CN115417870B - Pd-l1＆nampt双靶点抑制剂和用途 - Google Patents

Pd-l1＆nampt双靶点抑制剂和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种PD‑L1&NAMPT双靶点抑制剂和用途，所述抑制剂为结构通式如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐、消旋体、旋光异构体或溶剂化合物。本发明所述的双靶点抑制剂，可同时抑制PD‑L1和NAMPT活性并用于制备抗肿瘤药物，能有效克服单一型PD‑L1抑制剂效果差和单一型NAMPT抑制剂活性弱等缺点，有较好的应用前景。

Description

PD-L1＆NAMPT双靶点抑制剂和用途
技术领域
本发明涉及一种双靶点抑制剂和用途，具体涉及一种PD-1&NAMPT双靶点抑制剂和用途。
背景技术
程序性细胞死亡蛋白配体1(PD-L1)是一种在造血和非造血细胞，如T细胞和B细胞以及各种类型的肿瘤细胞表达的免疫抑制受体配体。编码蛋白是一种I型跨膜蛋白，具有免疫球蛋白V样和C样结构域。该配体与其受体的相互作用抑制T细胞活化和细胞因子产生。在正常组织的感染或炎症期间，这种相互作用对于通过维持免疫反应的稳态来预防自身免疫很重要。在肿瘤微环境中，这种相互作用通过细胞毒性T细胞失活为肿瘤细胞提供免疫逃逸。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是许多酶促反应的辅助因子，也是许多消耗NAD的酶的底物。烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)属于烟酸磷酸核糖基转移酶(NAPRTase)家族，被认为参与许多重要的生物过程，包括代谢，应激反应和衰老。NAMPT催化烟酰胺单核苷酸(NMN)从烟酰胺(NAM)和PRPP(在ATP存在下)合成烟酰胺单核苷酸(NMN)。然后NMN通过烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶(NMNAT)转化为NAD。癌细胞对ATP的较高需求，以及它们的代谢重编程，导致对NAD(P)的需求增加。因此，NAMPT抑制剂具有抗肿瘤的潜力。
现有技术中现有技术中尚存在PD-L1抑制剂单用效果差和单一型NAMPT抑制剂活性弱等问题，亟待解决。
发明内容
发明目的：本发明旨在提供一种能有效解决单一型PD-L1抑制剂效果差和单一型NAMPT抑制剂活性弱等缺点的双靶向化合物；本发明的另一目的在于提供一种所述双靶向抑制剂在抑制PD-L1和NAMPT活性中的应用。
技术方案：本发明所述的双靶点抑制剂为结构通式如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐、消旋体、旋光异构体或溶剂化合物：
其中，环A选自取代或非取代的5-6元杂环、苯环并3-6元杂环或5-6元杂环并3-6元杂环；所述5-6元杂环的取代基为卤素、氨基、羟基、羧基、氰基、烯烃或酰胺中的至少一种；
环B选自苯基、
X选自氮原子或氧原子；
L1是连接基团，选自直链或支链的亚烷基链、亚螺环基、1，4-哌嗪亚基或者1，3二炔亚基，L1可被以下基团中的一个、多个或任意组合中断一或多次：-O-、-CONH-、NHCO-、-NHCONH-、-NH-、-S-、亚磺酰基、磺酰基、氨基磺酰基氨基、亚炔基、亚烯基、亚环烷基、亚芳基、6元亚杂环基或6元亚杂芳基；所述L1可被以下一个或多个基团取代：卤素、氨基、羟基、羧基、酰胺、氰基、烯烃、炔烃、C1-6烷氧基、C1-10烷基；
L2选自以下基团：
X1，X2，X3选自碳原子或氮原子；
R1选自氢、氘、取代或未取代的C1-4烷基；所述C1-4烷基的取代基选自羧基、羟基、酰胺、氰基、卤素、C1-4烷基或C1-4烷氧基中的至少一种；
R2选自氢、氘、氰基、卤素或C1-4烷基；
R3，R4选自氢、氘、C1-4取代或未取代的羟基、C1-4取代或未取代的氨基；所述C1-4取代的羟基、C1-4取代的氨基的取代基选自以下羧基、羟基、氨基、酰胺、氰基、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的吡啶基；所述取代的芳基、取代的吡啶基的取代基选自以下一个或多个取代基：氰基、羟基、羧基、氨基、酰胺、卤素；
m，t为0，1或2。
优选地，所述环A选自：
L1选自：
所述n＝0-8；
L2选自以下基团：
或没有基团；
X1，X3为C，X2为C或N；
R1为氢；
R2为氯、溴或甲基；
R3为氢；
R4为
优选地，所述化合物包括：
所述双靶点抑制剂可应用于同时抑制PD-L1和NAMPT活性。
所述双靶点抑制剂可应用于制备抗肿瘤药物。
