，CDM)作为良好的实验室实践。然而，无血清培养基的效力是有限的；许多细胞系仍然需要血清以生长，并且许多无血清培养基制剂旨在用于狭义定义的细胞类型。因此，胎儿血清仍被广泛用于细胞培养。

内皮细胞生长补充剂(ECGS)是未明确限定的补充剂，其通常由酸性FGF(acidic-FGF，aFGF)、碱性FGF(basic-FGF，bFGF)以及用作信号传导分子的各种附着因子组成。bFGF或碱性成纤维细胞生长因子是ECGS中发出内皮细胞生长信号的活性组分。肝素与FGF结合并促进与FGFR(FGF受体)的配体形成。因此，将肝素连同FGF一起添加至培养基中是重要的。可能需要尝试不同批次的ECGS，因为该补充剂是非限定的并且通常包含不同浓度的bFGF。

III.微图案化/纳米图案化方法

基底的微图案化是公知的工艺，其中基底通过各种沉积、退火和生长过程来制造，并且通过光刻工艺图案化，所述光刻工艺包括光敏抗蚀剂(photosensitive resist，PR)的沉积、图案的排列、PR的显影和特定未掩蔽区域的蚀刻。

电子束蒸镀是其中在kV范围内的高电压下和在高真空下用由带电钨丝产生的电子束轰击坩埚中的锭靶材料的物理气相沉积过程或EBPVD。电子束使来自靶的原子转变为气相。然后将这些原子沉积到固体基底(在此为Si晶片)上以产生良好控制的层。

在EBPVD系统中，必须将沉积室抽空至至少1×10^-6托的压力，以确保并入到膜中的最小污染水平并允许膜的均匀沉积。在各自具有几十千瓦到几百千瓦的功率的单个EBPVD系统中，可以同时使用多种类型的蒸镀材料和电子枪。电子束可以通过热离子发射、场电子发射或阳极弧方法产生。产生的电子束被加速至高动能并朝向蒸镀材料。在撞击蒸镀材料时，电子将非常迅速地失去它们的能量。电子的动能通过与蒸镀材料的相互作用被转化为其他形式的能量。产生的热能加热蒸镀材料，使其熔化或升华。一旦温度和真空度足够高，蒸气将由熔体或固体产生。然后，所得蒸气可以用于涂覆表面。加速电压可以为3kV至40kV。当加速电压为20kV至25kV并且束流为几安培时，电子动能的85％可以转化为热能。入射电子能量中的一些通过产生X射线和二次电子发射而损失。

根据蒸镀材料的相图，一些难熔碳化物(如碳化钛)和硼化物(如硼化钛、硼化锆和硼化铪)可以在不经历在气相中分解的情况下蒸镀。这些化合物通过由锭块直接蒸镀而作为薄膜沉积在给定的基底上。

将其上发生膜沉积的基底根据适当的清洁方法(recepy)清洗，干燥并固定至基底保持器。将基底保持器连接至机械手轴。机械手轴平移移动以调节锭源与基底之间的距离。轴还以特定速度使基底旋转，使得膜均匀地沉积在基底上。通常，来自电子枪之一的聚焦高能电子或来自加热器灯的红外光可以用于预热基底。基底的加热通过给予吸附原子足够的能量以克服动力学障碍而允许增加的吸附原子–基底和吸附原子-膜扩散。

本发明人选择用于所有三种二硼化物的电子束蒸镀工艺作为用于具有由其相图确定的相合组成的高熔化温度化合物的最可再现的沉积方法。电子束不具有原位清洁选项，因此必须严格遵循基底在沉积和高真空之前的表面准备。

数种沉积系统例如溅射具有在膜沉积之前通过离子轰击进行原位清洁的优点，但二硼化物沉积技术非常困难。此外，化学气相沉积(CVD)法很难开发以形成非常薄的复合材料层。

光学光刻工艺(也称为光刻(包括UV和极UV光刻))是用于微加工以在薄膜或基底(也称为晶片)的主体上产生图案的工艺。其利用光将几何图案从光掩模(也称为光学掩模)转移至基底上的光敏(photosensitive)(即，光敏(light-sensitive))化学光致抗蚀剂。然后，一系列化学处理允许显影、将曝光图案蚀刻到材料中。在复杂的集成电路中，CMOS晶片可能经过多达50次的光刻周期。

光刻与摄影共有一些基本原理，即光致抗蚀剂蚀刻中的图案是通过使其直接(不使用掩模)曝光或使用光掩模用投影图像曝光来产生。该过程与用于制造集成电路或印刷电路板的方法的高精度版本相当。这种方法经细致的修改可以产生非常小的图案，尺寸小到几十纳米或甚至几纳米。其提供了对其创建的对象的形状和尺寸的精确控制，并且可以在整个表面上成本有效地创建图案。光刻需要非常干净的操作条件，这是洁净室设施的标准。

光刻的单次迭代按顺序组合数个步骤。现代洁净室使用自动化的机器人晶片轨道系统来协调过程。光刻工艺通过晶片轨道和步进器/扫描器来进行，并且晶片轨道系统和步进器/扫描器并排安装。一般步骤包括清洁、准备、光致抗蚀剂施加、曝光和显影、蚀刻和光致抗蚀剂去除。

为了确保光刻之前的表面清洁度，可以使用光致抗蚀剂的良好粘合所必需的湿法化学处理。然后，将晶片最初加热至足以脱气的150℃的温度，即，除去晶片表面上可能存在的水分。液态或气态“粘合促进剂”例如双(三甲基甲硅烷基)胺(“六甲基二硅氮烷”，HMDS)可以用于促进光致抗蚀剂对晶片的粘合。

晶片通过旋涂被光致抗蚀剂覆盖。最终厚度也由旋涂机的rpm和PR的粘度决定。对于非常小的、密集的特征(<125nm左右)，需要较低的抗蚀剂厚度(<0.5微米)以克服高纵横比下的塌陷效应；典型的纵横比<4:1。然后将光致抗蚀剂涂覆的晶片预烘烤以除去过多的光致抗蚀剂溶剂，通常在热板上在90℃至100℃下预烘烤30秒至60秒。可以在施加光致抗蚀剂之前施加BARC涂层(底部抗反射涂层)，以避免在光致抗蚀剂下面发生反射并且改善光致抗蚀剂在具有反射表面的较小半导体节点处的性能。

在预烘烤之后，使光致抗蚀剂暴露于由特征尺寸确定的特定波长的强光图案。曝光引起化学变化，该化学变化允许一些光致抗蚀剂通过被称为类比于照相显影剂的“显影剂”的特殊溶液除去。正性光致抗蚀剂(最常见的类型)在曝光时变得可溶于显影剂；对于负性光致抗蚀剂，未曝光区域可溶于显影剂。可以在显影之前进行曝光后烘烤(post-exposure bake，PEB)，通常是为了帮助减少因入射光的相消和相长干涉图案而引起的驻波现象。在深紫外光刻中，使用化学放大型抗蚀剂(chemically amplified resist，CAR)化学反应。该过程对PEB时间、温度和延迟更加敏感，因为大多数“曝光”反应(产生酸，使聚合物可溶于碱性显影剂)实际上发生在PEB中。

很像用于光致抗蚀剂沉积一样，使用旋涂机输送显影剂。显影剂最初通常包含氢氧化钠(NaOH)。然而，钠在Si芯片制造中被认为是非常不期望的污染物，因为其会降低栅极氧化物的绝缘性能(具体地，钠离子可以迁移进栅极和从栅极中迁移出，从而改变晶体管的阈值电压并且使得随时间更难或更容易打开晶体管)。如由PR生产商规定使用无金属离子显影剂来完成PR的图案化。根据所使用的PR类型，如果使用非化学放大型抗蚀剂，则可以使用“硬烘烤(hard-baked)”，通常在120℃至180℃下持续20分钟至30分钟。如果需要，硬烘烤使剩余的光致抗蚀剂固化，以在未来的离子注入、湿法化学蚀刻或等离子体蚀刻中制造更耐用的保护层。

在蚀刻中，液体(“湿的”)或等离子体(“干的”)化学试剂除去未受光致抗蚀剂保护的区域中的基底的最上层。在半导体制造中，通常使用干法蚀刻技术，因为它们可以被制成各向异性的，以避免光致抗蚀剂图案的显著底切。当待被定义的特征的宽度类似于或小于被蚀刻的材料的厚度时(即，当纵横比接近一时)，这是必不可少的。湿法蚀刻工艺在本质上通常是各向同性的，这对于其中悬浮结构必须从底层“释放”的微机电系统来说通常是不可或缺的。

在蚀刻之前，必须对光致抗蚀剂中产生的图案进行检查，然后进行蚀刻过程、再次检查和使用“抗蚀剂剥离剂”或经常是丙酮的抗蚀剂去除。或者，光致抗蚀剂可以通过被称为“等离子体灰化”的氧等离子体来去除。在湿抗蚀剂去除之后通常是在丙酮、酒精和去离子水中的最终冲洗。

IV.微图案化表面的细胞生物学用途

在原位，细胞对其微环境(例如它们生长的基底)的几何和机械约束高度敏感。基底的表面的微图案化可以显著影响细胞生长和行为的能力和类型。例如，微图案化可以用于限制培养区域的位置和形状。工程微图案可以为单个细胞或多细胞排列提供微米或纳米级、柔软、三维、复杂和动态的微环境。这些微图案化基底具有潜在地重现用于体外细胞培养的生理条件的优点。例如，通过操纵微图案形状，可以驱动细胞使其细胞骨架结构适应其微环境的几何形状，从而导致肌动蛋白和微管网络的重构以及细胞极性的适应。这些修改进一步影响细胞迁移、生长和分化。

在特定应用中：

·干细胞(间充质干细胞、诱导多能干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、其他非胚胎(成体)干细胞、脐带血干细胞和羊水干细胞)分化为其他细胞类型，例如胰岛素产生细胞、成骨细胞、软骨细胞等。

·不同细胞类型的共培养

·用于开发类器官的不同细胞类型的共培养

·用于筛选化学和表观遗传候选药物的药物发现平台

·癌症干细胞筛查和分析

·癌症转移筛查和分析

V.实施例

包括以下实施例以说明优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在实施方案的实践中很好地发挥作用的技术，因此可以被认为构成用于其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下可以对所公开的具体实施方案做出许多改变并且仍然获得相似或类似的结果。

实施例1–材料和方法

图案化基底的微加工。微图案化基底通过一系列确立已久的工艺例如通过电子束蒸镀的物理沉积、通过光刻的图案化和湿法蚀刻来制造。厚度在30nm至100nm的范围内的TiB₂(和ZrB₂、HfB₂)层由熔化的99.9％的这些硼化物的块通过电子束蒸镀在使用标准RCA清洁[60]清洁的(100)定向低掺杂n型和p型Si晶片上沉积。在电子束蒸镀之前，将基底浸入0.5％氢氟酸(HF)中以除去表面氧化物，用去离子(DI)水冲洗并在N₂中干燥。沉积过程的参数包括电子束能量8keV、低于3×10^-7托的基础压力、保持低于3×10^-6托的操作压力和

