CN115381863A - 一种海篷子提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种海篷子提取物及其制备方法和应用，制备步骤为：采集新鲜的海篷子，洗净晾干后烘干，再粉碎过筛得到海篷子粉末；以61vt.%的乙醇浸提三次，第一次pH为2.0，料液比为1g：20mL；第二次取滤渣，pH为7.5，料液比为1g：15mL；第三次取滤渣，pH为8.3，料液比为1g：10mL；合并全部滤液，脱色后经过滤浓缩、冷冻干燥得到所述海篷子提取物。该制备方法采用半仿生技术，简便易行，生产成本低，制得的提取物具有调节肠道菌群的作用，并且具有潜在的降脂减肥功效，可作为新型益生元用于改善或调节肠道菌群紊乱导致的高血脂、高血压等疾病治疗相关药物或食品添加剂，具有广阔的开发前景。

Description

一种海篷子提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种海篷子提取物及其制备方法和应用。
背景技术
人类肠道中含有的微生物多达1013-1014个，总重量可达到1.5kg，它们与宿主之间是相互依存的关系，深刻影响着宿主的免疫系统与代谢。肠道微生物在宿主的药物代谢与毒性、能量代谢、免疫系统的发育与成熟和术后恢复等方面发挥了重要作用。它们可以帮助机体消化食物、代谢药物及外源复合物、合成维生素、抑制病原体的侵袭，影响免疫系统发育和大脑活动，甚至调控宿主的情绪行为，影响自闭症的病理。然而，不同地区、不同年龄段人群中肠道菌群的种类、数量存在显著的差异，这可能与地理环境及饮食差异等有关。如儿童肠道内微生物菌群个体差异小且稳定性高于婴儿及老年人；老年人肠道菌群的差异水平高于年轻人，特别是拟杆菌、双歧杆菌和肠杆菌等有益菌数量显著降低，一些病原菌如梭菌等微生物的浓度显著升高，这与老年人饮食习惯和生活环境存在着显著的内在联系。有研究表明，不同人体内肠道中的微生物群落结构是不同的，同一人体内肠道微生物在不同时期也会不同。正常人体内微生物处于动态平衡的状态中，虽然有一些病原菌的存在，但其他微生物可以抑制病原微生物的代谢活动，使宿主维持健康状态，如果肠道微生物的菌落结构失衡，就会导致使宿主肠道微生物在种类、数量、比例、定位和生物学特性上发生变化，宿主将会表现出一系列的症状。
高血压是最常见、全球疾病负担最重的慢性非传染性疾病，研究者发现肠道菌群的代谢产物能影响高血压的发生和发展，尤其是短链脂肪酸(SCFAs)、氧化三甲胺(TMAO)、胆汁酸(BA)和脂多糖(LPS)等与高血压密切相关，短链脂肪酸可以通过影响肠道菌群的丰度影响血压；在盐敏性大鼠饮食中添加盐会影响到肠道微生物的组成，减少粪便中短链脂肪酸的产生，致使肠道微生物丰度降低，血压值升高。有研究表明将高血压患者肠道微生物移植至无菌小鼠，结果表明微生物群转移可显著升高血压，从而证实了肠道微生物与高血压相关。同时，通过益生菌治疗自发性高血压大鼠的高血压症，表明口服益生菌可改善高血压大鼠内皮功能障碍、心肌肥大等最终降低机体血压。大脑－肠道－骨髓轴的调节作用表明肠道微生物及肠道代谢活动在交感神经－肠道活动中的变化可能对宿主血压的波动具有一定的影响，伴随着宿主神经活动的变化，交感神经活动加强会促进肠道炎症，同时提高机体的血压。因此，肠道微生物和高血压之间有着非常强的相关性。
随着科技的发展，肠道微生物在人体健康与疾病中的重要性逐渐被重视。人体肠道微生物群在童年时期相对稳定，成年后因受环境因素、饮食习惯、地理位置等因素的影响而发生改变，肠道微生物群失衡时会引发各类疾病，而通过调整膳食结构可改善人体健康。大量研究表明，通过服用具有调节肠道微生物结构的物质，特别是促进有益微生物生长，抑制有害微生物的成分，不仅可以对倡导微生物群落结构失衡引起的疾病有显著的治疗效果，而且对预防某些因肠道菌群失衡导致的慢性疾病有着非常好的作用。
