CN115382481A - 连续液相氨解系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种连续液相氨解系统及方法。连续液相氨解系统包括：氨罐、第一循环管、第二循环管、氨解程度检测器和输送泵，氨罐以及反应柱均与第二循环管连通，氨罐、第一循环管、反应柱、第二循环管形成循环回路。连续液相氨解方法包括氨解步骤。本发明的技术方案的连续液相氨解系统能够解决现有氨解方式过程繁琐，以及在空间局限的氨解罐中导致氨解液与固相载体接触不充分，造成寡核苷酸脱保护不完全的问题。

Description

连续液相氨解系统及方法

技术领域

本发明涉及寡核苷酸制备技术领域，具体而言，涉及一种连续液相氨解系统及方法。

背景技术

寡核苷酸是脱氧核糖核酸( deoxyribonucleic acid，DNA) 或核糖核酸(ribonucleic acid，ＲNA) ，一般是由 15 ～ 50 个核苷酸组成。天然的寡核苷酸在体内很容易被降解，特异性低，而人工合成的寡核苷酸作为新一代基因药物，避免了天然寡核苷酸的缺点，可以直接对基因表达进行调控，从而起到对疾病的治疗作用。目前已上市的寡核苷酸药物主要通过化学修饰来提高寡核苷酸结构的代谢稳定性及降低不良反应，例如对磷酸二酯键、核糖、核苷酸碱基或核糖-磷酸骨架进行修饰。与传统药物的开发模式相比，新一代寡核苷酸药物优势明显。常规的小分子药物开发需要经过大量的筛选、优化过程，而寡核苷酸药物通常仅基于靶基因的一级序列就可快速筛选出候选对象，进而设计出高特异性的先导化合物。除此之外，寡核苷酸药物特有的作用机制使得其可以调节不能被小分子识别的靶标的活性，从而提供了更广泛的临床应用范围。与其他小分子药物和蛋白药物相比，寡核苷酸药物表现出不同的理化特性。在药物开发需求和监管要求的推动下，研究者探索了许多分析研究策略，对寡核苷酸药物进行深入研究。化学合成寡核苷酸技术是奠定基因治疗的重要基石，而商业化合成寡聚核苷酸一般采用固相合成的方法，在固相合成后需要进行氨解过程，其目的是主要有4个方面：（1）将寡核苷酸从固相载体上切割下来；（2）将寡核苷酸的3’-OH暴露；（3）将A、C、G碱基上的保护基Ac、Bz、dmf切除；（4）将磷酸上的氰乙基切除。基于氨解独有的特点和未来市场的大量需求，寡核苷酸氨解设备的出现是必然的。

现有的氨解方式为：将装有固相载体的合成柱，即反应柱拆卸后，将其中负载有寡核苷酸的固相载体导出反应柱，然后再与氨解液统一加入到氨解罐中搅拌，进行氨解处理，再将含有寡核苷酸产品的液相通过密封管道传输至处理釜中，管道加装滤网，过滤掉固相载体，再将固相载体进行处理。首先，该方式需要先将负载有寡核苷酸的固相载体导出反应柱，再导入氨解罐中进行氨解，后导入处理釜进行分离，过程十分繁琐，效率低。其次，由于氨解罐的内部空间局限，导致氨解液与固相载体接触不够充分，造成寡核苷酸脱保护不完全，不仅浪费了合成的寡核苷酸，也给下一步纯化增加了难度。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种连续液相氨解系统及方法，能够解决现有氨解方式过程繁琐，以及在空间局限的氨解罐中导致氨解液与固相载体接触不充分，造成寡核苷酸脱保护不完全的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一方面，提供了一种连续液相氨解系统，包括：氨罐，氨罐用于承载氨解液；第一循环管，氨罐和反应柱均与第一循环管连通，反应柱为固相合成寡核苷酸的合成柱，反应柱能够承装负载有寡核苷酸的固相载体；第二循环管，氨罐以及反应柱均与第二循环管连通，氨罐、第一循环管、反应柱、第二循环管形成循环回路；氨解程度检测器，氨解程度检测器设置在第一循环管和/或第二循环管上，氨解程度检测器能够检测第一循环管和/或第二循环管内氨解液与固相载体之间的氨解反应程度；以及输送泵，设置在第一循环管或第二循环管上，输送泵的抽液方向为从氨罐至反应柱。

进一步地，连续液相氨解系统还包括产物输出管、产物输出阀和除氨罐；产物输出管与第一循环管连通，两者的连通节点位于输送泵与反应柱之间；产物输出阀设置在产物输出管上，产物输出阀用于控制产物输出管的通断；除氨罐与产物输出管连通，氨解反应完全后脱离固相载体的寡核苷酸能够通过开启的产物输出阀、产物输出管进入除氨罐中。

进一步地，连续液相氨解系统还包括控制器，控制器与氨解程度检测器、产物输出阀均电性连接，控制器能够根据氨解程度检测器检测的信号控制产物输出阀的开关，以使氨解反应完全后脱离固相载体的寡核苷酸进入除氨罐中。