/秒至

/秒的沉积速率。使用在用于光刻过程的玻璃上沉积并图案化的铬层制造具有由直径在100μm至600μm的范围内的圆的阵列和/或可变长度达到约500μm且宽度从5μm至50μm变化的线组成的图案的掩模。使用接触模式下的光学光刻和用于图案曝光的负性光致抗蚀剂(Futurrex，Franklin，NJ)将硼化物层图案化为设计的结构。在具有充当掩模的图案化光致抗蚀剂的沉积膜上，将30％过氧化氢中的湿法蚀刻工艺用于TiB₂(对于ZrB₂和HfB₂，添加5％的HF)。然后在丙酮中剥离光致抗蚀剂并在IPA中冲洗，然后进行去离子水冲洗。使用压缩氮气(N2)气枪将洁净的晶片干燥。为了进行实验，使用金刚石切割机将基底切割成小正方形或矩形，面积通常在20mm²至40mm²之间。在细胞培养之前，通过在70％乙醇中浸没30分钟对基底进行灭菌。

材料表面表征方案。使用在小于5×10^-9托的背景压力下操作的X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy)(XPS；5700型，Physical Electronics,Inc.,Chanhassen,MN)确定微图案化基底的分子组成。该仪器用于收集使用在350W下操作的单色A1-kαx射线源(1486.6eV)产生的光电子。将分析区域设定为800μm，并且收集实心锥(collection solid cone)和出射角(take off angle)分别为5°和45°。11.75eV的通能引起大于0.51eV的能量分辨率。在至少5×10^-9托的真空中获得频谱。然后使用MultipakTM软件处理数据，并应用Shirley背景扣除程序[61]。

将在10kV下操作的配备有电子色散X射线检测器的场发射扫描电子显微镜(FieldEmission Scanning Electron Microscope，FE-SEM)Hitachi S-4800用于样品成像并用于能量色散X射线(Energy Dispersive X-Ray，EDX)光谱。将在200kV下操作的配备有小面积电子衍射(small area electron diffraction，SAED)的透射电子显微镜(transmissionelectron microscope)(TEM；JEOL 2000FX，JEOL USA，Inc.，Peabody，MA)用于晶体学表征。使用基于切片、胶合、压凹(dimpling)和最后在4keV下通过氩气进行离子铣削的标准程序进行TEM样品制备。

原子力显微术(atomic force microscopy，AFM)在休斯顿卫理公会医院研究所(Houston Methodist Hospital Research Institute)的AFM-SEM中心和斯旺西大学医学院进行。使用具有峰值力轻敲模式(Peak Force Tapping mode)(扫描速率：1Hz，样品/线：256)下的ScanAsyst,Santa Barbara,CA和硅探针(Bruker型号RFESP-75，测量的弹簧常数为2.857N/m)的Bruker Multimode 8检查基底的表面形貌和均方根粗糙度。使用NanoscopeAnalysis软件v1.50中包含的特定程序测量粗糙度Rq，该程序计算

其中，N为考虑区域中的点的数量，以及Zi为各个点i从平均数据平面的垂直位移。对于每种表面类型，收集三个单独的区域(各自为25μm²)，并在500nm×500nm的子区域上计算Rq，其中对于每种表面类型(Si或Ti)，总计为约60个Rq值。在Matlab 2019(Mathworks，Natick，MA)中绘制了粗糙度值的直方图。AFM NanoScope软件的承载和颗粒分析功能用于确定吸附的蛋白质的厚度。在承载分析中，假设所有吸附的蛋白质都作为地形特征可检测[62、63]。该分析提供了样品上表面高度(深度)的直方图的图。然后使用颗粒分析工具计算高于阈值深度的表面积和高度。在没有吸附的蛋白质的情况下，使用干燥的Si和TiB₂对照样品的表面高度分布确定阈值深度。

通过接触角测量确定表面可润湿性。通过超声波处理在乙醇和去离子水中清洗样品，并使用N2气枪干燥。使用座滴(sessile drop)(5μl)法和Matrix 8300EletrapetteProgrammable Piper仪器测量接触角。用数码相机记录接触角的图像，并使用Si和TiB₂基底各三个进行测量。

使用MTS nanoindenter XP(Keysight Technologies，UK)和Oliver和Pharr的分析技术[64]在基底上进行60nm深度的纳米压痕，以确定弹性模量和硬度。该仪器在连续刚度模式下操作，并且使用20nm直径的尖端制作压痕。取十个凹痕(indent)并取平均值。

通过开路电势(OCP)测量对去离子水和培养基中的Si(p型和n型)和TiB₂基底进行表面电荷评估。将基底安装在定制的样品保持器上，并使用Autolab PGSTAT12恒电位仪和NOVA软件(Metrohm，Riverview，FL)进行测量。参比电极为在-0.265V下相对于标准氢电极(normal hydrogen electrode，NHE)校准的银/氯化银。测量提供了系统中没有电流流动的稳态电势。为了使得能够实现适当的扫描时间和稳定的OCP测量，测量期间的电势变化限制为dE/dt<10^-6V/秒。去离子水中的测量值用于校准基线参考值以解释培养基中的相应读数。

细胞培养。将人脐血管内皮细胞(Umbilical Vascular Endothelial Cell)(HUVEC；CC-2519，Lonza，Allendale，NJ)在补充有20％胎牛血清(FBS,F4135)、1％抗生素抗真菌溶液(A5955)、1％肝素(H3393)、1％ HEPES(H0887)和1％内皮细胞生长补充剂(ECGS，E2759)的培养基199(11150067，ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)中在包被有0.2％明胶的常规组织培养塑料瓶(TCPS)中培养。使细胞在湿润控制环境中在37℃和5％ CO₂下生长至汇合，随后分裂以进行实验和进一步传代。使用流式细胞术表征的对CD14、CD34、CD45表达呈阴性以及对CD73、CD90和CD105表达呈阳性的人成体骨髓MSC是根据IRB批准的MTA从卫理公会医院获得的。将MSC在37℃和5％ CO₂环境下在补充有10％FBS的DMEM(MEM，M8042)中在TCPS中培养。除非另有说明，否则所有试剂均购自Sigma-Aldrich Corp.,MO,USA。

卵巢癌细胞系的细胞培养：将SKOV3和OVCAR3细胞系在癌症培养基(CancerMedia，CM)(含有谷氨酰胺的20％ RPMI 1640(02-0205VWR Life Science)、1％抗生素(Sigma-Aldrich A5955)和0.1％胰岛素(ABM TM053))中培养。对于基底上的细胞培养，CM补充有10ng/mL人FGF2(Sigma-Aldrich F0291)+1％肝素(Sigma-Aldrich H3393)。将细胞在37℃和5％ CO₂的湿润培养箱中培养。

以300个/mm²至600个/mm²的细胞密度从第1至9次传代的细胞用于接种图案化基底，使用丙酮、甲醇、IPA、去离子水和70％乙醇在标准过程中对所述基底进行清洗和灭菌。在细胞培养之前，不存在基底的生化或化学功能化。

光学成像和图像分析。对于免疫荧光染色，将细胞用新鲜的4％多聚甲醛在室温下固定15分钟，并用0.1％ Triton X-100透化。使用罗丹明缀合的鬼笔环肽对肌动蛋白丝进行染色并且使用黏着斑蛋白染色用于黏着斑。分析了以下细胞类型特异性生物标志物：cd-31(血小板内皮细胞黏附分子)、cd-105、n-钙黏着蛋白，并且使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核中的DNA进行染色。

通过分别使用SZX-10(Olympus America，NY)和荧光共聚焦显微术(FluoView-1000，Olympus America，NY)对基底上未染色细胞的反射立体显微术(反射光)来进行在图案化基底上生长的HUVEC的形态学和生存力评估。荧光显微术包括使用吖啶橙(AO；磷酸缓冲盐水中3μg/ml)来量化细胞生存力[65]，以及使用免疫荧光成像用细胞特异性单克隆抗体来评估功能表型[66]。使用两种方法来量化细胞生长。(1)使用落射荧光共聚焦显微术的合并AO的可生存细胞百分比。使用ImageJ分析每个时间点每个基底圆形图案的三至五个图像以确定覆盖圆形TiB₂图案的可生存细胞的百分比。注意，在每个时间点随机挑选一至三个基底而无需更换。确定在接种之后的不同天数覆盖有可生存细胞的图案的百分比面积。从两个重复中分析在每个时间点来自每个基底的至少四个单个圆形图案，并且确定平均值。(2)使用立体显微术的形态完整的附着细胞(未染色的/无标记的)的百分比。对于细胞计数，使用接种之前基底的图像以在背景Si上产生TiB₂图案区域的图像掩模。将在接种之后的时间点捕获的图像与图像掩模手动对齐，增强对比度，并且使用边缘检测来描绘细胞。通过对MSC和HUVEC分别使用200μm和100μm的周长来确定每单位面积的细胞计数。分析至少三个重复，对于每个重复，每个时间点6至24个图像。通过使用立体显微术定量地测量附着细胞沿图案的取向来评估细胞排列。通过从立体显微镜图像中手动勾勒细胞来鉴定单个细胞的排列的长度、宽度和轴。1.0的长宽比表示圆形或立方形形状，而大于1.0的比说明“长于宽”或者伸长的细胞形状。在来自三个重复的图案化基底上进行细胞形状(长宽比)测量。对于每个重复，分析具有宽度为5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、45μm、50μm和150μm的线图案的一至三个基底。在接种两周的时间之后，在不同时间点对基底进行成像。在每个时间点，分析数量范围为3至15个的细胞的不同宽度的线图案。

在具有宽度为5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、45μm、50μm和150μm的线图案的五个基底上进行细胞取向分析。使用细胞轴与图案轴之间的角度作为细胞排列的量度，其中0°/180°的角度表示完美的排列，以及90°的角度表示垂直排列[67]。对每个基底每个线约3至20个细胞进行分析。

使用用吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)的双荧光染色[68]结合激光扫描共聚焦显微术来进行在基底上的聚集体中的MSC的生存力分析。AO对活细胞的DNA染色，而PI为仅进入质膜受损的死细胞的膜不可渗透的染料。将具有MSC聚集体的基底用AO/PI溶液的混合物(磷酸缓冲盐水中的3μg/ml AO和10μg/ml PI)在室温下染色20分钟并使用共聚焦显微术成像。

从DAPI染色的细胞核的共聚焦图像的z-堆叠中测量聚集体的尺寸。手动勾勒聚集体的直径并基于具有DAPI染色的细胞核的z区段的数量计算厚度(高度)。

使用ImageJ交互式和/或定制的脚本进行免疫荧光图像和立体显微镜图像二者的图像分析[69]。

RNA-测序(RNA-seq)文库制备、测序和转录物组分析。使用带有柱上无RNA酶的DNA酶的MiRNeasy微型试剂盒提取RNA，按照制造商的说明(Qiagen，Germantown，MD)进行消化。在Tapestation 4200(Agilent，Santa Clara，CA)上使用RNA tape对所提取的RNA样品进行品质控制评估并且用Qubit荧光计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)将其量化。将RIN评分>8.80的样品进一步处理用于测序。在休斯顿大学(University of Houston)Seq-N-Edit Core中按照标准协议制备RNA文库并且对其进行测序。用使用100ng输入RNA的QIAseq Stranded Total RNAlibrary试剂盒(Qiagen，Germantown，MD)制备RNA文库。使用SPRIselect珠(Beckman Coulter Inc.，Brea，CA)进行文库的尺寸选择，并使用DNA1000tape Tapestation 4200分析文库的纯度。将所制备的文库合并，并使用NextSeq 500(Illumina Inc.，San Diego，CA)测序；产生每个样品约2000万个2×76bp配对末端读取。