海蓬子为藜科(Chenopodiaceae)盐角草属(Salicornia L.)盐生经济作物，营养价值丰富，素有海芦笋和海人参等美称。由于其可以用海水直接灌溉，且无需使用化肥和农药，因此也被认定为绿色有机食品。同时，《中华本草》记载海蓬子具有平肝、利尿、降压等功效，可用于治疗高血压和偏头痛。海蓬子也被用作民间药使用，如在印度，海蓬子被用于治疗瘙痒、疥癣等皮肤病；在韩国，海蓬子主要被用于治疗高血压、糖尿病、肥胖、便秘、癌症等。现代研究表明海蓬子中含有大量的活性成分，如黄酮类、生物碱类、皂苷类、甾体类等物质，被用于抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、降糖降脂、抗动脉粥样硬化等作用。近年来，海蓬子实现人工种植，已经具备资源可获得性优势，可以进行大规模的开发利用。但目前尚未检索到利用海篷子提取物制备用于调节肠道菌群以及改善由肠道菌群紊乱导致的高血压、高血脂等相关疾病的相关产品的研究或报道。
发明内容
解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供了一种海篷子提取物及其制备方法和应用。该制备方法简便易行，生产成本低，制得的提取物调节肠道菌群效果显著，可作为新型益生元用于改善或调节肠道菌群紊乱导致的高血脂、高血压等疾病治疗相关药物或食品添加剂，具有广阔的开发前景。
技术方案：一种海篷子提取物的制备方法，包括步骤如下：
S1.原料预处理：采集新鲜的海篷子，洗净晾干后烘干，再粉碎过筛得到海篷子粉末备用；
S2.第一次提取：取海蓬子粉末，以61vt.％的乙醇溶液浸提，调节浸提溶液的pH为2.0，浸提料液比为1g：20mL，浸提后分离得到一次滤液和一次滤渣；
S3.第二次提取：取一次滤渣，以61vt.％的乙醇溶液浸提，调节浸提溶液的pH为7.5，浸提料液比为1g：15mL，浸提后分离得到二次滤液和二次滤渣；
S4.第三次提取：取二次滤渣，以61vt.％的乙醇溶液浸提，调节浸提溶液的pH为8.3，浸提料液比为1g：10mL，浸提后分离得到三次滤液和三次滤渣；
S5.制备提取物：合并一次滤液、二次滤液和三次滤液，脱色后经过滤浓缩、冷冻干燥得到所述海篷子提取物。
优选的，所述步骤S1中烘干的温度为50℃。
优选的，所述步骤S1中过筛目数为60。
优选的，所述步骤S2、S3和S4中，采用超声波辅助提取，功率为180W，温度为50℃，时间为0.5h。
优选的，所述步骤S2中，采用2mol/L的盐酸溶液调节溶液的pH。
优选的，所述步骤S3和S4中采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调节溶液的pH。
优选的，所述步骤S5中通过活性炭脱色。
由上述方法制备得到的海篷子提取物。
该提取物在制备用于调节肠道菌群的产品中的应用。
该提取物在制备用于调节肠道菌群紊乱导致的高血脂和高血压的产品中的应用。
有益效果：本发明以海篷子为原料，采用半仿生技术获得提取物，能够模拟口服给药经胃肠道吸收和转运过程，得到有效成分和更高的活性物质。本发明制备的海蓬子提取物能够显著降低大鼠血脂、血压，并且能够被肠道菌群利用，增加有益菌的种类和丰度，抑制有害菌群的增殖，从而调节肠道菌群，可作为新型益生元用于改善或调节肠道菌群紊乱导致的高血脂、高血压等疾病治疗相关药物或食品添加剂，具有广阔的开发前景。
附图说明
图1是因素X1和因素X2的交互作用对总黄酮得率的响应面图；
图2是因素X1和因素X3的交互作用对总黄酮得率的响应面图；
图3是因素X2和因素X3的交互作用对总黄酮得率的响应面图；
图4是海蓬子提取物对大鼠体重的影响图；
图5是海蓬子提取物对大鼠收缩压的影响图；
图6是海蓬子提取物对大鼠舒张压的影响图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
一种海篷子提取物的制备方法，包括步骤如下：
S1.原料预处理：采集新鲜的海篷子，洗净泥沙后晾干水分，采用50℃进行烘干，烘干后用粉碎机进行粉碎，过60目的筛，备用；
S2.第一次提取：取海蓬子粉末100g，加入500mL石油醚，搅拌均匀后静置过夜，除去酯溶性成分，过滤除去石油醚，在通风橱内并挥干残留的石油醚，以61vt.％的乙醇水溶液作为浸提溶剂。第一次提取模拟胃环境中pH，采用2mol/L的盐酸溶液将浸提溶液的pH调整为2.0，利用超声波辅助提取法，以料液比1:20(g/mL)溶于61vt.％乙醇水溶液，于180W功率下超声提取0.5h，提取温度为50℃，提取结束后，过滤分离得到一次滤液和一次滤渣；
S3.第二次提取：取一次滤渣，模拟小肠液环境，采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液将浸提溶液的pH值调整为7.5，料液比1:15(g/mL)溶于61vt.％乙醇水溶液，180W功率下超声提取0.5h，提取温度为50℃，提取结束后，过滤分离得到二次滤液和二次滤渣；
