CN115362264A

CN115362264A - 用于分析物检测的组合物和方法

Info

Publication number: CN115362264A
Application number: CN202180024956.3A
Authority: CN
Inventors: 伊凡·道哈瑟; 理查德·特里; 康纳·坎普丽森; 大卫·巴克利; 泰勒·米塞利斯; 陈红; 舒舒尼·德罗兹
Original assignee: 10X Genomics Inc
Current assignee: 10X Genomics Inc
Priority date: 2020-01-29
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2022-11-18
Also published as: EP4097251A1; WO2021155063A1; US20230212657A1

Abstract

本公开内容提供了用于检测具有三维基质的生物样品中的核酸序列的方法、系统和组合物。本公开内容还提供了用于处理用于在核酸序列检测中使用的生物样品的方法、系统和组合物。

Description

用于分析物检测的组合物和方法

交叉引用

本申请要求于2020年1月29日提交的美国临时专利申请号62/967,362的优先权，所述申请以引用方式整体并入本文以用于所有目的。

背景技术

荧光原位测序(FISSEQ)可以用于原位检测样品(例如，生物样品)内的靶分子。在FISSEQ期间，可以在样品内生成三维(3D)基质以固定靶分子或其衍生物。随后可在3D基质内对核酸靶分子进行扩增和测序。具有连接的核酸分子的3D基质可以提供信息存储介质，其中核酸分子代表可以在3D基质内读取的存储信息。

FISSEQ可用于在多于一个荧光检测周期内检测从FISSEQ文库内的每个测序模板发出的一个或多个荧光信号，其中整个检测周期内的荧光信号可包含信息架构，其可映射到分子鉴定或以其他方式提供关于所检测分子的性质的信息。3D基质可以在不损失靶分子的情况下允许试剂交换和背景分子的去除。

发明内容

本文认识到需要用于处理用于荧光原位测序(FISSEQ)的样品的稳健方案。本文提供的方法和系统可以用于将靶核酸分子固定在三维(3D)基质上并允许在3D基质内进行有效的缓冲液交换和背景分子的清除。

在一个方面，本公开内容提供了一种用于处理生物样品的方法，其包括：(a)提供包含生物样品的容器，所述生物样品包含处于合成的三维(3D)基质内的分析物，所述合成的3D基质包含连接部分；以及(b)将束缚分子引导到生物样品中，使得束缚分子(i)流动通过合成的3D基质并与分析物接触，并且(ii)连接至分析物和连接部分，从而将分析物连接至合成的3D基质。

在一些实施方案中，束缚分子包含对连接部分具有特异性的束缚部分。在一些实施方案中，合成的3D基质包封生物样品。在一些实施方案中，所述方法还包括，在(a)之前，在容器中提供基质形成材料，并且使用基质形成材料生成合成的3D基质。在一些实施方案中，合成的3D基质通过基质形成材料的聚合生成。在一些实施方案中，合成的3D基质通过基质形成材料的交联生成。在一些实施方案中，所述方法还包括，在(b)之后，鉴定合成的3D基质内的分析物。在一些实施方案中，束缚分子包含与分析物的序列互补的核酸序列。在一些实施方案中，束缚分子包含聚脱氧胸苷(dT)序列。在一些实施方案中，所述方法还包括，在(b)中，使生物样品与杂交反应增强剂接触，其中杂交反应增强剂提高核酸序列与分析物的序列之间的杂交速率。在一些实施方案中，杂交反应增强剂包含促进杂交反应增强剂的失活的官能团。在一些实施方案中，所述方法还包括在使生物样品与杂交反应增强剂接触之后，使官能团经受足以使杂交反应增强剂失活的条件。在一些实施方案中，所述方法还包括使杂交反应增强剂失活。在一些实施方案中，官能团是水合基团。在一些实施方案中，水合基团是离子基团、电解基团或亲水基团。在一些实施方案中，官能团还包含可切割接头，所述可切割接头连接官能团与杂交反应增强剂的聚合物主链。在一些实施方案中，可切割接头包含α-羟基酸、β-酮酸或二硫键。在一些实施方案中，所述方法还包括从杂交反应增强剂的聚合物主链上切割官能团。在一些实施方案中，所述方法还包括从合成的3D基质中去除官能团。在一些实施方案中，所述方法还包括从合成的3D基质中去除杂交反应增强剂。在一些实施方案中，去除包括从合成的3D基质中洗掉杂交反应增强剂。在一些实施方案中，所述方法还包括，在(b)之后，使包封在合成的3D基质内的生物样品与蛋白酶接触。在一些实施方案中，分析物是(i)核酸分子或(ii)多肽分子。在一些实施方案中，分析物是一个或多个多肽分子，其中分析物与抗体或其片段结合。在一些实施方案中，抗体或其片段与核酸条形码缀合，并且其中束缚分子包含与核酸条形码互补的核酸序列。在一些实施方案中，分析物是一个或多个多肽分子，并且其中束缚分子是与核酸条形码缀合的抗体或其片段。在一些实施方案中，核酸条形码包含束缚部分，所述束缚部分连接至合成的3D基质的连接部分。

在一些实施方案中，分析物是核酸分子，并且其中束缚分子包含与一个或多个核酸分子中的核酸分子的序列互补的引物序列。在一些实施方案中，所述方法还包括，在(b)中，使引物序列与核酸分子的序列杂交。在一些实施方案中，所述方法还包括，在(b)之后，延伸与核酸分子的序列杂交的引物序列以产生连接至合成的3D基质的延伸产物。在一些实施方案中，所述方法还包括在另外的杂交反应增强剂的存在下使探针与延伸产物杂交。在一些实施方案中，探针是锁式探针或分子倒置探针。在一些实施方案中，所述方法还包括使另外的杂交反应增强剂失活或从合成的3D基质中去除另外的杂交反应增强剂。在一些实施方案中，所述方法还包括使探针环化。在一些实施方案中，环化包括连接探针的3’端和5’端。在一些实施方案中，所述方法还包括使探针经受扩增反应以产生扩增产物。在一些实施方案中，扩增反应是滚环扩增。在一些实施方案中，扩增反应将修饰的碱基掺入扩增产物中。在一些实施方案中，修饰的碱基是5-叠氮甲基-dUTP。在一些实施方案中，扩增反应是非酶促反应。在一些实施方案中，非酶促反应是杂交链式反应(HCR)或分支DNA反应。在一些实施方案中，生物样品是细胞或组织。在一些实施方案中，细胞或组织是固定的。在一些实施方案中，细胞或组织是透化的。

在另一方面，本公开内容提供了一种用于处理生物样品的方法，其包括：(a)使包含分析物的生物样品与束缚分子和杂交反应增强剂接触，其中束缚分子包含束缚部分和与分析物的序列互补的核酸序列，并且其中杂交反应增强剂提高核酸序列与分析物的序列之间的杂交速率；(b)使束缚分子的核酸序列与分析物的序列杂交；(c)使具有与分析物杂交的束缚分子的生物样品与基质形成材料接触；以及(d)使用基质形成材料形成合成的三维(3D)基质，合成的三维(3D)基质具有通过束缚部分连接到其上的束缚分子。

在一些实施方案中，合成的3D基质保持分析物在生物样品内的绝对或相对空间位置。在一些实施方案中，合成的3D基质可以保持与生物样品内的分析物缔合的分子的绝对或相对空间位置(例如，保持分析物的衍生物或与结合分析物的结合剂偶联的核酸分子的位置)。在一些实施方案中，合成的3D基质还包含连接部分。在一些实施方案中，束缚分子的束缚部分对连接部分具有特异性。在一些实施方案中，所述方法还包括，在(d)中，将束缚部分连接至连接部分。在一些实施方案中，杂交反应增强剂包含促进杂交反应增强剂的失活的官能团。在一些实施方案中，所述方法还包括，在(d)之后，使官能团经受足以使杂交反应增强剂失活的条件。在一些实施方案中，所述方法还包括使杂交反应增强剂失活。在一些实施方案中，官能团是水合基团。在一些实施方案中，水合基团是离子基团、电解基团或亲水基团。在一些实施方案中，官能团还包含可切割接头，所述可切割接头连接官能团与杂交反应增强剂的聚合物主链。在一些实施方案中，可切割接头包含α-羟基酸、β-酮酸或二硫键。在一些实施方案中，所述方法还包括从杂交反应增强剂的聚合物主链上切割官能团。在一些实施方案中，所述方法还包括从合成的3D基质中去除官能团。在一些实施方案中，所述方法还包括从合成的3D基质中去除杂交反应增强剂。在一些实施方案中，去除包括从合成的3D基质中洗掉杂交反应增强剂。在一些实施方案中，所述方法还包括，在(d)之后，使包封在合成的3D基质内的生物样品与蛋白酶接触。在一些实施方案中，分析物是(i)核酸分子或(ii)多肽分子。在一些实施方案中，分析物是一个或多个多肽分子，其中分析物与抗体或其片段结合。在一些实施方案中，抗体或其片段与核酸条形码缀合，并且其中束缚分子包含与核酸条形码互补的核酸序列。在一些实施方案中，分析物是一个或多个核酸分子，并且其中束缚分子包含与一个或多个核酸分子中的核酸分子的序列互补的引物序列。在一些实施方案中，所述方法还包括，在(d)之后，延伸与核酸分子的序列杂交的引物序列以产生连接至合成的3D基质的延伸产物。在一些实施方案中，所述方法还包括在另外的杂交反应增强剂的存在下使探针与延伸产物杂交。在一些实施方案中，探针是锁式探针或分子倒置探针。在一些实施方案中，所述方法还包括使另外的杂交反应增强剂失活或从合成的3D基质中去除另外的杂交反应增强剂。在一些实施方案中，所述方法还包括使探针环化。在一些实施方案中，环化包括连接探针的3’端和5’端。在一些实施方案中，所述方法还包括使探针经受扩增反应以产生扩增产物。在一些实施方案中，扩增反应是滚环扩增。在一些实施方案中，扩增反应将修饰的碱基掺入扩增产物中。在一些实施方案中，修饰的碱基是5-叠氮甲基-dUTP。在一些实施方案中，扩增反应是非酶促反应。

在一些实施方案中，非酶促反应是杂交链式反应(HCR)或分支DNA反应。在一些实施方案中，生物样品是细胞或组织。在一些实施方案中，细胞或组织是固定的。在一些实施方案中，细胞或组织是透化的。

在另一方面，本公开内容提供了一种用于处理包含分析物的生物样品的组合物，其包含：包封在合成的三维(3D)基质内的生物样品；与合成的3D基质偶联的连接部分；束缚探针，其中束缚探针包含与分析物的序列互补的核酸序列，并且其中核酸序列被配置为与分析物的序列杂交；以及杂交反应增强剂，所述杂交反应增强剂提高核酸序列与分析物的序列之间的杂交速率。在一些实施方案中，连接部分被配置为保持分析物在合成的3D基质内的绝对或相对空间位置。

在一些实施方案中，分析物是核酸分子或多肽分子。在一些实施方案中，生物样品是细胞或组织。在一些实施方案中，细胞或组织是固定的。在一些实施方案中，细胞或组织是透化的。在一些实施方案中，杂交反应增强剂包含促进杂交反应增强剂的失活的官能团。在一些实施方案中，官能团是水合基团。在一些实施方案中，水合基团是离子基团、电解基团或亲水基团。在一些实施方案中，官能团还包含可切割接头，所述可切割接头连接官能团与杂交反应增强剂的聚合物主链。

在另一方面，本公开内容提供了一种用于处理生物样品的方法，其包括：(a)使包含多肽分析物的生物样品与束缚分子接触，其中束缚分子包含(i)与核酸条形码缀合的抗体或其片段以及(ii)束缚部分；(b)使多肽分析物与束缚分子结合；(c)使具有与多肽分析物结合的束缚分子的生物样品与基质形成材料接触；以及(d)使用基质形成材料形成合成的三维(3D)基质，合成的三维(3D)基质具有通过束缚部分连接至其上的束缚分子。

在另一方面，本公开内容提供了一种用于处理生物样品的方法，其包括提供包含处于合成的三维(3D)基质内的多肽分析物的生物样品，所述合成的3D基质包含连接部分；使生物样品与束缚分子接触，其中束缚分子包含(i)与核酸条形码缀合的抗体或其片段以及(ii)束缚部分；以及使多肽分析物与束缚分子结合；从而通过连接部分将分析物连接至合成的3D基质。

在任何此类实施方案中的一些中，生物样品可包含处于合成的3D基质内的另外的分析物。在一些实施方案中，合成的3D基质包含另外的连接部分。在一些情况下，在合成的3D基质形成之后向其提供一个或多个另外的连接部分。在一些情况下，在合成的3D基质形成之前或期间向其提供一个或多个另外的连接部分。在一些情况下，使所述生物样品与束缚分子接触与合成的3D基质的形成同时或并发进行。在一些情况下，使所述生物样品与束缚分子接触在合成的3D基质的形成之后进行。在一些实施方案中，另外的分析物是核酸分子。