使用FastQC[70]分析原始fastq文件，FastQC是一种用于高通量测序数据的品质控制工具，其提供一组参数(例如，序列品质或重复读取的存在)，从而允许快速评估数据可行性用于进一步分析。然后用CLC Genomics Workbench v12(Qiagen，Germantown，MD)处理RNA-seq fastq文件。修整衔接子，并将读取映射至hg38人参考基因组。通过使用以下参数将读取比对表示为整数计数：对于一个读取最多10个命中、误配成本(mismatch cost)2、插入成本(insertion cost)3、删除成本(deletion cost)3、长度分数(length fraction)0.8、相似性分数(similarity fraction)0.8。通过M值的修整平均值(Trimmed Means ofM-values，TMM)算法将整数读取计数归一化，最终产生测序读取的基因计数矩阵。使用基因计数矩阵来筛选在各实验条件中存在或不存在的转录物；使用维恩图[71]比较基因列表。此外，在读取计数的归一化之后，本发明人使用EdgeR包[72]进行差异基因表达，所述EdgeR包使用与负二项分布相关联的广义线性模型来鉴定显著性。使用0.05的FDR调节的p值的显著性水平以及大于或等于2的log₂倍数变化来鉴定差异表达基因。将原始的和经处理的RNA-seq数据存储在NCBI GEO数据集(登录号GSE135824)中。

使用平台PANTHER以执行功能性分类分析、统计过度表示测试(statisticaloverrepresentation test)和统计富集测试[73、74]。被选择以进行功能性分类分析的PANTHER GO术语为“生物过程”和“分子功能”；结果显示为饼图。对所有主要GO术语测试过度表示(二项检验)，从而比较在不同的实验条件(例如，对于在基底上培养的细胞(HUVECTiB₂)与在常规组织培养瓶中的对照细胞(HUVEC塑料))中表达的基因列表。类似地，对所有主要GO术语使用差异表达基因列表测试富集；结果显示出与整体表达趋势相比不同的显著富集的基因簇分布。

实施例2-结果

微图案化基底的表面表征。使用圆形微图案来控制细胞形态已被证明可用于改变MSC的干性(stemness)，以保持其多潜能性[47]以及诱导MSC球状体形成[46]。类似地，线微图案已广泛用于实现微血管形成以及评估使用HUVEC的血管重塑过程[45、75、76]。

图1A(Si(较暗))和TiB₂(较亮))中示出了未图案化的Si和TiB₂以及直径范围为100μm至600μm的Si-TiB₂圆形的阵列和可变线(宽度为5μm至50μm并且长度高至500μm)的立体显微术图像。SEM成像还突出了基底上的背景和图案化区域，其中如在图1B中所看到的Si(较亮)和TiB₂(较暗)。此外，截面TEM分析表明TiB₂层为30nm至40nm厚且均匀，具有薄的(约2nm)表面氧化物层(图1C)。选区电子衍射图案(SAED)显示TiB₂膜表现出无定形晶体学结构(单晶(斑点)衍射来自<110>区轴取向；参见图1C中的插图)。退火硼化物的互补测量(数据未示出)示出对应于TiB₂的具有晶格参数

(对于100、101和002晶格条纹衍射线，

以及

)的六方结构[77、78]。对于ZrB₂和HfB₂，分别获得了表明化学计量组成的类似测试结果[177]。在膜的表面处或主体中没有鉴定出结晶氧化物例如TiO₂锐钛矿和金红石。AFM分析使得能够实现Si-TiB₂3D表面表示(surface representation)，从而确定了40nm的记录厚度并突出了Si和TiB₂区域的类似表面形貌(图1D)。表面粗糙度(Rq)的量化确定了差异小，其中Si背景表现出

的较低的平均Rq，而TiB₂微图案表现出

的略高的平均Rq(参见图2A)。如在图2B中所看到的，纳米压痕测量记录了TiB₂在14GPa下的硬度和在200GPa下的杨氏模量，而对于Si，值为10GPa和150GPa。TiB₂的这些结果示出了比厚膜硼化物所公开的值[79]更小的值，但是匹配如由Zyganitidis(2009)所公开的较薄膜的值[80]。使用X射线光电子能谱法(XPS)来确定沉积的二硼化物层的分子组成，其中使用Ar原位溅射[81、82]进行深度剖析。XPS表明，对于在膜的主体中的所有分析的二硼化物(图2C中仅示出TiB₂，其中仅标记了TiO₂峰)和纯化学计量二硼化物(以TiB₂示出)组成，在顶部表面层处都存在薄的B氧化物和金属氧化物以及混合氧化物，这也通过深度剖析得到确定(图2D)。对于ZrB₂和HfB₂获得了类似的XPS结果，示出了在主体中的这些二硼化物的化学计量组成以及仅在表面处的B₂O₃和混合(各自的)金属氧化物(未示出图)。观察到作为典型污染物的C-1s主要吸附在表面处并且表面氮水平也是低的，即，低于0.46原子％，没有形成氮化物例如TiN或BN。这可能部分归因于对氧化的强烈敏感性，与Ti类似，即使在RT下，Ti也会在空气中与氧瞬间反应并形成非常薄的氧化物(例如TiO和Ti₃O₂)[83]。与先前关于氧化的报道一致，Ti⁴⁺态更占主导地位，而TiO₂通常在升高的退火温度下形成[84]。这样的氧化物层是稳定的，并且由于通过氧化物的有限的氧扩散而使表面钝化[85至87]。

以能量色散X射线光谱(EDX)的形式进行进一步化学表征，示出了TiB₂层上的较低的Si峰(图2E)，而仅在TiB₂图案化区域上看到弱的Ti峰。如图2F中所示，如通过在DI水中获得的开路电势(OCP)测量的，在n型和p型硅表面上均记录了比TiB₂表面上更大的负表面电荷。

Si的OCP值为(“p型”-0.24V至-0.27V，“n型”-0.22V至-0.23V)，而硼化物TiB₂的OCP值为-0.082V至-0.14V)。这些值与公开的对Si和SiO₂[88-91]以及Ti和TiO₂[92]所报道的零电荷点(point of zero charge，PZC)或等电点(isoelectric point，IEP)值一致。

这是预期的，因为TiB₂的功函数大于低掺杂Si的功函数，并且来自第4族的所有过渡金属氧化物的IEP值显著大于二氧化硅的IEP值[186]。第4族过渡金属硼化物的电子功函数值大(4.71eV至4.96eV TiB₂、4.41eV至4.85eV ZrB₂、4,71eV至4,86eV HfB₂)[175]，表明化学稳定性和表面带电荷。硅低掺杂的n型和p型具有相似的值，其与由电导率类型和掺杂浓度水平限定的费米能级差异无关。纯Ti的零电荷电势(Potential of zero charge，PZC)比Si更大，因此在相同pH下的溶液中，Ti在表面处表现出更少的负电荷。研究表明对于Ti合金，硼将表面电势转变成更加酸性的，从而使表面带更多负电荷[93]。然而，添加TiB₂的薄涂层导致比对于Ti所看到的负电势更小的负电势，表明更小的负电荷[94、95]，正如用本发明人的基底所看到的，其中在表面处的TiB₂中的硼呈薄氧化物的形式并且在水溶液中也作为硼酸。类似地，与硅相比，ZrB₂基于其在pH＝6.7处的等电点，可以预期更多的正表面电荷[187]。本发明人的Si和TiB₂基底的行为示出了OCP随时间的变化小(硼效应)，这可能表明氧化物累积[96]。清洁的TiB₂图案(和第4族的其他二硼化物)表现出接触角范围为16°至20°的亲水性表面，而背景SiO₂/Si基底亲水性较低，接触角为45°。

暴露于补充培养基的微图案化基底的表面表征。在补充有ECGS和肝素的培养基中的Si基底和TiB₂基底的OCP分析示出了对于这两种材料，负电荷显著增加，在测量开始时这两者之间具有增加的差异(图3)。

如从无蚀刻的表面质量可以看出，增加的负电荷与任何适时地蚀刻/腐蚀无关。在浸泡在补充培养基中时，TiB₂的OCP值下降至-0.4V并且Si的OCP值下降至-0.6V。应注意，对于少数测量，OCP保持不变，并且如由10^-6V/秒的设定电势变化限制所决定的，进一步测试被终止。培养基组分在表面上的吸附可能是观察到的OCP的时间依赖性的原因[97]。如在补充培养基中过夜储存之后测试的Si和TiB₂样品中所看到的，培养基组分层在每种材料的表面处的吸附在延长的浸泡中变得独立于原始基底电荷。这些结果表明当来自培养基的蛋白质吸附在基底的表面处时，静电效应在基底接种期间的培养过程开始时是最重要的。

在清洁基底以及在具有和不具有肝素的ECGS中孵育过夜的基底上进行AFM和XPS以评估微图案化TiB₂基底上的蛋白质吸附。在未图案化的TiB₂层和Si基底二者上，与50μg/mL ECGS一起孵育，观察到清晰的蛋白质沉积物层；然而，在存在1％肝素的情况下，在背景Si上观察到蛋白质沉积物减少，表明肝素介导了在TiB₂上的差异蛋白质吸附(图4A至E)。在存在ECGS和肝素的情况下，虽然TiB₂区域的形貌是相对均匀的，但是Si区域示出了随机分散的球状沉积物(在图4A的3D表面图中作为分散的峰也是明显的)。用图4B中示出的Rq分析确定了这些观察结果，其中Si背景表现出

至

的宽范围的Rq值以及

的平均值。TiB₂微图案表现出

至

的更高、更均匀分布的Rq范围以及

的平均值。此外，如在(图4C)和表1中所看到的，XPS结果确定了AFM观察结果，示出了当在50μg/ml ECGS中孵育过夜时，Si和TiB₂二者的元素浓度的百分比减少以及有机基质元素增加。图4D至E中示出了Si和TiB₂在暴露于具有和不具有肝素的ECGS时的承载分析的AFM图像和直方图。在插入的AFM图像中，以青色突出蛋白质特征以将其与背景基底特征区分开。观察到表面高度分布的整体相似轮廓形状，但是分布向不同的深度移动。如在图4D中所看到的，在不存在肝素的情况下，在整个TiB₂和Si上，表面高度分布在相对相似的范围内，其中平均值分别为4.4±2.2nm(范围：1.5nm至16.0nm)和6.8±3.0nm(范围：2.7nm至21.5nm)。在存在ECGS和肝素的情况下(图4E)，TiB₂上的平均表面厚度为3.3±1.5nm(范围：1.5nm至7.3nm)，而Si的平均表面厚度为9.8±7.1nm(范围：0.8nm至30.1nm)，表明蛋白质的分离的团集区域分布在Si上。