含有所述双靶点抑制剂的药物组合物，以所述抑制剂作为活性成分和药学上可接受的载体。优选地，所述药物组合物是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂；所述药物组合物还包括羟丙甲基纤维素E、淀粉、聚维酮K30和硬脂酸镁，该组合物通过将上述物质混合，制粒，压片后制成。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明所述的双靶点抑制剂，能有效克服单一型PD-L1抑制剂效果差和单一型NAMPT抑制剂活性弱等缺点，有较好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
本实施例所述的双靶点抑制剂，结构式如下所示：
合成路线：
化合物1-A的合成：
参考Journal of Medicinal Chemistry 2021 64(11),7390-7403中化合物22a的合成，可得化合物1-A。
化合物1的合成：
将306mg化合物1-A，413mg二环己基碳二亚胺，245mg 4-二甲氨基吡啶和226mg(E)-3-(咪唑并[1，2-a]吡啶-6-基)丙烯用5mL的DMSO溶解，氮气保护，置于室温条件下搅拌反应一天。加入50mL水，用100mL的乙酸乙酯萃取两次，饱和食盐水洗一次，有机相收集，旋干溶剂经柱层析(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得303mg白色固体化合物1。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.48(s,1H),7.90(s,1H),7.72(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.64–7.48(m,4H),7.48–7.32(m,8H),7.28(t,J＝7.8Hz,1H),6.38(d,J＝16.5Hz,1H),5.36(d,J＝12.8Hz,1H),5.23(d,J＝12.8Hz,1H),3.91(s,3H),2.57(s,3H)。
实施例2
本实施例所述的双靶点抑制剂，结构式如下所示：
合成路线：
化合物2-A的合成：
参考Journal of Medicinal Chemistry 2022 65(5),3879-3893中化合物Ⅶb的合成，可得化合物2-A。
化合物2的合成：
将306mg化合物2-A，358mg二环己基碳二亚胺，245mg 4-二甲氨基吡啶和226mg(E)-3-(咪唑并[1，2-a]吡啶-6-基)丙烯用5mL的DMSO溶解，氮气保护，置于室温条件下搅拌反应一天。加入50mL水，用100mL的乙酸乙酯萃取两次，饱和食盐水洗一次，有机相收集，旋干溶剂经柱层析(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得369mg白色固体化合物2。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.68(s,1H),8.54–8.51(m,1H),7.92(dd,J＝10.3,0.7Hz,1H),7.90(dt,J＝8.6,1.3Hz,1H),7.82(d,J＝4.1Hz,1H),7.61(d,J＝4.1Hz,1H),7.60–7.55(m,2H),7.53(d,J＝0.8Hz,1H),7.51–7.31(m,9H),7.25(t,J＝7.7Hz,1H),7.20(ddt,J＝7.7,2.3,1.0Hz,1H),7.13(tt,J＝2.1,1.1Hz,1H),6.42(d,J＝15.6Hz,1H),5.19(t,J＝1.2Hz,2H),2.62(s,3H)。ESI-MS m/z:528.2[M+H]+。
实施例3-6
采用实施例1和实施例2的合成方法，可以合成化合物3-6。
具体合成的化合物如下表所示。
实施例7
本实施例所述的双靶点抑制剂，结构式如下所示：
合成路线：
化合物3-B的合成：
将163mg化合物咪唑并[1，2-a]吡啶-6-羧酸，226mg(4-氨基丁基)氨基甲酸叔丁酯，1.54g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和850mg1-羟基苯并三氮唑用5mL的DMSO溶解，氮气保护，置于室温条件下搅拌反应12h。加入50mL水，用100mL的乙酸乙酯萃取两次，饱和食盐水洗一次，有机相收集，浓缩得289mg化合物3-B。
化合物3-C的合成：
将333mg化合物3-B用3.5mL的二氯甲烷和1.5mL的三氟乙酸溶解，室温搅拌反应1小时，TLC监测反应完毕，旋干溶剂经柱层析(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得210mg白色固体化合物3-C。