在任何此类实施方案中的一些中，所述方法包括提供另外的束缚分子，其中另外的束缚分子包含与核酸分子的序列互补的引物序列。在一些方面，所述方法包括使引物序列与核酸分子的序列杂交。在一些实例中，所述方法包括延伸与核酸分子的序列杂交的引物序列以产生延伸产物。在一些实施方案中，可以将延伸产物连接至合成的3D基质。

在一些实施方案中，所述方法包括使探针与延伸产物杂交。在一些实例中，探针是锁式探针或分子倒置探针。在一些情况下，所述方法包括使探针环化。在一些实例中，环化包括连接探针的3’端和5’端。在一些实施方案中，使探针经受扩增反应以产生扩增产物。在一些实例中，扩增反应是滚环扩增。在一些实施方案中，扩增反应将修饰的碱基掺入扩增产物中。在一些情况下，修饰的碱基是5-叠氮甲基-dUTP。

在任何此类实施方案中的一些中，连接部分和另外的连接部分是不同的。例如，在一些情况下，束缚部分包含丙烯酰基并且另外的束缚部分是叠氮化物。在一些实施方案中，另外的束缚分子(i)流动通过合成的3D基质并与另外的分析物接触，并且(ii)连接至另外的分析物和另外的连接部分，从而将另外的分析物连接至合成的3D基质。

本公开内容的另一方面提供了一种包括机器可执行代码的非暂态计算机可读介质，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实施上文或本文其他地方的任何方法。

本公开内容的另一方面提供了一种系统，其包括一个或多个计算机处理器和与其耦接的计算机存储器。计算机存储器包括机器可执行代码，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实施上文或本文其他地方的任何方法。

本公开内容的另外的方面和优点将从以下具体实施方式变得为本领域技术人员显而易知，其中仅示出并描述本公开内容的例示性实施方案。应当认识到的是，本公开内容能够具有其他以及不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种不同方面做出修改，所有均不脱离本公开内容。因此，附图和说明书应被视为在本质上是说明性的而不是限制性的。

以引用的方式并入

在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文，其程度就如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体和单独地指出以引用的方式并入一般。如果通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相矛盾，则说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾材料。

附图说明

本发明的新型特征在随附权利要求中具体阐述。通过参考对其中利用本发明的原理的例示性实施方案作出阐述的以下详细描述以及附图(在本文中还有“图(Figure和FIG.)”)获得对本发明的特征和优点的更好理解，在附图中：

图1示出使用本文所述的方法处理样品的示例性过程。

图2示出使用本文所述的方法处理样品的示例性过程。

图3示出已编程或以其他方式被配置为实现本文提供的方法的计算机系统。

图4A示出本文所述的点击化学的实例并且图4B示出本文所述的示例性试剂。

图5A示出点击单体滴定的实例并且图5B示出本文所述的图形化结果。

图6A和图6B示出本文所述的自由基对叠氮化物官能团的破坏的实例。

图7A、图7B和图7C示出使用本文所述的方法进行叠氮化物探针束缚的实例。

图8A和图8B示出使用本文所述的方法进行叠氮化物探针标记的实例。

具体实施方式

虽然本文已经示出并描述本发明的各种实施方案，但是本领域技术人员显而易知此类实施方案仅作为举例来提供。许多改变、变化和取代可由本领域技术人员想到且不脱离本发明。应理解，可使用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。

每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在一系列两个或更多个数值中的第一个数值前面时，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于所述系列数值中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3等效于大于或等于1、大于或等于2，或大于或等于3。

每当术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”在一系列两个或更多个数值中的第一个数值前面时，术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”适用于所述系列数值中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1等效于小于或等于3、小于或等于2或小于或等于1。

如本文所用，术语“核酸”通常是指包含多个核苷酸或核苷酸类似物的核酸分子。核酸可以是核苷酸的聚合形式。核酸可包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其类似物或其组合。核酸可以是寡核苷酸或多核苷酸。核酸可具有各种三维结构并且可执行各种功能。核酸的非限制性实例包括DNA、RNA、基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析限定的一个或多个基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组核酸、分支核酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针以及引物。核酸可包含一个或多个修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则可在核酸的组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核酸的核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。可在聚合之后，诸如通过缀合，利用用于固定的官能部分对核酸进一步修饰。

在本文中术语“多肽”和“肽”可互换使用，并且它们是指氨基酸的聚合形式。多肽可以包含两个或更多个氨基酸。多肽可以是非结构化或结构化的。多肽可以是蛋白质。

如本文所用，术语“滚环集落(rolony)”通常是指滚环集落(rolling circlecolony)，例如通过滚环扩增(RCA)产生的核酸分子的集落。

术语“扩增(amplifying)”和“扩增(amplification)”通常是指产生核酸的一个或多个拷贝(或“扩增产物(amplified product)”或“扩增产物(amplification product)”)。一个或多个拷贝可通过核酸延伸产生。这种延伸可以是单轮延伸或多轮延伸。扩增产物可通过聚合酶链式反应(PCR)产生。

样品处理方法

本公开内容提供了用于处理样品(例如生物样品)的方法。在一些方面，所述方法可以包括提供包含生物样品的容器，所述生物样品包含处于三维(3D)基质内的分析物。3D基质可以是合成的3D基质。例如，可以通过包含基质形成单体或聚合物的基质形成材料的聚合或交联生成3D基质。3D基质可以包封样品。3D基质可以包含用于固定分析物的连接部分。分析物可以是核酸分子、多肽分子、小分子或其组合。接下来，可将束缚分子引导到样品中，穿过3D基质并与分析物接触。束缚分子可连接至分析物和连接部分，从而将分析物连接至3D基质。束缚分子可以包含对连接部分具有特异性的束缚部分。束缚部分和连接部分可以是蛋白质-蛋白质结合对或可以相互反应的官能部分。例如，束缚部分可以是胺、硫醇、叠氮化物、炔烃、硝酮、烯烃、四嗪、四唑、丙烯酰胺基(acrydite)或其他点击反应性基团。束缚分子可以包含与分析物的序列互补的核酸序列。例如，束缚分子可以包含聚脱氧胸苷(dT)序列。接下来，可以在3D基质内检测分析物。检测方法可以是本文所述的各种方法，包括但不限于与标记探针杂交和测序。

可以使3D基质内的样品与杂交反应增强剂接触。杂交反应增强剂可以提高核酸序列与分析物序列之间的杂交速率。杂交反应增强剂可以包含促进杂交反应增强剂失活的官能团。可以使官能团经受足以使杂交反应增强剂失活的条件。可以使杂交反应增强剂失活。官能团可以是水合基团。例如，水合基团可以是离子基团、电解基团或亲水基团。官能团还可以包含可切割接头。可切割接头可以使官能团与杂交反应增强剂的聚合物主链连接。可切割接头可以包含α-羟基酸、β-酮酸或二硫键。可从杂交反应增强剂的聚合物主链上切割官能团。可从3D基质中去除官能团。在一些情况下，可以通过缓冲液从3D基质中洗掉官能团。也可从3D基质中去除杂交反应增强剂。例如，可以从3D基质中洗掉杂交反应增强剂。在一些实施方案中，杂交反应增强剂不是硫酸葡聚糖。此外，可通过从3D基质中洗掉本文所述的增强剂(包括例如较小的增强试剂)而使其失活。

在一些情况下，可以使包封在3D基质内的生物样品经受清洁过程。可以使包封在3D基质内的生物样品与试剂接触以清洁样品并完全透化样品。例如，可以使生物样品与蛋白酶接触以分解蛋白质。用于分解非靶分子的试剂的其他实例包括但不限于去污剂、有机溶剂和变性剂。在一些实施方案中，在直接或间接结合或连接分析物(或其衍生物)的束缚分子结合或连接至3D基质后，将清除剂应用于样品。在一些实施方案中，在直接或间接结合或连接分析物(或其衍生物)的束缚部分结合或连接至3D基质的连接部分后，将清除剂应用于样品。

分析物可以是各种分子。分析物可以是一个或多个核酸分子或一个或多个多肽分子。在一些情况下，分析物是多肽分子，并且分析物可以与鉴定结合剂的报告序列(例如，核酸条形码)缀合的结合剂(例如，抗体或抗体片段)结合。在一些实施方案中，鉴定结合剂的报告序列可以被靶向以用于分析。在一些实施方案中，术语“抗体”包括抗体来源的多肽，如单链可变片段(scFv)、双体抗体或其他多聚体scFv、重链抗体、单结构域抗体，或包含足以赋予与多肽的特异性抗原结合能力的抗体部分(例如，一个或多个互补决定区(CDR))的其他多肽。在一些情况下，分析物是与核酸条形码杂交的核酸。在一些实施方案中，与核酸条形码缀合的抗体或抗体片段或缀合的条形码本身，是分析物，并且与核酸条形码杂交的核酸，诸如核酸探针或其衍生物(例如，其中核酸探针可以被环化、连接和扩增以形成RCA，诸如滚环集落))是束缚分子。在一些实施方案中，扩增产物(例如，RCA产物诸如滚环集落)包含用于固定的官能部分并且是束缚分子。在一些实施方案中，用于与缀合至抗体或其片段的核酸条形码杂交的核酸探针是锁式探针。在一些实施方案中，核酸探针包含一种或多种核苷酸三磷酸类似物，其包含用于固定的官能部分。在一些实施方案中，所产生的扩增产物可以在扩增过程中被官能化，诸如通过添加包含用于固定的官能部分的核苷酸三磷酸类似物。束缚分子可以包含与核酸条形码互补的核酸序列。在一些情况下，分析物是核酸分子，并且束缚分子可以包含与核酸分子的序列互补的引物序列。引物序列可以与核酸分子的序列杂交。然后可以延伸与核酸分子的序列杂交的引物序列以产生连接至3D基质的延伸产物。引物延伸可以包括逆转录或第二链合成。

在一些情况下，探针可以与延伸产物杂交。杂交可以在另外的杂交反应增强剂的存在下进行。本文提供的探针可以是锁式探针或分子倒置探针。探针可环化。例如，可通过连接探针的3’端和5’端使探针环化。可扩增探针以产生扩增产物。可以使用各种扩增方法例如聚合酶链式反应或等温扩增来扩增探针。扩增反应可以是滚环扩增。扩增反应可以将修饰的碱基掺入扩增产物中。修饰的碱基可以使扩增产物与3D基质连接。修饰的碱基可以是5-叠氮甲基-dUTP。扩增反应可以是非酶促反应。非酶促反应的实例包括但不限于杂交链式反应(HCR)和分支DNA反应。当进行HCR时，探针可进一步包含起始子序列，该起始子序列可以触发来自稳定或亚稳定单体(例如，HCR单体)池的核酸分子的杂交链反应。HCR单体可以采用发夹结构。HCR单体可以直接或间接地与可检测部分连接。HCR可以用于通过增加定位于起始子序列的可检测部分(诸如荧光团)的数量来放大信号。当进行分支DNA反应时，探针还可包含可以与预扩增分子(pre-amplifier molecule)的序列杂交的序列。预扩增分子可以进一步包含不可与探针杂交并且可以结合多个核酸分子(例如，分支DNA反应单体)以放大信号以供检测的序列。

在一些情况下，样品的分析物是蛋白质或多肽。蛋白质或多肽可以是可溶性蛋白、不溶性蛋白、表面细胞受体、核糖核蛋白复合物或本文所述的其他肽组合物。在一些实施方案中，束缚分子是与核酸或核酸条形码缀合的抗体或其片段。在一些实施方案中，束缚分子被配置为与缀合至抗体或其片段的核酸或核酸条形码杂交以结合分析物。条形码可包含具有诸如叠氮化物基团或本文所述的其他束缚部分的束缚官能团的一个或多个修饰的核苷酸。样品可包埋在3D基质中。3D基质可由连接部分组成。连接部分可包含烷基或本文所述的其他连接部分。连接部分可通过点击化学、自由基或本文所述的其他连接化学与束缚部分共价结合。在一个实施方案中，与核酸缀合的抗体或其片段与多肽分析物结合，与抗体或其片段缀合的核酸的束缚部分与3D基质的连接部分共价结合或连接，可应用蛋白酶或其他蛋白质清除剂，并且通过本文所述的任何方法检测与抗体缀合的核酸。

在一些实施方案中，可以使本文所述的束缚分子的组合接触或流动通过基质，以同时或顺序地检测同一组织切片、细胞或其他样品中的多种不同分析物。核酸探针、所探测的延伸产物和带有核酸条形码的抗体可组合使用，以同时或顺序地检测多种分析物，包括核酸、蛋白质、小分子或本文所述的其他分析物。在一些情况下，束缚分子和分析物的组合可以提供多组学信息，包括多种分析物的各种水平、表达或浓度，所述分析物包括本文所述的不同分析物类型的那些。

