CN115400156A - 百香果在制备治疗生殖损伤的产品中的应用 - Google Patents

百香果在制备治疗生殖损伤的产品中的应用 Download PDF

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陈嘉莉
唐雅园
肖宇航
孙建霞
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及百香果在制备治疗生殖损伤的产品中的应用。本发明提供了百香果在制备治疗生殖损伤的产品中的应用。本发明提供了百香果在改善生殖损伤中的应用，包括提高精子总数和降低精子畸形率等。本发明为缓解生育的不利提供了新途径，为改善男性生殖损伤的营养保健食品或辅助药物开发提供了理论基础和启发依据，具有重要的现实意义，在保健食品市场的应用前景良好。

Description

百香果在制备治疗生殖损伤的产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及百香果在制备治疗生殖损伤的产品中的应用。
背景技术
百香果(Passion fruit)隶属于西番莲科西番莲属，种类多达500种，主要分布于世界热带和亚热带气候区。原产南美洲，常见的有黄色百香果和紫色百香果两大类。紫色百香果因甜度风味更佳适合新鲜食用，黄色百香果因其较高的出汁率而常用于食品生产加工。
成熟后的百香果，果肉多汁并富含酚类化合物、类胡萝卜素、钾、钙、维生素A、B6、C和E以及膳食纤维，具有多种生物活性。百香果鲜皮热量低，膳食纤维含量丰富，可制成百香果皮粉或膳食纤维浓缩物，食用可增加饱腹感和改善消化系统功能。此外研究表明，紫色百香果的果皮提取物对平缓血压及改善哮喘患者的喘息、咳嗽和气短有良好成效。而从百香果种子中可提取出一种抗真菌二聚蛋白(Passiflin)具有抗真菌特性。其果肉提取物也有着明显的抗氧化、抗糖尿病和抗菌活性。因其丰富的生物活性，百香果提取物已被用于治疗焦虑、失眠、哮喘、支气管炎、尿路感染以及作为温和的镇静剂用于治疗支气管哮喘、神经胃肠疾病和更年期问题。体内及体外研究表明，颜色鲜艳的百香果经浓缩、提取而制作出的百香果提取物，含有丰富的酚类物质尤其是花青素，有着优异的抗炎、抗氧化活性。
由于近年来人类精子的质量在环境、激素等物质的影响下呈现下降趋势，且精子的数量也日趋减少。影响精子的数量和活力低下的原因有内分泌紊乱、生殖系统感染、精索静脉曲张、血液循环障碍等，虽然通过补充蛋白质、维生素等微量元素可以促进精子的产生，但是目前临床上并没有作用明显、安全的药物或成分对精子的数量和质量进行改善，因此，寻找一种安全、高效、无毒副作用的成分用于提高精子的数量和质量至关重要。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了百香果在制备治疗生殖损伤的产品中的应用。本发明提供了百香果在改善生殖损伤中的应用，包括提高精子总数和降低精子畸形率等。本发明为提高精子质量提供了新途径，为改善男性生殖损伤的营养保健食品或辅助药物开发提供了理论基础和启发依据，具有重要的现实意义，在保健食品市场的应用前景良好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了百香果在制备治疗生殖损伤的产品中的应用。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述生殖损伤为男性生殖损伤。
本发明还提供了百香果在制备治疗精子数量或密度降低的产品中的应用。
本发明还提供了百香果在制备精子畸形率升高的产品中的应用。
本发明还提供了百香果在制备睾丸组织损伤的产品中的应用。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述百香果皮包括百香果皮提取物。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述百香果皮提取物包括：矢车菊素3-槐糖苷-5-葡萄糖苷(Cyanidin 3-sophoroside-5-glucoside)、矢车菊素-3-槐糖苷(Cyanidin 3-sophoroside)、矢车菊素-3-(6-酰基)-葡萄糖苷(Cyanidin 3-(6”-coumaroyl)glucoside)、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin 3-O-glucoside)、芍药素-3-葡萄糖苷(Peonidin-3-glucoside)、矢车菊素-3-(丙二酰)葡萄糖苷(Cyanidin-3-(malonoyl)glucoside)。