进一步地，连续液相氨解系统还包括压力检测器、温度检测器、调压阀、加热器、搅拌器以及控制器；第一循环管和/或第二循环管上依次设有压力检测器、温度检测器和调压阀；加热器设置在氨罐上，加热器用于调节氨罐内部的温度；搅拌器设置在氨罐的内部；压力检测器、温度检测器、调压阀以及加热器均与控制器电性连接，控制器能够接收压力检测器和温度检测器的检测数据，并能够根据压力检测器的数据调节调压阀的压力、根据温度检测器的数据调节加热器的温度。

进一步地，压力检测器和温度检测器分别设置有至少两个，第一循环管和第二循环管上均设有至少一个压力检测器和至少一个温度检测器。

进一步地，连续液相氨解系统还包括淋洗液输入管、淋洗液输出管以及淋洗液输出阀；淋洗液输入管与氨罐连通，淋洗液输入管内能够通入淋洗液；淋洗液输出管的一端与第一循环管或第二循环管连通，淋洗液输出管的另一端与除氨罐连通；淋洗液输出阀设置在淋洗液输出管上，用于控制淋洗液输出管的通断，淋洗液能够通过淋洗液输入管进入氨罐，并在流过第一循环管、反应柱以及第二循环管后，通过开启的淋洗液输出阀、淋洗液输出管进入除氨罐中。

进一步地，连续液相氨解系统还包括氨解液输入管、氨解液输入阀以及淋洗液输入阀；氨解液输入管与氨罐连通；氨解液输入阀设置在氨解液输入管上，用于控制氨解液输入管的通断；淋洗液输入阀设置在淋洗液输入管上，用于控制淋洗液输入管的通断。

进一步地，连续液相氨解系统还包括阀门，阀门设置在第一循环管或第二循环管上，阀门用于控制第一循环管或第二循环管的通断。

进一步地，氨解程度检测器设置有至少一个；和/或，产物输出阀为位于产物输出管和第一循环管的连通节点的三通阀。

根据本发明的另一方面，还提供了一种连续液相氨解方法，使用连续液相氨解系统实现，连续液相氨解方法包括氨解步骤，氨解步骤包括：

步骤SA10：通过控制器控制氨解液输入阀开启，氨解液通入氨罐内，待氨罐中的氨解液至预定液位时，开启阀门，氨解液从氨罐输出，并沿第一循环管、反应柱、第二循环管、氨罐形成的循环回路循环流动；

步骤SA20：利用氨解程度检测器实时检测第一循环管路或第二循环管路内的氨解反应程度，并获取检测数值；

步骤SA30：判断检测数值与预设的允许输出数值的差值是否大于预定的允许公差；如果是，则通过控制器控制产物输出阀开启，使第一循环管或第二循环管内氨解完成后形成的寡核苷酸链通过产物输出管进入除氨罐中；如果否，则重复执行步骤SA10和步骤SA20。

进一步地，控制器内设置有计时器；连续液相氨解方法还包括淋洗步骤，淋洗步骤在氨解步骤之后，淋洗步骤包括：

步骤SB10：控制器控制淋洗液输入阀和淋洗液输出阀开启，计时器开始计时，淋洗液依次从氨罐、第一循环管、反应柱、第二循环管形成的循环回路循环流动，并从淋洗液输出管流至除氨罐中；

步骤SB20：利用计时器计算淋洗时长，并获取时长数值；

步骤SB30：判断时长数值是否等于或大于预设的淋洗数值；若是，则控制器控制淋洗液输入阀和淋洗液输出阀关闭，淋洗液停止流动，并全部进入除氨罐中；若否，则重复执行步骤SB20。

应用本发明的技术方案，设计氨罐、第一循环管和第二循环管，形成一个连通整体，在需要氨解时，直接通过第一循环管、第二循环管将氨罐与反应柱连通形成循环回路，氨罐中的氨解液通过第一循环管或第二循环管进入反应柱中，对反应柱中负载有寡核苷酸的固相载体进行氨解，并带动氨解反应完成的寡核苷酸链流动至氨罐中，在整个流动过程中进行动态氨解，不需要通过将反应柱中负载有寡核苷酸的固相载体导入至氨解罐中进行氨解，氨解前操作过程简单，效率相对高。除此之外，氨罐、第一循环管、第二循环管、反应柱共同形成的氨解空间，相较于氨解罐内部的有限空间，更能保证氨解液与固相载体的接触充分，相对减少寡核苷酸脱保护不完全的情况，减少合成的寡核苷酸的浪费，进而降低了下一步纯化的难度。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了本发明的实施例的连续液相氨解系统的原理图，其中，箭头为氨解液的流动方向；以及

图2示出了本发明的实施例的连续液相氨解方法的氨解步骤和淋洗步骤流程图。

其中，上述附图包括以下附图标记：

101、氨罐；102、第一循环管；103、第二循环管；104、氨解程度检测器；105、输送泵；106、控制器；107、产物输出管；108、产物输出阀；109、除氨罐；110、第一压力检测器；111、第一温度检测器；112、第二压力检测器；113、第二温度检测器；114、除氨程度检测器；115、调压阀；116、淋洗液输入管；117、淋洗液输出管；118、淋洗液输出阀；119、氨解液输入管；120、氨解液输入阀；121、阀门；90、反应柱。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

需要说明的是，现有技术中，反应柱90应用于寡核苷酸合成中氨解的上一环节，即固相合成寡核苷酸的合成柱。氨解反应是通过氨解液将固相载体上的寡核苷酸切割下来，同时将Ac、Bz和dmf这些碱不稳定基团切除。