多组学信息可通过核酸(包括DNA和RNA)、蛋白质或多肽、小分子、脂质或糖部分的任何组合的检测产生。在一些情况下，多组学信息是通过检测与多于一种核酸、蛋白质、多肽、小分子、脂质、糖部分或其组合相关的信号产生的。在一个实例中，可通过检测与蛋白质和RNA相关的信号来产生多组学信息。为了产生蛋白质和RNA多组学信息，可将如本文所述的样品包埋在如本文所述的包含连接部分的3D基质中，使包含束缚部分的RNA-分析物结合探针和包含束缚部分的蛋白质-分析物结合剂(例如，抗体)流入基质中，包含束缚部分的RNA-分析物结合探针与RNA结合，包含束缚部分的蛋白质-分析物结合剂或抗体与蛋白质结合，向基质提供点击反应混合物并且该点击反应混合物使所有束缚部分与3D基质的连接部分共价结合，并且通过本文所述的任何方法检测探针或抗体。在一些其他实施方案中，蛋白质-分析物结合剂或抗体包含与RNA-分析物结合剂的束缚部分不同的束缚部分。在一些实施方案中，将蛋白质-分析物束缚(例如，通过包含束缚部分的结合剂或抗体，使用与结合剂缀合的核酸条形码)至3D基质的连接部分与将RNA-分析物束缚至3D基质的连接部分分开进行。在一些方面，与多种RNA分析物(或其衍生物)相关的束缚分子和与多种蛋白质分析物(或其衍生物)相关的束缚分子可以被直接或间接束缚至3D基质的连接部分。在任何此类实施方案中的一些中，可以在3D基质的形成之前、期间和/或之后提供束缚分子。在任何此类实施方案中的一些中，束缚分子可以在3D基质的形成期间或之后连接至连接部分。核酸、蛋白质、多肽、小分子、脂质或糖部分结合剂或包含束缚部分的抗体，或其他束缚部分分子的任何组合可用于产生多组学信息。可以同时或顺序进行多种分析物的质询。此外，针对不同类型分析物(包括本文针对核酸和多肽以及蛋白质描述的那些)的检测策略可以用于多组学分析。

在一些情况下，可以使另外的杂交反应增强剂失活或从3D基质中去除另外的杂交反应增强剂。在一些实施方案中，通过洗涤去除另外的杂交反应增强剂、使其失活或两者。杂交反应增强剂的实例在本文其他地方描述，其中另外的非限制性实例描述于PCT公布号WO2018/045181、美国专利公布号2019/0177718以及美国专利公布号2019/0330617中。可以从3D基质中去除此类杂交反应增强剂，包括通过洗涤。

本文提供的样品可以是生物样品。生物样品可以是细胞或组织。细胞或组织可以是固定的。细胞或组织可以是透化的。可以对细胞或组织进行固定，然后进行透化。

图1示出本文提供的方法的示例性过程。在第一操作101中，提供了包含生物样品的容器，所述生物样品包含处于合成的三维(3D)基质内的分析物。合成的3D基质可以包含连接部分。接下来，在第二操作102中，将束缚分子引导到生物样品中，使得束缚分子可以流动通过合成的3D基质并与分析物接触并且连接至分析物和连接部分，从而将分析物连接至合成的3D基质。

在一些方面，用于处理生物样品的方法可以包括使包含分析物的生物样品与束缚分子和杂交反应增强剂接触。束缚分子可以包含束缚部分和与分析物的序列互补的核酸序列。杂交反应增强剂可以提高核酸序列与分析物序列之间的杂交速率。接下来，可以使束缚分子的核酸序列与分析物的序列杂交。接下来，可以使具有与分析物杂交的束缚分子的生物样品与基质形成材料接触。接下来，可以使用基质形成材料形成合成的三维(3D)基质，合成的三维(3D)基质具有通过束缚部分连接至其上的束缚分子。合成的3D基质可以保持分析物在生物样品内的绝对或相对空间位置。合成的3D基质还可以包含连接部分。束缚分子的束缚部分可以对连接部分具有特异性。在一些情况下，束缚部分可以连接至连接部分。

图2示出本文提供的方法的示例性过程。在第一操作201中，使包含分析物的生物样品与束缚分子和杂交反应增强剂接触。束缚分子可以包含束缚部分和与分析物的序列互补的核酸序列。在第二操作202中，可以使束缚分子的核酸序列与分析物的序列杂交。在第三操作203中，使具有与分析物杂交的束缚分子的生物样品与基质形成材料接触。在第四操作204中，使用基质形成材料形成合成的三维(3D)基质，其中束缚分子通过束缚部分连接至其上。

分析物

本文提供了用于分析物分析或检测的样品处理方法和系统。分析物可以是生物样品中的感兴趣的靶标。在一些情况下，分析物可以是核酸分子。在一些情况下，分析物可以是蛋白质。在分析物是蛋白质的情况下，与蛋白质结合的结合剂可以与核酸序列连接，然后可以通过本文提供的方法和系统检测所述核酸序列。例如，结合剂可以是抗体或抗体片段。结合剂可以与核酸条形码缀合。在一些情况下，核酸条形码可以包含束缚部分，其可以使核酸条形码与3D基质连接。在此类情况下，结合剂本身可用作束缚分子。在一些情况下，核酸条形码可以通过束缚分子与3D基质连接，所述束缚分子包含与核酸条形码互补的核酸序列和用于连接至3D基质的束缚部分。核酸分析物可以是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。核酸分析物可以是天然存在的核酸或非天然存在的核酸，诸如使用合成方法制备的核酸。

核酸靶标，无论是天然存在的还是合成的，都可以存在于三维(3D)基质内并共价连接至3D基质，使得每个核酸的相对位置在3D基质内是固定的(例如，固定化的)。以此方式，可以提供任何序列的共价结合的核酸的3D基质。每个核酸在基质材料内可具有其自己的三维坐标并且每个核酸可代表信息。以此方式，可以将大量信息存储在3D基质中。单独信息编码核酸靶标，诸如DNA或RNA，可以原位(即在基质内)扩增和测序，从而能够在合适的3D基质中存储和读取大量信息。天然存在的核酸靶标可以包括内源性DNA和RNA。合成核酸靶标可以包括引物、条形码、扩增产物和探针。合成核酸靶标可衍生自内源性核酸分子或包括内源性核酸分子的序列信息。合成核酸靶标可以用于将内源性核酸靶标捕获到3D基质上，并且可以随后被测序或检测以鉴定内源性核酸分子的序列信息、位置(或空间)信息或两者。例如，合成核酸靶标可以是具有聚脱氧胸腺嘧啶(dT)序列的引物，其可以与内源性mRNA分子杂交。引物可固定于3D基质，并且可延伸以包括mRNA分子的序列信息(例如，序列)。然后可以通过锁式探针捕获延伸的引物并原位扩增以供检测。在另一个实例中，合成核酸靶标可以是缀合在抗体上的条形码。条形码可被锁式探针捕获并原位扩增以供检测。

核酸靶标可以是生物样品中的内源性核酸，例如基因组DNA、信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、小细胞质RNA(scRNA)以及小核RNA(snRNA)。核酸靶标可以是与结合剂连接的合成核酸。结合剂可与生物样品中的任何待检测生物分子结合。例如，为了检测蛋白质，结合剂可以是具有与其连接的核酸序列的抗体或其部分。又如，为了检测蛋白质，结合剂可以是适配体。

可对核酸靶标进行扩增以在3D基质内产生扩增产物或扩增子。可使用核酸扩增例如聚合酶链式反应(PCR)来扩增核酸靶标。核酸靶标可与探针结合，并且随后可对探针进行扩增以产生扩增产物或扩增子。在一些情况下，核酸靶标是RNA靶标，并且RNA靶标可被逆转录以产生cDNA。然后可对cDNA进行扩增或可使其与探针(例如，锁式探针)接触。探针可以与cDNA杂交。在一些情况下，核酸靶标是DNA靶标，并且可以使DNA靶标经受扩增或可以使其与探针(例如，锁式探针)接触。例如，可以通过扩增引物直接扩增DNA靶标。又如，可使锁式探针与DNA靶标接触并与DNA靶标杂交。然后可以对锁式探针进行环化和扩增。扩增产物或扩增子可以例如，通过共聚或交联连接至基质。这可以产生核酸的结构稳定且化学稳定的3D基质。核酸的3D基质可允许延长的信息存储和读取周期。核酸/扩增子基质可允许在三个维度上对一系列广泛的样品进行高通量测序。

三维基质

本公开内容提供了一种三维(3D)基质。3D基质可包含多种核酸。3D基质可包含共价或非共价连接至其上的多种核酸。3D基质可以是凝胶基质。3D基质可以是水凝胶基质。3D基质可以保持多个核酸分子的绝对或相对3D位置。

在一些情况下，可使用基质形成材料形成3D基质。基质形成材料可以是可聚合单体或聚合物，或可交联聚合物。基质形成材料可以是聚丙烯酰胺、丙烯酰胺单体、纤维素、藻酸盐、聚酰胺、琼脂糖、葡聚糖或聚乙二醇。基质形成材料可以使用基质形成材料专用的方法以及方法、试剂和条件，通过基质形成材料的聚合、交联或两者来形成基质。基质形成材料可形成聚合基质。基质形成材料可形成聚电解质凝胶。基质形成材料可形成水凝胶凝胶基质。

基质形成材料可形成包括多种核酸同时保持核酸的空间关系的3D基质。在这方面，可以将多种核酸固定在基质材料内。通过核酸与基质形成材料的共聚，可将多种核酸固定在基质材料内。也可通过核酸与基质材料的交联或者与基质形成材料的交联而将多种核酸固定在基质材料内。也可通过共价连接或通过与基质的配体-蛋白质相互作用而将多种核酸固定在基质内。

基质可以是多孔的，从而允许将试剂引入基质中的核酸的位点以扩增核酸。可根据各种方法制备多孔基质。例如，使用合适的丙烯酰胺:双丙烯酰胺比率控制交联密度，聚丙烯酰胺凝胶基质可以与丙烯酰胺基修饰的链霉抗生物素蛋白单体和生物素化的DNA分子共聚。可以通过添加另外的交联剂(诸如官能化的聚乙二醇)来实现对分子筛尺寸和密度的另外控制。

3D基质可以是足够光学透明的，或者可具有适用于标准测序化学和深度三维成像以进行高通量信息读出的光学特性。利用荧光成像的测序化学的实例包括ABI SoLiD(LifeTechnologies)，其中模板上的测序引物与具有可切割终止子的荧光标记的八聚体的文库连接。连接后，接着可以使用四个颜色通道(FITC、Cy3、得克萨斯红和Cy5)对模板进行成像。然后可以切割终止子，留下游离端以参与下一连接-延伸循环。在确定所有二核苷酸组合后，可以将图像映射到颜色代码空间以确定每个模板的特定碱基识别(base call)。可以使用自动化射流和成像装置(即，SoLiD 5500W基因组分析仪，ABI Life Technologies)实现该工作流程。测序平台的另一个实例使用合成法测序(sequencing by synthesis)，其中可以使用DNA聚合酶掺入具有可切割终止子的单核苷酸池。成像后，可以切割终止子并且可以重复该循环。然后可以对荧光图像进行分析以识别流动池内的每个DNA扩增子的碱基(HiSeq，Illumina)。

生物样品

可在本文所述的方法、系统和组合物中提供生物样品。生物样品可以包含使用本文所述的方法待处理、检测或两者的分析物。

在一些方面，可在基质形成材料例如水凝胶亚单元的存在下固定生物样品。“固定(fixing)”生物样品是指将生物样品(例如，细胞或组织)暴露于固定剂，使得细胞组分变得彼此交联。“水凝胶”或“水凝胶网络”是指不溶于水的聚合物链的网络，其有时作为胶态凝胶存在，其中水为分散介质。换句话说，水凝胶是可以吸收大量水且不溶解的一类聚合物材料。水凝胶可以含有超过99％的水，并且可包含天然或合成聚合物，或其组合。由于其显著含水量，水凝胶也可具有与天然组织非常相似的柔韧性程度。“水凝胶亚单元”或“水凝胶前体”是指可以交联或“聚合”以形成3D水凝胶网络的亲水性单体、预聚物或聚合物。不受任何科学理论的束缚，在存在水凝胶亚单元的情况下固定生物样品可将生物样品的组分与水凝胶亚单元交联，由此将分子组分固定在适当的位置，从而保持组织架构和细胞形态。