表1呈现了如通过XPS确定的在存在不同培养基补充剂的情况下，吸附在基底上的材料的元素组成。Si和Ti(以及B)的元素浓度分别用于评估Si基底和TiB₂基底的暴露表面。此外，C、N和S的元素浓度用于评估吸附的蛋白质的相对量[98]。来自FBS或ECGS的蛋白质在Si和TiB₂二者上的吸附高，因为与较低量的Si(与51.6％对照相比，11％至13％)和Ti(与13.8％对照相比，1.4％至2.8％)相比，>50％的总的C、N和S存在于表面上。肝素在Si基底或TiB₂基底上的吸附最少，因为Si的表面浓度(45.8％)与对照(51.6％)的表面浓度相似。类似地，Ti(15.2％)和B(15.8％)的表面浓度与Ti(13.8％)和B(16.8％)的对照值相当。如通过开路测量所测量的，Si基底和TiB₂基底均表现出负表面电荷并且可能排斥在所有已知生物分子中具有最高净负电荷密度的肝素的吸附[99]。在存在肝素和ECGS的情况下，在Si基底和TiB₂基底二者上看到了蛋白质吸附，但是与其中蛋白质吸附相对较少的背景Si(其中与51.6％的对照相比，在表面处测量到38.4％的Si)相比，在TiB₂上看到了相对较高的蛋白质吸附(与13.8％对照相比，表面Ti含量减少至6.6％)。肝素为以高亲和力与大量蛋白质(例如含有带正电荷的肝素结合结构域的生长因子)结合的带负电荷的高度硫酸化的乙酰肝素糖胺聚糖[100]。ECGS构成含有肝素结合结构域的人生长因子(包括碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)和内皮生长因子(EGF))的混合物[101、102]。因此，在存在肝素和ECGS的情况下，肝素结合的生长因子被吸附在微图案化基底上，其中在TiB₂上的浓度更高。与TiB₂相比，Si带更多的负电荷，从而排斥肝素结合的ECGS蛋白质并导致相对较低的蛋白质吸附水平。值得注意的是，肝素不会显著影响来自FBS的蛋白质在Si或TiB₂上的沉积。在存在肝素和FBS的情况下，如由Si和Ti的低表面浓度(<2％)以及C、N和S的高浓度(>58％)所表明的，大部分基底覆盖有蛋白质。这是由于当与ECGS相比时，FBS中具有肝素结合结构域的蛋白质的量减少[101至103]。令人感兴趣的是，在存在FBS、ECGS和肝素的情况下，如由Si和Ti的低表面浓度(<1％)以及C、N和S的高浓度(>56％)所表明的，在Si和Ti二者上的蛋白质吸附均高。然而，鉴于来自ECGS的蛋白质在存在肝素的情况下由于Si更大的负表面电势而较不容易吸附在Si上，较大部分的肝素结合的ECGS蛋白质可能在TiB₂上。这些数据表明，在补充有ECGS和肝素的培养基中，相对于Si背景，TiB₂微图案上的蛋白质吸附更高。

微图案化基底上的HUVEC和MSC的细胞图案化。发明人通过以24小时至48小时的间隔获取立体显微镜图像，评估了HUVEC和MSC在2周至3周的时间内在TiB₂微图案化基底上黏附和生长的能力。图5中呈现了来自在(i)不含ECGS且不含肝素的培养基、(ii)补充有ECGS的培养基、(iii)补充有肝素的培养基、以及(iv)补充有ECGS和肝素的培养基中在Si-TiB₂基底上培养的HUVEC和MSC的立体显微术的代表性反射光图像。如在图5(左上图)中所看到的，在不存在ECGS和肝素二者的情况下，在Si背景和TiB₂图案上均观察到一些MSC黏附。然而，比起背景Si，MSC偏好TiB₂图案，正如通过黏附至圆形图案的显著较大量的细胞所明显看出的(补充表2)。在仅存在ECGS的情况下，细胞最初偏好图案，但随着时间的推移，生长到背景Si区域上。类似地，在仅存在肝素的情况下，虽然细胞最初表现出在TiB₂图案上优先生长，但它们后来在基底上生长为汇合的单层。值得注意的是，在培养一周多之后，圆形TiB₂图案上的MSC自发地分组和簇集以在圆形图案上形成3D聚集体。令人感兴趣的是，在补充有ECGS和肝素的培养基中，细胞黏附和生长对TiB₂微图案是高度特异性的，在整个培养周中，在Si背景上没有观察到细胞黏附或生长(在三周时间内测试，还参见补充图1A至B)。MSC聚集最早在第5天发生，然后在所述培养周结束之前形成3D聚集体。

如用MSC所观察到的，在存在ECGS和肝素的情况下，HUVEC也表现出在TiB₂图案上的高度特异性生长，而在Si背景上没有生长。然而，与能够在没有补充剂的培养基中生长的MSC不同，HUVEC无法黏附，并因此它们在没有ECGS和/或肝素的情况下不能表现出在基底上的任何生长(参见图5，右图)。这是预期的行为，因为已证明生长因子和肝素对任何体外HUVEC培养增殖均是至关重要的[104至106]。使用图像分析宏对细胞增殖进行量化以将对于不同培养基补充剂在Si背景与图案上生长的细胞进行划分(参见补充图2A至G)。对于每个重复，分析每天二至四个图像。对于在不含补充剂的培养基中生长的MSC分析四个重复，对于在补充培养基中生长的MSC分析六个重复，以及对于在补充培养基中生长的HUVEC分析3个重复。细胞计数在9天的时间内增加，对于不含补充剂的培养基，与Si背景相比，在TiB₂图案上看到更多数量的MSC(补充表2)。除了发生聚集并且计数的细胞总数被低估(因为不能从2D图像中得到3D数据)的一周内的几天之外，细胞计数随着时间的推移显著不同并且在经补充的样品和不含补充剂的样品上显著不同(补充表1至补充表3)。HUVEC在一周的时间内也接近稳定状态生长(补充表1和图5)。在不存在ECGS和肝素的情况下，HUVEC不能在Si背景上生长(图5，右图)，因此仅针对补充培养基给出细胞计数。这些结果明确地证明了只有在存在ECGS和肝素的情况下才实现TiB₂图案特异性生长。对于在通过电子束蒸镀沉积在硅基底上的ZrB₂和HfB₂层中形成的相同图案，获得了相同的生长选择性。

重要的是，这些硼化物的微图案的形状影响细胞生长图案。先前的工作表明，圆形图案特异性地促进细胞聚集[57、107]。本发明人观察到类似的生长图案，其中，圆形图案促进了3D MSC聚集体形成(图5；左图)和补充图1A至B(红色箭头)，而当不受图案几何形状限制时，MSC在连续未图案化的TiB₂上的未限定层中生长(图5；左图)和补充图1B(蓝色箭头)。也在具有圆形图案和线图案的基底上在补充培养基中培养MSC(参见补充图1AB和补充图3)。除了MSC在圆形图案上的聚集之外，本发明人还观察到线图案与圆形图案的接近导致细胞在线和圆形上伸长(参见白色箭头)。值得注意的是，MSC表现出沿着(5μm宽的)线图案排列的接触引导。如在图5(右图)中所看到的，也在仅圆形以及圆形和线图案上培养HUVEC。

对于MSC和HUVEC二者，在本研究中观察到的细胞生长的最长持续时间为三周。补充图1A至B中示出了示出在具有不同图案的基底上以24小时至48小时间隔持续2周至3周的时间的MSC生长进展的图像。体内MSC是迁移性的并且已知从骨髓中移动，通过组织迁移并且在损伤部位归巢。MSC归巢可以通过化学刺激发生或者在导致细胞响应于刚度梯度而定向迁移的趋硬性(durotactic)信号下发生。近来，Vincent等,2013年，证明了MSC在接种后数小时内的初始附着和扩散不依赖于梯度强度或刚度，因此在3天之后，细胞迁移至基底较硬的部分[108]。在本研究中，本发明人观察到类似的结果，在不存在ECGS和肝素的情况下，MSC在微图案上的非特异性刚度依赖性优先生长，以及在存在ECGS和肝素的情况下，在图案上的特异性生长和3D聚集体形成。

可商购的ECGS主要用于支持内皮细胞的扩增，并且大多数制剂构成人生长因子(包括碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)和内皮生长因子(EGF))的混合物[101、102]。值得注意的是，所有这些生长因子均具有肝素结合位点[109]，并且近来越来越多的生理过程例如细胞黏附、迁移和增殖已被证明受到肝素作用的调节[100、110至112]。为了确定MSC特异性和3D聚集是否限于特定的生长因子，本发明人用5nM、10nM或20nM浓度的FGF、EGF或VEGF以及1％肝素补充培养基。对于所测试的各生长因子，观察到微图案特异性生长和MSC 3D聚集(数据未示出)。这表明特异性不限于特定的生长因子补充剂或组合，而是任何单独的具有肝素结合结构域的生长因子均可以用于实现二硼化物图案特异性生长和3D聚集。

HUVEC生存力、表型和形态表征。发现微图案化基底对HUVEC生长是生物相容的，根据图案排列和接触引导的公认效果观察到选择性生长图案[37、45、113至23、117]。用生存力染料AO染色的HUVEC的图像证明了细胞在具有可变尺寸的圆形和线的几何微图案化TiB₂基底上的优先黏附和生长(图6A；第1至3行)。第1列中的图像为4倍放大倍数，其中所选择的区域(彩色框)以更高的20倍放大倍数示出(图6A，第2至4列)。在TiB₂图案上生长的HUVEC细胞沿图案的长轴伸长、排列(图6A，红色箭头)，并且最外面的细胞的边界沿着它们附着的图案的边缘很好地扩散(图6A，白色箭头)。

图案尺寸也具有明显的效果，细胞以比细胞直径大5至10倍的更宽的图案的形式扩散和定殖整个区域(图6A，白色箭头)。如果图案直径受到控制并且仅为接种细胞的两倍，则细胞在保持伸长的同时彼此相邻排列以形成逐个细胞的阵列(图6A，红色箭头)。最后，当窄直径的线宽度被图案化时，看到单个细胞沿着图案伸长并排列(图6A，黄色箭头)。这些结果与数个先前的研究一致，这些先前的研究已示出了包括成纤维细胞、内皮细胞、间充质细胞、神经、心脏和肌肉的各种细胞类型的图案尺寸和形状依赖性受控生长和排列(综述于[116、118])。在与Si背景相比时，HUVEC的这种选择性偏好是由材料特性(包括二硼化物层的硬度、亲水性和电荷)的差异所介导的生长因子在存在肝素的情况下在图案化区域上的差异吸附的结果。此外，绿色荧光的存在表明AO染料对DNA的嵌入，从而确定了培养细胞的整体健康和生存力。此外，如其他研究[119]中所示出的，HUVEC的黏附和扩散受图案的形状和尺寸影响。

为了评估在基底培养之后功能性HUVEC细胞表型的采用，对血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM-1或CD31)、肌动蛋白(细胞骨架)和黏着斑蛋白(黏着斑)进行免疫荧光染色。用DAPI对细胞进行复染以使所有细胞核可视。当在TiB₂微图案化基底上培养时，HUVEC表达CD31(红色)(图6B)。在圆形图案上(图6B，第1列)，细胞表现出“鹅卵石”形态，其中在构成汇合的单层的细胞间边界的细胞膜表面处可见CD31染色。在线图案上(图6B，第2至4列)，细胞沿着图案的定向轴排列。这些发现提供的证据表明，当在微图案化表面上培养时，HUVEC通过PECAM的持续表达而保留其特征表型，同时与几何图案对齐。