参见图1所示，本发明提供了一种连续液相氨解系统。该连续液相氨解系统包括：氨罐101，氨罐101用于承载氨解液；第一循环管102，氨罐101和反应柱90均与第一循环管102连通，反应柱90为固相合成寡核苷酸的合成柱，反应柱90能够承装负载有寡核苷酸的固相载体；第二循环管103，氨罐101以及反应柱90均与第二循环管103连通，氨罐101、第一循环管102、反应柱90、第二循环管103形成循环回路；氨解程度检测器104，氨解程度检测器104设置在第一循环管102和/或第二循环管103上，氨解程度检测器104能够检测第一循环管102和/或第二循环管103内氨解液与固相载体之间的氨解反应程度；以及输送泵105，设置在第一循环管102或第二循环管103上，输送泵105的抽液方向为从氨罐101至反应柱90。

在本实施例中，第一循环管102和第二循环管103的端部分别适配于反应柱90的出入口，或第一循环管102和第二循环管103的端部分别设置有适配于反应柱90出入口的连接扣，在反应柱90固相合成寡核苷酸后，通过第一循环管102和第二循环管103直接将反应柱90与氨罐101快速连通并形成循环回路。上述方案中，不需要将反应柱90中负载有寡核苷酸的固相载体导出至氨解罐中，减少氨解工序，提高氨解效率。氨罐101中的氨解液先沿第一循环管102进入反应柱90中，与负载有寡核苷酸的固相载体发生氨解反应，并带动氨解后得到的寡核苷酸链从反应柱90流出，并沿第二循环管103进入氨罐101中，氨解液通过循环回路不断的进入反应柱90中进行氨解反应，即在流动过程中进行动态连续的氨解反应，增大氨解液与固相载体的接触面积和接触时间，使氨解液与固相载体能够充分发生反应。

在本实施例中，氨解程度检测器104设置在第二循环管103上，氨解程度检测器104为高精度的PH检测器，根据氨解程度检测器104显示的PH值，判断第二循环管103内氨解反应是否完全。PH值检测的方式为判断氨解反应是否完全的较为准确的检测方式，因此，本方案中使用PH检测器作为氨解程度检测器104。

在本实施例中，第二循环管103位于反应柱90的下游，用于将氨解反应得到的寡核苷酸链及氨解液循环回氨罐101中。第二循环管103内部设置有过滤器，用于过滤掉固相载体。

在本实施例中，输送泵105为高精度、脉动小的泵，使氨解反应期间流量或压力破坏最小化，通过控制器106控制。输送泵105具有流量检测的功能，输送泵105与控制器106电性连接，输送泵105实时检测第一循环管102内氨解液的流量，并将流量数据发送至控制器106，控制器106接收输送泵105传输的流量数据，并结合氨解程度检测器104检测的PH值，控制输送泵105的压力，调节第一循环管102内氨解液的流量至需求流量。

在另一实施例中，在氨罐101的上游，设置有其他与控制器106电性连接的高精度检测器，可以为固定或可变波长的近红外或紫外检测器、电导率检测器、适度检测器中的一种或多种，根据实际需求，调整和增补能够检测关键和/或可变进料的特性并输出可测量信号的任何检测器进行检测，并将检测数据发送至控制器106，控制器106进行分析对比相关成分、组成、湿度和反应程度等。

在另一实施例中，氨解液可以通过蒸汽的形式通入整个循环回路中。

参见图1所示，本发明的一个实施例中，连续液相氨解系统还包括产物输出管107、产物输出阀108和除氨罐109；产物输出管107与第一循环管102连通，两者的连通节点位于输送泵105与反应柱90之间，产物输出管107内设置有过滤器，过滤器被构造为能够过滤并阻挡固相载体；产物输出阀108设置在产物输出管107上，产物输出阀108用于控制产物输出管107的通断；除氨罐109与产物输出管107连通，氨解反应完全后脱离固相载体的寡核苷酸能够通过开启的产物输出阀108、产物输出管107进入除氨罐109中。

在本实施例中，氨解反应完全后脱离固相载体的寡核苷酸链不再继续沿循环回路流动，通过产物输出管107进入到除氨罐109中，进行下一步的除氨工序，产物输出管107与第一循环管102连通。产物输出阀108设置在产物输出管107与第一循环管102的连通节点处，其为三通阀。在产物输出阀108打开时，第一循环管102向反应柱90的流通路径被截断，且第一循环管102向产物输出管107的流通路径被导通，第一循环管102内的寡核苷酸链不再流向反应柱90，直接通过产物输出管107进入除氨罐109中；在产物输出阀108关闭时，第一循环管102向产物输出管107的流通路径被截断，且第一循环管102向反应柱90的流通路径被导通，第一循环管102内负载有寡核苷酸的固相载体不再流向除氨罐109，直接通过第一循环管102进入反应柱90中，继续在循环回路中流动；产物输出阀108用于在氨解反应完全时，使寡核苷酸链进入除氨罐109中，在氨解反应不完全时，防止负载有寡核苷酸的固相载体进入除氨罐109中。为了保证除氨罐109中不存在固相载体，在产物输出管107内壁设置过滤器，将进入产物输出管107中的固相载体阻挡，防止固相载体进入除氨罐109中。过滤器为本领域技术人员公知的设置在氨解系统中用于过滤固相载体的过滤器。