在一些情况下，生物样品(例如，细胞或组织)可被透化或以其他方式使其对于生物样品外部的环境来说是可接近的。在一些情况下，可首先将生物样品固定和透化，然后可以将基质形成材料添加到生物样品中。

可从对象获得包含核酸的任何合适的生物样品。包含核酸的任何合适的生物样品均可用于本文所述的方法和系统中。生物样品可以是固体物质(例如，生物组织)或可以是流体(例如，生物流体)。通常，生物流体可以包括与活生物体相关的任何流体。生物样品的非限制性实例包括从对象的任何解剖位置(例如，组织、循环系统、骨髓)获得的血液(或血液组分—例如，白细胞、红细胞、血小板)、从对象的任何解剖位置获得的细胞、皮肤、心脏、肺、肾、呼吸系统(breath)、骨髓、粪便、精液、阴道分泌物(vaginal fluid)、源自肿瘤组织的间质液、乳房、胰腺、脑脊液、组织、咽拭子、活检、胎液、羊水、肝脏、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、结肠、肠、脑、腔液、痰、脓、微生物群(micropiota)、胎粪、母乳、前列腺、食道、甲状腺、血清、唾液、尿液、胃液和消化液、泪液、眼液、汗液、粘液、耳垢、油脂、腺体分泌物、脊髓液、头发、指甲、皮肤细胞、血浆、鼻拭子或鼻咽洗液、脊髓液、脐带血、淋巴液(emphatic fluid)、其他排泄物或身体组织或其组合。生物样品可以是无细胞样品。这种无细胞样品可包括DNA和/或RNA。

任何便利的固定剂(fixation agent)或“固定剂(fixative)”可用于在不存在或存在水凝胶亚单元(例如，甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙酮、乙醇、甲醇等)的情况下固定生物样品。在一些情况下，可以在缓冲液(例如，盐水、磷酸盐缓冲液(PB)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、柠檬酸缓冲液、磷酸钾缓冲液等)中以通常约1-10％，例如，1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％或10％的浓度稀释固定剂，例如，4％多聚甲醛/0.1M磷酸盐缓冲液；2％多聚甲醛/0.2％苦味酸/0.1M磷酸盐缓冲液；0.1M磷酸盐缓冲液中的4％多聚甲醛/0.2％高碘酸盐/1.2％赖氨酸；磷酸盐缓冲液中的4％多聚甲醛/0.05％戊二醛；等等。所用固定剂的类型和暴露于固定剂的持续时间将取决于样本中感兴趣的分子对通过固定剂实现的变性的敏感性，并且可使用组织化学或免疫组织化学技术容易地确定。

固定剂/水凝胶组合物可包含任何水凝胶亚单元，诸如但不限于聚(乙二醇)及其衍生物(例如PEG-二丙烯酸酯(PEG-DA)、PEG-RGD)、聚脂族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚环丁烷氧化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)和聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖、明胶、藻酸盐、蛋白质聚合物、甲基纤维素等。诸如亲水性纳米颗粒，例如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PLG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚苯乙烯、聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)等试剂可用于改善水凝胶的渗透性，同时保持可成图案性。诸如PEG的嵌段共聚物、可降解PEO、聚(乳酸)(PLA)和其他类似材料等材料可以用于为水凝胶增加特定的性能。可包括交联剂(例如双丙烯酰胺、二吖丙啶等)和引发剂(例如偶氮二异丁腈(AIBN)、核黄素、L-精氨酸等)，以在后期聚合事件中促进相互作用的大分子之间的共价键合。

可在固定后对生物样品(例如，细胞或组织)进行透化。可进行透化以促进进入细胞的细胞质或细胞内分子、组分或结构。透化可允许试剂(诸如磷选择性抗体、核酸缀合抗体、核酸探针、引物等)进入细胞并在细胞内达到高于在不存在这种透化处理的情况下可以正常渗透到细胞中的浓度。在一些实施方案中，可在透化后储存细胞。在一些情况下，可使细胞与一种或多种剂接触以允许透化后的一种或多种剂的渗透，且没有任何储存步骤，并且接着进行分析。在一些实施方案中，可在至少约60％、70％、80％、90％或更多甲醇(或乙醇)的存在下对细胞进行透化并将其在冰上孵育一段时间。孵育时间段可以是至少约10、15、20、25、30、35、40、50、60或更多分钟。

在一些实施方案中，可通过任何合适的方法进行细胞的透化。可进行适当透化剂的选择以及孵育条件和时间的优化。合适的方法包括但不限于暴露于去污剂(诸如CHAPS、胆酸、脱氧胆酸、洋地黄皂苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、十二烷基硫酸盐、甘氨脱氧胆酸、正月桂酰肌氨酸、皂苷和triton X-100)或有机醇(诸如甲醇和乙醇)。其他透化方法可以包括使用使膜可透过的某些肽或毒素。还可通过向细胞中添加有机醇来进行透化。

例如，通过说明且不限制的方式，通过使用表面活性剂、去污剂、磷脂、磷脂结合蛋白、酶、病毒膜融合蛋白等；通过使用渗透活性剂；通过使用化学交联剂；通过包括电穿孔等的物理化学方法或通过其他透化方法也可以实现透化。

因此，例如，可使用多种已知技术中的任一种，诸如暴露于浓度低于用于裂解细胞和溶解膜的浓度(即，低于临界胶束浓度)的一种或多种去污剂(例如，洋地黄皂苷、TritonX-100^TM、NP-40^TM、辛基葡糖苷等)使细胞透化。也可使用某些转染试剂，诸如二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。ATP也可以用于使完整细胞透化。用作固定剂的低浓度化学品(例如，甲醛)也可用于使完整细胞透化。

可清除3D基质内的生物样品中不是感兴趣的靶标的蛋白质、脂质或两者。在可以与分析物(例如,蛋白质)缔合的核酸通过束缚部分与3D基质结合之后，可使用清除剂处理3D基质内的生物样品。例如，可以通过酶促蛋白水解清除生物样品中的蛋白质(也称为“脱蛋白”)。可在任何靶分子或其衍生物的共价固定之前或之后进行清洁过程。

在一些情况下，在靶核酸分子(例如，RNA或DNA)、引物(例如，RT引物)、靶分子衍生物(例如，cDNA或扩增子)、探针(例如，锁式探针)共价固定至合成的3D基质之后进行清洁过程。可以在使任何后续的核酸杂交反应能够在样品已基本上脱蛋白(如通过酶促蛋白水解(“蛋白质清除”))的条件下进行固定之后的清洁过程。这种方法可以具有从靶分子中去除核糖体和其他RNA或核酸靶标结合蛋白(同时保持空间位置)的益处，其中蛋白质组分可能阻碍或抑制引物结合、逆转录或锁式连接和扩增，从而通过减少由于靶核酸的蛋白质占据或蛋白质拥挤/接近而导致的探针捕获事件中的偏差来提高测定的灵敏度和定量性。

清洁过程可以包括从3D基质中去除非靶标。清洁过程可以包括使非靶标降解。清洁过程可以包括使样品暴露于能够降解蛋白质的酶(例如，蛋白酶)。清洁过程可以包括使样品暴露于去污剂。

可使用可将蛋白质分解成较小组分和/或氨基酸的酶、变性剂、螯合剂、化学剂等从样品中清除蛋白质。这些较小组分可更容易通过物理方式去除，可足够小或可以是惰性的，使得它们不显著影响背景，或两者。类似地，可使用表面活性剂等从样品中清除脂质。在一些情况下，例如同时或顺序地使用这些试剂中的一种或多种。合适的酶的非限制性实例包括诸如蛋白酶K、朊酶(protease)或肽酶的蛋白酶(proteinase)或诸如胰蛋白酶、胃蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的消化酶。合适的变性剂的非限制性实例包括盐酸胍、丙酮、乙酸、脲或高氯酸锂。能够使蛋白质变性的化学剂的非限制性实例包括溶剂，诸如酚、氯仿、异氰酸胍、脲、甲酰胺等。表面活性剂的非限制性实例包括Triton X-100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚)、SDS(十二烷基硫酸钠)、Igepal CA-630或泊洛沙姆。螯合剂的非限制性实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐或聚天冬氨酸。在一些实施方案中，可将诸如这些的化合物应用于样品以清除蛋白质、脂质、其他组分或两者。例如，可将缓冲溶液(例如，含有Tris或三(羟甲基)氨基甲烷)应用于样品，然后将其去除。

在一些情况下，也可清除不是感兴趣的靶标的核酸。这些非靶标核酸可不被捕获、固定至3D基质、或两者，并且因此可以用酶降解核酸分子被去除。可用于去除DNA的DNA酶的非限制性实例包括DNA酶I、dsDNA酶、多种限制性酶等。清除RNA的技术的非限制性实例包括诸如RNA酶A、RNA酶T或RNA酶H的RNA酶或化学试剂，例如，通过碱水解(例如，通过将pH增加至大于10)。去除糖或细胞外基质的系统的非限制性实例包括酶，诸如几丁质酶、肝素酶或其他糖基化酶。去除脂质的系统的非限制性实例包括酶，诸如脂类酶(lipidase)；化学试剂，诸如醇类(例如，甲醇或乙醇)或诸如Triton X-100或十二烷基硫酸钠的去污剂。以此方式，可去除样品的背景，这可有利于例如，使用荧光显微术或如本文所述的其他技术的核酸探针或其他靶标的分析。

固定至三维基质

本文提供了组合物和方法，通过所述组合物和方法可以将靶标分析物或衍生物束缚到预先存在的基质中，包括不引发自由基水凝胶聚合反应。3D基质，诸如3D水凝胶基质，可以包含官能性束缚部分，其对存在于靶标分析物或衍生物或探针上的相容性束缚部分具有反应性。

在本公开内容的各个方面，束缚分子可以用于将分析物连接至三维(3D)基质。束缚分子可以是具有与靶核酸分子的序列互补的序列的核酸分子。在一些情况下，束缚分子可以具有可以在聚合反应中延伸的游离3’端。例如，束缚分子可以是引物或核酸探针。在一些情况下，分析物是RNA分子，并且束缚分子是锁式探针。引物可以是靶向核糖核酸分子的逆转录(RT)引物。引物可以是多聚dT引物。在一些情况下，引物可以是锁式RT引物。在分析物是多肽分子(例如，蛋白质)的一些情况下，多肽分子可由与核酸序列连接的结合剂结合，然后可以通过本文提供的方法和系统对其进行检测。例如，结合剂可以是核酸条形码缀合的抗体或抗体片段。束缚分子可以具有与抗体或其片段的核酸条形码互补的序列。在一些情况下，包含核酸条形码的结合剂本身可以用作束缚分子，其可以用于使结合剂与3D基质直接连接。在此类情况下，核酸条形码可包含用于连接至3D基质的束缚部分。

束缚分子可以包含用于将束缚分子连接至3D基质的束缚部分。3D基质可以包含连接部分。束缚部分可以与连接部分结合，使得束缚分子可以连接至3D基质。束缚部分和连接部分可以是可以相互反应的官能部分。束缚部分和连接部分可以包含通过点击化学诸如铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)点击化学)相互反应的点击官能部分。例如，束缚部分可以包含炔烃，并且连接部分可以是叠氮化物，或反之亦然。连接部分可以是在3D基质形成过程中(例如，在自由基聚合过程中)掺入3D基质中的单体、聚合物或交联剂的形式，包括丙烯酰胺-共-炔烃(炔丙基丙烯酰胺)、具有丙烯酰基的化合物或其他参与3D基质形成并从而掺入3D基质中的部分。连接部分也可以在3D基质形成后掺入3D基质中。单体基团可以是聚乙二醇(PEG)或另一水凝胶或基质组分。束缚部分可包含叠氮化物、硫醇、胺、炔烃或可以用于缀合或生物缀合目的其他基团。一些实施方案包括在某些条件下具有反应性而在其他条件下不具有反应性的束缚部分或连接部分，所述条件诸如催化缀合反应诸如铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)铜催化的点击反应的那些。催化或门控缀合反应的其他方法包括通过温度、pH、光反应性基团(包括光催化的点击反应)或氧化还原状态，包括硫醇基团和二硫键的还原和氧化。此类功能性使得试剂(诸如探针)能够被引入3D基质或其他基质中，以灌注通过靶标分析物并与其结合，诸如通过核酸杂交或抗体与蛋白质的结合，或能够参与反应诸如衍生物分子(cDNA、聚合酶集落(polony)、滚环集落等)的合成，并随后通过束缚部分与3D基质连接。这可导致缀合不均匀的产物空间定位，例如定位至靶标分析物。点击官能部分的实例包括但不限于胺、硫醇、叠氮化物、炔烃、硝酮、烯烃、四嗪、四唑和丙烯酰胺基。如本文所用，术语“反应性基团”或“官能部分”是指第一反应物上能够与第二反应物上的另一官能部分或反应性基团发生化学反应以形成共价或离子键的任何部分。例如，基质形成材料的单体或聚合物的反应性基团可以与感兴趣的底物或靶标上的官能部分(或另一反应性基团)发生化学反应以形成共价或离子键。然后可通过由反应性基团和官能部分形成的键使感兴趣的底物或靶标固定至基质。合适的反应性基团或官能部分的实例包括亲电体或亲核体，它们可以通过分别与感兴趣的底物上的相应亲核体或亲电体反应形成共价键。合适的亲电反应性基团的非限制性实例可包括，例如，包括活化酯(例如，琥珀酰亚胺酯)的酯、酰胺、丙烯酰胺、酰基叠氮化物、酰基卤化物、酰基腈、醛、酮、烷基卤化物、烷基磺酸酯、酸酐、芳基卤、氮杂环丙烷、硼酸盐、碳化二亚胺、重氮烷烃、环氧化物、卤代乙酰胺、卤代铂酸盐、卤代三嗪、亚氨基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、亚磷酰胺、甲硅烷基卤化物、磺酸酯、磺酰基卤化物等。合适的亲核反应性基团的非限制性实例可包括，例如，胺、苯胺、硫醇、醇、酚、肼、羟胺、羧酸、二醇、杂环等。束缚部分和连接部分可以是结合对，例如蛋白质-蛋白质结合对。束缚部分和连接部分可以形成非共价相互作用，例如离子相互作用、范德华力、疏水相互作用和氢键合。束缚部分可以是生物素(或其衍生物)，并且连接部分可以是抗生物素蛋白(例如链霉抗生物素蛋白)，并且反之亦然。