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述产品包括：药物和/或食品。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述药物包括：辅助药物。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述食品包括：保健食品。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述药物的剂型包括：片剂、胶囊或颗粒中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述药物的给药剂量为50mg/kg·bw(小鼠)。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述药物的辅料包括：螯合剂、保护剂、表面活性剂、赋形剂或稳定剂中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述药物的给药方式包括：舌下含化、口服、肌肉注射或静脉注射中的一种或多种。
本发明提供了百香果在制备治疗生殖损伤的产品中的应用。
本发明的有益效果包括：
(1)百香果可有效改善男性生殖损伤。百香果显著性缓解了体重下降，并在一定程度上提高了精子总数，对精液质量和男性生殖具有一定程度的保护效果。
(2)本发明为未来百香果作为营养保健食品或相关辅助药物以改善生殖损伤的开发提供理论基础和启发依据，具有重要的现实意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示百香果(Passion fruit)干预对体重的影响；
其中：标注不同小写字母表示组间差异性显著(p<0.05)，标注相同小写字母表示组间差异性不显著(p>0.05)；
图2示百香果(Passion fruit)干预对精子数量和畸形率的影响；
其中：左示精子总数；右示畸形率；标注不同小写字母表示组间差异性显著(p<0.05)，标注相同小写字母表示组间差异性不显著(p>0.05)；
图3示睾丸重量(g)；其中：从左至右依次为：对照、DSS、DSS+百香果；
图4示睾丸切片Johnsen’s score；其中：从左至右依次为：对照、DSS、DSS+百香果；
图5示睾丸生精小管的生精上皮厚度(μm)；其中：从左至右依次为：对照、DSS、DSS+百香果；
图6示矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin 3-O-glucoside,C3G)二级质谱图；
图7示百香果皮提取物二级质谱图；其中a示Cyanidin 3-sophoroside-5-glucoside矢车菊素-3-槐糖苷-5-葡萄糖苷；b示Cyanidin 3-sophoroside矢车菊素-3-槐糖苷；c示Cyanidin 3-(6‘ ‘-coumaroyl)glucoside矢车菊素-3-(6-酰基)-葡萄糖苷；d示Peonidin 3-glucoside芍药素3-葡萄糖苷；e示Cyanidin 3-(malonoyl)gl ucoside矢车菊素3-(丙二酰)葡萄糖苷；f示Cyanidin 3-O-glucoside矢车菊素-3-O-葡萄糖苷；
图8示百香果皮提取物液相色谱图(520nm)；其中1示Cyanidin-3-sopho roside-5-glucoside；2示Cyanidin-3-sophoroside；3示Cyanidin-3-(6”-coumaroyl)glucoside；4示Cyanidin-3-O-glucoside；5示Peonidin-3-glucoside；6示Cyanidin-3-(malonoyl)glucoside；
图9示百香果皮提取物液相色谱图(280nm)；其中1示特征峰1；2示特征峰2；3示特征峰3；4示特征峰4；5示特征峰5；6示特征峰6；7示特征峰7；8示特征峰8；9示特征峰9；10示特征峰10；11示特征峰11；12示特征峰12。
具体实施方式
本发明公开了百香果在制备治疗生殖损伤的产品中的应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明提供的技术方案包括：