在本实施例中，除氨罐109具有加热和搅拌功能，氨解完成的寡核苷酸链通过开启的产物输出阀108进入产物输出管107中，最终进入除氨罐109中，除氨罐109将多余的氨气进行回收处理，该步骤为氨解反应的后续工艺，也为整个连续液相氨解系统的最后一步。

参见图1所示，本发明的一个实施例中，连续液相氨解系统还包括控制器106，控制器106与氨解程度检测器104、产物输出阀108均电性连接，控制器106能够根据氨解程度检测器104检测的信号控制产物输出阀108的开关，以使氨解反应完全后脱离固相载体的寡核苷酸链进入除氨罐109中。

在本实施例中，控制器106将产物输出阀108的开关设计为自动形式的，不需要人为实时检测氨解程度检测器104，并通过氨解程度检测器104的反馈控制产物输出阀108的启闭，控制器106代替人工，增加整个连续液相氨解系统的智能化程度，降低工人劳动强度。

参见图1所示，本发明的一个实施例中，连续液相氨解系统还包括压力检测器、温度检测器、调压阀115、加热器、搅拌器以及控制器106；第一循环管102和/或第二循环管103上依次设有压力检测器、温度检测器和调压阀115；加热器设置在氨罐101上，加热器用于调节氨罐101内部的温度；搅拌器设置在氨罐101的内部；压力检测器、温度检测器、调压阀115以及加热器均与控制器106电性连接，控制器106能够接收压力检测器和温度检测器的检测数据，并能够根据压力检测器的数据调节调压阀115的压力、根据温度检测器的数据调节加热器的温度。

在本实施例中，压力检测器为精密的压力传感器，用于检测第一循环管102和/或第二循环管103的压力，并通过数值实时反馈给控制器106；温度检测器为精密的温度传感器，用于检测第一循环管102和/或第二循环管103的温度，并通过数值实时反馈给控制器106；调压阀115为自动背压阀，位于反应柱90的下游，用于调节流体进入反应柱90的压力，使反应柱90中能够保持均匀的压力，维持反应柱90稳定、均匀的背压压力；加热器用于调节进入反应柱90中流体的温度，使反应柱90内部保持符合工艺要求的温度。控制器106用于实现智能化控制，根据压力检测器的压力数据和温度检测器的温度数据调节循环管路的压力和温度，保证整个氨解反应的环境达到要求，进而保证整个氨解反应的效率。

在本实施例中，氨罐101的加热器和搅拌器分别用于实现加热和搅拌的功能，使氨罐101内的氨解液通过搅拌均匀受热。

参见图1所示，本发明的一个实施例中，压力检测器和温度检测器分别设置有至少两个，第一循环管102和第二循环管103上均设有至少一个压力检测器和至少一个温度检测器。

在本实施例中，压力检测器设置为两个，分别为第一压力检测器110和第二压力检测器112；温度检测器设置为两个，分别为第一温度检测器111和第二温度检测器113；第一压力检测器110和第一温度检测器111沿氨解液的流动方向依次设置在第一循环管102上，第二温度检测器113和第二压力检测器112沿氨解液的流动方向依次设置在第二循环管103上，反应柱90位于第一温度检测器111和第二温度检测器113之间，使得第一温度检测器111和第二温度检测器113分别检测反应柱90出入口的温度，第一压力检测器110和第二压力检测器112分别检测反应柱90出入口的压力，反应柱90出入口的压力和温度最能代表整个循环回路的温度和压力，因此，将第一压力检测器110、第二压力检测器112、第一温度检测器111和第二温度检测器113设置在对应位置处。

参见图1所示，本发明的一个实施例中，连续液相氨解系统还包括淋洗液输入管116、淋洗液输出管117以及淋洗液输出阀118；淋洗液输入管116与氨罐101连通，淋洗液输入管116内能够通入淋洗液；淋洗液输出管117的一端与第一循环管102或第二循环管103连通，淋洗液输出管117的另一端与除氨罐109连通；淋洗液输出阀118设置在淋洗液输出管117上，用于控制淋洗液输出管117的通断，淋洗液能够通过淋洗液输入管116进入氨罐101，并在流过第一循环管102、反应柱90以及第二循环管103后，通过开启的淋洗液输出阀118、淋洗液输出管117进入除氨罐109中。

在本实施例中，由于在氨解反应后，整个循环回路中存在遗留的寡核苷酸链，这些寡核苷酸链遗留在氨罐101的内壁、第一循环管102的管壁、第二循环管103的管壁、反应柱90的内壁，淋洗液的设计用于将这些残留的寡核苷酸链冲至除氨罐109中，减少寡核苷酸链的浪费。淋洗液输出管117与第二循环管103连通，淋洗液输出阀118设置在淋洗液输出管117与第一循环管102的连通节点处。淋洗液输出阀118为三通阀，在淋洗液输出阀118打开时，第二循环管103与氨罐101的流通路径被截断，且第二循环管103与淋洗液输出管117的流通路径被导通，第二循环管103内的淋洗液不再流向氨罐101，直接通过淋洗液输出管117进入除氨罐109中；在淋洗液输出阀118关闭时，第二循环管103向淋洗液输出管117的流通路径被截断，且第二循环管103与氨罐101的流通路径被导通，循环回路不再进行淋洗，进入待氨解反应的状态。