在一些情况下，本文所述的其他核酸(例如，RNA分子、cDNA分子、引物或探针)可包含官能部分。核酸可以通过官能部分与3D基质连接。官能部分可以通过缀合化学与3D基质上的反应性基团反应。

在一些情况下，官能部分可以通过缀合化学连接至感兴趣的靶标。在一些情况下，官能部分可以直接连接至天然核酸分子上的反应性基团。在一些情况下，官能部分可以通过中间化学物质或基团与靶标间接连接。本文所述的缀合策略不限于核酸靶标并且也可以用于蛋白质或小分子靶标。在核酸合成或延伸反应过程中，可以将包含官能部分的核苷酸类似物掺入核酸(例如，cDNA分子、探针或引物)的生长链中。

cDNA分子可在逆转录反应期间被官能化，诸如通过添加包含用于固定的官能部分的核苷酸三磷酸类似物。此类核苷酸三磷酸类似物包括但不限于氨基-烯丙基dUTP、5-TCO-PEG4-dUTP、C8-炔烃-dUTP、5-叠氮甲基-dUTP、5-乙烯基-dUTP、5-乙炔基dUTP以及包含用于通过交联或在cDNA与细胞或合成的原位基质之间形成化学键固定cDNA的官能部分的其他核苷酸三磷酸类似物。此外，细胞或合成的原位基质可包含或被制备成包含可以通过官能化反应与cDNA中的官能部分反应的化学部分(例如，反应性基团)。例如，氨基-烯丙基dUTP可与存在于内源性或外源性细胞基质内或存在于改性的合成水凝胶基质(诸如通过聚丙烯酰胺和N-(3-氨基丙基)-甲基丙烯酰胺的共聚形成的胺官能化的聚丙烯酰胺水凝胶)中的蛋白质和其他生物分子中存在的内源性游离胺基团交联；同样，含有叠氮化物官能部分的核苷类似物可与包含炔烃官能部分的合成水凝胶基质(诸如通过丙烯酰胺和炔丙基丙烯酰胺的共聚形成的)交联。

cDNA分子可在逆转录后使用用于固定的部分进行官能化。合成后cDNA官能化的机制可包括多种生化和化学方法。这些包括但不限于使用连接反应将携带用于固定的官能部分的寡核苷酸缀合至cDNA分子，使用DNA聚合反应向cDNA添加模板化或非模板化碱基，如在通过Taq聚合或通过利用由DNA末端修复机制介导的反应进行A加尾的过程中。可替代地，DNA化学官能化的化学方法可用于缀合用于固定的官能部分。例如，Label-IT胺和Label-X是双官能试剂，其可以通过氮芥烷基化机制与核酸反应，以用于将游离胺或丙烯酰基缀合至核酸的目的，其可以用于固定至基质的目的。包括但不限于DNA烷基化和羟汞化的其他化学方法可以提供用于官能化DNA的机制。

本公开内容提供了将一种或多种分析物(例如，核酸和/或其他大分子)原位修饰成包含官能部分的方法。在一些情况下，官能部分可包含可聚合基团。在一些情况下，官能部分可包含自由基可聚合基团。在一些情况下，官能部分可包含胺、硫醇、叠氮化物、炔烃、硝酮、烯烃、四嗪、四唑、丙烯酰胺基或其他点击反应性基团。在一些情况下，官能部分可以随后与3D基质原位连接。官能部分还可用于保持样品内两个或更多个分子之间的绝对或相对空间关系。

在一些实施方案中，在样品处理期间进行两个或更多个缀合反应(例如，铜催化的点击反应)以使两种或更多种类型的分析物(直接或间接地)与3D基质连接。在示例性工作流程中，所述方法包括：使包含多种类型的分析物(例如，核酸分析物和多肽分析物)的生物样品与核酸条形码缀合的结合剂(例如，抗体或其片段)接触，该核酸条形码与束缚部分(例如，丙烯酰基)缔合；使所述多肽分析物与所述结合剂结合；进行逆转录以由核酸分析物产生cDNA；形成合成的三维(3D)基质并束缚结合剂和/或缔合的核酸条形码；用清除剂处理样品；任选地释放所产生的cDNA；使样品与探针(或包含其他核酸分子诸如用于杂交和/或连接的夹板(splint)的探针组)接触，其中探针与一种或多种分析物杂交；连接一个或多个探针；进行扩增反应(例如，使用杂交和连接的探针作为模板的RCA)；使扩增产物束缚至3D基质(例如，在扩增过程中使用掺入产物中的官能化部分，诸如叠氮化物-dUTP)；以及对一种或多种分析物进行分析。在一些情况下，可以以各种顺序进行示例性工作流程的一个或多个方面，并且在整个工作流程中可以进行一个或多个另外的方面以处理样品和/或分析物。

支持物

基质可与支持物(例如，固体或半固体支持物)结合使用。例如，可以使得基质的一个表面连接至支持物(例如，玻璃表面、流动池、载玻片、孔)，而基质的另一个表面暴露或夹置于两个固体支持物之间的方式使基质聚合。根据一个方面，基质可以包含在容器内。在一些情况下，生物样品可固定或固定化在支持物上。

本公开内容的支持物可制成多种形状。在某些实施方案中，支持物是基本上平面的。支持物的实例包括诸如载玻片、多孔板、流动池、盖玻片、微芯片等的板、诸如微量离心管、试管等的容器、管材、片材、垫、膜等。此外，支持物可以是例如生物的、非生物的、有机的、无机的或其组合。

如本文所用，术语“固体表面”旨在表示固体或半固体支持物的表面，并且包括可以用作固体或半固体基础以用于连接生物样品或其他分子诸如多核苷酸、扩增子、DNA球、其他核酸、其他聚合物(包括生物聚合物)或其组合的任何材料。构成固体表面的材料的示例性类型包括玻璃、改性玻璃、功能化玻璃、无机玻璃、微球(包括惰性颗粒、磁性颗粒、惰性和磁性颗粒)、塑料、多糖、尼龙、硝化纤维素、陶瓷、树脂、二氧化硅、二氧化硅基材料、碳、金属、光纤或光纤束、除上文所述的那些之外的多种聚合物以及多孔板。塑料的示例性类型包括但不限于丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯和Teflon^TM。二氧化硅基材料的示例性类型包括但不限于硅和各种形式的改性硅。

固体表面的形状也可以取决于在本文所述的方法中的应用而变化。例如，可用于本公开内容的固体表面可以是平面的或含有凹入或凸出的区域。

扩增

任何类型的核酸扩增反应均可用于进行在本文所述的方法或系统中的扩增反应并产生扩增产物。此外，核酸的扩增可以是线性的、指数性的或其组合。核酸扩增方法的非限制性实例包括转录(例如，体外转录)、逆转录、引物延伸、聚合酶链式反应、连接酶链式反应、解旋酶依赖性扩增、不对称扩增、滚环扩增以及多重置换扩增(MDA)。在一些情况下，扩增产物可以是DNA。在扩增靶RNA的情况下，可以通过RNA的逆转录获得DNA，并且随后的DNA扩增可以用于产生扩增的DNA产物。在一些情况下，通过逆转录酶将靶RNA逆转录以产生cDNA。在一些情况下，通过RNA聚合酶转录靶DNA以产生RNA。扩增的DNA产物可指示生物样品中靶RNA的存在。在扩增DNA的情况下，可采用任何DNA扩增方法。DNA扩增方法的非限制性实例包括聚合酶链式反应(PCR)、PCR的变体(例如，实时PCR、等位基因特异性PCR、组装PCR、不对称PCR、数字PCR、乳液PCR、拨出PCR(dial-out PCR)、解旋酶依赖性PCR、巢式PCR、热启动PCR、反向PCR、甲基化特异性PCR、微引物PCR(miniprimer PCR)、多重PCR、巢式PCR、重叠延伸PCR、热不对称交错PCR、降落PCR)以及连接酶链式反应(LCR)。在一些情况下，DNA扩增是线性的。在一些情况下，DNA扩增是指数性的。在一些情况下，DNA扩增是通过巢式PCR实现的，这可以提高检测扩增的DNA产物的灵敏度。

可在基质内进行核酸序列的扩增。扩增核酸的方法可包括原位滚环扩增。在某些方面，扩增核酸的方法可包括使用PCR，诸如锚定PCR、RACE PCR或连接链式反应(LCR)。替代性的扩增方法包括但不限于自我持续序列复制、转录扩增系统、Q-β复制酶、递归式PCR(recursive PCR)或任何其他核酸扩增方法。

可在足以扩增核酸的合适反应条件下使3D基质内的核酸与试剂接触。基质可以是多孔的以允许试剂迁移到基质中以接触核酸。在某些方面，可通过使扩增引物与核酸序列3’端的扩增位点选择性杂交来扩增核酸。尽管使用不同长度的寡核苷酸，扩增引物的长度为6至100个以及甚至高达1,000个核苷酸，但有时为10至40个核苷酸。在一些情况下，扩增引物的长度可以为至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个核苷酸。在一些情况下，扩增引物的长度可以为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500个或更多个核苷酸。扩增引物可与核酸探针杂交，核酸探针与DNA分子杂交，使得扩增引物可以用于扩增核酸探针的序列。扩增引物可存在于待添加到基质中的溶液中，或者可在基质形成期间添加它们以便与核酸充分相邻地存在于其中以允许杂交和扩增。

DNA聚合酶可以用于扩增反应。可使用任何合适的DNA聚合酶，包括可商购获得的DNA聚合酶。DNA聚合酶通常是指能够以模板结合方式使核苷酸掺入DNA链的酶。DNA聚合酶的非限制性实例包括Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段，以及其变体、修饰产物和衍生物。其他酶也可以用于扩增反应，包括但不限于RNA聚合酶(例如，T7RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶等)和逆转录酶(例如，禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、野生型人免疫缺陷病毒1(HIV-1)逆转录酶或莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶)。

检测

本公开内容提供了用于核酸检测的样品处理方法和系统。可鉴定核酸靶标的序列。各种方法(包括杂交和测序)可以用于核酸检测。核酸检测可以包括对本文所述的生物样品或3D基质进行成像。