S4.第三次提取：取二次滤渣，模拟大肠液环境，采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液将浸提溶液的pH指调整为8.3，料液比1:10(g/mL)溶于61vt.％乙醇水溶液，180W功率下超声提取0.5h，提取温度为50℃，提取结束后，过滤分离得到三次滤液和三次滤渣；
S5.制备提取物：合并一次滤液、二次滤液和三次滤液，经活性炭脱色后，经过滤浓缩、冷冻干燥得到所述海篷子提取物。
上述提取工艺经响应面技术优化得到，具体优化过程如下：
以芦丁做标准曲线，以提取物种黄酮含量为测定指标，选取乙醇浓度(X1)、提取功率(X2)、提取温度(X3)为试验因素。采用Box-Behnken设计方案做响应曲面研究，设计三因素三水平的响应面试验，以确定最优工艺条件。
以乙醇浓度(X1)61％、提取功率(X2)150W、提取温度(X3)50℃为中心，得到如表1所示的响应面分析实验设计及结果：
表1响应面分析实验设计及结果
Figure BDA0003777915430000041
Figure BDA0003777915430000051
对实验结果进行回归分析可得:
表2回归方程模型方差分析及其系数的显著性检验
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
模型 2.85 9 0.32 46.68 ＜0.0001 ＊＊＊
X<sub>1</sub> 0.067 1 0.067 9.78 0.0167 ＊＊
X<sub>2</sub> 0.030 1 0.030 4.40 0.0740 ＊
X<sub>3</sub> 8.000E-004 1 8.000E-004 0.12 0.07419 ＊
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub> 6.400E-003 1 6.400E-003 0.94 0.3647 ＊
X<sub>1</sub>X<sub>3</sub> 6.250E-004 1 6.250E-004 0.092 0.7708 ＊
X<sub>2</sub>X<sub>3</sub> 3.025E-003 1 3.025E-003 0.44 0.5266 ＊
X<sub>1</sub><sup>2</sup> 0.81 1 0.81 118.55 ＜0.0001 ＊＊＊
X<sub>2</sub><sup>2</sup> 0.90 1 0.90 132.47 ＜0.0001 ＊＊＊
X<sub>3</sub><sup>2</sup> 0.74 1 0.74 109.27 ＜0.0001 ＊＊＊
残值 0.048 7 6.814E-003
失拟性 0.030 3 0.010 2.34 0.2149 ＊
纯误差 0.017 4 4.33E-003
总和 2.90 16
R<sup>2</sup> 0.9835
RAdj<sup>2</sup> 0.9624
注：＊差异不显著(P＞0.05)，＊＊差异显著(P＜0.05)，＊＊＊差异极显著(P＜0.01)。
表2可得出二次回归方程：Y＝+4.10+0.091X1－0.061X2－0.010X3+0.040X1X2+0.013X1X3－0.027X2X3－0.44X1 2－0.46X2 2－0.42X3 2，经分析得出得率回归方程的方差分析。
并且由表2可得以下结论：此模型的显著性水平为P＜0.0001，表明模型显著；失拟误差值P＝0.2149＞0.05，失拟不显著，此回归方程和实验结果拟合性较佳。同时表3中的X1 2、X2 2、X3 2项(P＜0.0001)对得率的影响是极其显著的；而各因素对得率的影响强弱顺序为X1＞X2＞X3。其中R2＝0.9835，RAdj2＝0.9827，也都可以说明这个模型拟合度较好，该模型可解释98.35％的实验数据，表明了这个方程比较准确，也说明海蓬子总黄酮得率的实际值与预测值之间具有较好的拟合相关性。
对实验结果进行响应曲面分析与提取工艺优化会发现以下结果：
因素X1和因素X2提取功率的交互作用
由图1可知，将因素X3控制在零水平时，可以得到因素X1与因素X2两者交互作用对海蓬子总黄酮得率影响的方程为：