在本实施例中，第一循环管102和第二循环管103的管壁表面光滑，为避免不光滑的管壁造成的流体死体积大，配合淋洗设计，能够大程度减少寡核苷酸链的残余量，进而提高氨解液的利用率，以及减少合成的寡核苷酸的浪费。

参见图1所示，本发明的一个实施例中，连续液相氨解系统还包括氨解液输入管119、氨解液输入阀120以及淋洗液输入阀；氨解液输入管119与氨罐101连通；氨解液输入阀120设置在氨解液输入管119上，用于控制氨解液输入管119的通断；淋洗液输入阀设置在淋洗液输入管116上，用于控制淋洗液输入管116的通断。

在本实施例中，氨解液输入管119和氨解液输入阀120用于向循环回路中补充氨解液，氨解液在氨解反应过程中，会产生消耗，根据氨解程度检测器104反馈的数值判断氨解液消耗的程度，氨解液消耗预定量后，打开氨解液输入阀120，氨解液通过氨解液输入管119补充至循环回路中。淋洗液输入阀在淋洗过程中使用，在循环回路需要淋洗时，打开淋洗液输入阀，淋洗液通过淋洗液输入管116进入循环回路中进行淋洗。氨解液输入阀120和淋洗液输入阀为同一个三通阀，该三通阀的三个通口分别连通氨罐101、淋洗液输入管116和氨解液输入管119，使用一个阀控制两个通路，可灵活控制两个不同管道的连通或断开。

参见图1所示，本发明的一个实施例中，连续液相氨解系统还包括阀门121，阀门121设置在第一循环管102或第二循环管103上，阀门121用于控制第一循环管102或第二循环管103的通断。

在本实施例中，氨解反应准备中，氨罐101中的氨解液需要注入预定量后，再开始流动并进行氨解反应。阀门121用于防止在氨解液注入过程中的氨解液流动，阀门121设置在第一循环管102上，当氨解液注入完成后，阀门121打开，氨罐101中的氨解液从第一循环管102开始流动并在整个循环回路中循环。

参见图1所示，本发明的一个实施例中，氨罐101、阀门121、输送泵105、产物输出阀108、第一压力检测器110、第一温度检测器111、反应柱90、第二温度检测器113、第二压力检测器112、调压阀115、淋洗液输出阀118、氨解程度检测器104沿氨解液的流动方向依次设置。各个部件的设置位置能是对应部件的功能最大程度的发挥，不同部件实施不同功能，通过低成本制造出效果好的连续液相氨解系统。

参见图1所示，本发明的一个实施例中，连续液相氨解系统还包括设置在产物输出管107上的除氨程度检测器114；除氨罐109用于进行除氨工序，除氨程度检测器114用于实时检测除氨罐109的除氨程度。

在本实施例中，除氨程度检测器114为PH检测器。其中，除氨罐109与除氨程度检测器114的设计与配合为本领域技术人员的公知常识。

本发明的连续液相氨解系统还能够应用于其他物质的切割，可以是卤素的分解、羰基化合物的氨解、羟基化合物的氨解、磺基的氨解或硝基的氨解等各种直接氨解。

连续液相氨解系统氨解效率及效果实验：

（一）实验材料:

活化剂：含有0 .25 M 5-乙硫基四氮唑（ETT）的乙腈溶液；

脱保护试剂：含有3%三氯乙酸的二氯甲烷溶液；

盖帽试剂：10%乙酸酐/乙腈和N-甲基咪唑/吡啶/乙腈（比例为14:10:76）；

氧化剂：含有0 .05 M碘的四氢呋喃/吡啶/水（比例为70:20:10）；

AMA溶液（甲胺）：氨水体积比为1：1。

（二）实验方法

步骤1：引物合成：使用合成仪合成活化剂、脱保护剂、盖帽试剂和氧化剂；

步骤2：使用本发明的连续液相氨解系统进行氨解：

步骤2.1：设备调试：利用乙腈对连续液相氨解系统进行打料测试，测试过程中，设备运行正常；

步骤2.2：配料：氨解液使用100ml的AMA溶液，将其加入到打料模块的容器中；

步骤2.3：装柱：将合成完毕的反应柱90拆卸，其内含有1mmol的寡核苷酸的固相载体，并将反应柱90连接到连续液相氨解系统上；

步骤2.4：氨解：调控加热器升温氨解液到35℃，开启搅拌器、泵及阀门121进行连续氨解；

步骤2.5：转移：通过压力检测器、温度检测器、氨解程度检测器104在线检测氨解反应，并通过控制器106、调压阀115、加热器在线调节氨解反应，在氨解反应2小时后将产物输出阀108开启，流体转移至除氨罐109中；