报告剂可通过共价或非共价相互作用与核酸(包括扩增产物)连接。非共价相互作用的非限制性实例包括离子相互作用、范德华力、疏水相互作用、氢键合以及其组合。报告剂可与初始反应物结合并且报告剂水平的变化可用于检测扩增产物。当核酸扩增进行时，报告剂可以是可检测的(或不可检测的)。报告剂可以是光学可检测的。光学活性染料(例如，荧光染料)可用作报告剂。染料的非限制性实例包括SYBR绿、SYBR蓝、DAPI、碘化丙啶、Hoeste、SYBR金、溴化乙啶、吖啶、原黄素、吖啶橙、吖啶黄、荧光香豆素(fluorcoumanin)、玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、乙菲啶、光神霉素、多吡啶钌、安曲霉素、菲啶和吖啶、溴化乙啶、碘化丙啶、碘化己啶、二氢乙啶、乙啶同型二聚体1和2、单叠氮化乙啶和ACMA、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、DAPI、吖啶橙、7-AAD、放线菌素D、LDS751、羟芪巴脒、SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR金、SYBR绿I、SYBR绿II、SYBR DX、SYTO-40、SYTO-41、SYTO-42、SYTO-43、SYTO-44、SYTO-45(蓝)、SYTO-13、SYTO-16、SYTO-24、SYTO-21、SYTO-23、SYTO-12、SYTO-11、SYTO-20、SYTO-22、SYTO-15、SYTO-14、SYTO-25(绿)、SYTO-81、SYTO-80、SYTO-82、SYTO-83、SYTO-84、SYTO-85(橙)、SYTO-64、SYTO-17、SYTO-59、SYTO-61、SYTO-62、SYTO-60、SYTO-63(红)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-2、Cy-3、Cy-3.5、Cy-5、Cy5.5、Cy-7、得克萨斯红、Phar-Red、别藻蓝蛋白(APC)、Sybr绿I、Sybr绿II、Sybr金、CellTracker绿、7-AAD、乙啶同型二聚体I、乙啶同型二聚体II、乙啶同型二聚体III、溴化乙啶、伞形酮、伊红、绿色荧光蛋白、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、二苯乙烯、荧光黄、级联蓝(cascade blue)、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯、荧光镧系配合物(诸如包括铕和铽的那些)、羧基四氯荧光素、5或6-羧基荧光素(FAM)、5,6-羧基荧光素(FAM)、5-(或6-)碘乙酰氨基荧光素、5-{[2(和3)-5-(乙酰巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素(SAMSA-荧光素)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、5或6羧基罗丹明(ROX)、5,6羧基罗丹明(ROX)、7-氨基-甲基-香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、BODIPY荧光团、8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐、3,6-二磺酸-4-氨基-萘二甲酰亚胺、藻胆蛋白、AlexaFluor 350、AlexaFluor 405、AlexaFluor 430、AlexaFluor 488、AlexaFluor532、AlexaFluor 546、AlexaFluor 555、AlexaFluor 568、AlexaFluor 594、AlexaFluor610、AlexaFluor 633、AlexaFluor 635、AlexaFluor 647、AlexaFluor 660、AlexaFluor680、AlexaFluor 700、AlexaFluor 750和AlexaFluor 790染料、DyLight 350、DyLight405、DyLight 488、DyLight 550、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 650、DyLight 680、DyLight 755和DyLight 800染料、或其他荧光团。

在一些实施方案中，报告剂可以是序列特异性寡核苷酸探针，其在与核酸靶标或其衍生物(例如，扩增产物)杂交时具有光学活性。探针可与本文所述的任何光学活性报告剂(例如，染料)连接，并且还可包括能够阻断相关染料的光学活性的猝灭剂。可用作报告剂的探针的非限制性实例包括TaqMan探针、TaqMan Tamara探针、TaqMan MGB探针或Lion探针。

在一些方面，用于确定靶核酸分子的核酸序列的方法包括测序或序列分析。在一些方面，合成法测序、连接法测序或杂交测序用于确定靶核酸分子的核酸序列。如本文所公开，可以在测序之前采用各种扩增方法产生更大量的核酸样品，尤其是有限的核酸样品。例如，扩增方法可以产生扩增子的靶向文库。

对于连接法测序，可杂交和鉴定标记的核酸片段，以确定靶核酸分子的序列。对于合成法测序(SBS)，可使用标记的核苷酸确定靶核酸分子的序列。靶核酸分子可以与引物杂交并在聚合酶和含有封闭基团的标记的核苷酸的存在下进行孵育。可以延伸引物，使得掺入标记的核苷酸。封闭基团的存在可允许掺入单个核苷酸。标记物的存在可以允许鉴定所掺入的核苷酸。如本文所用，标记物可以是本文所述的任何光学活性染料。可以添加单一碱基，或者，可替代地，可以同时添加所有四种碱基，特别是当各碱基与可区分的标记物缔合时。在通过其相应标记物鉴定所掺入的核苷酸后，可以去除标记物和封闭基团，从而允许随后的一轮掺入和鉴定。因此，可切割接头可以将标记物连接至碱基。可切割接头的实例包括但不限于肽接头。此外，可使用可去除的封闭基团，使得可以进行多轮鉴定，从而允许鉴定靶核酸序列的至少一部分。本文公开的组合物和方法可用于这种SBS方法。此外，组合物和方法可以用于由固体支持物(例如，如本文所述的3D基质内的阵列或样品)测序，其中可以从固体支持物上的多个位置同时“读取”多个序列，因为每个位置上的每个核苷酸都可以基于其可鉴定的标记物进行鉴定。示例性方法描述于US 2009/0088327；US2010/0028885；以及US 2009/0325172，每一个均以引用方式并入本文。

计算机系统

本公开内容提供了被编程用于实施本公开内容的方法的计算机系统。图3示出计算机系统301，其被编程或以其他方式被配置为使用本公开内容的方法处理样品。计算机系统301可以调节本公开内容的样品处理的各个方面，例如，在样品保持器中提供样品、使试剂或缓冲液与样品接触、在样品内进行反应以及测序。计算机系统301可以是用户的电子设备或相对于电子设备远程定位的计算机系统。电子设备可以是移动电子设备。

计算机系统301包括中央处理单元(CPU，在本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)305，其可以是单核心或多核心处理器，或用于并行处理的多个处理器。计算机系统301还包括存储器或存储位置310(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元315(例如，硬盘)、与一个或多个其他系统通信的通信接口320(例如，网络适配器)，以及外围设备325，诸如高速缓存器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器310、存储单元315、接口320和外围设备325通过通信总线(实线)诸如母板与CPU 305通信。存储单元315可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统301可以借助于通信接口320来可操作地耦接至计算机网络(“网络”)330。网络330可以是互联网、互联网和/或外联网或与互联网通信的内部网和/或外联网。网络330在一些情况下是电信和/或数据网络。网络330可以包括一个或多个计算机服务器，其可以实现分布式计算，诸如云计算。网络330在一些情况下借助于计算机系统301，可以实施对等网络，其可使得耦接至计算机系统301的设备能够作为客户端或服务器来运作。

CPU 305可以执行一系列机器可读指令，所述指令可以在程序或软件中具体实现。指令可存储于存储位置，诸如存储器310中。指令可以被引导至CPU 305，其可以随后编程或另外配置CPU 305来实施本公开内容的方法。由CPU 305执行的操作的实例可以包括撷取、解码、执行和写回。

CPU 305可以是电路诸如集成电路的一部分。系统301的一个或多个其他部件可以包括在电路中。在一些情况下，电路是专用集成电路(ASIC)。

存储单元315可以存储文件，诸如驱动程序、文库和保存程序。存储单元315可以存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。计算机系统301在一些情况下可以包括一个或多个另外的数据存储单元，所述单元在计算机系统301外部，诸如位于通过内部网或互联网与计算机系统301通信的远程服务器上。

计算机系统301可以通过网络330与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统301可以与用户(例如，执行本公开内容的样品处理或核酸序列检测的用户)的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、板式PC或平板PC(例如，Apple

iPad、Samsung

GalaxyTab)、电话、智能电话(例如，Apple

iPhone、支持Android的设备、Blackberry

)或个人数字助理。用户可以通过网络330访问计算机系统301。

如本文所述的方法可以通过机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实施，所述代码存储于计算机系统301的电子存储位置上，例如像存储在存储器310或电子存储单元315上。机器可执行或机器可读代码可以软件形式提供。在使用期间，代码可以由处理器305执行。在一些情况下，代码可以从存储单元315获取并且存储在存储器310上准备由处理器305访问。在一些情况下，可以排除电子存储单元315，并且机器可执行指令存储于存储器310上。

代码可以预先编译并且被配置为供具有适于执行代码的处理器的机器使用，或可以在运行时间期间加以编译。代码可以编程语言提供，可以选择所述编程语言以使得代码能够以预先编译或原样编译方式执行。

本文提供的系统和方法，诸如计算机系统301的方面可以在编程中具体实现。技术的各个方面可被认为是通常呈机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据形式的“产品”或“制品”，所述数据承载或具体实现于一定类型的机器可读介质中。机器可执行代码可以存储在电子存储单元，诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”类型介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可在任何时候提供非暂时性存储以用于软件编程。软件的全部或部分可有时通过互联网或各种其他电信网络来传送。此类传送，例如，可使得将软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机计算机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可承载软件元件的另一种类型的介质包括光、电和电磁波，诸如跨越本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆地线网络和经各种空中链路的所使用的光、电和电磁波。携带此类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光链路等也可被视为承载软件的介质。如本文所用，除非限于非暂时性、有形“存储”介质，术语诸如计算机或机器“可读介质”是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

因此，机器可读介质，诸如计算机可执行代码，可采用许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括，例如，光盘或磁盘，诸如任何计算机等中的任何存储设备，诸如在附图中示出的可用于实施数据库等的存储设备。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这种计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可采用电或电磁信号，或声或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间生成的那些。常见形式的计算机可读介质因此包括例如：软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任何其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、冲孔卡纸带、具有孔图案的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒、运输数据或指令的载波、运输这种载波的电缆或链路，或计算机可读取编程代码和/或数据的任何其他介质。许多这些形式的计算机可读介质可涉及将一个或多个指令的一个或多个序列运载至处理器以供执行。

计算机系统301可以包括电子显示器335或与其通信，所述电子显示器335包括用户界面(UI)340，其用于提供例如用以执行本公开内容中描述的样品处理方法和/或核酸序列检测方法的方案。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。

本公开内容的方法和系统可以通过一种或多种算法实施。算法可以在由中央处理单元305执行后通过软件实施。可以例如执行该算法以便利用本公开内容中公开的方法和系统处理样品和/或检测核酸序列。

实施例

实施例1–三维基质中的分析物固定方案1

本实施例提供了用于处理样品以在三维(3D)基质内进行检测的方案。所述方案可以包括(1)使样品透化并使用点击凝胶(例如，具有连接部分以连接感兴趣的靶标的凝胶基质)包埋样品；(2)使束缚寡核苷酸(例如，具有5’束缚部分的多个锁式RT引物或具有束缚部分的多聚(dT)引物)与拥挤试剂(crowding agent)(例如，杂交反应增强剂)杂交；(3)通过CuAAC点击化学使束缚寡核苷酸与凝胶连接；(4)使拥挤试剂失活或洗掉所述拥挤试剂，并用蛋白酶处理样品以清洁样品并使样品完全透化；(5)进行杂交的RT引物的逆转录；(6)在拥挤试剂的存在下杂交锁式探针；(7)使拥挤试剂失活或洗掉所述拥挤试剂；(8)通过连接使锁式探针环化并进行滚环扩增(RCA)以掺入5-叠氮甲基-dUTP；以及(9)通过点击化学将滚环集落连接至凝胶基质。

实施例2–三维基质中的分析物固定方案2

本实施例提供了用于处理样品以在三维(3D)基质内进行检测的方案。所述方案可以包括(1)使样品透化并在拥挤试剂的存在下杂交束缚寡核苷酸(例如，具有5’束缚部分的多个锁式RT引物或具有束缚部分的多聚(dT)探针)；(2)将束缚寡核苷酸和样品包埋在凝胶基质中，以使束缚寡核苷酸的5’丙烯酰胺基束缚至凝胶基质；(3)使拥挤试剂失活或洗掉所述拥挤试剂，并用蛋白酶处理样品以清洁样品，并使样品完全透化；(4)对样品进行逆转录以延伸杂交的RT引物；(5)在拥挤试剂的存在下杂交锁式探针；(6)使拥挤试剂失活或洗掉所述拥挤试剂；(7)通过连接使锁式探针环化并进行滚环扩增(RCA)以掺入5-叠氮甲基-dUTP；以及(8)将滚环集落连接至凝胶基质。

实施例3–使用逆转录酶的分析物束缚

本实施例提供了用于通过包含官能性束缚部分的修饰的核苷酸的逆转录酶聚合将样品的分析物束缚至三维基质的方案。所述方案可以包括(1)使组织切片样品透化；(2)使用APS/TEMED，利用4％w/v 19:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺与另外的0.1％炔丙基丙烯酰胺将组织切片样品包埋在3D基质中；(3)引入包括逆转录酶和携带5’叠氮化物修饰束缚部分的RT引物(诸如随机(N)x6、(N)x8等，或多聚(dT))的逆转录反应混合物；(4)洗涤样品；(5)添加包含铜盐和抗坏血酸钠的点击反应混合物，其催化所生成的cDNA与基质之间的连接；(6)使锁式探针杂交并连接探针以形成环状模板；(7)添加RCA反应混合物以形成DNA扩增产物(例如纳米球)；以及(8)使用FISSEQ对DNA纳米球进行测序。