(1)本发明采用以无菌水溶解葡聚糖硫酸钠(DSS)，作为小鼠日常饮水来源，建立了DSS诱导生殖损伤小鼠模型，以评价百香果在治疗或改善生殖损伤的作用，发现百香果可以作为提高精子质量保护男性生殖健康的有效物质。本发明重点探讨了雄性生殖，以期为相关机制阐明提供新思考，并为生殖损伤提供干预方法及日常保健建议。
(2)实验期间每日对小鼠体重进行监测，实验结束后对精液质量进行分析，以评价百香果对体重的影响和生殖损伤的保护效果。
(3)实验发现，百香果的干预对DSS所致体重下降和精液质量的缓解或改善均具有显著性意义。总体而言，研究表明百香果提取物对DSS带来的体重下降和生殖损伤的改善起到了积极作用，有效提高了精子数量，降低了精子畸形率，进而起到改善生殖损伤的效果。
本发明中所用原料及试剂包括：
实验材料：百香果皮提取物，参照实验室前期建立的方法，百香果皮粉末经水提、减压旋蒸萃取、大孔树脂纯化、减压浓缩及冷冻干燥得百香果皮提取物粉末。
实验试剂：葡聚糖硫酸钠(DSS)，美国MP生物医疗公司(MP Biomedicals LLC)。
实验动物：C57BL/6JNifdc雄性小鼠，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司(合格证编号：20210331Abzz0619000958)。于暨南大学实验动物中心，环境温度为22±1℃，相对湿度40～70％且昼夜12h交替进行一周的适应性饲养。所有实验操作均得到《暨南大学实验动物伦理委员会》批准并按相关要求进行。其余原料和试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1百香果(Passion fruit)对生殖损伤的影响
实验方法
(1)实验分组及造模
所有小鼠经普通饲料适应性喂养一周后，依据体重分层法，将其随机分组，每组各8只，共三组：对照组；DSS组；DSS+百香果组。
DSS模型的建立：以无菌水溶解DSS，作为小鼠日常饮水来源，为期7天，随后给予为期2天的无菌水自由饮用。
(2)干预处理及监测
干预与造模同时进行，即在第1天开始干预，直至实验结束：DSS+百香果组以经口灌胃的给药方式获取定量的百香果(Passion fruit)，对照组和DSS组均灌胃相当体积的水。其中DSS浓度为1.5％，百香果提取物的干预剂量为50mg/kg·bw。每日进行体重监测。
(3)苏木素-伊红染色
1)睾丸从小鼠体内摘除并称重。
2)取睾丸组织进行石蜡包埋，按5μm厚度切片。
3)切片放于烘箱中70℃烤片2h。
4)脱蜡至水：二甲苯浸泡10min×3次；无水乙醇浸泡5min×2次；90％乙醇浸泡5min；80％乙醇浸泡5min；70％乙醇浸泡5min；去离子水浸泡5min。
5)苏木素染色35s，流水冲洗5min。
6)伊红快速染色3s，流水快速冲洗。
7)脱水透明：70％乙醇浸泡2min；80％乙醇浸泡2min；90％乙醇浸泡2min；无水乙醇浸泡3min；二甲苯浸泡5min×2次。
8)将中性树胶和新鲜二甲苯以4:1的比例混合后封片，自然晾干。
9)镜检，拍照分析。
(4)精子计数和畸形率统计
1)准备工作：精子计数板与生理盐水提前预热至37℃。
2)孵育：取每一只老鼠的右侧附睾尾置于1mL生理盐水，剪碎混匀，于37℃释放5min，充分混匀后取10μL精子悬液加于精子计数板，利用计算机辅助精液分析系统(Computer-aided Semen Analysis System，CASA)进行精子静态图片拍摄。
3)根据拍摄图片，结合CASA系统对精子进行精子数量统计和畸形判断。
(5)生精上皮厚度测量
1)在20X显微镜视野下，观察睾丸切片样本，取视野内上、下、左、右、中5个部分，每部分拍摄6个生精小管，共30个生精小管。
2)统计测量，利用显微镜配套软件测量生精小管外径、内径，计算得出生精小管厚度。生精小管厚度应从基底膜至长形精子末端，絮状物除外，且测量线段垂直于基膜。
(6)Johnsen’s score评判
1)在20X显微镜视野下，观察睾丸切片样本，取视野内上、下、左、右、中5个部分，每部分拍摄6个生精小管，共30个生精小管。
2)评分范围1～10，其中1分，管腔截面无细胞；2分，没有生殖细胞，但存在支持细胞；3分，生殖细胞类型中只有精原细胞；4分，只有少数精母细胞(<5)且不存在精子细胞或精子；5分，没有精子，没有精子细胞，但存在几个或许多精母细胞；6分，没有精子，只有少数精子细胞(<5-10)；7分，没有精子，但有许多精子细胞(包括圆形精子和正在变形的长形精子)；8分，切片中仅存在少许精子(5～10个)；9分，有许多精子，生精上皮排列紊乱伴有生精细胞脱落，或管腔阻塞；10分，有许多精子，有完整的精子发生的过程，生精上皮厚度正常，管腔留有空隙。