步骤2.6：淋洗：通入淋洗液，淋洗管道后将淋洗液转移到除氨罐109中；

步骤2.7：除氨；

步骤2.8：测量收率；

步骤3：使用传统的氨解罐进行氨解：

步骤3.1：设备调试：测试前利用乙腈对氨解罐进行打料测试，测试过程中，设备运行正常；

步骤3.2：配料：氨解液使用100ml的AMA溶液，将其加入到氨解罐中；

步骤3.3：装柱：将合成完毕的反应柱90拆卸，其内含有1mmol的寡核苷酸的固相载体，将其中负载有寡核苷酸的固相载体导出反应柱90，并导入氨解罐中；

步骤3.4：氨解：调控氨解罐夹套使其温度为35℃；分别氨解2小时、6小时、12小时；

步骤3.5：转移：分别氨解2小时、6小时、12小时后打开氨解罐，将含有寡核苷酸产品的液相通过密封管道传输至处理釜中，管道加装滤网，过滤掉固相载体得到寡核苷酸液体；

步骤3.6：测量收率。

（三）实验结果

表1

（四）实验结论

从上表1可以看出，在氨解完成后，连续液相氨解系统氨解收率为92.27％，氨解时间为2小时，而传统氨解罐氨解2小时后收率为40.52％。连续氨解系统氨解收率比传统的氨解罐收率大大提高，实验人员在多次单变量测量后的结果都与上述结论一致。

传统的氨解罐液相氨解在2小时时收率为40.52％，氨解6小时后收率为69.3％，氨解12小时后收率为90.1％，由此可见，传统氨解罐氨解收率想要与连续液相系统相当，需要更长的氨解时间，因此连续液相氨解系统大大提高了氨解效率，并缩短了氨解时间。

从以上的描述中，可以看出，本发明的上述的实施例实现了如下技术效果：

（1）反应柱90固相合成寡核苷酸后，直接通过第一循环管102和第二循环管103与氨罐101连通，氨解液通过与第一循环管102、反应柱90、第二循环管103形成的循环回路进行氨解反应，氨解前的操作步骤简单，方便快捷。

（2）不同于传统的氨解反应，本发明将氨解反应由静态变为动态，增加氨解液与固相载体的接触面积和接触时间，进而保证固相合成的寡核苷酸全部或大部分脱离固相载体，相较于传统的氨解反应，增加脱离固相载体的寡核苷酸的量，减少由于氨解反应不充分导致寡核苷酸的浪费。

（3）由于氨解液与固相载体的接触面积和接触时间的增加，使得寡核苷酸脱离固相载体完全，降低下一步纯化工序的难度。

（4）减少氨罐101内壁、第一循环管102管壁、第二循环管103管壁、反应柱90内壁的寡核苷酸链的残余，通过淋洗液对残余的寡核苷酸链进行冲洗收集，减少合成的寡核苷酸的浪费。

（5）由于氨解液与固相载体的接触面积增加，使得反应过程中的传热传质效率高，热量、质量和能量转移加快，并且传递充分、快速。

（6）氨解液能够根据氨解反应需求量向循环回路中补充，保证氨解反应的连续，进而提高氨解反应的效率，除此之外，氨解液的补充也能够使得新鲜的氨解液能够不断连续的进入循环回路中，不断连续的重复氨解切割固相载体，使得从固相载体上切割下来的寡核苷酸增加。

（7）将氨解过程可视化，通过压力检测器、温度检测器、输送泵105分别检测循环回路的压力、温度、流量，使氨解反应的状态能够实时反馈，并能够通过这些反馈数值调节调压阀115、加热器、输送泵105，使压力、温度和流量能够实时满足氨解反应的需求，提高氨解反应效率。并且通过这些数值以及氨解程度检测器104检测的PH数值，判断氨解反应是否完全，将传统通过经验和时间判断氨解反应情况的方式改为可视化的方式，判断更加准确。

（8）所有部件的设计顺序及位置布局，保证连续氨解系统的紧凑性、协调性，同时，将连续氨解系统的死体积最小化，实现通过低成本制造出效果好的连续液相氨解系统的目的。

参见图2所示，本发明提供了一种连续液相氨解方法，使用上述连续液相氨解系统实现，氨罐在预定液位的位置处设置有与控制器电性连接的液位传感器，控制器为PLC，连续液相氨解方法包括氨解步骤，氨解步骤包括：

步骤SA10：通过控制器控制氨解液输入阀开启，氨解液通入氨罐内，待氨罐中的氨解液至预定液位时，液位传感器产生信号并发送至控制器，控制器控制加热器开启，加热器将氨解液加热至需要温度时，控制器控制阀门开启，氨解液从氨罐输出，并沿第一循环管进入反应柱，与反应柱中负载有寡核苷酸的固相载体发生氨解反应，氨解完成得到的寡核苷酸链随着氨解液进入第二循环管、氨罐中，氨解液继续从氨罐中流出，并沿第一循环管进入反应柱中；

步骤SA20：利用氨解程度检测器实时检测第一循环管路或第二循环管路内的氨解反应程度，并获取检测数值，将检测数值发送至控制器；

步骤SA30：控制器内预设有允许输出数值和预定的允许公差，控制器判断接收到的检测数值与允许输出数值的差值是否大于预定的允许公差；如果是，则控制器控制产物输出阀开启，使第一循环管或第二循环管内氨解完成后形成的寡核苷酸链通过产物输出管进入除氨罐中；如果否，则重复执行步骤SA10和步骤SA20。