实施例4–探针束缚

本实施例提供了用于将探针束缚至三维基质的方案。所述方案可以包括(1)使组织切片样品透化；(2)使用APS/TEMED，利用4％w/v 19:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺与另外的0.1％炔丙基丙烯酰胺将组织切片样品包埋在3D基质中；(3)引入多种原位杂交(ISH)探针(诸如靶向RNA或基因组基因座的那些)，并且所述探针还携带叠氮化物修饰的束缚部分和可检测标记物，诸如条形码序列结构域；(4)洗涤样品；(5)添加包含铜盐和抗坏血酸钠的点击反应混合物，其催化ISH探针与基质之间的连接；以及(6)诸如通过如美国专利公布号20190218608和20190218608中所述的环状HCR检测探针。

实施例5–抗体条形码束缚

本实施例提供用于将包含条形码的抗体束缚至三维基质的方案。所述方案可以包括(1)使组织切片透化；(2)使用APS/TEMED，利用4％w/v 19:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺与另外的0.1％炔丙基丙烯酰胺将组织切片包埋在3D基质中；(3)使用去污剂溶液(例如1X硼酸盐缓冲液中的4％w/v SDS，pH 8.0)对组织切片样品进行脱脂；(4)引入多种带有DNA条形码的一抗(包含束缚部分)，其结合靶蛋白分析物；(5)洗涤组织切片样品；(6)添加包含铜盐和抗坏血酸钠的点击反应混合物，其催化抗体DNA条形码标签与基质之间的连接；(7)任选地使用蛋白酶反应混合物清除蛋白质，所述混合物包含适当缓冲液中蛋白酶K的1:100稀释；(8)洗涤样品；以及(9)诸如通过FISSEQ或环状HCR检测DNA条形码。用于将包含条形码的抗体束缚至三维基质的一些方案可与其他束缚核酸探针的方案结合，以便实现多组学方法，由此可通过将探针和抗体的各种组合束缚至同一组织切片样品中的三维基质来对DNA、RNA、脂质和蛋白质定位数据的组合进行编码和检测。

实施例6–探针束缚化学

本实施例提供了用于在用于将分析物、探针和抗体束缚至如本文所述的三维基质的方案中使用的组合物。在一些实施方案中，用于将分析物、探针和抗体束缚至三维基质的方法利用在缓冲液中用铜盐和抗坏血酸钠催化的炔烃与叠氮化物官能团之间的点击化学，如图4A所示。例如，可通过使各种点击反应性化合物或点击单体交联，以将点击化学官能团嵌入基质的结构中来形成三维基质。点击化学基质可以通过将炔丙基丙烯酰胺掺杂到凝胶反应混合物中来形成(图4B)。为了确定待掺杂到凝胶反应混合物中的炔丙基丙烯酰胺的最佳量，将各种量的炔丙基丙烯酰胺点击单体掺杂到凝胶反应混合物中，如图5A所示。图5B是描绘凝胶基质中点击单体(炔丙基丙烯酰胺)的百分比以及束缚收率对束缚节点密度或凝胶组合物中的束缚基团浓度的依赖性的响应曲线的图。在基质聚合后，可将叠氮化物官能性束缚对添加到三维基质中(在这里是水凝胶)(图6A-图6B)，因为叠氮化物在自由基聚合中被消耗(在APS/TEMED的存在下)。

点击化学部分(例如，叠氮化物)可以用于各种探针、核酸或抗体，以通过炔丙基丙烯酰胺聚合束缚至包含炔烃官能团的三维基质。如图7A所示，含叠氮化物探针(例如，叠氮化物寡核苷酸)可与基质内的DNA纳米球杂交。通过将RCA试剂混合物添加到凝胶上并孵育以发生扩增，通过注入基质的环形模板上的phi29滚环扩增(RCA)原位形成纳米球。在一些实施方案中，纳米球包含用于结合杂交探针或含叠氮化物探针(例如，叠氮化物寡核苷酸)的DNA序列结构域。每个含叠氮化物探针(例如，叠氮化物寡核苷酸)包含与纳米球上的区域互补的序列以及其他结构域(例如，突出区域，诸如用于结合检测寡核苷酸)。从样品中洗掉未结合的探针，并将含有铜盐和抗坏血酸钠的点击反应混合物添加到样品中，从而催化探针上的叠氮化物与水凝胶基质中的炔烃之间的点击反应。使样品暴露于变性条件下，诸如孵育并用80％的甲酰胺水溶液洗涤，这破坏DNA纳米球与探针之间的杂交。由此从样品中洗掉未束缚至基质的探针。通过比较红色荧光杂交探针的信号与纳米球中的DNA序列结构域的信号或来自与含叠氮化物探针的突出端结合的检测寡核苷酸的绿色信号来评估点击束缚的性能(图7B)。例如，含有与检测结构域互补的绿色荧光探针的杂交混合物可以与样品杂交。含有与同一区域互补的红色荧光杂交探针的杂交混合物可以与样品杂交，从而与尚未被含叠氮化物探针(例如，叠氮化物寡核苷酸)占据的DNA纳米球结合。洗涤未结合的荧光探针。进行成像以检测来自绿色和红色通道的荧光信号，从而检测通过点击反应束缚到水凝胶基质中的含叠氮化物探针(例如，叠氮化物寡核苷酸)和可用于结合DNA纳米球上的杂交探针的未占据序列(例如，主要是通过在变性条件下被洗掉的未束缚的点击探针；由于点击探针的杂交反应的不完全收率，可能产生一些很小的背景)的相对丰度。图7B示出通过显微镜成像获得的红色和绿色荧光信号的+/-铜条件。在铜(+)条件下，检测到由与共价基质束缚的含叠氮化物探针(例如，叠氮化物寡核苷酸)结合的绿色荧光检测寡核苷酸生成的绿色点状信号，而来自竞争性红色荧光杂交探针(例如“追踪探针(chase probe)”)的信号极小。在铜(-)条件下，完全没有检测到绿色荧光信号表明，在不存在点击反应的情况下，在变性条件后基质没有在空间上保留含叠氮化物探针(例如，叠氮化物寡核苷酸)。

本文所述的方法也可应用于水凝胶形成后原位形成的衍生物分子。如图8A所示，如本文所述，在缺乏炔丙基丙烯酰胺(无点击反应性单体)的水凝胶基质内，除了在RCA反应期间添加叠氮化物-dUTP(其在RCA期间通过Phi29掺入)，通过RCA形成衍生纳米球。在铜盐和抗坏血酸钠的存在下，将绿色荧光炔烃荧光团添加到样品中，触发染料与DNA纳米球的缀合反应。提供了用于与DNA纳米球上的序列结构域杂交的红色荧光探针，并从样品中洗掉未结合的探针和染料。如图8B所示，绿色和红色荧光通道在Cu+/-条件下的成像表明，DNA纳米球(例如，靶标分析物的衍生物(例如，针对RNA或CDNA分子的锁式探针))可以通过掺入对点击反应条件具有反应性的叠氮化物官能团来形成。因此，当暴露于点击反应条件时，在炔烃反应性水凝胶基质内形成的含叠氮化物的DNA纳米球可以被共价束缚至水凝胶基质。

尽管本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，此类实施方案仅作为实例提供。本发明不旨在受到本说明书中提供的具体实例的限制。尽管已经参考上述说明书描述了本发明，但本文中的实施方案的描述和说明不意图以限制性意义解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面均不限于本文所述的具体描述、配置或相对比例，其取决于多种条件和变量。应当理解的是，可在实践本发明时采用在本文中描述的本发明的实施方案的各种替代方案。因此，预期本发明还应涵盖任何此类替代方案、修改、变型或等同物。所意图的是，以下权利要求限定本发明的范围以及由此涵盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。

Claims

1.一种用于处理生物样品的方法，包括：

(a)提供包含所述生物样品的容器，所述生物样品包含处于合成的三维(3D)基质内的分析物，所述合成的3D基质包含连接部分；以及

(b)将束缚分子引导到所述生物样品中，使得所述束缚分子(i)

流动通过所述合成的3D基质并与所述分析物接触，并且(ii)

连接至所述分析物和所述连接部分，从而将所述分析物连接至所述合成的3D基质。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述束缚分子包含对所述连接部分具有特异性的束缚部分。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述合成的3D基质包封所述生物样品。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，还包括，在(a)之前，在所述容器中提供基质形成材料，并且使用所述基质形成材料生成所述合成的3D基质。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述合成的3D基质通过所述基质形成材料的聚合而生成。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述合成的3D基质通过所述基质形成材料的交联而生成。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，还包括，在(b)之后，鉴定所述合成的3D基质内的所述分析物。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述束缚分子包含与所述分析物的序列互补的核酸序列。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述束缚分子包含聚脱氧胸苷(dT)序列。

10.如权利要求8或权利要求9所述的方法，还包括，在(b)中，使所述生物样品与杂交反应增强剂接触，其中所述杂交反应增强剂提高所述核酸序列与所述分析物的所述序列之间的杂交速率。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述杂交反应增强剂包含促进所述杂交反应增强剂的失活的官能团。

12.如权利要求10或权利要求11所述的方法，还包括在使所述生物样品与所述杂交反应增强剂接触之后，使所述官能团经受足以使所述杂交反应增强剂失活的条件。

13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，还包括使所述杂交反应增强剂失活。

14.如权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述官能团是水合基团。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述水合基团是离子基团、电解基团或亲水基团。

16.如权利要求11-15中任一项所述的方法，其中所述官能团还包含可切割接头，所述可切割接头连接所述官能团与所述杂交反应增强剂的聚合物主链。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述可切割接头包含α-羟基酸、β-酮酸或二硫键。

18.如权利要求16或权利要求17所述的方法，还包括从所述杂交反应增强剂的所述聚合物主链上切割所述官能团。

19.如权利要求18所述的方法，还包括从所述合成的3D基质中去除所述官能团。

20.如权利要求10-19中任一项所述的方法，还包括从所述合成的3D基质中去除所述杂交反应增强剂。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述去除包括从所述合成的3D基质中洗掉所述杂交反应增强剂。

22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，还包括，在(b)之后，使所述生物样品与蛋白酶接触。

23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述分析物包含(i)核酸分子或(ii)多肽分子。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述分析物包含一个或多个多肽分子，并且其中所述分析物与抗体或其片段结合。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述抗体或其片段与核酸条形码缀合，并且其中所述束缚分子包含与所述核酸条形码互补的核酸序列。

26.如权利要求23所述的方法，其中所述分析物包含一个或多个多肽分子，并且其中所述束缚分子是与核酸条形码缀合的抗体或其片段。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述核酸条形码包含束缚部分，所述束缚部分连接至所述合成的3D基质的所述连接部分。

28.如权利要求23所述的方法，其中所述分析物是所述核酸分子，并且其中所述束缚分子包含与所述一个或多个核酸分子中的核酸分子的序列互补的引物序列。

29.如权利要求28所述的方法，还包括，在(b)中，使所述引物序列与所述核酸分子的所述序列杂交。

30.如权利要求29所述的方法，还包括，在(b)之后，延伸与所述核酸分子的所述序列杂交的所述引物序列以产生连接至所述合成的3D基质的延伸产物。

31.如权利要求30所述的方法，还包括在另外的杂交反应增强剂的存在下使探针与所述延伸产物杂交。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述探针是锁式探针或分子倒置探针。

33.如权利要求31或32所述的方法，还包括使所述另外的杂交反应增强剂失活或从所述合成的3D基质中去除所述另外的杂交反应增强剂。

34.如权利要求33所述的方法，还包括使所述探针环化。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述环化包括连接所述探针的3’端和5’端。

36.如权利要求31-35中任一项所述的方法，还包括使所述探针经受扩增反应以产生扩增产物。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述扩增反应是滚环扩增。

38.如权利要求36或37所述的方法，其中所述扩增反应将修饰的碱基掺入所述扩增产物中。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述修饰的碱基是5-叠氮甲基-dUTP。

40.如权利要求36所述的方法，其中所述扩增反应是非酶促反应。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述非酶促反应是杂交链式反应(HCR)或分支DNA反应。

42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述生物样品是细胞或组织。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述细胞或所述组织是固定的。

44.如权利要求42或43所述的方法，其中所述细胞或所述组织是透化的。

45.一种用于处理生物样品的方法，包括：

(a)使包含分析物的所述生物样品与束缚分子和杂交反应增强剂接触，其中所述束缚分子包含束缚部分和与所述分析物的序列互补的核酸序列，并且其中所述杂交反应增强剂提高所述核酸序列与所述分析物的所述序列之间的杂交速率；

(b)使所述束缚分子的所述核酸序列与所述分析物的所述序列杂交；

(c)使具有与所述分析物杂交的所述束缚分子的所述生物样品与基质形成材料接触；以及

(d)使用所述基质形成材料形成合成的三维(3D)基质，所述合成的三维(3D)基质具有通过所述束缚部分连接到其上的所述束缚分子。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述合成的3D基质保持所述分析物在所述生物样品内的绝对或相对空间位置。