Y＝+4.10+0.091X1－0.061X2+0.040X1X2－0.44X1 2－0.46X2 2
因素X2不变时，因素X1不断加大，海蓬子总黄酮得率随之增高，然而当因素X1达到一定值时，海蓬子总黄酮得率就会降低。因素X1不变时，随着提取功率的不断增加，总黄酮得率的趋势为先上升后下降。
因素X1乙醇浓度和X3提取温度的交互作用
由图2可知，将因素X2控制在零水平时，可以得到因素X1与因素X3两者交互作用对海蓬子总黄酮得率影响的方程为：
Y＝+4.10+0.091X1－0.010X3+0.013X1X3－0.44X1 2－0.42X3 2
因素X3不变时，因素X1不断加大，海蓬子总黄酮得率随之增高，然而当因素X1达到一定值时，海蓬子总黄酮得率就会降低。因素X1不变时，随着因素X3的不断增加，总黄酮得率的趋势为先上升后下降。
因素X2提取功率和因素X3提取温度的交互作用
由图3可知，将因素X1控制在零水平时，可以得到因素X3与因素X2两者交互作用对海蓬子总黄酮得率影响的方程为：
Y＝+4.10－0.061X2－0.010X3－0.027X2X3－0.46X2 2－0.42X3 2
因素X3不变时，因素X2不断加大，总黄酮得率随之增高，然而当因素X2达到一定值时，总黄酮得率就会降低。因素X2不变时，随着因素X3的不断增加，总黄酮得率的趋势为先上升后下降。
采用Design-Expert-8.0软件分析得出：将得率作为响应值的各因素相互作用3D图，由回归模型预测得出较佳理论值的各项参数为：乙醇浓度为61.30vt.％，提取功率为178.37W，提取温度为49.71℃，预测总黄酮得率最优值为3.91996％。在此条件下，为了判断这个方法是否准确，以及对实验误差的考虑，将工艺条件修正为乙醇浓度为61vt.％，提取功率为180W，提取温度为50℃。在这个参数下进行验证，实际测得海蓬子总黄酮得率更佳，为4.20600％，两者的误差只有0.28604％，与理论值相差较近。
所以乙醇浓度为61vt.％，提取功率为180W，提取温度为50℃即为海篷子总黄酮的最佳提取工艺条件。
实施例2
海蓬子提取物对SHR大鼠血压、血脂和体重的影响
1.试验方法
从实验动物公司购买30只雄性SHR大鼠，8周大，在实验室内适应性饲养1周，普通饲料喂养，自由饮水。将SHR大鼠随机分为空白对照组、阳性对照组(卡托普利40mg/kg)、海蓬子低剂量组(100mg/kg)、海蓬子高剂量组(200mg/kg)、海蓬子高剂量组(400mg/kg)，每组大鼠6只。连续给药8周，用无创血压计测量大鼠鼠尾血压，安乐死大鼠后，采集大鼠血清、盲肠内容物等材料用于后续分析。
1.1海蓬子提取物对大鼠体重的影响
正式实验前记录各组大鼠的体重，实验过程中每周称量一次，待实验结束后称取各组大鼠体重，分析各组大鼠的重量变化，明确海蓬子提取物对大鼠体重的影响，体重测量时间均为上午9时。
1.2海蓬子提取物对大鼠血压的影响
在大鼠清醒的状态下，采用无损血压检测器测定大鼠尾静脉血压，每周记录一次，直到实验结束。分别取出大鼠，将其置于恒温箱内露出鼠尾，采用血压计加压尾套套住大鼠尾巴，使其尾静脉与脉搏传感器紧密接触，观测脉搏波形，待大鼠稳定后，出现相对稳定的脉搏波以后，开始正式测量血压。给与尾套进行充气，脉搏波纹逐渐消失，当压力降低至出现脉搏时即为收缩压，每只大鼠测定3次，取平均值作为一周的血压值。
1.3海蓬子提取物对大鼠血清中血脂的影响
大鼠安乐死后，收集血液，室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液备用，采用ELISA法测定大鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯的(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。
2.实验结果
2.1海蓬子提取物对大鼠体重的影响
如图4所示，正式实验前，各组大鼠体重基本一致，随着实验时间的延长，大鼠体重呈现上升趋势。阳性对照组大鼠体重与空白对照组数据之间无显著差异，表明卡托普利并未对大鼠体重有明显的影响；海蓬子提取物三个组中大鼠体重均有所下降，与空白对照组相比，到实验结束时，海蓬子中剂量组和高剂量组的大鼠体重出现显著的下降(P<0.05),从图中可以看出，第三周开始海蓬子剂量组体重增长速度已经开始出现下降，并呈现剂量依赖性，表明海蓬子提取物对大鼠的体重增长有抑制作用，说明海蓬子提取物对大鼠减重有一定的效果。