HUVEC通过形成细胞黏附复合物例如黏着斑(黏着斑蛋白)和细胞骨架(F-肌动蛋白纤维)重排来形成对TiB₂图案化基底的不同附着(图6C)。肌动蛋白应力纤维沿TiB₂线图案的纵轴以及沿圆形图案的外周排列(参见白色箭头)。对于窄线，清楚地观察到肌动蛋白丝与图案边缘完美对齐，说明通过“接触引导”的细胞-材料相互作用[120]。由于图案不是通过生化手段活化的，即，它们没有被任何黏附促进剂例如纤维蛋白原或其他蛋白质功能化，这些结果与过去的工作一致，表明基底刚度可以影响细胞骨架取向和黏着斑的形成[121]。

还使用立体显微术图像评估了响应于圆形和线形图案的HUVEC形态(形状；长宽比)和取向(排列)。在图6D中将细胞的长宽比的平均值的平均值相对于图案化线的不同宽度作图。当将窄宽度≤20μm上的细胞与较宽线上的细胞进行比较时，细胞的伸长因子存在显著差异，其中在5μm线上观察到大多数伸长的细胞。这些结果与Lei等的结果一致[45]，Lei等指出内皮细胞在较窄图案上的扩散受限。随着线宽度的增加，细胞沿宽度扩散不受限制，并且这导致伸长因子约4倍的减少。图6E中还示出了以范围为5°至35°的不同角度与图案轴对齐的在不同宽度的图案化线上的细胞百分比的图。对于线宽度≤20μm的图案，有多于80％的细胞可以看到细胞与图案的几乎完美的对齐(角度≤5°)。该结果通过以下事实得到证实：附着的HUVEC的宽度可以在5μm至20μm的尺寸范围内[75]，这将限制在宽度≤20μm的线上占据不超过1至2个细胞。然而，根据公开的研究，将线宽度增加至大于20μm能够使多个细胞沿不受图案边缘限制的随机方向生长，并因此导致更大的取向角[45]。如在图6E中所看到的，与线图案的中心部分相比，在图案边缘处出现了非常强的细胞对齐。150μm(边缘)具有约75％的以0°至5°范围的角度排列的细胞，约15％的在5°至10°范围内的细胞，以及约10％的在10°至30°范围内的细胞。中心区域具有约48％的在0°至5°范围内的细胞以及在10°至35°范围内的剩下的52％。

通过确定覆盖图案化表面的可生存细胞的总面积，进一步证实了在图案化基底上的细胞生长和生存力。接种之后第4天直至第7天观察到显著生长(p值为0.0002<0.05)，在这之后，在第11天观察到细胞数量的减少(p值为0.004<0.05)，随后细胞生长维持在稳定状态下(第11至第13天；p>0.05)(补充图4)。

在圆形微图案上的MSC 3D聚集体的尺寸由DAPI染色的细胞核的共聚焦堆叠确定。如在图7A中所看到的，球状体直径依赖于图案直径，其中较大的球状体形成在较大的圆形图案上，而球状体的厚度相对均匀，其在45μm至50μm的尺寸范围内。图7B呈现了用AO/PI染色的MSC 3D聚集体的最大强度投影。发现3D聚集体内的细胞生存力在64.3％至89.0％的范围内，其中平均值为75.8±10％。

此外，表型(CD105，图7C)、细胞-细胞相互作用(N-钙黏着蛋白，图7D至E)和结构形态(F-肌动蛋白)评估验证了在基底上培养的MSC的生物标志物可持续性。CD105存在于两周培养时间内的细胞中，其中在沿边缘的细胞中观察到了比在聚集体内的分布水平更高的分布水平。图7D呈现了对F-肌动蛋白(绿色)、细胞核(DAPI，蓝色)和N-钙黏着蛋白(红色)进行了染色的MSC 3D聚集体的最大强度正交投影，而图7E通过聚集体呈现单个z切片。

如所预期的，观察到在3D聚集体内的N-钙黏着蛋白的簇集与在图案边界处的细胞中的均匀染色。此外，值得注意的是，在单个共聚焦z切片中的F-肌动蛋白细胞骨架(绿色)沿圆形图案的外周的特征纺锤形伸长和锚定(参见图7E中的第1列)与对3D聚集体所看到的内部细胞中的细胞骨架的圆形团集(图7E，第4列至第5列)。

总RNA测序转录物组分析。为了鉴定对TiB₂微图案化基底上的HUVEC和聚集的MSC具有特异性的基因表达图案，本发明人使用超深度无偏RNA测序(RNA-Seq)方法进行了转录物组分析。使用在常规塑料组织培养瓶中以单层培养的MSC和HUVEC作为对照。如图5和补充图1A至补充图1B中所示，在存在肝素和ECGS的情况下，MSC和HUVEC二者均无法黏附至背景硅上。因此，本发明人能够选择性地分离在微图案上生长的细胞以用于RNA分析。

使用FastQC对原始Illumina读取进行品质控制分析以监测数据品质[70]。QC度量例如序列品质、衔接子的存在或重复水平以及其他参数在样品之间表现出高同源性并且认为其可接受进行RNA-seq数据的分析。

在正常组织培养瓶中生长的HUVEC细胞的测序分析鉴定了8294个不同的转录物，而在TiB₂基底上生长的HUVEC细胞中鉴定了2441个(图8A)。为了在转录水平上测试基底的生物相容性，将鉴定出的基因列表与进化关系平台PANTHER进行了比较。PANTHER利用二项检验将用户提供的基因列表与限定的PANTHER GO术语的参考列表(所选择的生物体在PANTHER数据库中的所有基因)相关联[73、74]。

本发明人映射了针对“生物过程”和“分子功能”的主要Go术语在HUVEC细胞中表达的转录物列表(补充图5A和5C以及补充图6A至B)，表明虽然在表达基因的数量上存在差异，但是两个细胞群均表现出稳定的生物学功能和分子功能。基因数量上的差异可能是微环境因素的影响。研究报道了内皮细胞的体外培养对微环境因素例如涂覆表面的存在、培养基中生长因子的可用性和接种密度的依赖性[122、123]。Heng等,2011年还证明了接种密度对接种在不同生物材料表面上的HUVEC的增殖和基因表达谱具有深远影响[122]。基于PANTHER分析(补充图4至补充图6)，在基底上培养的HUVEC表现出与在塑料上培养的HUVEC相似的生物学谱和分子谱。

在MSC的情况下，当在塑料上生长时鉴定了5811个转录物，当在微图案化TiB₂基底上生长时鉴定了6147个转录物(图8B)。PANTHER分析证实了表面之间的生物相容性(补充图4B和4D)。为了了解在微图案化TiB₂基底上生长时特异性富集的途径，使用PANTHER(GO术语“PANTHER Pathways”)评估转录物列表的过度表示测试。在TiB₂中生长的HUVEC和MCS中鉴定出的富集途径描述于图8C中并且包括过程例如“血管生成”(HUVEC)和“胆固醇生物合成”(MCS)。令人感兴趣的是，当与在塑料瓶中表达的独特转录物(1912个，图8B)相比时，MCS中的“胆固醇生物合成”途径在TiB₂样品中表达的独特转录物组中也显著富集(2248个，图8B)。该结果表明，与典型的培养瓶相反，当MCS在TiB₂微图案化基底上生长时，胆固醇生物合成活性增加。

在塑料和TiB₂基底中生长的HUVEC之间的差异基因表达分析的结果表明，在所有检测的基因中，109个显著改变了表达水平[倍数变化>±1.5，错误发现率(FDR)<0.05]。在这109个转录物之外，95个下调，14个上调(补充表4)。当评估MSC的差异基因表达时，仅22个基因显著改变表达(倍数变化>±1.5；FDR<0.05)，其中7个基因下调，15个上调(补充表5)。为了进一步了解差异表达转录物列表内哪些过程或途径显著富集，本发明人进行了PANTHER富集测试。MSC(26)的情况下的差异表达基因列表太小以致不能产生显著的结果；然而，PANTHER能够使用GO术语“生物过程”和“分子功能”来鉴定在TiB₂基底上生长的HUVEC中的大量富集过程(图8D)。因此，与塑料对照相比，与线粒体ATP合成和NADH活性相关的过程在TiB₂上的HUVEC细胞中显著上调(图8D)。大量线粒体基因也在MSC细胞中上调(补充表5)，强烈表明增加的代谢活性与微图案TiB₂基底上的细胞生长之间的联系。

表1-如通过XPS分析确定的在存在不同的培养基补充剂的情况下吸附在基底上的材料的元素组成

在存在以下物质的情况下，Si和TiB₂基底上的元素含量(原子％)

各种元素的化学状态：Si为Si约70％至80％以及SiO₂约30％至20％，Ti为TiO₂约90％以及TiB₂约10％，B为硼化物和/或硼约30％以及B₂O₃约70％，C为CHn约40％至60％以及C与N、O约60％至40％，N为铵盐、有机基质约97％以及氮化物、氰化物、叠氮化物约3％。

补充表1

Student t检验(双侧，P值<0.05被认为是显著的)，对微图案化基底上的HUVEC和MSC在9天时间内的细胞计数进行比较。对于每个重复，分析每天二至四个图像。对于在不含补充剂的培养基中生长的MSC，分析四个重复，对于在补充培养基中生长的MSC，分析六个重复，以及对于在补充培养基中生长的HUVEC，分析3个重复。

补充表2

Student t检验(双侧，P值<0.05被认为是显著的)，对在Si与TiB₂上在不含补充剂的培养基中在9天时间内的微图案化基底上的MSC计数进行比较。对于每个重复，分析每天二至四个图像。对于在不含补充剂的培养基中生长的MSC，分析四个重复。

补充表3

Student t检验(双侧，P值<0.05被认为是显著的)，对在补充培养基与不含补充剂的培养基中在9天时间内的微图案化基底上的MSC计数进行比较。对于每个重复，分析每天二至四个图像。对于在不含补充剂的培养基中生长的MSC，分析四个重复，对于在补充培养基中生长的MSC，分析六个重复。

补充表4

与在常规塑料瓶上生长的细胞相比，在TiB₂基底上生长的HUVEC中靠前基因发生改变(上下)(左＝上调，右＝下调)。

实施例3-讨论

对鉴定合适的生物材料和组织培养基底，尤其是使得能够实现3D微环境的平台的关注日益增加，以满足用于组织工程、再生医学和药物发现的大量应用的需求。本发明人已经展示了无需要另外的生化表面修饰的用于组织培养应用中细胞图案化的具有生物材料Si与TiB₂、ZrB₂和HfB₂的独特组合的新的微制造基底。具体地，使用通常使用的培养基组分例如内皮细胞生长补充剂和肝素使得能够实现内皮细胞的空间图案化，从而通过促进聚集为间充质干细胞提供3D微环境。重要的是，两种生物材料(Si和上述二硼化物)的特性中的差异为细胞生长和分化提供了一些有益的信号。