在本实施例中，预设有允许输出数值范围为9~12，预定的允许公差为0.1±0.05。

参见图2所示，本发明的一个实施例中，连续液相氨解方法还包括淋洗步骤，淋洗步骤在氨解步骤之后，淋洗步骤包括：

步骤SB10：控制器内设置有计时器，控制器控制淋洗液输入阀和淋洗液输出阀开启，计时器开始计时，淋洗液依次从氨罐、第一循环管、反应柱、第二循环管形成的循环回路流动，并从淋洗液输出管流至除氨罐中；

步骤SB20：利用计时器计算淋洗时长，并获取时长数值；

步骤SB30：控制器内预设有时长数值，控制器判断时长数值是否等于或大于预设的淋洗数值；如果是，则控制器控制淋洗液输入阀和淋洗液输出阀关闭，淋洗液停止流动，并全部进入除氨罐中；如果否，则重复执行所述步骤SB20。

在本实施例中，时长数值根据实际需要的路径长度以及经验进行定义。

本发明的一个实施例中，连续液相氨解方法还包括氨解液补充步骤：

SC10：氨解程度检测器将检测到的PH值实时发送至控制器；

SC20：控制器中预设有预定的PH值及预定的PH公差值，控制器判断接收到的PH值与预定的PH值的差值是否大于预定的PH公差值；若是，则控制器控制氨解液输入阀开启，新鲜的氨解液补充至氨罐中；若否，则控制器控制氨解液输入阀关闭。

在本实施例中，通过氨解程度检测器判断是否需要补充氨解液的方式，使得打料氨解液精度准确。预定的PH值范围为9~12，预定的PH公差值为0.1±0.05。

本发明的一个实施例中，连续液相氨解方法还包括压力调节步骤：

SD10：第一压力检测器和第二压力检测器将检测到的压力值实时发送至控制器；

SD20：控制器内预设有预定的压力值和预定的压力公差值，控制器判断接收到的压力值与预定的压力值的差值是否大于预定的压力公差值，若是，则控制器控制调压阀增压；若否，则重复执行步骤SD10。

在本实施例中，预定的压力值范围为0~0.5MPa，预定的压力公差值为0.001MPa。

本发明的一个实施例中，连续液相氨解方法还包括温度调节步骤：

SE10：第一温度检测器和第二温度检测器将检测到的温度值实时发送至控制器；

SE20：控制器内预设有预定的温度值和预定的温度公差值，控制器判断接收到的温度值与预定的温度值的差值是否大于预定的温度公差值，若是，则控制器控制加热器升温；若否，则重复执行步骤SE10。

在本实施例中，预定的温度值范围为20~60℃，预定的温度公差值为0.1℃。

本发明的一个实施例中，连续液相氨解方法还包括流量调节步骤：

SF10：输送泵将检测到的流量值实时发送至控制器；

SF20：控制器内预设有预定的流量值和预定的流量公差值，控制器判断接收到的流量值与预定的流量值的差值是否大于预定的流量公差值，若是，则控制器控制泵加压；若否，则重复执行步骤SF10。

在本实施例中，预定的流量值及预定的流量公差值根据实际氨解的物质，以及本领域人员的公知常识或经验进行定义。

从以上的描述中，可以看出，本发明的上述的实施例实现了如下技术效果：

（1）通过控制器实时调节循环回路中的压力、温度、流量，使氨解反应始终在要求条件下进行，间接提高氨解反应的效率。

（2）控制器使整个连续液相氨解系统智能化程度提高，能够实现连续自动氨解。

显然，上述所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、工作、器件、组件和/或它们的组合。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种连续液相氨解系统，其特征在于，包括：

氨罐（101），所述氨罐（101）用于承载氨解液；

第一循环管（102），所述氨罐（101）和反应柱均与所述第一循环管（102）连通，所述反应柱为固相合成寡核苷酸的合成柱，所述反应柱能够承装负载有寡核苷酸的固相载体；

第二循环管（103），所述氨罐（101）以及所述反应柱均与所述第二循环管（103）连通，所述氨罐（101）、所述第一循环管（102）、所述反应柱、所述第二循环管（103）形成循环回路；

氨解程度检测器（104），所述氨解程度检测器（104）设置在所述第一循环管（102）和/或所述第二循环管（103）上，所述氨解程度检测器（104）能够检测所述第一循环管（102）和/或所述第二循环管（103）内氨解液与固相载体之间的氨解反应程度；以及

输送泵（105），设置在所述第一循环管（102）或所述第二循环管（103）上，所述输送泵（105）的抽液方向为从氨罐（101）至所述反应柱。

2.根据权利要求1所述的连续液相氨解系统，其特征在于，所述连续液相氨解系统还包括产物输出管（107）、产物输出阀（108）和除氨罐（109）；

所述产物输出管（107）与所述第一循环管（102）连通，两者的连通节点位于所述输送泵（105）与所述反应柱之间；

所述产物输出阀（108）设置在所述产物输出管（107）上，所述产物输出阀（108）用于控制所述产物输出管（107）的通断；

所述除氨罐（109）与所述产物输出管（107）连通，氨解反应完全后脱离固相载体的寡核苷酸能够通过开启的所述产物输出阀（108）、所述产物输出管（107）进入所述除氨罐（109）中。