化合物3-D的合成：
参考Journal of Medicinal Chemistry 2021 64(11),7390-7403中化合物23a的合成，可得化合物3-D。
化合物7的合成：
将318mg化合物3-D，280mg化合物3-C用5mL的甲醇溶解，氮气保护，置于室温条件下搅拌反应3h。加入314mg氰基硼氢化钠，继续反应9h。加入50mL水，用100mL的乙酸乙酯萃取两次，饱和食盐水洗一次，有机相收集，旋干溶剂经柱层析(二氯甲烷：甲醇＝15：1)得374mg化合物7。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.65–8.61(m,1H),8.06–8.00(m,2H),7.82(d,J＝4.0Hz,1H),7.70(dd,J＝8.6,0.7Hz,1H),7.63(d,J＝4.1Hz,1H),7.61(d,J＝8.7Hz,1H),7.52–7.30(m,9H),3.95–3.91(m,5H),3.40(tt,J＝6.4,5.1Hz,1H),3.30(td,J＝5.3,4.6Hz,2H),2.60(q,J＝4.9Hz,2H),2.50(s,3H),1.61–1.52(m,4H)。ESI-MS m/z:520.3[M+H]+。
实施例8
本实施例所述的双靶点抑制剂，结构式如下所示：
合成路线：
化合物4-B的合成：
将163mg化合物咪唑并[1，2-a]吡啶-6-羧酸，226mg(4-氨基丁基)氨基甲酸叔丁酯，1.54g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和850mg1-羟基苯并三氮唑用5mL的DMSO溶解，氮气保护，置于室温条件下搅拌反应12h。加入50mL水，用100mL的乙酸乙酯萃取两次，饱和食盐水洗一次，有机相收集，浓缩得289mg化合物4-B。
化合物4-C的合成：
将333mg化合物3-B用3.5mL的二氯甲烷和1.5mL的三氟乙酸溶解，室温搅拌反应1小时，TLC监测反应完毕，旋干溶剂经柱层析(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得210mg白色固体化合物4-C。
化合物4-D的合成：
参考Journal of Medicinal Chemistry 2022 65(5),3879-3893中化合物Ⅷb的合成，可得化合物4-D。
化合物8的合成：
将356mg化合物4-D，280mg化合物4-C用5mL的甲醇溶解，氮气保护，置于室温条件下搅拌反应3h。加入314mg氰基硼氢化钠，继续反应9h。加入50mL水，用100mL的乙酸乙酯萃取两次，饱和食盐水洗一次，有机相收集，旋干溶剂经柱层析(二氯甲烷：甲醇＝15：1)得343mg化合物8。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.80(s,1H),8.65–8.61(m,1H),8.07–8.00(m,2H),8.0–7.97(m,1H),7.84(d,J＝4.0Hz,1H),7.66(d,J＝4.1Hz,1H),7.60(d,J＝8.7Hz,1H),7.53(dd,J＝7.7,0.8Hz,1H),7.51–7.39(m,5H),7.36–7.33(m,3H),7.25(d,J＝15.6Hz,1H),7.16(tt,J＝2.1,1.0Hz,1H),7.09(ddq,J＝7.9,2.2,1.0Hz,1H),4.70(p,J＝5.4Hz,1H),3.88(dt,J＝5.5,1.0Hz,2H),3.30(td,J＝5.3,4.6Hz,2H),2.69(s,3H),2.53(q,J＝5.1Hz,2H),1.61–1.52(m,4H)。ESI-MS m/z:572.3[M+H]+。
实施例9-30
采用实施例7和实施例8的合成方法，可以合成化合物9-30。
具体合成的化合物如下表所示。
/>
/>
/>
实施例31
本实施例所述的双靶点抑制剂，结构式如下所示：
合成路线：
化合物5-B的合成：
将148mg化合物咪唑并[1，2-a]吡啶-6-基甲胺、888mg三光气用5mL的甲苯溶解，氮气保护，置于110℃条件下搅拌回流12h。反应完毕，浓缩反应液，直接用于下一步合成。
化合物5-C的合成：
参考Journal of Medicinal Chemistry 2021 64(11),7390-7403中化合物22a的合成，可得化合物5-C。
化合物31的合成：