实验结果
如表1所示，百香果(Passion fruit)的加入干预后，有效地缓解了体重丢失。
表1各组间小鼠体重增长比较
Figure BDA0003902224730000071
表注：不同字母表示组间差异显著p＜0.05；相同字母表示组间无明显差异p＞0.05；表1对应图1数据。
借助计算机辅助精液分析系统，分析了百香果对雄性生殖损伤的影响。与对照组相比，DSS组精子数量显著减少，畸形率也有所上升(如图2和表2所示)。而相较于DSS组，百香果(Passion fruit)的干预，提高了精子密度、数量及降低了畸形率，呈现轻微差异。本发明指出，百香果(Passion fruit)在一定程度上可治疗和/或预防男性生殖损伤，即百香果(Passion fruit)可以作为改善生殖损伤的有效物质。
表2各组间小鼠精子总数及畸形率的比较
Figure BDA0003902224730000081
表注：不同字母表示组间差异显著p＜0.05；相同字母或未标注字母表示组间无明显差异p＞0.05。表2对应图2的数据。
进一步，测定睾丸重量，对睾丸内部生精小管进行生精上皮厚度和Johnsen’sscore评分，分析睾丸组织内部损伤情况(如图3～图5和表3～表5所示)。实验发现，小鼠睾丸重量下降，睾丸组织生精小管厚度变薄，Johnsen’s score分值相对最小。而伴随50mg/kg·bw剂量的百香果口服灌胃的DSS+百香果组情况有所好转，虽无明显差异，但呈现一定恢复趋势。其中睾丸重量是雄性生殖评价的直观指标之一，如在毒理学实验中必须监测。故此，在器官系数无明显变化的情况下，睾丸的绝对重量是比生育力实验更敏感的关键指标。分析发现，DSS组睾丸重量呈现下降趋势，这可能是由于生精上皮厚度减少或生精细胞数量减少所致，这一点与生精上皮厚度结果一致。同时，Johnsen’s score也是预测男性生殖能力的组织病理学指标之一，可运用于男性不育症患者接受各种治疗后的精液质量改善评价。精子质量下降，睾丸重量下降等生殖损伤，一定程度上可能与精子发生周期不规律，精子和精母细胞缺乏有关。
表3各组小鼠睾丸重量的比较
Figure BDA0003902224730000082
表注：未标注字母，表示无显著性差异p＞0.05；表3对应图3的数据。
表4各组小鼠睾丸Johnsen’s score的统计
Figure BDA0003902224730000091
表注：未标注字母，表示无显著性差异p＞0.05；表4对应图4的数据。
表5各组小鼠睾丸生精上皮厚度的比较
Figure BDA0003902224730000092
表注：未标注字母，表示无显著性差异p＞0.05；表5对应图5的数据。
实施例2百香果皮提取物中花色苷的种类鉴定
(1)样品前处理
避光取4.2mg百香果皮提取物粉末，加入2.1mL的超纯水，涡旋1min，过0.22μm滤膜制得样品，放置在4℃冰箱待用，按仪器工作条件进行测定。
(2)三重四级杆液质联用(LC-MS)条件
采用液相-质谱联用系统(LC-MS 8045，日本岛津公司)对样品进行洗脱，流速为0.25mL/min、进样体积为5μL，柱温箱温度为30℃。流动相A为1％甲酸水，B相为100％乙腈，检测波长为280nm和520nm，洗脱条件为B相：0～3min，6％～6％；3～6min,6％～13％；6～26min，13％～30％；26～28min，30％～95％；28～30min，95％～95％；30～32min，95％～6％；32～35min，6％～6％。质谱条件：电喷雾离子源，接口电压为4.0kV，接口温度为300℃，脱溶剂管的温度为250℃，加热块温度为400℃，电喷雾离子源，接口电压为4.0kV，接口温度为280℃，加热块温度为400℃，并在100～1000m/z内进行母体离子扫描，选取目标离子再进行二级质谱产物离子扫描，优化电压以达到分离特征离子峰，对其进行鉴定。色谱柱：C18(2.1×100mm，1.8μm)反相色谱柱艾杰尔-飞诺美公司。
实施例3百香果皮提取物的花色苷含量测定
(1)样品前处理
避光取4.2mg百香果皮提取物粉末，加入2.1mL的超纯水，涡旋1min，过0.22μm滤膜制得样品，放置在4℃冰箱待用，按仪器工作条件进行测定。
(2)高效液相色谱(HPLC)条件