Si被公认为生物材料，并且在本研究中，本发明人证明了第4族过渡金属二硼化物TiB₂、ZrB₂和HfB₂用于组织培养应用的潜力。这些二硼化物的特征在于极高的硬度、刚度和强度以及高的热力学(在高于约3,000℃下熔化[124])和化学稳定性[29、125至127]。它们还具有低电阻率(TiB₂ 9μΩcm至15μΩcm、ZrB₂ 6.7μΩcm至22μΩcm、HfB₂ 6.3μΩcm至16.6μΩcm)和影响其表面电荷的高电子功函数(约5eV)。使用电子束蒸镀而不是通过溅射来制造薄TiB₂、ZrB₂和HfB₂层在Si上的沉积物，由于这些二硼化物的相图而允许精确控制层化学计量，并确保可再现性。在此讨论了所选择的细胞基底机理的方面以探究TiB₂、ZrB₂和HfB₂是否有潜力成为用于细胞培养的生物材料。在本研究中，使用TiB₂、ZrB₂和HfB₂用于HUVEC和MSC的特异性体外细胞图案化。通过在为较软的材料的Si上对这些二硼化物层进行图案化，本发明人建立了刚度和硬度的机械梯度，观察它们对细胞生长和生存力的影响。Si或SiO₂/Si上的TiB₂、ZrB₂和HfB₂表现为细胞培养相容性材料，细胞由于趋硬性而迁移到其上，在图案上伸长、扩散和增殖。细胞生长和排列也受到微图案尺寸和几何形状的影响，从而示出了在HUVEC中的促进的接触引导以及图案形状促进的MSC聚集。在不存在生长因子和肝素的情况下，在图案上看到优先细胞生长(与背景相比，在微图案上的细胞相对更多)，然而在生长因子和肝素的存在下，生长是高度特异性的，仅限于几何图案并且通过图案取向引导排列。虽然窄线宽度引起HUVEC伸长，但是比细胞更大的显著更大的图案尺寸无法控制除了边缘区域处之外的细胞取向。

本发明人的材料表征结果表明导致细胞黏附和生长的选择性的主要机理。从XPS谱中，本发明人鉴定了在膜的主体区域中的化学计量的TiB₂、ZrB₂和HfB₂以及在表面处的由B、O和各金属以不同浓度和氧化水平构成的氧化物。所有这些二硼化物均对氧化具有强烈的敏感性，尤其是在表面氧化物生长[83]的高温下[85至87、173]，并且已知为植入物提供钝化和生物相容性。如在截面TEM图像中所看到的，这些氧化物存在于基底上。此外，在二硼化物表面处发现氧化硼(B₂O₃)，其已被证明增加表面亲水性[128]，因此使得能够实现细胞附着。

越来越多的证据表明，细胞-表面相互作用在微米至纳米的多个粗糙度尺度下发生[130]。AFM测量确定了与Si背景相比，TiB₂图案的粗糙度略高。基底粗糙度在细胞-生物材料相互作用中起着不可或缺的作用，改变从细胞黏附到形态的一系列细胞功能[129]。对于这种基底，粗糙度影响可忽略不计，因为背景Si

和TiB₂

的测量形貌低于文献中指示的哺乳动物细胞黏附的临界阈值范围[98、131]。还从纳米压痕和接触角测量中注意到，当与背景Si相比时，TiB₂图案表现出增加的硬度和亲水性。已知生物材料刚度影响细胞黏附、增殖和分化[56、108、132、133]。在不存在培养基补充剂的情况下(图5)，对于MSC，本发明人清楚地注意到与Si背景(10GPa)相比，细胞优先附着于硬TiB₂图案(14GPa)。这种行为符合已发表的文献，其中MSC表现出趋硬性[57]。硼化物的这些材料特性(包括其非常高的硬度和刚度、通过氧化物金属氧化物和B₂O₃对表面的化学终止以及润湿行为)为细胞黏附和生长提供了有利的条件。这样的结果是在对沉积在Si晶片上的所有分析的二硼化物TiB₂、ZrB₂和HfB₂的测量中获得的。

重要的是，由于Ti和Si的PZC的差异[78]以及通过B₂O₃对表面电荷的另外的修饰，开路测量确定了在DI水以及经ECGS和肝素补充的培养基二者中，TiB₂图案均比背景Si带更少的负电荷。这种表面电势的变化可能显著有助于蛋白质吸附，尤其是在存在为具有非常高的负电荷密度的高度硫酸化的糖胺聚糖的肝素的情况下[134]。已知肝素与内皮细胞和成纤维细胞生长因子结合，从而增加了它们对受体的亲和性，同时诱导更多的促有丝分裂构象[102、111]。带负电荷的肝素与Si的更多负表面电荷之间的排斥力可能限制生长因子在Si上的吸附。事实上，通过XPS和AFM研究确定了这种观察结果，所述研究显示，当与TiB₂比较时，Si上的蛋白质沉积减少。可能有助于图案特异性细胞选择性的另一个因素是肝素在骨来源干细胞中的细胞-纤连蛋白相互作用中的作用。已知纤连蛋白内的肝素结合结构域通过与细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的相互作用来促进细胞与纤连蛋白的黏附[135]。

整体基底特性是影响细胞行为的非常广谱的环境信号之一。机械特性例如刚度、硬度和弹性导致机械力转导的调节，并且还已知为细胞生长、运动性和伸长的原因[36][136][137]。基底物理特性例如形貌、粗糙度、非平面性或平整度[138][114、139]也已被证明影响细胞附着、伸长和扩散。此外，基底化学组成、电特性和表面自由能已被证明是细胞相互作用的重要调节因素。原子终止修饰(atomic termination modification)可以使表面疏水或亲水，因此改变各种黏附蛋白质的吸附。然而，由于这些相互作用的复杂性，因此没有预定的材料/细胞相互依赖性，并且关键介质的任何泛化均是不可能的。在细胞-生物材料相互作用的早期阶段发生的蛋白质吸附在随后的细胞黏附和扩散中起重要的作用。表面化学[41、140、141]、润湿性[142、143]、电荷[144至146]和形貌(粗糙度)[37、38、147、148]是生物材料表面处的相互作用中的重要影响因素[149]。这些表面特性中的每一者复杂地相关联，协同地或拮抗地相互作用，并且还呈现出时空相互依赖性，使得难以确定单一表面特性与蛋白质吸附和/或随后的细胞黏附之间的直接关系[118、33 140、141、143、147、149至158]。对于相同程度的粗糙度，材料表面能的显著变化可以引发润湿性的急剧转变，从疏水到亲水，反之亦然，其中对于中等亲水/疏水表面具有明显的细胞吸收偏好[149]。静电相互作用也已被证明主导细胞黏附[157、159至162]。类似地，不同的细胞类型具有其自身独特的特性，所述特性与它们如何响应于表面电荷、润湿性和自由能、粗糙度以及表面的化学组成有关[163至165]。对于本发明人的基底，粗糙度影响可以忽略不计。就润湿性而言，Si在浸入水溶液中时由于其表面处存在氧化物而可以变得亲水，或者Si在被氢钝化(例如，在氢氟酸蚀刻之后)时可以是疏水的。与Si相比，TiB₂、ZrB₂和HfB₂由于在表面处存在氧化硼而是更加亲水的[166]。另一方面，表面处具有SiO₂的硅在水和各种介质溶液中均具有比TiB₂、ZrB₂和HfB₂更低的电势(等电点；IEP≈2)，并且具有较大电子功函数值的TiB₂、ZrB₂和HfB₂与Si相比具有较小的负表面电势，如通过OCP对TiB₂所确定的。虽然TiB₂具有相对更亲水的性质，但是本发明人重复地检测到与Si相比，TiB₂对蛋白质的吸附略好，如通过XPS所证明的(在存在FBS或ECGS而没有肝素的情况下，在XPS中与10％的TiB₂表面相比，约20％的Si表面是可见的)。因此，本发明人观察到与Si相比，更多数量的细胞粘附至TiB₂。然而，在存在肝素和ECGS的情况下，当与Si相比时，TiB₂对蛋白质的吸附是均匀的并且得到了高度改善(在XPS中与22％的TiB₂表面相比，约74％的Si表面是可见的)。带负电荷的肝素与Si的更多负表面电荷之间的排斥力可能阻碍肝素结合生长因子在Si上的吸附。此外，肝素诱导成纤维细胞生长因子分子的寡聚化，从而促进其与FGF受体结合时的二聚化和活化[167]，并且还通过防止蛋白水解降解来稳定生长因子活性[168]。总之，当与Si相比时，TiB₂、ZrB₂和HfB₂图案表现出多个信号，例如改善的亲水性、表面电荷(更小的负性)和硬度，这在不存在肝素和生长因子的情况下促进改善的细胞黏附，但是仅在存在肝素和生长因子的情况下实现细胞图案化。

在此，本发明人已经表明，作为在Si/SiO₂上图案化的刚性材料的TiB₂、ZrB₂和HfB₂改善了HUVEC的黏附性、其增殖和生长，并且导致在用补充培养基的细胞培养中的选择性，而MSC在不存在ECGS和肝素的情况下响应于图案刚度的差异并在这些硼化物上表现出优先生长，并且在肝素和ECGS补充的培养基中引导聚集和聚集体形成。

对于HUVEC，细胞扩散和附着受到图案的限制，由此观察到细胞在TiB₂、ZrB₂和HfB₂线图案和图案边缘上排列和增殖，而在圆形图案内观察到随机取向和生长。类似地，减小的图案线宽度表明增加的细胞排列，而较粗的线示出沿边缘排列的细胞和在图案中心内的更加随机的细胞取向。通过黏着斑复合物和细胞骨架的可视化进一步证实HUVEC机械地响应于图案，这表明对图案的强烈的细胞黏附和肌动蛋白纤维排列。最重要的是，如通过细胞计数、阳性AO染色和PECAM的表达所表明的，HUVEC在培养中可生存2周至3周。这些结果与其他研究一致，其中TiO₂的图案化表明HUVEC的黏附增加[169]，并且先前关于细胞-图案相互作用的研究表明图案尺寸和图案形状依赖性的细胞的扩散和排列[67、116、118、170]。类似地，MSC在2周至3周的培养时间内可生存并且表现出表型稳定性，如通过CD105和N-钙黏着蛋白表达所指出的。此外，根据其先天的体内行为，MSC在图案化表面上表现出响应于刚度梯度的流动性，所述刚度梯度是由硬硼化物层在相对不太硬的Si背景上赋予的。重要的是，圆形图案使得能够实现MSC 3D聚集体形成，这在提供3D微环境中，尤其是在靶细胞分化的应用中是重要的。

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)是美国女性最致命的癌症之一，大多数女性处于晚期，然而存活率差[188]。虽然在手术减积(surgical debulking)、基于铂的化学治疗、靶向试剂和免疫治疗方面快速进展，但是复发和化学抗性转移持续推动EOC的高死亡率。因此，迫切需要促进对与卵巢癌细胞迁移和侵袭特性相关的分子机制的理解。

肿瘤发生是通过关键现象的相互作用进行协调的复杂的多方面过程，所述关键现象包括但不限于上皮向间充质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)、肿瘤起始癌症干细胞(tumor initiating cancer stem cell，TIC)、转移能力、和化学抗性的发生。EMT已被证明对于获得侵袭转移特性[189]以及诱导卵巢癌中的TIC[190]而言至关重要。TIC和转移二者也均与对化学治疗的抗性密切相关[191、192]。值得注意的是，现在已知除了可以刺激EMT的可溶性信号例如生长因子和细胞因子之外，生物力学力也用作还调节形态、生物标志物的表达和肿瘤细胞的侵袭性的刺激[193]。因此，现在对更好地理解细胞如何感知物理力并将“机械信号”转化为生物响应存在相当大的兴趣，伴随对开发针对癌症的机械生物学靶向治疗方法(被称为机械药理学)的兴趣[192、194]。