2.2海蓬子提取物对大鼠血压的影响
如图5和图6所示，阳性药卡托普利对SHR大鼠的收缩压和舒张压具有显著的降低作用，且下降的趋势基本一致，卡托普利起效时间短，给药1周后即出现较为明显的下降趋势，随着给药时间的延长，大鼠血压出现稳定降低。海蓬子提取物对大鼠收缩压和舒张压均有一定的影响，血压变化与卡托普利组变化趋势基本一致，随着海蓬子给药剂量的增加，海蓬子提取物降压作用逐渐增强，呈现剂量依赖性，海蓬子高剂量组的降压效果显著(P<0.05)，但作用效果未超过阳性药卡托普利。该研究表明海蓬子提取物能够显著降低大鼠的收缩压和舒张压(P<0.05)，虽然起效速度不如卡托普利，但海蓬子作用通过效果维持时间较长，同时海蓬子作为药食同源资源，长时间食用并不会产生副作用。海蓬子提取物大鼠对血压的降低作用，可以有效的降低心血管疾病的发病率。因此，将海蓬子提取物开发成为长效降压产品有潜在的巨大价值。
2.3海蓬子提取物对大鼠血清中血脂的影响
由表3可知，卡托普利对大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的水平有一定的作用，但作用不显著。高剂量组海蓬子提取物对大鼠血清中TC有极显著的降低作用，对TG和HDL-C有显著的降低作用，对LDL-C无显著的影响，海蓬子中剂量组和低剂量组对大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C均有一定的降低作用，但均不显著。
表3海蓬子提取物对大鼠血脂水平的影响
Figure BDA0003777915430000081
注：*表示与空白对照组比较差异显著(P<0.05)；**表示与空白对招租相比差异极显著(P<0.01)。
实施例3
微生物组学分析海蓬提取物对大鼠肠道菌群的影响
1.研究方法
实验选取空白对照组大鼠3只(SHRK1、SHRK2、SHRK3)和海蓬子高剂量组大鼠3只(SbTG1、SbTG2、SbTG3)，分别采集大鼠盲肠内容物，提取样品总DNA后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina NovaSeq进行测序。高通量测序(如Illumina NovaSeq等测序平台)得到的原始图像数据文件，经碱基识别(BaseCalling)分析转化为原始测序序列。微生物多样性信息分析包括数据处理与质控、基本分析和高级分析三部分。数据处理与质控，主要是通过对原始Reads的拼接过滤和数据评估，获得后续分析可用的高质量clean tags。基本分析是对处理后的tags做OTU(OperationalTaxonomic Units)聚类，进而进行物种注释和多样性分析。其中多样性分析主要是对样品丰富度的评估，包括α多样性分析(AlphaDiversity)和β多样性分析(Beta Diversity)。高级分析主要包括显著差异分析、相关性分析、功能预测及肠型分析。
2.研究结果
2.1测序数据质量评估
通过统计数据处理各阶段样品序列数目，评估数据质量。主要通过统计各阶段的序列数，序列长度，Q20和Q30质量值，参数对数据进行评估。由表4测序结果可知对照组最长序列为418.47，实验组最长序列为414.352；6组QC20的平均值为98.77，6QC30平均值为95.67。
表4样品测序数据处理结果统计表
Figure BDA0003777915430000091
2.2 OUT基础分析
使用usearch(Version11.0.667http://www.drive5.com/usearch/)软件按照97％相似性序列进行聚类。步骤如下：去除冗余序列并统计丰度；按照丰度信息将去除冗余后的序列集排序；去除丰度为1的singleton序列(即全部序列中只出现1次的tag)后进行OTU聚类，得到每个OTU代表序列集；将全部序列map到OTU的代表序列上形成OTU列表，统计各样本的OTU数目及相应的tags数，如下表5所示：
表5各样本的OTU数目统计表
Figure BDA0003777915430000101
2.3 OUT分布Venn图