将上述所得化合物5-B，304mg 5-C用5mL的甲醇溶解，加入0.15mL三乙胺，置于室温条件下搅拌反应4h。加入50mL水，用100mL的乙酸乙酯萃取两次，饱和食盐水洗一次，有机相收集，浓缩得430mg化合物31。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.92–8.88(m,1H),7.77(d,J＝4.1Hz,1H),7.70(dd,J＝8.5,0.7Hz,1H),7.62(d,J＝4.0Hz,1H),7.49(dd,J＝7.7,0.7Hz,1H),7.47–7.30(m,9H),5.85(t,J＝5.1Hz,1H),4.88(d,J＝4.2Hz,2H),4.21(d,J＝5.0Hz,2H),4.06(d,J＝7.2Hz,2H),3.95(s,3H),3.08(tt,J＝7.1,4.0Hz,1H)。ESI-MS m/z:508.2[M+H]+。
实施例32
本实施例所述的双靶点抑制剂，结构式如下所示：
合成路线：
化合物6-B的合成：
将148mg化合物咪唑并[1，2-a]吡啶-6-基甲胺、888mg三光气用5mL的甲苯溶解，氮气保护，置于110℃条件下搅拌回流12h。反应完毕，浓缩反应液，得化合物6-B，直接用于下一步合成。
化合物6-C的合成：
参考Journal of Medicinal Chemistry 2021 64(11),7390-7403中化合物22a的合成，可得化合物6-C。
化合物32的合成：
将上述所得化合物6-B，358mg 6-C用5mL的甲醇溶解，加入0.15mL三乙胺，置于室温条件下搅拌反应4h。加入50mL水，用100mL的乙酸乙酯萃取两次，饱和食盐水洗一次，有机相收集，浓缩得398mg化合物32。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.92–8.87(m,1H),8.78(s,1H),7.97(dd,J＝10.2,0.7Hz,1H),7.74(d,J＝4.0Hz,1H),7.62(d,J＝4.0Hz,1H),7.54(dd,J＝7.9,0.8Hz,1H),7.51–7.33(m,8H),7.30–7.21(m,3H),7.13(tt,J＝2.1,1.1Hz,1H),5.80(t,J＝5.2Hz,1H),5.08(t,J＝1.0Hz,2H),4.21(d,J＝5.3Hz,2H),2.67(s,3H)。ESI-MS m/z:531.2[M+H]+。
实施例33-36
采用实施例27和施例28的合成方法，可以合成化合物33-36:
具体合成的化合物如下表所示。
实施例37
所述含有双靶点抑制剂的药物组合物片剂的制备方法如下：
将实施例1中制得的化合物1(50g)、羟丙甲基纤维素E(150g)、淀粉(200g)、聚维酮K30适量和硬脂酸镁(1g)混合，制粒，压片。
此外，可以根据药典2020版常规制剂法，将实施例1-36制得的化合物赋予不同的药物辅料制成胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂等。
应用实施例
药理试验证明，本发明的PD-L1抑制活性，可用于制备抗肿瘤药物。下面是本发明部分化合物的药理实验结果：
一、化合物对PD-1/PD-L1相互作用抑制效果的测定
(一)实验设备及试剂
1、离心机Eppendorf 5430
2、酶标仪Perkin Elmer EnVision
3、PD-1-Eu、PD-L1-Biotin、Dye labeled acceptor(BPS Bioscience)
4、BMS-202(Selleckchem)
5、384well microplate(Perkin Elmer)
(二)实验方法
利用TR-FRET assay的方法检测化合物对PD-1/PD-L1相互作用的抑制效果，化合物以1000nM起始，3倍稀释，10个浓度点，单孔检测。以BMS-202作为阳性对照化合物。用酶标仪测试得到不同浓度化合物在665nm和620nm的荧光强度并计算TR-FRET ratio(665nmemission/620nm emission)。
1.实验步骤
1.1配制1×modified TR-FRET assay buffer。
1.2化合物浓度梯度的配制：受试化合物测试浓度为1000nM起始，3倍稀释，10个浓度点，单孔检测。在96孔板中用DMSO稀释成100倍终浓度的溶液，然后用1×buffer稀释至20倍终浓度，转移1uL到384反应板中备用。阴性对照孔和阳性对照孔中分别加1uL的20％DMSO。
1.3用1×modified TR-FRET assay buffer配制5倍终浓度的PD-L1-Biotin溶液。
1.4在化合物孔和阳性对照孔分别加4μL的5倍终浓度的PD-L1-Biotin溶液；在阴性对照孔中加4μL的1×modified TR-FRET assay buffer。
1.5 1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温孵育15分钟。