虽然具有挑战性，但是相关因素(EMT、TIC、转移、生物力学)的这种情况需要通过深入研究来阐明以提供对癌症进展和治疗响应的见解[195]。对于卵巢癌，EOC的多方面异质性加剧了这种情况。EOC不仅具有不同的组织学亚型，而且细胞群中也存在肿瘤内异质性，并且在个体患者和患者群体中，在临床水平上存在分子异质性[196]。最后，化学治疗性治疗可以进一步驱动肿瘤进化，从而在不同水平上进一步诱导异质性[197]。

目前用于评估影响肿瘤发生的因素的平台已包括涉及以下的体外策略：常规的二维(2D)单层组织培养、三维(3D)培养系统、transwell测定，以及具有同基因的体内动物模型、异种移植物和患者来源(PDX)肿瘤模型。然而2D系统无法模拟体内3D微环境，动物模型昂贵[198]。基于球状体、聚集体和类器官的3D体外系统提供了更廉价且生物相关的替代方案，但是大多数当前系统存在处理限制，在球状体尺寸和形状方面缺乏再现性，并且不提供对探针表面特性的直接可及性[199]。最重要的是，就来自球状体外周的细胞迁移行为的鉴定和定量而言，3D癌细胞球状体模型不利于监测细胞的转移能力。

令人感兴趣的是，与MSC类似，在存在生长因子和肝素的情况下，也注意到了人成纤维细胞和卵巢癌SKOV3细胞的3D聚集。基于该观察，本发明人开发了克服该障碍的新型硅-二硼化物(Si-TiB₂、Si-ZrB₂、Si-HfB₂)微图案化基底[200]。在该基底上，3D聚集体在圆形图案上生长，使得能够直接获取肿瘤细胞的3D聚集体。如图9A至C中所示，EOC细胞系SKOV3形成3D聚集体，其在接种之后的第7天达到60μm至80μm的厚度(95％ CI为55.75至63.06)。3D聚集体直径取决于圆形图案直径(p<0.05)[201]。这种使得能够实现3D培养的可大规模生产的2D平台与一系列单细胞/小细胞分析技术兼容以揭示对探索肿瘤发生中的复杂事件至关重要的分子机制和可靶向的细胞并且促进靶向治疗和诊断工具的开发。

这种基底提供了具有良好表征的突出特征(粗糙度、刚度、润湿性和电荷)的独特的实验设置，其使得能够在类似的生化和物理信号下同时观察单层与3D聚集体中的细胞行为[200]。本发明人已经确定了评估在本发明人的基底上形成的EOC 3D聚集体中的肿瘤发生的可行性，尤其是研究驱动早期转移性细胞分化的行为。初步研究表明，在本发明人的基底上产生的EOC 3D聚集体阵列中，13％表现出相对较高的侵袭性，从而导致聚集体间多细胞桥的形成。这些“细胞桥”反映了在3D聚集体的亚群中发生的适应性过程，在其内，细胞形成驱动其迁移行为的较高的转移能力。其结果是细胞桥接相邻聚集体之间的间隙以形成多细胞通道。

这种新的低成本Si-二硼化物基底使得能够实现3D癌细胞聚集体培养物的阵列，并且可以用作用于以下的发现平台：(a)鉴定细胞的适应性转变中的新靶标以获得转移能力，以及(b)检查目前在临床试验中靶向EOC治疗的效力。

Si-二硼化物基底可以用于通过利用了基底特性例如刚度梯度(已知促进趋硬性)的优化基底设计来显著影响对卵巢癌生长和治疗的理解。创新包括由以下两种不同刚度的生物相容性生物材料组成的微图案基底：硅Si和二硼化钛TiB₂(图10A图10A-)，其中TiB₂在Si上被微图案化以产生特定的几何设计并调整基底拓扑结构[200]。已经将微图案化与其他材料一起使用以引起接触引导的效果[202、203]，然而，迄今为止还没有为癌症研究建立的类似的Si-TiB₂基底，该基底使得能够实现这样的可定制的图案几何形状：其允许在单个基底上同时但不同区域的单层或3D培养，从而允许在相似的生化和物理信号下观察二者。如在(图10A-)中所看到的，这些基底允许不同细胞的图案特异性单层(2D)与3D培养。如所预期的[204]，低侵袭性潜在EOC细胞系OVCAR3经一周的培养优先以单层在TiB₂微图案上生长，但无法形成3D聚集体(图10A-)，而高侵袭性EOC癌细胞系SKOV3细胞在未图案化的TiB₂上以单层生长(左图，图10A-)并且在约第3至4天自组装成3D聚集体(右图，(图10A至10C)以随时间形成紧密的3D聚集体(第5至7天)。在Si晶片上形成的类似的ZrB₂和HfB₂图案上的细胞行为与TiB₂图案上相同。

重要的是，这些基底可以用于监测基因组对癌细胞中的迁移谱的适应性。虽然先前的研究已经确定了机械转导对EOC的重要性，但目前的3D球状体培养方法无法用于描绘支持迁移癌细胞行为的适应性转录物组学情况。这些新的Si-TiB₂基底允许我们通过微图案化刚度梯度建立机械转导环境。

在本发明人的基底上形成的SKOV3(高侵袭性EOC)的3D聚集体使得能够观察转移行为例如细胞迁移和聚集体间“细胞桥”的形成(图11中的白色箭头)。来自本研究的技术和结果不限于卵巢癌并且还可以用于推动对其他疾病的进一步进展。本发明人还证明了本发明人的基底使用不同的侵袭潜力和化学敏感性或化学抗性的EOC癌细胞系来评估在本发明人的基底上形成的3D聚集体中的肿瘤发生的可行性[204]。

从原发性EOC到远端转移部位的多阶段疾病进展的患者样品的转录物组分析用作理解卵巢癌的基础资源。不幸的是，肿瘤间的异质性阻止了利用这种知识进行EOC预后。患者来源的异种移植物(patient-derived xenograft，PDX)是有前景的临床前模型，但是PDX需要大量手术样品和昂贵的体内动物研究[205]。3D培养系统为动物模型提供了可行的替代方案[206、207、208]，但大多数没有限定疾病的适应性进展；相反，当前的细胞系统丰富了选择的终点EOC细胞群(例如，单细胞vs.聚集体形成，入侵vs.非入侵)。因此，经常同时使用独立的细胞工具来评估动态癌细胞生物学。值得注意的是，由于工具的多样性以及缺乏标准化，从用于癌症生物学的基于体外细胞的平台的大组群中产生比较推论一直具有挑战性[199]。为了克服这一点，本发明人将利用本发明人开发的Si-TiB₂基底[200、201]来表征具有静态与迁移表型的3D聚集体。研究已经确定，侵袭性SKOV3细胞是间充质样细胞，而OVCAR3是更多的上皮样细胞[204、209]。此外，与OVCAR3不同，SKOV3在皮下和腹膜内注射到裸鼠中时形成肿瘤[210、211]。如图中所示，这些基底的独特属性是，取决于细胞的侵袭潜力，它们形成2D单层(在任何图案上的OVCAR3或在平面图案上的SKOV3)或3D聚集体(在圆形图案上的SKOV3)的能力、以及3D聚集体的尺寸和数量可以用光刻掩模的简单定制来控制。本发明人对Si-TiB₂基底上的SKOV3聚集体(第7天)进行了总RNA-seq分析(图12A至B)。来自基底的转录物与来自塑料的对照(NCBI GEO:GSM5049693)的STAR比对[212]显示>75％重叠，其中640(3.8％)个用于基底的独特转录物(图12A至B)。值得注意的是，这些640个转录物的过度表示分析没有统计学显著性，表明本发明人的基底保持SKOV3基因型。接下来，他们对具有IFC>|2|的上调基因进行基因集富集途径分析(gene-set enrichment pathwayanalysis，GSEA)[213]。图12A至B B示出了在基底上的SKOV3的前几个上调途径。令人感兴趣的是，这些途径突出了Β-联蛋白结合的下游的Wnt信号传导和TCF依赖性信号传导的显著上调[214]，以及上调的RHO GTP酶信号传导——两个过程均示出调节细胞运动性和侵袭[215]。

本发明人使用他们的Si-二硼化物基底([200]中描述的)来培养高侵袭潜力的SKOV3(

HTB-77^TM)癌细胞。将细胞以600/mm²的密度接种在Si-TiB₂基底(2cm×2cm)上，并且每个基底将被放置在24孔培养皿的孔中并在具有谷氨酰胺、20％ FBS、1％抗生素、0.01mg/mL胰岛素、10ng/ml FGF2和1％肝素1的RPMI 1640中培养超过10天以建立单层(第1至3天)或者允许形成3D聚集体(第4至10天)。2cm×2cm基底可以容纳至少500个300μm圆形图案(又名500个直径为约150μm至200μm且厚度为60μm至80μm的3D聚集体)。基于初步数据，“细胞桥”形成的比率为13％/基底或50％/聚集体。如图9A至C、图10A至C和图11A至B中所示，高侵袭性SKOV3以单层开始，然后自组装以形成3D聚集体。重要的是，本发明人能够通过调节图案几何形状和细胞接种密度来控制聚集的动力学以及聚集体的尺寸和数量[201]。可以在培养后第2天、第4天、第6天和第8天鉴定静态的3D聚集体(没有任何迁移结果(sequalae)的密实聚集体)和迁移表型的3D聚集体(通过迁离聚集体并与相邻聚集体建立连接的细胞而鉴定；参见图12A至B)。这些初步结果表明自组装和聚集体形成在约第3至5天完成，大多数桥形成发生在约第6天。因此，这些捕获时间点具有关于细胞单层(≤第2天)、自组装(第3至4天)和密实的3D聚集体(第5至8天)的数据。迁移3D聚集体表型在天数≥5可见，其中在约第6至7天看到最大数量的跨聚集体的细胞桥。迁移3D聚集体在使用具有多个≥2个聚集体的基底时可以从基底上刮下，或者可以仅仅从具有为一对聚集体定制的单一图案几何形状的基底上吸收掉。然后可以对来自4个时间点的每一者的细胞进行富集FACS的深度覆盖scRNA-seq以建立EOC细胞的动态适应性的“快照”。

靶向治疗对使用Si-TiB₂基底的3D聚集体中的迁移表型的影响。对标准化学治疗的获得性抗性和固有抗性在EOC患者中是常见的。事实上，化学抗性是引起在患有高级EOC的患者中发生不可治愈的转移性疾病和低生存率的原因。因此，鉴定用于晚期卵巢癌的靶向独立治疗或组合治疗仍然是首要挑战。由于化学治疗导致组蛋白脱乙酰酶(histonedeacetylase，HDAC[216])的诱导，因此包括泛基因组辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA，又名伏立诺他(Vorinostat))在内的HDAC抑制剂(HDACi)[217]作为有前景的治疗出现。本发明人已经监测了在具有或不具有基于铂的化学治疗的情况下HDACi分子的作用，以监测其对EOC转移潜力的作用。与基于铂的化学治疗组合的SAHA目前正处于针对复发和/或进展成转移性疾病的卵巢癌患者的临床试验中。由于转移前和转移后复发性卵巢癌是不同的并且表现出独特的驱动物[218]，因此Si-TiB₂基底可以用于监测治疗响应。所述基底可以用于临床前筛选以从转移前和转移后复发性卵巢癌的混合临床组群中鉴定药物治疗响应者。