47.如权利要求45所述的方法，其中所述合成的3D基质还包含连接部分。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述束缚分子的所述束缚部分对所述连接部分具有特异性。

49.如权利要求48所述的方法，还包括，在(d)中，将所述束缚部分连接至所述连接部分。

50.如权利要求45-49中任一项所述的方法，其中所述杂交反应增强剂包含促进所述杂交反应增强剂的失活的官能团。

51.如权利要求50所述的方法，还包括，在(d)之后，使所述官能团经受足以使所述杂交反应增强剂失活的条件。

52.如权利要求51所述的方法，还包括使所述杂交反应增强剂失活。

53.如权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述官能团是水合基团。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述水合基团是离子基团、电解基团或亲水基团。

55.如权利要求50-54中任一项所述的方法，其中所述官能团还包含可切割接头，所述可切割接头连接所述官能团与所述杂交反应增强剂的聚合物主链。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述可切割接头包含α-羟基酸、β-酮酸或二硫键。

57.如权利要求55或56所述的方法，还包括从所述杂交反应增强剂的所述聚合物主链上切割所述官能团。

58.如权利要求57所述的方法，还包括从所述合成的3D基质中去除所述官能团。

59.如权利要求45-49中任一项所述的方法，还包括从所述合成的3D基质中去除所述杂交反应增强剂。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述去除包括从所述合成的3D基质中洗掉所述杂交反应增强剂。

61.如权利要求45-60中任一项所述的方法，还包括，在(d)之后，使包封在所述合成的3D基质内的所述生物样品与蛋白酶接触。

62.如权利要求45-61中任一项所述的方法，其中所述分析物包含(i)核酸分子或(ii)多肽分子。

63.如权利要求62所述的方法，其中所述分析物是一个或多个多肽分子，其中所述分析物与抗体或其片段结合。

64.如权利要求63所述的方法，其中所述抗体或其片段与核酸条形码缀合，并且其中所述束缚分子包含与所述核酸条形码互补的核酸序列。

65.如权利要求62所述的方法，其中所述分析物是一个或多个核酸分子，并且其中所述束缚分子包含与所述一个或多个核酸分子中的核酸分子的序列互补的引物序列。

66.如权利要求65所述的方法，还包括，在(d)之后，延伸与所述核酸分子的所述序列杂交的所述引物序列以产生连接至所述合成的3D基质的延伸产物。

67.如权利要求66所述的方法，还包括在另外的杂交反应增强剂的存在下使探针与所述延伸产物杂交。

68.如权利要求67所述的方法，其中所述探针是锁式探针或分子倒置探针。

69.如权利要求67或68所述的方法，还包括使所述另外的杂交反应增强剂失活或从所述合成的3D基质中去除所述另外的杂交反应增强剂。

70.如权利要求69所述的方法，还包括使所述探针环化。

71.如权利要求70所述的方法，其中所述环化包括连接所述探针的3’端和5’端。

72.如权利要求67-71中任一项所述的方法，还包括使所述探针经受扩增反应以产生扩增产物。

73.如权利要求72所述的方法，其中所述扩增反应是滚环扩增。

74.如权利要求72或73所述的方法，其中所述扩增反应将修饰的碱基掺入所述扩增产物中。

75.如权利要求74所述的方法，其中所述修饰的碱基是5-叠氮甲基-dUTP。

76.如权利要求72所述的方法，其中所述扩增反应是非酶促反应。

77.如权利要求76所述的方法，其中所述非酶促反应是杂交链式反应(HCR)或分支DNA反应。

78.如权利要求45-77中任一项所述的方法，其中所述生物样品是细胞或组织。

79.如权利要求78所述的方法，其中所述细胞或所述组织是固定的。

80.如权利要求78或79所述的方法，其中所述细胞或所述组织是透化的。

81.一种用于处理包含分析物的生物样品的组合物，包含：

包封在合成的三维(3D)基质内的所述生物样品；

偶联至所述合成的3D基质的连接部分；

束缚探针，其中所述束缚探针包含与所述分析物的序列互补的核酸序列，并且其中所述核酸序列被配置为与所述分析物的所述序列杂交；以及

杂交反应增强剂，所述杂交反应增强剂提高所述核酸序列与所述分析物的所述序列之间的杂交速率。

82.如权利要求81所述的组合物，其中所述连接部分被配置为使所述分析物保持在所述合成的3D基质内的绝对或相对空间位置。

83.如权利要求81或权利要求82所述的组合物，其中所述分析物是核酸分子或多肽分子。

84.如权利要求81-83中任一项所述的组合物，其中所述生物样品是细胞或组织。

85.如权利要求81-84中任一项所述的组合物，其中所述细胞或所述组织是固定的。

86.如权利要求84或85所述的组合物，其中所述细胞或所述组织是透化的。

87.如权利要求81-86中任一项所述的组合物，其中所述杂交反应增强剂包含促进所述杂交反应增强剂的失活的官能团。

88.如权利要求87所述的组合物，其中所述官能团是水合基团。

89.如权利要求88所述的组合物，其中所述水合基团是离子基团、电解基团或亲水基团。

90.如权利要求87-89中任一项所述的组合物，其中所述官能团还包含可切割接头，所述可切割接头连接所述官能团与所述杂交反应增强剂的聚合物主链。

91.一种用于处理生物样品的方法，包括：

(a)使包含多肽分析物的所述生物样品与束缚分子接触，其中所述束缚分子包含(i)与核酸条形码缀合的抗体或其片段以及(ii)束缚部分；

(b)使所述多肽分析物与所述束缚分子结合；

(c)使具有与所述多肽分析物结合的所述束缚分子的所述生物样品与基质形成材料接触；以及

92.如权利要求91所述的方法，其中所述合成的三维(3D)基质包含连接部分。

93.如权利要求91或权利要求92所述的方法，其中所述束缚部分是叠氮化物。

94.如权利要求93所述的方法，其中所述连接部分包含炔烃并且(b)包括使所述炔烃与所述叠氮化物反应。

95.如权利要求91-94中任一项所述的方法，其中，在(b)中，所述束缚分子通过点击化学反应连接至所述连接部分。

96.如权利要求91-94中任一项所述的方法，其中所述连接部分和所述束缚部分被配置为在点击化学反应中彼此偶联。

97.如权利要求91-96中任一项所述的方法，还包括，在(b)之后，使所述分析物降解。

98.如权利要求97所述的方法，还包括，在(b)之后，使所述生物样品与蛋白酶接触。

99.如权利要求91-98中任一项所述的方法，其中，在(a)中，所述生物样品包含处于所述合成的3D基质内的另外的分析物，所述合成的3D基质包含另外的连接部分。

100.如权利要求99所述的方法，还包括使另外的束缚分子与所述生物样品接触，使得所述另外的束缚分子(i)流动通过所述合成的3D基质并与所述另外的分析物接触，并且(ii)连接至所述另外的分析物和所述另外的连接部分，从而将所述另外的分析物连接至所述合成的3D基质。

101.如权利要求99或权利要求100所述的方法，其中所述多肽分析物和所述另外的分析物是不同分析物。

102.如权利要求101所述的方法，其中所述多肽分析物和所述另外的分析物是不同类型的分析物。

103.如权利要求99-102中任一项所述的方法，其中所述另外的分析物是核酸分子。

104.如权利要求103所述的方法，其中所述核酸是核糖核酸分子。

105.如权利要求99-104中任一项所述的方法，还包括鉴定所述多肽分析物和所述另外的分析物。

106.如权利要求103-105中任一项所述的方法，其中所述另外的束缚分子包含与所述核酸分子的序列互补的引物序列。

107.如权利要求106所述的方法，还包括使所述引物序列与所述核酸分子的所述序列杂交。

108.如权利要求107所述的方法，还包括延伸与所述核酸分子的所述序列杂交的所述引物序列以产生连接至所述合成的3D基质的延伸产物。

109.如权利要求108所述的方法，还包括使探针与所述延伸产物杂交。

110.如权利要求109所述的方法，其中所述探针是锁式探针或分子倒置探针。

111.如权利要求109或权利要求110所述的方法，还包括使所述探针环化。

112.如权利要求111所述的方法，其中所述环化包括连接所述探针的3’端和5’端。

113.如权利要求109-112中任一项所述的方法，还包括使所述探针经受扩增反应以产生扩增产物。

114.如权利要求113所述的方法，其中所述扩增反应是滚环扩增。

115.如权利要求113或权利要求114所述的方法，其中所述扩增反应将修饰的碱基掺入所述扩增产物中。

116.如权利要求115所述的方法，其中所述修饰碱基是5-叠氮甲基-dUTP。

117.如权利要求113所述的方法，其中所述扩增反应是非酶促反应。

118.如权利要求117所述的方法，其中所述非酶促反应是杂交链式反应(HCR)或分支DNA反应。

119.如权利要求91-118中任一项所述的方法，其中所述生物样品是细胞或组织。

120.如权利要求119所述的方法，其中所述细胞或所述组织是固定的。

121.如权利要求119或权利要求120所述的方法，其中所述细胞或所述组织是透化的。

122.如权利要求99-118中任一项所述的方法，其中在使所述多肽分析物连接至所述连接部分之前，将所述另外的分析物连接至所述另外的连接部分。

123.如权利要求99-122中任一项所述的方法，其中所述连接部分和所述另外的连接部分是不同的。

124.如权利要求123所述的方法，其中在(d)之后将所述另外的连接部分添加至所述3D基质。

125.如权利要求123所述的方法，其中在(d)之后、在(d)期间或在(d)之前将所述另外的连接部分添加至所述3D基质。

126.如权利要求123-125中任一项所述的方法，其中所述束缚部分包含丙烯酰基并且所述另外的束缚部分是叠氮化物。

127.一种用于处理生物样品的方法，包括：

(a)提供包含处于合成的三维(3D)基质内的多肽分析物的所述生物样品，所述合成的3D基质包含连接部分；

(b)使所述生物样品与束缚分子接触，其中所述束缚分子包含(i)与核酸条形码缀合的抗体或其片段以及(ii)束缚部分；以及

(c)使所述多肽分析物与所述束缚分子结合，从而通过所述连接部分将所述分析物连接至所述合成的3D基质。

128.如权利要求127所述的方法，其中，在(a)中，所述生物样品包含处于所述合成的3D基质内的另外的分析物。

129.如权利要求127或128所述的方法，其中所述合成的3D基质包含另外的连接部分。

130.如权利要求129所述的方法，其中在所述合成的3D基质在(a)中形成之后向其提供所述另外的连接部分。

131.如权利要求129所述的方法，其中在所述合成的3D基质在(a)中形成之前或期间向其提供所述另外的连接部分。

132.如权利要求127-131中任一项所述的方法，其中(b)与所述合成的3D基质的形成同时或并发进行。

133.如权利要求127-131中任一项所述的方法，其中(b)在所述合成的3D基质的形成之后进行。

134.如权利要求128-133中任一项所述的方法，其中所述另外的分析物是核酸分子。

135.如权利要求134所述的方法，还包括提供另外的束缚分子，其中所述另外的束缚分子包含与所述核酸分子的序列互补的引物序列。

136.如权利要求135所述的方法，还包括使所述引物序列与所述核酸分子的所述序列杂交。

137.如权利要求136所述的方法，还包括延伸与所述核酸分子的所述序列杂交的所述引物序列以产生延伸产物。

138.如权利要求137所述的方法，其中所述延伸产物连接至所述合成的3D基质。

139.如权利要求137或权利要求138所述的方法，还包括使探针与所述延伸产物杂交。

140.如权利要求139所述的方法，其中所述探针是锁式探针或分子倒置探针。

141.如权利要求139或权利要求140所述的方法，还包括使所述探针环化。

142.如权利要求141所述的方法，其中所述环化包括连接所述探针的3’端和5’端。

143.如权利要求139-142中任一项所述的方法，还包括使所述探针经受扩增反应以产生扩增产物。

144.如权利要求143所述的方法，其中所述扩增反应是滚环扩增。

145.如权利要求143或权利要求144所述的方法，其中所述扩增反应将修饰的碱基掺入所述扩增产物中。

146.如权利要求145所述的方法，其中所述修饰的碱基是5-叠氮甲基-dUTP。

147.如权利要求129-146中任一项所述的方法，其中所述连接部分和所述另外的连接部分是不同的。

148.如权利要求135-147中任一项所述的方法，其中所述另外的束缚分子(i)流动通过所述合成的3D基质并与所述另外的分析物接触，并且(ii)连接至所述另外的分析物和所述另外的连接部分，从而将所述另外的分析物连接至所述合成的3D基质。

149.如权利要求135-148中任一项所述的方法，其中所述束缚部分包含丙烯酰基并且所述另外的束缚部分是叠氮化物。