3.根据权利要求2所述的连续液相氨解系统，其特征在于，所述连续液相氨解系统还包括控制器（106），所述控制器（106）与所述氨解程度检测器（104）、所述产物输出阀（108）均电性连接，所述控制器（106）能够根据所述氨解程度检测器（104）检测的信号控制所述产物输出阀（108）的开关，以使氨解反应完全后脱离固相载体的寡核苷酸进入所述除氨罐（109）中。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的连续液相氨解系统，其特征在于，所述连续液相氨解系统还包括压力检测器、温度检测器、调压阀（115）、加热器、搅拌器以及控制器（106）；

所述第一循环管（102）和/或所述第二循环管（103）上依次设有所述压力检测器、所述温度检测器和所述调压阀（115）；

所述加热器设置在所述氨罐（101）上，所述加热器用于调节所述氨罐（101）内部的温度；

所述搅拌器设置在所述氨罐（101）的内部；

所述压力检测器、所述温度检测器、所述调压阀（115）以及所述加热器均与所述控制器（106）电性连接，所述控制器（106）能够接收所述压力检测器和所述温度检测器的检测数据，并能够根据所述压力检测器的数据调节所述调压阀（115）的压力、根据所述温度检测器的数据调节所述加热器的温度。

5.根据权利要求4所述的连续液相氨解系统，其特征在于，所述压力检测器和温度检测器分别设置有至少两个，所述第一循环管（102）和所述第二循环管（103）上均设有至少一个所述压力检测器和至少一个所述温度检测器。

6.根据权利要求2或3中任一项所述的连续液相氨解系统，其特征在于，所述连续液相氨解系统还包括淋洗液输入管（116）、淋洗液输出管（117）以及淋洗液输出阀（118）；

所述淋洗液输入管（116）与所述氨罐（101）连通，所述淋洗液输入管（116）内能够通入淋洗液；

所述淋洗液输出管（117）的一端与所述第一循环管（102）或所述第二循环管（103）连通，所述淋洗液输出管（117）的另一端与所述除氨罐（109）连通；

所述淋洗液输出阀（118）设置在所述淋洗液输出管（117）上，用于控制所述淋洗液输出管（117）的通断，淋洗液能够通过所述淋洗液输入管（116）进入所述氨罐（101），并在流过所述第一循环管（102）、所述反应柱以及所述第二循环管（103）后，通过开启的所述淋洗液输出阀（118）、所述淋洗液输出管（117）进入所述除氨罐（109）中。

7.根据权利要求6所述的连续液相氨解系统，其特征在于，所述连续液相氨解系统还包括氨解液输入管（119）、氨解液输入阀（120）以及淋洗液输入阀；

所述氨解液输入管（119）与所述氨罐（101）连通；

所述氨解液输入阀（120）设置在所述氨解液输入管（119）上，用于控制所述氨解液输入管（119）的通断；

所述淋洗液输入阀设置在所述淋洗液输入管（116）上，用于控制所述淋洗液输入管（116）的通断。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的连续液相氨解系统，其特征在于，所述连续液相氨解系统还包括阀门（121），所述阀门（121）设置在所述第一循环管（102）或所述第二循环管（103）上，所述阀门（121）用于控制所述第一循环管（102）或所述第二循环管（103）的通断。

9.根据权利要求2所述的连续液相氨解系统，其特征在于，所述氨解程度检测器（104）设置有至少一个；和/或，所述产物输出阀（108）为位于所述产物输出管（107）和所述第一循环管（102）的连通节点的三通阀。

10.一种连续液相氨解方法，其特征在于，使用如权利要求1至9中任一项所述的连续液相氨解系统实现，所述连续液相氨解方法包括氨解步骤，所述氨解步骤包括：

步骤SA10：通过控制器控制氨解液输入阀开启，氨解液通入所述氨罐内，待所述氨罐中的氨解液至预定液位时，开启阀门，氨解液从所述氨罐输出，并沿所述第一循环管、所述反应柱、所述第二循环管、所述氨罐形成的循环回路循环流动；

步骤SA20：利用所述氨解程度检测器实时检测所述第一循环管路或所述第二循环管路内的氨解反应程度，并获取检测数值；

步骤SA30：判断所述检测数值与预设的允许输出数值的差值是否大于预定的允许公差；如果是，则通过所述控制器控制产物输出阀开启，使所述第一循环管或所述第二循环管内氨解完成后形成的寡核苷酸链通过产物输出管进入除氨罐中；如果否，则重复执行所述步骤SA10和所述步骤SA20。

11.根据权利要求10所述的连续液相氨解方法，其特征在于，所述控制器内设置有计时器；所述连续液相氨解方法还包括淋洗步骤，所述淋洗步骤在所述氨解步骤之后，所述淋洗步骤包括：

步骤SB10：所述控制器控制淋洗液输入阀和淋洗液输出阀开启，所述计时器开始计时，淋洗液依次从所述氨罐、所述第一循环管、所述反应柱、所述第二循环管形成的循环回路流动，并从所述淋洗液输出管流至所述除氨罐中；

步骤SB20：利用所述计时器计算淋洗时长，并获取时长数值；

步骤SB30：判断所述时长数值是否等于或大于预设的淋洗数值；如果是，则所述控制器控制所述淋洗液输入阀和所述淋洗液输出阀关闭，淋洗液停止流动，并全部进入所述除氨罐中；如果否，则重复执行所述步骤SB20。

Images