通常情况下，按照97％相似度聚类的OTU可以近似看作一个种。通过R语言绘制Venn图可以直观地观察多个样本或分组(一般小于6个)共有的、各自特有及相互交叠的OTU数目，进而对样品的物种分布情况进行初步判断：实验室组和对照组共有的OUT的数量为1319，实验组独有的OUT数量为1413，对照组独有的OUT数量为710，初步说明实验组的大鼠肠道微生物中种群数量较对照组数量多，一定程度上反应了海蓬子提取物对肠道菌群的调节作用。
2.4物种组成分析
根据物种注释结果，选取各分组在门水平上最大丰度排名前10的物种生成相对丰度分布柱形图，在门水平上，排名前10的物种的相对丰度总和占所测序列的99.9％以上。处于绝对优势地位，其中各组的Firmicutes(厚壁菌门)和Bacteroidetes(拟杆菌门)相对丰度占比之和在92.49％-93.17％，是最主要的菌群。因此对肠道菌群的稳定性会产生显著影响。
如表6所示，海蓬子提取物灌胃干预后，SHR大鼠肠道微生物在门水平上排名前10的物种总丰度有所下降，其中Firmicutes(厚壁菌门)和Bacteroidetes(拟杆菌门)总和出现下降，其他而菌群相对丰度提高。厚壁菌门的相对丰度显著提高，Firmicutes与Bacteroidetes丰度比值(F/B)由原来的44.45升高到71.66，出现显著升高(P<0.05)。除此之外，在前10物种中，Tenericutes(软壁菌门)和Verrucomicrobia(疣微菌门)相对丰度降低，Proteobacteria(变形菌门)出现显著升高(P<0.05)，一些变形菌可以储存能量，有助于肠道微生物代谢的进行。Actinobacteria(放线菌门)出现显著降低(P<0.05)，大多数的放线菌未致病菌，对宿主产生严重的影响，如引起肿瘤和肺部感染等疾病。本研究还发现海蓬子提取物对梭杆菌具有显著的抑制作用，梭杆菌是稀有生存在人体肠道细菌，在结肠癌细胞中处于异常活跃状态，证实梭杆菌与癌症具有相关性，但此前的研究发现这些微细菌可导致溃疡性结肠炎高发病率。对比健康的结肠组织和癌细胞，研究人员发现癌细胞中的梭杆菌数量是健康结肠组织的数百倍。从门水平分析可以发现海蓬子提取物对肠道中微生物群落结构和丰度有着显著的调节作用，特别是对有害微生物有着显著的抑制作用，对有益微生物有着促进作用。
表6门水平物种组成数据
ax_Phylum 微生物 Control Experiment Pvalue UP DOWN
Firmicutes 厚壁菌 92.906153 90.704169 0.2752335 √
Proteobacteria 变形菌 1.1814233 4.8155598 0.0126908 √
Actinobacteria 放线菌 2.5965658 0.974118 0.0495346 √
Tenericutes 软壁菌门 0.2295515 0.894074 0.5272593 √
Verrucomicrobia 疣微杆菌 0.3901674 0.252229 0.5126908 √
Bacteroidetes 拟杆菌 2.090071 1.265642 0.0112573 √
Acidobacteria 酸杆菌 0.1770262 0.428441 0.5126908 √
Chloroflexi 绿弯菌门 0.1387798 0.2276142 0.8272593 √
Coprothermobacteraeota 粪嗜热菌群 0.0485945 0.0018249 1 √
Patescibacteria 髌骨细菌 0.0395311 0.0961248 0.5126908 √
Euryarchaeota 广古菌门 0.038095 0.0202249 0.2752335 √
Unknown 未知 0.029248 0.0542864 0.8272593 √
Synergistetes 同力菌门 0.0225601 0.0627144 0.1266305 √
Deinococcus-Thermus 奇异球菌栖热菌 0.0156963 0 0.3173105 √
Gemmatimonadetes 芽单胞菌门 0.0145512 0.0298633 0.5126908 √
Nitrospirae 硝化螺旋藻 0.0124089 0.0300346 0.3758251 √
Epsilonbacteraeota 变形菌门 0.0105453 0 0.1213353 √