流量：1mL/min，柱温：30℃。进样量：10μL，色谱柱：Venusil ASB C18(4.6*250mm；5μm；150A)。色谱条件：梯度洗脱，流动相A为5％甲酸水，B相为100％乙腈，检测波长为280nm和520nm，洗脱条件为B相：0～2min，3％～3％；2～4min,3％～20％；4～14min，13％～30％；14～31min，20％～20％；31～32min，20％～50％；32～34min，50％～3％。结果以峰面积占比评估花色苷总体含量。
百香果鲜皮热量低，果皮厚实，富含多酚、纤维、多糖和微量元素，广泛用于酿酒、茶饮、烹饪、果胶提取、药用以及加工饲料等。参照实验室前期建立的方法，百香果皮粉末经水提、减压旋蒸萃取、大孔吸附树脂纯化、减压浓缩及冷冻干燥而得紫红色的百香果皮提取物粉末。百香果皮提取物颜色鲜艳，富含花色苷，由实施例1的实验结果可知，百香果皮提取物的口服有助于保护男性生殖损伤。进一步通过三重四级杆液质联用仪鉴定其中所含花色苷种类和高效液相色谱仪测定总花色苷含量占比。
验证例1LC-MS
经鉴定，如图6所示，所得花色苷粉末中的主要物质为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin 3-O-glucoside,C3G)，m/z 287为矢车菊素，为母体离子m/z 449失去1个葡萄糖苷(449-287＝162)中性碎片而形成。如图7所示，经分析百香果皮提取物主要含有六种花色苷：矢车菊素-3-槐糖苷-5-葡萄糖苷(Cyanidin 3-sophoroside-5-glucoside)、矢车菊素-3-槐糖苷(Cyanidin 3-soph oroside)、矢车菊素-3-(6-酰基)-葡萄糖苷(Cyanidin 3-(6“-coumaroyl)glucosi de)、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin 3-O-glucoside)、芍药素3-葡萄糖苷(Peonidin 3-glucoside)、矢车菊素3-(丙二酰)葡萄糖苷(Cyanidin 3-(malonoyl)glucoside)。
验证例2HPLC
验证例1的质谱鉴定结果表明，百鲜果皮提取物中主要含六种花色苷。虽然花色苷的UV吸收曲线的最大吸收波长略有差异，但在520nm均有较强吸收，故本验证例选用520nm作为花色苷梯度洗脱条件优化前提。优化后如图8所示，百香果皮提取物的花色苷成分有较好的分离效果且峰形完整，结合质谱结果确定了对应的六种花色苷种类。
在波长280nm附近，多酚及蛋白质都可被检测出，而6种花色苷组分也存在最大吸收峰，故选择280nm作为花色苷含量测定波长(如图9所示)。根据峰面积占比计算，分离纯化所得百香果皮提取物总花色苷含量占比约64.12％(如表6所示，由表6的峰4、5、6、7、10、12相对峰面积占比合计所得)。
表6百香果皮提取物的主要成分液相数据(280nm)
Figure BDA0003902224730000111
表注：相同字母表示组间无明显差异p＞0.05。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.百香果在制备治疗生殖损伤的产品中的应用。
2.百香果在制备治疗精子数量或密度降低的产品中的应用。
3.百香果在制备精子畸形率升高的产品中的应用。
4.百香果在制备睾丸组织损伤的产品中的应用。
5.如权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述百香果包括：百香果皮提取物。
6.如权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括：药物和/或食品。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括：片剂、胶囊或颗粒中的一种或多种。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述药物的给药剂量为50mg/kg·bw小鼠。
9.如权利要求6至8任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的辅料包括：螯合剂、保护剂、表面活性剂、赋形剂或稳定剂中的一种或多种。
10.如权利要求6至9任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式包括：舌下含化、口服、肌肉注射或静脉注射中的一种或多种。
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