1.6用1×modified TR-FRET assay buffer配制4倍终浓度的PD-1-Eu和2倍终浓度的Dye labeled acceptor混合溶液。
1.7加入15μL PD-1-Eu和Dye labeled acceptor混合溶液(其中含5μL的4倍终浓度的PD-1-Eu和10μL 2倍终浓度的Dye labeled acceptor)。
1.8 1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温孵育90分钟。
1.9将384孔板1000rpm离心30秒，振荡混匀后用EnVision读取665nm和620nm的荧光强度，并计算TR-FRET ratio(665nm emission/620nm emission)。
(三)实验结果
下表为化合物对PD-1/PD-L1抑制活性的活性范围或IC50。范围如下：A＝1-10nM；B＝10.01-100nM；C＝100.1-1000nM。
编号 PD-1/PD-L1 IC50(nM) 编号 PD-1/PD-L1IC50(nM)
1 A 19 B
2 B 20 B
3 A 21 A
4 B 22 A
5 B 23 B
6 B 24 B
7 B 25 B
8 B 26 B
9 7.2 27 B
10 B 28 B
11 B 29 B
12 B 30 B
13 B 31 3.9
14 B 32 B
15 2.6 33 A
16 A 34 B
17 A 35 B
18 B 36 B
二、化合物对NAMPT活性抑制效果的测定
(一)实验设备及仪器
1、酶标仪Molecular Devices SpectraMax i3x
2、NAMPT比色试剂盒(CycLex货号：CY-1251)
3、DMSO(国药试剂，货号：30072418)
4、96孔板(NEST，货号：701001)
(二)实验方法
NAM和PRPP在NAMPT的催化下可以生成NMN，而NMN和ATP在NAMPT1的作用下会生成NAD+，经乙醇脱氢酶(ADH)的催化变成NADH，而NADH在心肌黄酶的作用下又会变回NAD+。WST-1在NAD+/NADH的循环中变成橙黄色的甲臜，在450nm左右有最大吸收峰。所以450nm波长处吸光度变化反映化合物对NAMPT酶活性的影响。
1.实验步骤
1.1化合物溶液配制：用DMSO溶解配制浓度为10mM的母液，设置8个浓度梯度，2倍稀释，3个复孔。
1.2 mixture-1的配制：20×NAMPT测试缓冲液5μl，PRPP 5μl，ATP 5μl，重组NAMPT1 5μl，双蒸水35μl和NAMPT 5μl混匀。
1.3 mixture-2的配制：WST-1 5μl，ADH 5μl，心肌黄酶5μl，乙醇5μl混匀。
1.4向96孔板依次加入10μl双蒸水、5μl NAM以及5μl待测化合物或DMSO，再加入60μl配制好的mixture-1，混匀后于30℃条件下孵育1小时。
1.5加入配制好的mixture-2，于30℃条件下孵育30分钟。
1.6用酶标仪测定450nm波长处吸光度OD值并计算NAMPT抑制率。
(三)实验结果
下表为化合物对NAMPT抑制活性的活性范围或IC50。范围如下：A＝1-100nM；B＝100-1000nM；C＝1000-10000nM。
编号 NAMPT IC50(nM) 编号 NAMPT IC50(nM)
1 B 19 C
2 B 20 B
3 C 21 B
4 C 22 C
5 B 23 B
6 B 24 B
7 B 25 C
8 B 26 B
9 B 27 C
10 C 28 C
11 B 29 B
12 C 30 B
13 B 31 C
14 B 32 B
15 B 33 C
16 B 34 C
17 C 35 B
18 C 36 B

Claims (5)

1.一种双靶点抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为结构式如下所示任一化合物或其药学上可接受的盐，
2.一种权利要求1所述的双靶点抑制剂在制备同时抑制PD-L1和NAMPT活性的药物中的应用。
3.一种权利要求1所述的双靶点抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.一种含有权利要求1所述的双靶点抑制剂的药物组合物，其特征在于，以所述抑制剂作为活性成分和药学上可接受的载体。
5.根据权利要求4所述的含有双靶点抑制剂的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括羟丙甲基纤维素E、淀粉、聚维酮K30和硬脂酸镁，该组合物通过将上述物质混合，制粒，压片后制成。
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