Rokubacteria 己科河菌门 0.0093872 0.0187427 0.657905 √
Cyanobacteria 蓝细菌 0.0090553 0.0160826 0.0495346 √
Latescibacteria 匿杆菌门 0.0054747 0.0031357 0.657905 √
Planctomycetes 浮霉菌门 0.0049883 0.0126227 0.657905 √
Thaumarchaeota 奇古菌属 0.0048854 0.0043151 1 √
Atribacteria 暗黑菌门 0.0048221 0.0063113 1 √
Cloacimonetes 阴沟单胞菌门 0.0045635 0.0169778 0.2682859 √
Entotheonellaeota 内生菌 0.0044606 0.0192567 0.3758251 √
Spirochaetes 螺旋体 0.0040359 0.0187758 0.1266305 √
WPS-2 WPS-2 0.0019459 0 0.3173105 √
Caldiserica 嗜热丝菌门 0.0015212 0.0036497 0.4866741 √
Armatimonadetes 装甲菌门 0.0015212 0.0026616 0.7962534 √
Thermotogae 热袍菌门 0.0010141 0.0112527 0.0463016 √
Fusobacteria 梭杆菌 0.0008484 0 0.3173105 √
Kiritimatiellaeota Kiritimatiellaeota 0.0005071 0.0006654 0.7962534 √
Hydrogenedentes 食氢菌门 0 0.0026616 0.3173105 √
BRC1 BRC1 0 0.0023189 0.1213353 √
Dependentiae 从属关系 0 0.0013308 0.3173105 √
Fibrobacteres 纤维杆菌 0 0.0013308 0.3173105 √
Margulisbacteria 马古利斯菌 0 0.0009881 0.3173105 √
如表7所示，在属水平上，选取最大丰度前45的物种数据进行分析，其中菌群丰度显著增加的有Faecalibaculum(粪杆菌属)、Eubacterium_coprostanoligenes_group(真细菌群)、Bifidobacterium(双歧杆菌)、Ruminococcaceae_UCG-005(瘤胃球菌科UCG-005)、Roseburia(罗氏菌属)、Akkermansia(艾克曼菌)。其中粪杆菌属可通过释放短链脂肪酸，在不影响适应性免疫细胞的情况下抑制肿瘤细胞生长，短链脂肪酸是调节血压的重要物质基础；真细菌群主要参与肠道中能量的代谢，其丰度的增加有利于肠道微生物向机体供能；双歧杆菌作为一种生理性有益菌，对人体健康具有生物屏障、营养作用、抗肿瘤作用、免疫增强作用、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能，同时双歧杆菌能抑制人体有害细菌的生长，抵抗病原菌的感染，合成人体需要的维生素，促进人体对矿物质的吸收，产生醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等有机酸刺激肠道蠕动，促进排便；瘤胃球菌是最早发现的胃部细菌之一，在新陈代谢中起着至关重要的作用，瘤胃球菌通过分解宿主消化系统的纤维素来获取营养，也能够发酵葡萄糖和木糖，其丰度的增加能够促进机体代谢获得所需应用物质；罗氏菌属是共生细菌的一部分，在世界各地的人群中都有代表，占健康肠道细菌总数的2-31％。产生短链脂肪酸，特别是丁酸，影响结肠运动，具抗炎特性。罗氏菌属能够代谢膳食成分，刺激其增殖和代谢活动，也可以分泌各种分子，与宿主和消化道的其他细菌相互作用，改善肠道生物多样性，提高葡萄糖耐受性，帮助减肥，使结肠细胞恢复活力。罗氏菌属的失调(过少)可能影响多种代谢途径，并与多种疾病相关(包括肠易激综合征、肥胖、2型糖尿病、神经系统疾病、过敏、肝病等)罗氏菌属也可以作为症状性病理(如胆石形成)的生物标志物，或作为益生菌修复有益菌群。艾克曼菌是近几年备受关注的新兴益生菌，其可以保护肠道黏膜，防止肠道炎症的发生，其代谢产物乙酸是重要的短链脂肪酸。研究表明肠道菌群解纤维代谢产生的乙酸、醋酸等短链脂肪酸经肝脏等途径调节血压水平。因此粪杆菌属、双歧杆菌、罗氏菌属和艾克曼菌可能参与到降血压调控中。相反的，一些可能引起血压升高或肠道疾病的菌属丰度则会出现下降。