缺乏概括EOC细胞的迁移行为的临床前药物筛选平台。因此，Si-二硼化物基底呈现出用作未来筛选平台的难得的机会。以已知尺寸的预确定阵列对圆形图案进行微制造使基底适合于通过自动成像脚本进行筛选。此外，随着细胞桥微结构的出现，细胞运动性(如在图11中所看到的)是可量化的。化学抗性SKOV3细胞在Si-TiB₂基底上培养7天以开始形成3D聚集体和模拟微侵袭的侵袭细胞结构(图13A至E A)。此时，用亚致死剂量3μM的SAHA对Si-TiB₂培养的细胞进行处理[219、220]。虽然未经处理的聚集体继续增大尺寸并且开始形成细胞桥(图13A至E B，箭头)，但在接种后第7天用SAHA处理细胞使侵袭的多细胞微结构解离(图13A至E D，箭头)并减小3D聚集体的尺寸(图13A至E13E)。

通过上调的去泛素化观察到用于研究癌症转移以及EOC生长和运动动力学的Si-二硼化物方法的进一步验证(图12A至B)[221、222]。EOC SKOV3 3D聚集体的转录物组分析表明以包括UCHL1、UCHL3、A20/OTUD7c和OTUB2的多个DUB的升高的mRNA水平诱导去泛素化途径(图12A至B)。如同HDACi一样，靶向去泛素化酶(DUB)也正作为用于晚期EOC的有前景的治疗出现。DUB的诱导使蛋白质降解失调以驱动包括卵巢癌[225]在内的多种内分泌驱动的癌症[223、224]中的化学抗性。ES2中的DUB USP39的基因组敲低恢复了化学敏感性，同时减少了细胞迁移和侵袭[226]。类似地，小分子RA-9降低蛋白酶体相关的DUB(Sigma中的USP2、USP5、USP8、UCHL1、UCHL3和UCHL5，MSDS)的活性以增加泛素介导的蛋白质降解并降低化学抗性EOC细胞SKOV3和OVCAR3的生存力[227]。此外，异种移植物中的EOC ES2肿瘤因施用相同的小分子得到显著抑制。可以测试DUB抑制剂对EOC转移或者甚至EOC细胞运动性/侵袭的影响。Si-TiB₂系统呈现了测试靶向治疗对EOC细胞迁移的效力/功效的独特的平台。

使用Si-二硼化物基底共培养间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞。Si-二硼化物基底支持细胞图案化并且使得能够实现单培养或共培养3D微环境。该基底提供了对聚集体尺寸的控制，同时简化了细胞聚集体的处理，并且提供对细胞的直接获取以通过光学成像和标准的基于接触的技术(例如用于测量机械特性的AFM)进行评估。相对于用于生成球状体的3D培养技术例如超低附着板、悬滴、微孔以及天然凝胶和合成凝胶的使用，这些是明显有利的。此外，如图6A至H中对于TiB₂示出的间充质干细胞(MSC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)所示，所述基底使得能够实现细胞的共培养。

RNA-seq转录物组分析确定，与塑料瓶中的常规的单层培养相比，在微图案化基底上培养的细胞具有持续的代谢活性和生物活性。虽然与塑料上的细胞相比，在基底上的细胞中观察到稳健的分子谱和生物学谱，但本发明人观察到对在基底上培养的HUVEC所鉴定的转录物的总数减少。为了另外了解对于HUVEC表达的基因数量的差异，本发明人将其RNA测序数据与NCBI的基因表达综合(Gene Expression Omnibus，GEO)档案上的现有数据进行了比较。本发明人检索了在包被有明胶的组织培养塑料(tissue culture plastic，TCPS)上生长的HUVEC的总RNA测序的五个数据集：GSM3494325(TCPS_control_Rep1和TCPS_control_Rep1)、GSM1828760(SCR_static_n2)、GSM1828761(SCR_static_n4)和GSM1828762(SCR_static_n5)。在整个样品中的表达基因的数量是一致的(>10,000个转录物)，具体地，在TCPS_control_Rep1中12993个基因、在TCPS_control_Rep2中10202个基因、在SCR_static-n2中10,476个基因、在SCR_static-n4中10755个基因以及对于SCR_static-n5，13166个基因。考虑到方法学差异，对于在包被有明胶的组织培养塑料上培养的本发明人的HUVEC数据集鉴定的转录物的数量(8295个)与NCBI的GEO上的存档数据一致。此外，本发明人将来自GEO数据集的基因列表与这些数据进行比较，并且获得了数据集对(例如，SCR_static-n2 vs.本发明人的数据)之间共有基因的百分比，从而确定了65％至75％的共有基因特征。这些结果验证了本发明人的RNA测序数据并且在数据集中给出了足够的置信度。

对在TIB₂图案上生长的HUVEC的转录物组分析是本研究所独有的并且本发明人不能在NCBI GEO档案上找出关于钛或其合金上的HUVEC的总RNA测序的任何数据集。在现有文献中关于对不同生物材料上的HUVEC记录的转录物总数的公开数据不存在的情况下，本发明人进行了转录物组分析并鉴定了在塑料对照上与在他们的基底上的差异表达基因，并且进行了PANTHER分类分析，所述PANTHER分类分析确定了两个细胞群均显示出稳定的生物学功能和分子功能。对于在塑料上生长的HUVEC和在TiB₂基底上生长的HUVEC，对于仅在塑料上表达的独特的基因集合与在所述基底上表达的基因集合的生物学功能和分子功能的GO术语映射的整体谱是相似的(补充图6A至B)。在表明生物材料Si与TiB₂、ZrB₂和HfB₂的组合适用于适当的细胞生长和聚集的同时，使用PANTHER软件的途径分析还鉴定了样品之间差异富集的一组过程，进一步验证了本发明人先前的观察。具体地，参与细胞黏附的调节的基因例如钙黏着蛋白(细胞-细胞)和整联蛋白(细胞-胞外基质)在TiB₂上生长的HUVEC细胞中过度表示，这与本发明人的增加黏着斑复合物和细胞骨架重排的可视化一致。此外，途径分析表明二硼化物基底生长与增加的代谢活性之间存在关系，这可能与MSC聚集的能力有关。

在本研究中，本发明人展示了用于对培养中的细胞进行选择性空间图案化的Si与TiB₂、ZrB₂和HfB₂的新组合图案化基底。这种微制造过程不仅适合于扩大规模，而且也由于没有复杂的表面修饰过程而是简单的，从而使其对大规模制造具有吸引力。此外，本发明人使用在组织修复和再生医学方面均起至关重要的作用的HUVEC和MSC测试了与限定的几何形状(例如圆形和线)生物学相关的组织工程微图案。这种微图案基底支持在培养中的扩展的细胞生长，从而提供了可行的组织培养平台。另外的优点包括，(1)通过简单除去吸附的蛋白质实现基底可重用性(2)通过简单的微制造掩模设计来控制产生的MSC聚集体的尺寸、数量和均匀性，(3)通过轻轻的摇动或刮擦而容易地回收MSC聚集体，以及(4)以限定的阵列设计的微图案可以使得能够实现聚集体的系统化和可再现的评估(例如，自动化成像)。虽然在本研究中，本发明人证明了内皮细胞生长补充剂和肝素在引导图案特异性HUVEC和MSC生长中的作用，但是他们指出，细胞图案化是通过用任何肝素结合生长因子例如FGF、VEGF、IGF或EGF补充培养基来实现的。在它们不存在的情况下，与Si相比，细胞表现出对TiB₂图案的优先附着，而在补充培养基中观察到对图案的高度选择性生长。由Si和二硼化物的表面特性的差异介导的蛋白质的差异吸附在驱动细胞图案化中起关键作用。总之，本发明人提出了用于细胞图案化和体外细胞培养的新的微制造平台，该平台将为组织工程和药物发现中的潜在应用提供强大的工具。

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根据本公开内容，可以在没有过度实验的情况下进行和实施本文所公开和要求保护的所有组合物和方法。虽然已经按照优选的实施方案描述了本公开内容的组合物和方法，但是对于本领域技术人员将明显的是，在不脱离本公开内容的构思、精神和范围的情况下，可以对本文中所描述的组合物和方法以及方法的步骤或步骤的顺序进行改变。更具体地，将明显的是，可以用某些在化学和生理学两个方面均相关的试剂代替本文中所描述的试剂，同时实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这样的类似替代方案和修改均被认为在由所附权利要求限定的本公开内容的精神、范围和构思内。

VI.参考文献

以下参考文献就其提供补充本文中所阐述的那些操作或细节的示例性操作或其他细节而言特别地通过引用并入本文。

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Claims (17)

1.一种包含图案化表面的组合物，所述图案化表面包含：

(a)含硅的基底(Si/SiO₂)；和

(b)在所述硅基底上图案化的二硼化物，

其中所述图案化表面包含硅暴露部分和二硼化物暴露部分二者。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述图案化表面还暴露于一种或更多种生物分子，从而包含吸附的生物分子。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述一种或更多种生物分子包括肝素、内皮细胞生长补充剂(ECGS)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、内皮生长因子(EGF)、和/或具有肝素结合结构域的任何蛋白质(例如，玻连蛋白、纤连蛋白)。

4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述一种或更多种生物分子包括内皮细胞生长补充剂(ECGS)、胎牛血清(FBS)和肝素，和/或肝素结合蛋白、胎牛血清(FBS)和肝素。

5.根据权利要求1至4所述的组合物，其中所述图案化表面包含一个或更多个被硅暴露区域包围的TiB₂暴露区域。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述一个或更多个二硼化物暴露区域为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、500个、750个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、7500个或10,000个TiB₂暴露区域。

7.根据权利要求5所述的组合物，其中一个或更多个TiB₂区域包括50μM至1000μM的区域，例如呈线、圆、正方形、矩形、椭圆形、和/或任何几何形状的形式。

8.根据权利要求1至7所述的组合物，其中所述图案化表面使得能够通过细胞聚集实现3D微环境。

9.根据权利要求1至8所述的组合物，其中所述图案化表面位于微孔中、载玻片、芯片或晶片、组织培养瓶和/或任何其他常规组织培养容器上。

10.根据权利要求2至8所述的组合物，其中所述图案化表面包含ECGS+肝素、FBS+肝素、FBS+ECGS+肝素、和/或FBS+肝素+任何肝素结合蛋白。

11.根据权利要求1至10所述的组合物，其中所述二硼化物为TiB₂、ZrB₂或HfB₂。

12.一种用于捕获和/或培养细胞的方法，包括使细胞或含细胞的组合物与根据权利要求1至11所述的组合物接触。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞为内皮细胞(例如，HUVEC)、癌细胞(例如，SKOV3、OVCAR3)、间充质干细胞(MSC)、上皮和/或内皮谱系和中胚层谱系的任何细胞、以及非侵袭性和/或侵袭性癌细胞，例如卵巢癌细胞或乳腺癌细胞，及其组合(即，不同细胞类型的共培养物)。

14.根据权利要求12至13所述的方法，所述方法还包括测量细胞生物学的功能、表面或结构参数。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述功能、表面或结构参数为生长、迁移、分裂、基因表达、表面生物标志物、生存力、微骨骼状态、氧化呼吸、转移潜能、凋亡、生物力学力、分泌组、和/或转录物组。

16.根据权利要求12至15所述的方法，所述方法还包括用药物、生物制剂、光、热或辐射处理所述细胞。

17.根据权利要求16所述的方法，所述方法还包括再次测量所述细胞生物学的功能或结构参数。

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