在属水平上显著降低的菌群有：Enterococcus(肠球菌)、Pseudomonas(假单胞菌)、Acetoanaerobium(厌氧醋菌属)、Agathobacter(不动杆菌)、Eubacterium_eligens_group(真杆菌群)、Trichococcus(明串珠菌属)。其中肠球菌属于病原菌，能够引起各类感染及耐药性；假单胞菌属于条件致病菌，可导致人体感染疾病，造成败血症或休克；不动杆菌是机会致病菌，当机体抵抗力降低时易引起呼吸道感染、败血症、脑膜炎、心内膜炎、伤口及皮肤感染、泌尿生殖道感染等。真杆菌群能够发酵葡萄糖或蛋白胨的主要产物通常包括大量的丁酸、乙酸等，有些是脊椎动物的致病菌。
表7属水平物种组成数据
Figure BDA0003777915430000131
Figure BDA0003777915430000141
综上所述，海蓬子提取物对肠道菌群有着显著的调节作用，能够增加大鼠肠道菌群的多样性和丰度，使高血压大鼠肠道菌落结构发生明显变化。同时，海蓬子提取物干预后益生菌的种类和丰度都出现增加，尤其是乳杆菌和艾克曼菌等这些产乙酸、丁酸的益生菌，极大地改善了肠道环境，抑制了高血压动物体内常见的致病菌，保持了肠道环境的稳定。该研究结果表明海蓬子提取物对预防和缓解高血压症状有着显著的效果，并且通过降血脂和调节肠道菌群实现降血压作用。

Claims (10)

1.一种海篷子提取物的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
S1.原料预处理：采集新鲜的海篷子，洗净晾干后烘干，再粉碎过筛得到海篷子粉末备用；
S2.第一次提取：取海蓬子粉末，以61vt.%的乙醇溶液浸提，调节浸提溶液的pH为2.0，浸提料液比为1g：20mL，浸提后分离得到一次滤液和一次滤渣；
S3.第二次提取：取一次滤渣，以61vt.%的乙醇溶液浸提，调节浸提溶液的pH为7.5，浸提料液比为1g：15mL，浸提后分离得到二次滤液和二次滤渣；
S4. 第三次提取：取二次滤渣，以61vt.%的乙醇溶液浸提，调节浸提溶液的pH为8.3，浸提料液比为1g：10mL，浸提后分离得到三次滤液和三次滤渣；
S5.制备提取物：合并一次滤液、二次滤液和三次滤液，脱色后经过滤浓缩、冷冻干燥得到所述海篷子提取物。
2.根据权利要求1所述的一种海篷子提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中烘干的温度为50℃。
3.根据权利要求1所述的一种海篷子提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中过筛目数为60。
4.根据权利要求1所述的一种海篷子提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤S2、S3和S4中，采用超声波辅助提取，功率为180W，温度为50℃，时间为0.5h。
5.根据权利要求1所述的一种海篷子提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，采用2 mol/L的盐酸溶液调节溶液的pH。
6.根据权利要求1所述的一种海篷子提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤S3和S4中采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调节溶液的pH。
7.根据权利要求1所述的一种海篷子提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中通过活性炭脱色。
8.由权利要求1-7任一项制备方法制备得到的海篷子提取物。
9.权利要求8所述的提取物在制备用于调节肠道菌群的产品中的应用。
10.权利要求8所述的提取物在制备用于调节肠道菌群紊乱导致的高血脂和高血压的产品中的应用。
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